ES2253675T3

ES2253675T3 - Proteina de fusion de proteinas reguladoras/accesorias de hiv.

Info

Publication number: ES2253675T3
Application number: ES03730029T
Authority: ES
Inventors: Paul Howley; Sonja Leyrer; Eva Felder
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2023-05-14
Also published as: EP1652857B1; KR100996330B1; NZ556144A; MXPA04010683A; CN1653085A; US8147839B2; US20060257974A1; US8389275B2; PT1652857E; KR20050010000A; IL197304A0; EP1506223B1; KR20120106894A; KR20100063126A; US20120142096A1; DE60302356D1; EP1652857A3; US8435535B2; BR0309963A; KR101196178B1

Abstract

¿ Proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión y en donde un derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína de HIV es una secuencia de aminoácidos que exhibe una homología de al menos 50%, cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína de HIV respectiva en el aislado HXB2R de HIV¿1 (número de acceso a Genebank K03455).

Description

Proteína de fusión de proteínas reguladoras/accesorias de HIV.

La invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no se procesa a proteínas de HIV individuales que tengan los términos N y C naturales. La invención concierne adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y métodos para producir dichas proteínas. La proteína de fusión, los ácidos nucleicos y los vectores pueden utilizarse como vacunas para la profilaxis al menos parcial contra las infecciones por HIV.

Antecedentes de la invención

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) es el agente causal del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Al igual que todos los retrovirus, el genoma del virus codifica las proteínas Gag, Pol y Env. Adicionalmente, el genoma vírico codifica proteínas reguladoras adicionales, a saber Tat y Rev, así como proteínas accesorias, a saber Vpr, Vpx, Vpu, Vif y Nef.

A pesar de los esfuerzos de la sanidad pública para reprimir la propagación de la epidemia de SIDA, el número de nuevas infecciones está aumentando todavía. La Organización Mundial de la Salud estimaba la epidemia global en 36,1 millones de individuos infectados a finales del año 2000; 50% más que lo que se había predicho sobre la base de los datos disponibles diez años antes (WHO & UNAIDS, UNAIDS, 2000). Globalmente, el número de nuevas infecciones por HIV-1 en el año 2000 se estima en 5,3 millones.

Dada la propagación continua de la epidemia, existe todavía necesidad de proporcionar una vacuna eficaz a la clínica. Se han desarrollado actualmente varias estrategias diferentes de suministro de vacunas HIV-1 tales como nuevos vectores o sistemas adyuvantes, y se han evaluado en diferentes situaciones pre-clínicas así como en pruebas clínicas. La primera vacuna candidato que entró en una prueba clínica de fase III está basada en la proteína gp 120 de la envoltura en alumbre (Francis et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998; 14 (Suppl 3)(5): S325-31). Las pruebas de fase III se han iniciado, aunque la vacuna no demostró tener demasiado éxito en la prueba anterior de fase II.

Después de muchos años de esfuerzos profilácticos en vacunación basados en antígenos de la envoltura, los esfuerzos más recientes se han concentrado en el uso de proteínas reguladoras tales como Tat, Nef y Rev como antígenos de vacuna candidatos. El uso de estos antígenos reguladores en situaciones terapéuticas ha sido continuo durante varios años (Miller et al., Nature Medicine 1997, 3, 389-94, Calarota et al. Lancet 1998, 351, 1320-5, Ayyavoo et al., AIDS, 2000, 14, 1-9). Más recientemente, el uso de estos antígenos en estudios profilácticos de vacunación en pequeñas pruebas pre-clínicas se ha revelado prometedor. Se demostró que el uso de Tat y Rev, o Tat sola como candidato de vacuna profiláctica, reprimía SIVmac (Osterhaus et al., Vaccine 1999, 17, 2713-4). Además, existen indicaciones de que CTL dirigidas hacia las proteínas reguladoras precoces del virus son importantes para eliminar células infectadas antes que alcancen su nivel elevado de producción de viriones maduros (van Baalen et al., J. Gen. Virol. 1997, 78, 1913-8; Addo et al., PNAS, 2001, 98, 1781-6).

Aunque las proteínas reguladoras/accesorias de HIV inducen una respuesta inmunitaria eficaz, la mayoría, si no la totalidad de ellas, tienen efectos secundarios graves, que limitan hasta ahora su uso como vacuna: Se ha demostrado que Nef, Tat y Vpu juegan un papel en la regulación decreciente de la expresión de CD4+ y/o MHC clase I (Howcroft et al., Science, 1993, 260, 1320-2; Schwartz et al., Nature Med. 1996, 2, 338-42; Swann et al., Virology, 2001, 282, 267-77; Janvier et al., J. Virol., 2001, 78, 3971-6; Weissmann et al., PNAS 1998, 95, 11601-6). Se sabe que Tat media la inmunosupresión aguda in vivo (Cohen et al., PNAS, 1999, 96, 10842-10847). Se han descrito también efectos inmunosupresores para Vpr (Ayyavoo et al., Nature Med., 1997, 3: 1117-1123). Se ha descrito que Vpr y Vpx tienen efectos citostáticos y citotóxicos diferenciales en células de levadura (Zhang et al., Virology, 1997, 230, 103-12). Así, la mayoría si no todas las proteínas accesorias/reguladoras de HIV parecen tener propiedades funcionales que no son deseables en una formulación de vacuna.

Intentos para reducir los efectos perjudiciales de las proteínas de HIV se describen en el documento WO 02/06303. En particular, WO 02/06303 describe una proteína de fusión que incluye las secuencias de aminoácidos de Vif, Vpu y Nef de HIV, en donde las proteínas componentes son contiguas a otra proteína componente o están separadas por proteínas no componentes tales comos secuencias de aminoácidos, que proporcionan sitios de escisión proteolítica. Se expone que es preferible utilizar aquellas proteínas de fusión que comprenden sitios de escisión proteolítica entre las proteínas componentes. Dado que las proteínas componentes están separadas por sitios de escisión proteolítica, se producen proteínas de HIV nativas que se sabe son perjudiciales. Para reducir cualesquiera efectos perjudiciales de las proteínas de HIV que resultan de la escisión de la proteína de fusión, el documento WO 02/06303 sugiere la utilización de proteínas atenuadas, Así, el documento WO 02/06303 propugna la utilización de una proteína de fusión que comprende las proteínas Vif, Vpr y Nef de HIV, en donde los sitios de escisión están insertados entre las proteínas de HIV y en donde las proteínas de HIV son proteínas atenuadas. Sin embargo, la desventaja de las proteínas atenuadas es que la secuencia de aminoácidos de la proteína atenuada difiere de la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa por lo que una inmunización con la proteína atenuada puede conducir a una respuesta inmunitaria que reconoce sólo débilmente la proteína nativa, o que incluso no reconoce la proteína nativa en absoluto.

Objeto de la invención

Fue el objeto de la presente invención proporcionar una vacuna que permita la generación de una respuesta inmunitaria eficaz, en particular una respuesta eficaz a las células T citotóxicas, contra varias o la totalidad de las proteínas reguladoras/accesorias de HIV, en donde las proteínas reguladoras/accesorias de HIV en la vacuna o producidas por la vacuna son menos funcionales que las proteínas reguladoras/accesorias nativas individuales, de tal modo que se reduce el riesgo de que las proteínas accesorias/reguladoras en la vacuna ejerzan efectos secundarios no deseados y en donde las proteínas de HIV menos activas inducen una respuesta inmunitaria similar a la de las proteínas de HIV nativas.

Descripción detallada de la invención

El objeto se ha conseguido por la provisión de una proteína de fusión que comprende la secuencia de amino-ácidos de al menos cuatro proteínas de HIV diferentes seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no se procesa a proteínas individuales de HIV que tengan los términos N y C naturales. En particular, el objeto de la presente invención se ha conseguido por ácidos nucleicos y vectores que codifican dichas proteínas de fusión.

Si la proteína de fusión se produce en células animales, con inclusión de células humanas, la proteína de fusión no es escindida por las proteasas celulares de tal manera que se obtengan proteínas accesorias/reguladoras con los términos N y C nativos. Debido al hecho de que una proteína de HIV que forma parte de una proteína de fusión tiene una estructura secundaria/terciaria alterada en comparación con la proteína de HIV individual, la proteína de HIV en la proteína de fusión es menos funcional que la proteína individual, si no totalmente disfuncional. Una proteína reguladora/accesoria que es menos funcional o incluso que no es funcional en absoluto no produce los efectos secundarios indeseables de la proteína de HIV en su conformación natural. En la medida en que está implicada la inmunogenicidad, no existe diferencia sustancial alguna cuando se compara la inmunogenicidad de la proteína de fusión con la inmunogenicidad de las proteínas reguladoras/accesorias de HIV individuales que forman la proteína de fusión. En particular, no existe ninguna diferencia sustancial con respecto a la respuesta de las células T citotóxicas (CTL) dado que los epítopes que se presentan al sistema inmunitario son idénticos. Las mismas consideraciones son aplicables también si la proteína de fusión se administra al paciente.

En el contexto de la presente invención, el término "HIV" hace referencia a cualquier grupo, subtipo ("clade"), cepa o aislado de HIV conocido por las personas expertas en la técnica. En particular, HIV puede ser HIV-1 o HIV-2. HIV-1 ha sido clasificado en nueve subtipos (clades A a I), en tanto que HIV-2 ha sido clasificado en cinco subtipos (A a E), todos los cuales están abarcados por el alcance de la presente invención. Los clades más preferidos de HIV de acuerdo con la presente invención son los clades A, B y C de HIV-1. Sin embargo, la invención no está restringida a estas clades más preferidas.

Las secuencias proteínicas de las proteínas reguladoras de HIV Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, Vpx y Nef son conocidas por las personas expertas en la técnica. A modo de ejemplo y sin quedar restringido a dichas realizaciones como se hace referencia a las diversas secuencias que se describen en la base de datos de Genebank, en particular a la secuencia del aislado HXB2R de HIV-1 que tiene el número de acceso a Genebank KO3455. En esta entrada de Genebank, se especifican las secuencias de los diversos genes de HIV-1 y de las proteínas codificadas por dichos genes.

Preferiblemente, las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión se derivan de la misma clade. De acuerdo con una realización alternativa, las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión se derivan de dos o más clades. Es posible también que una o más de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión sean proteínas de HIV-1 y que una o más de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión sean proteínas de HIV-2.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión son preferiblemente secuencias que están codificadas por aislados de HIV conocidos; es decir, la secuencia de aminoácidos de las proteínas de HIV en la proteína de fusión es idéntica a las secuencias de aminoácidos de las proteínas correspondientes tal como son codificadas por aislados de HIV existentes naturalmente. En una alternativa, la secuencia de aminoácidos de una o más proteínas de HIV en la proteína de fusión puede ser una secuencia de consenso, es decir una secuencia que puede no encontrarse como tal en un aislado de HIV conocido, pero que exhibe una homología óptima - en particular con respecto a epítopes de CTL - con varios o todos los aislados de HIV conocidos. Las personas expertas en la técnica conocen algoritmos de ordenador para calcular una secuencia de consenso.

En una realización alternativa, la proteína de fusión puede comprender derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más proteínas de HIV que son parte de la proteína de fusión. La expresión "derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína de HIV", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a proteínas de HIV que tienen una secuencia de aminoácidos alterada comparada con la proteína de HIV correspondiente existente naturalmente. Una secuencia de aminoácidos alterada puede ser una secuencia en la cual uno o más aminoácidos de la secuencia de la proteína de HIV están sustituidos, insertados o delecionados. Más particularmente, un "derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína de HIV" es una secuencia de aminoácidos que exhibe una homología de al menos 50%, más preferiblemente de al menos 70%, todavía más preferiblemente de al menos 80%, muy preferiblemente de al menos 90% cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína de HIV respectiva de aislados de HIV conocidos. Se considera que una secuencia de aminoácidos tiene la homología de secuencia arriba indicada aun cuando la homología se encuentre para la proteína correspondiente de un solo aislado de HIV, con indiferencia del hecho de que pudieran existir proteínas correspondientes en otros aislados que exhiban una homología menor. A modo de ejemplo, si un derivado de Vpr en la proteína de fusión exhibe una homología de 95% con la secuencia Vpr de un solo aislado de HIV, pero sólo una homología de 50-70% para "todos" los demás aislados de HIV, se considera que la homología de dicho derivado de Vpr es de al menos 90%.

Se ha señalado anteriormente que las proteínas de HIV en la proteína de fusión tienen una actividad reducida, o no tienen incluso actividad alguna en absoluto, en comparación con las proteínas individuales, dado que la conformación de las proteínas en la proteína de fusión es diferente a la conformación natural de las proteínas biológicamente activas. Sin embargo, pudiera ser deseable deducir ulteriormente el riesgo de que las proteínas de HIV en la proteína de fusión sean biológicamente activas. A este fin, "derivados" particularmente preferidos de una proteína de HIV individual que forma parte de una proteína de fusión son derivados de secuencias de aminoácidos en los cuales varios aminoácidos están delecionados, insertados o sustituidos, más preferiblemente no más de 10 aminoácidos, muy preferiblemente no más de 5 aminoácidos, para obtener una proteína de HIV con actividad reducida o sin actividad alguna en absoluto. Las personas expertas en la técnica conocen ensayos concernientes al modo de determinar si una proteína de HIV tiene actividad biológica reducida:

El mecanismo molecular de la proteína Vif, que es esencial para la replicación vírica in vivo, sigue siendo desconocido, pero Vif posee una tendencia acusada hacia la autoasociación. Se ha demostrado que esta multimerización es importante para la función de Vif en el ciclo vital del virus (Yang S. et al., J Biol Chem 2001; 276: 4889-4893). Adicionalmente, se ha demostrado que Vif se asocia específicamente con el complejo de nucleoproteínas vírico, y esto pudiera ser funcionalmente importante (Khan M.A. et al., J Virol. 2001; 75(16): 7252-65). Así, una proteína vif con actividad reducida exhibe una multimerización y/o asociación reducidas con el complejo de nucleoproteínas.

La proteína Vpr juega un papel importante en el ciclo vital del virus. Vpr regula la importación nuclear del complejo de preintegración vírico y facilita la infección de las células que no se dividen tales como macrófagos (Agostini et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2002; 18(4): 283-8). Adicionalmente, aquélla tiene actividad de trans-activación mediada por interacción con la LTR (Vanitharani R. et al., Virology 2001; 289(2): 334-42). Así, una vpr con actividad reducida exhibe una transactivación y/o interacción disminuidas o incluso nulas con el complejo de preintegración
vírico.

Vpx, que es altamente homóloga a Vpr, es crítica también para la replicación vírica eficiente en células que no se dividen. Vpx está empaquetada en partículas de virus por una interacción con el dominio p6 de la poliproteína precursora gag. Al igual de Vpr, Vpx está involucrada en el transporte del complejo de preintegración al núcleo (Mahalingam et al., J. Virol 2001; 75(1): 362-74). Así, una Vpx con actividad reducida tiene una capacidad disminuida para asociarse al complejo de preintegración por la vía del precursor gag.

Se sabe que la proteína Vpu interacciona con la cola citoplásmica de CD4 y causa la degradación de CD4 (Bour et al., Virology 1995; 69(3): 1510-20). Por esta razón, la Vpu con actividad reducida tiene una capacidad reducida para desencadenar la degradación de CD4.

La actividad biológica relevante de la bien caracterizada proteína Tat es la transactivación de la transcripción por interacción con el elemento de respuesta a la transactivación (TAR). Se ha demostrado que Tat es capaz de transactivar promotores heterólogos que carecen de secuencias de HIV distintas de TAR (Han P. et al., Nucleic Acid Res 1991; 19(25): 7225-9). Así, una proteína tat con actividad reducida exhibe una transactivación reducida de los promotores por la vía del elemento TAR.

La proteína Nef es esencial para la replicación vírica responsable del progreso de la enfermedad por inducción de la regulación decreciente de la superficie celular de CD4 (Lou T et al., J Biomed Sci 1997; 4(4): 132). Esta regulación decreciente se inicia por interacción directa entre CD4 y Nef (Preusser A. et al., Biochem Biophys Res Commun 2002; 292(3): 734-40). Así, la proteína Nef con función reducida exhibe una interacción reducida con CD4.

La función relevante de Rev es la transactivación posterior a la transcripción iniciada por interacción con el elemento de respuesta Rev (RRE) del RNA vírico (Iwai et al., 1992; Nucleic Acids Res 1992; 20(24): 6465-72). Así, una Rev con actividad reducida exhibe una interacción reducida con el RRE.

Las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV diferentes seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx, Tat y Nef. La proteína de fusión puede comprender preferiblemente 5, 6 o la totalidad de dichas proteínas de HIV. El orden de las proteínas de HIV en la proteína de fusión no es crítico.

Una o más de las al menos cuatro proteínas de HIV diferentes pueden estar comprendidas en la proteína de fusión en dos o más copias. Así, a modo de ejemplo una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención puede comprender Vif, Vpr, Vpu y dos copias de Rev. La secuencia de aminoácidos de las dos o más copias de una proteína de HIV puede ser idéntica. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos de las copias puede ser diferente, en particular si se utilizan secuencias de proteína que se derivan de cepas o clades de HIV diferentes (v.g., una copia de una HIV-1 Rev y una copia de una HIV-2 Rev).

Las proteínas de HIV adyacentes en la proteína de fusión pueden fusionarse sin aminoácidos adicionales o fusionarse de tal manera que dos proteínas de HIV adyacentes en la proteína de fusión están separadas por al menos un aminoácido adicional. Asimismo, combinaciones de ambas están dentro del alcance de la presente invención. A modo de ejemplo, en una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención que comprende la secuencia de aminoácidos de cuatro proteínas de HIV, dos proteínas de HIV adyacentes pueden estar enlazadas directamente una a otra, mientras que las proteínas de HIV tercera y cuarta están enlazadas por aminoácidos adicionales. El término "aminoácido adicional" en el contexto de esta realización hace referencia a aminoácidos que no se encuentran en esta posición en las proteínas de HIV existentes naturalmente.

Así, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención tiene preferiblemente la fórmula general siguiente:

+P1- - -P2- - -P3- - -P4- - -P5*- - -P6*- - -P7*+

en la cual P1 a P7 son proteínas de HIV diferentes seleccionadas de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev y Nef, en donde la proteína de fusión comprende al menos cuatro de dichas proteínas de HIV diferentes a saber P1 a P4 y opcionalmente una (P5*), dos (P5*- - -P6*) o tres (P5*- - -P6*- - -P7*) de dichas proteínas de HIV adicionales. La abreviatura "- - -" representa independientemente 0 a n aminoácidos adicionales. Cuando "- - -" representa 0 aminoácidos, las proteínas de HIV adyacentes están fusionadas directamente una a otra sin aminoácidos adicionales. Cuando "- - -" representa 1 a n aminoácidos, las proteínas de HIV adyacentes están separadas por 1 a n aminoácidos. El límite superior de los aminoácidos adicionales, es decir el número entero n, depende del tamaño máximo de la proteína de fusión que puede producirse o expresarse en las células.

De acuerdo con una realización, todos los "- - -" representan independientemente 0 a 20, más preferiblemente 0 a 10, todavía más preferiblemente 0a 5 aminoácidos adicionales.

De acuerdo con una realización alternativa, al menos uno de "- - -" representa la secuencia de aminoácidos de una proteína adicional o una parte de la misma, que no es una proteína de HIV seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat y Nef. Así, de acuerdo con esta realización alternativa, la proteína adicional está flanqueada por proteínas de HIV reguladoras/accesorias. La proteína adicional puede ser cualquier proteína. Más preferiblemente, la proteína adicional comprende epítopes adicionales que pueden ayudar a inducir una respuesta inmunitaria mejora contra el HIV. Así, la proteína adicional puede ser la proteína de HIV Env, Gag y/o Pol, o partes de las mismas. En este contexto, el término "parte" de Env, Gag y Pol hace referencia a un tramo de aminoácidos derivado de una de dichas proteínas, que comprende al menos un epítope. Más preferiblemente, el término "parte" hace referencia a al menos 10, todavía más preferiblemente a al menos 20, aún más preferiblemente a al menos 50 aminoácidos de una de dichas proteínas. De acuerdo con una realización afín, al menos uno de "- - -" representa la secuencia de aminoácidos de una o más de las proteínas P1 a P7 que forman parte de la proteína de fusión. Así, en este caso, la proteína de fusión puede comprender una o más copias de una o más de las proteínas que forman parte de la proteína de fusión. Como se ha reseñado, las copias de las proteínas pueden tener o no una secuencia de aminoácidos idén-
tica.

En la fórmula anterior, la abreviatura "+" representa independientemente de 0 a n aminoácidos adicionales terminales. Así, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención puede comprender o no aminoácidos adicionales en el término C y/o N de la proteína. De acuerdo con una realización, al menos uno de "+" representa la secuencia de aminoácidos de una proteína adicional o parte de la misma, que no es una proteína de HIV seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat y Nef. Así, de acuerdo con esta realización, la proteína de fusión comprende en su término C y/o N una proteína adicional, que no es Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat o Nef. La proteína adicional puede ser cualquier proteína. Más preferiblemente, la proteína adicional comprende epítopes adicionales que pueden ayudar a inducir una mejor respuesta inmunitaria contra HIV. V.g., la proteína adicional puede ser la proteína Env, Gag y/o Pol de HIV o partes de las mismas. En este contexto, el término "parte" de Env, Gag y Pol hace referencia a un tramo de aminoácidos derivado de una de dichas proteínas, que comprende al menos un epítope. Más preferiblemente, el término "parte" hace referencia a al menos 10, todavía más preferiblemente a al menos 20, y muy preferiblemente a al menos 50 aminoácidos de una de dichas proteínas.

De acuerdo con una realización alternativa, al menos uno de "+" representa una secuencia de aminoácidos que permite una detección o purificación fácil de la proteína de fusión. Así, al menos uno de "+" pudiera ser por ejemplo un marcador tal como un marcador His.

De acuerdo con la presente invención, la proteína de fusión no se procesa para dar proteínas de HIV individuales que tengan los términos N y C naturales. Más particularmente, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención no se procesa para dar proteínas de HIV individuales que tengan los términos naturales N y C, cuando se expresa en células humanas. Las personas expertas en la técnica conocen métodos concernientes al modo de comprobar si una proteína de fusión, una vez expresada en células humanas se procesa a proteínas de HIV individuales que tengan los términos N y C naturales. En este contexto, se hace referencia a Ayyavoo et al., AIDS 2000, 14, 1-9, en particular al experimento descrito en la Figura 2 de dicha publicación. Resumidamente, una persona experta en la técnica pudiera expresar fácilmente la proteína de fusión respectiva en células humanas tales como células HeLa; las células se lisan luego y los lisados celulares se someten a experimentos de transferencia Western o ensayos de inmunoprecipitación con anticuerpos específicos para las proteínas de HIV individuales que forman juntas la proteína de fusión de HIV respectiva. Para una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, no se detecta cantidad significativa alguna de
proteínas de HIV cuyo tamaño corresponde al tamaño de una proteína individual reguladora/accesoria de HIV.

Con objeto de asegurar que la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención no se procesa a proteínas de HIV individuales que tengan los términos N y C naturales, la proteína de fusión no debería contener secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión. Así, la secuencia de aminoácidos "- - -", tal como se abrevia en la fórmula general anterior, no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de proteínas de HIV que tuvieran los términos N y C naturales. En particular, la proteína de fusión no contiene la secuencia de escisión REKRAVVG (código de aminoácidos de una sola letra) entre las secuencias de aminoácidos de las diferentes proteínas de HIV que forman la proteína de fusión. Secuencias de escisión adicionales para proteasas celulares son conocidas por las personas expertas en la técnica. Así, las personas expertas en la técnica pueden evitar fácilmente la inclusión de secuencias de escisión para proteasas (celulares) que pudieran conducir a proteínas de HIV individuales que tuvieran términos N y C naturales. Un ejemplo de la secuencia de escisión de una cisteinproteasa es Ile/Leu-X-Thr-X-Gly.

Las proteínas de acuerdo con la presente invención no comprenden secuencias de escisión específicas que conduzcan a proteínas de HIV que tengan ambos términos N y C nativos. Sin embargo, esto no excluye generalmente la presencia de sitios de escisión para proteasas celulares entre las proteínas en la proteína de fusión con tal que estos sitios de escisión no medien la generación de proteínas de HIV que tengan a la vez un término N natural y un término C natural. En particular, la secuencia de aminoácidos "- - -" tal como se abrevia en la fórmula general anterior puede comprender sitios de escisión para las proteasas que están implicadas en la generación de péptidos cortos presentados en MHCI o MHCII. De acuerdo con esta realización, el resultado de la reacción de escisión es un tramo peptídico corto que tiene preferiblemente menos de 20 aminoácidos, cuyo término N o C puede corresponder al término N o C de una de las proteínas accesorias/reguladoras de HIV. Sin embargo, estos péptidos cortos, cuando se producen durante el proceso de presentación de antígenos, no tienen ya la actividad de la proteína de HIV de la que se derivan.

La invención se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión arriba definidas de acuerdo con la presente invención. El ácido nucleico puede ser DNA o RNA. Preferiblemente, el ácido nucleico es DNA si se pretende insertar el ácido nucleico en células humanas utilizando un vector de DNA tal como un plásmido o un vector basado en un virus de DNA.

Las personas expertas en la técnica conocen métodos concernientes al modo de construir un ácido nucleico que codifique la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. Sin ligarse a los métodos que siguen, las personas expertas en la técnica pueden partir de un clon de HIV genómico, de un clon de HIV subgenómico o de cualquier material inicial, tal como plásmidos, que comprenda la secuencia codificante de una o más de las proteínas reguladoras/accesorias de HIV. Si la secuencia codificante de una proteína reguladora/accesoria se encuentra en la forma de un marco de lectura continuo, dicha secuencia codificante puede aislarse por escisión del ácido nucleico que comprende dicha secuencia codificante con enzimas de rescisión apropiadas. Los fragmentos de DNA así obtenidos pueden utilizarse para clonación ulterior. Alternativamente, las secuencias codificantes de una proteína accesoria/reguladora pueden obtenerse utilizando los métodos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con iniciadores apropiados. Si las proteínas reguladoras/accesorias están codificadas por más de un exón, como ocurre v.g. en el caso de Tat y Rev, puede ser necesario clonar independientemente los diferentes exones y fusionarlos para generar un marco de lectura continua para la proteína reguladora/accesoria o utilizar tecnología de transcripción inversa tal como RT-PCR.

Puede proporcionarse también una secuencia codificante por síntesis de genes, es decir por generación de un gen utilizando una serie de oligonucleótidos complementarios y/o solapantes.

Con objeto de obtener una proteína de fusión, el ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión contiene preferiblemente un marco de lectura continuo. Por consiguiente, los codones de parada de todas menos la última secuencia que codifica las proteínas de HIV o proteínas adicionales se someten preferiblemente a mutación en un codón que codifica un aminoácido o se delecionan completamente. Con preferencia, esto puede realizarse fácilmente si se utilizan para la PCR iniciadores específicos que amplifican la secuencia codificante sin el codón de parada. Dicho de otro modo, de acuerdo con esta alternativa el iniciador de aguas abajo no debería ser complementario al codón de parada. El fragmento de DNA amplificado no contendrá por tanto un codón de parada y puede clonarse en el vector de clonación. Alternativamente, es también posible clonar una secuencia codificante con su codón de parada en el vector de clonación. El codón de parada puede delecionarse más tarde, v.g. utilizando endonucleasas específicas o por mutagenización.

El resultado de los pasos de clonación debería ser un marco de lectura continuo que codifique la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

Los elementos reguladores que son necesarios para obtener la expresión de la proteína de fusión puede ser cualesquiera elementos reguladores que impulsen la expresión en el sistema de expresión deseado. Si se pretende producir la proteína de fusión en células procariotas tales como Escherichia coli, es preferible utilizar un promotor bacteriano o de fago. Si se pretende expresar la proteína de fusión en células eucariotas, es preferible utilizar un promotor/intensificador eucariota o vírico. Si se pretende expresar la proteína de fusión utilizando un promotor de poxvirus (véase más adelante), es preferible utilizar un promotor poxvírico tal como el promotor 7.5 o el promotor ATI.

Como se ha reseñado anteriormente, la proteína de fusión puede comprender parejas de fusión que no son proteínas de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev y Nef. Así, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de otras proteínas o partes de las mismas. Ejemplos de otras proteínas son las proteínas Gag, Pol y Env de HIV. Como consecuencia, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender también las secuencias codificantes de una o más proteínas adicionales o partes de las mismas en el marco de lectura abierto que codifica al menos cuatro proteínas reguladoras/accesorias de HIV o derivados de las mismas.

En una realización adicional de la presente invención, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente casetes de expresión independientes que codifiquen proteínas adicionales que pueden contribuir a mejorar adicionalmente la respuesta inmunitaria contra el HIV. En una realización preferida, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente casetes de expresión que comprenden la secuencia codificante de al menos una proteína de HIV adicional seleccionada de Gag, Pol y Env o partes de las mismas. Todavía más preferiblemente, el ácido nucleico puede comprender además de la secuencia codificante de la proteína de fusión, las secuencias codificantes de todas las proteínas de HIV Gag, Pol y Env. El ácido nucleico es preferiblemente parte de un vector. El ácido nucleico puede ser también el genoma vírico o parte del mismo de un vector vírico, preferiblemente un vector de poxvirus tal como MVA. De este modo, es posible expresar a partir del vector poxvírico la proteína de fusión así como las proteínas de HIV adicionales, v.g., al menos una proteína de HIV adicional seleccionada de Gag, Pol y Env.

La invención se refiere adicionalmente a vectores que comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El término "vector" hace referencia a cualesquiera vectores conocidos por las personas expertas en la técnica. Un vector puede ser un vector plasmídico tal como pBR322 o un vector de la serie pUC. Más preferiblemente, el vector es un vector de virus. En el contexto de la presente invención, el término "vector vírico" o "vector de virus" hace referencia a un virus infeccioso y/o atenuado que comprende un genoma vírico. En este caso, el ácido nucleico de la presente invención es parte del genoma vírico del vector vírico respectivo y/o constituye el genoma vírico. Los vectores recombinantes pueden utilizarse para la infección de células y líneas de células, en particular para la infección de animales vivos, con inclusión de humanos. Vectores de virus típicos de acuerdo con la presente invención son vectores de adenovirus, vectores de retrovirus o vectores basados en el virus 2 adeno-asociado (AAV2). Son muy preferidos los vectores poxvíricos. El poxvirus puede ser preferiblemente un poxvirus de canario, un poxvirus de ave de corral o un virus vaccinia. Es más preferido el virus vaccinia Ankara modificado (MVA) (Sutter, G. et al., [1994], Vaccine 12: 1032-40). Una cepa de MVA típica es MVA 575 que ha sido depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures bajo el número de depósito ECACC V00120707. Es muy preferida la cepa MVA-BN o un derivado de la misma, que ha sido descrito en la solicitud PCT PCT/EP01/13628 presentada en la Oficina Europea de Patentes en fecha 22 de noviembre de 2001, titulada "Modified Vaccinia Ankara Virus Variant". MVA-BN ha sido depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures con el número de depósito ECACC V00083008. Por la utilización de MVA-BN o un derivado de la misma, se ha resuelto el problema técnico adicional de proporcionar una vacuna de virus particularmente segura contra HIV, dado que el vector vírico de MVA-BN es un virus extremadamente atenuado, que se deriva del virus Vaccinia Ankara Modificado y que se caracteriza por la pérdida de su capacidad para replicarse reproductivamente en células humanas. MVA-BN es más segura que cualesquiera otras cepas de virus vaccinia conocidas debido a la falta de replicación en humanos. En una realización preferida, la invención concierne como vector vírico que contiene el DNA de acuerdo con la presente invención a MVA-BN y derivados de MVA-BN. Las características de MVA-BN, la descripción de los ensayos biológicos que permiten evaluar si un MVA es MVA-BN o un derivado del mismo y los métodos que permiten obtener MVA-BN o un derivado del mismo se describen en la solicitud PCT PCT/EP01/13628 arriba citada, que se incorpora en esta memoria por referencia.

Así, de acuerdo con estas realizaciones, la invención concierne preferiblemente a un MVA recombinante, tal como MVA-BN, que comprende en el genoma vírico una casete de expresión que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

Métodos para insertar el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en el genoma vírico y métodos para obtener virus recombinantes son conocidos por las personas expertas en la técnica.

En un virus vaccinia recombinante, la expresión del DNA de acuerdo con la presente invención está preferiblemente, pero no de modo exclusivo, bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus, más preferiblemente de un promotor del virus vaccinia. La inserción del DNA de acuerdo con la presente invención tiene lugar preferiblemente en una región no esencial del genoma vírico. En otra realización preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico heterólogo se inserta en un sitio de deleción existente naturalmente del genoma poxviríco (descrito en el documento PCT/EP96/02926). Sin embargo, la naturaleza del sitio de inserción no es crítica para la presente invención con tal que se obtenga un virus Vaccinia recombinante. Así, las personas expertas en la técnica pueden idear fácilmente sitios de inserción adicionales adecuados.

Preferiblemente, el vector vírico, en particular el vector de poxvirus, puede comprender genes retrovíricos adicionales seleccionados de los genes Gag, Pol y Env de HIV en el genoma vírico, además de la secuencia codificante para la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente, el vector vírico, en particular el vector poxvírico, puede comprender todos los genes de HIV que codifican Gag, Pol y Env además de la secuencia codificante para la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. Ciertos genes adicionales pudieran haber sido insertados con el mismo ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con esta realización, todos los genes de HIV pudieran estar localizados en el mismo sitio de inserción en el genoma vírico. En una realización alternativa, los genes adicionales están insertados en localizaciones diferentes del genoma vírico.

En una realización preferida, la presente invención concierne al ácido nucleico, el vector o la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención como una vacuna para la profilaxis al menos parcial contra infecciones por HIV y SIDA. Una "vacuna" es un compuesto, a saber, un ácido nucleico, una proteína de fusión, un vector o un virus que induce una respuesta inmunitaria específica.

De acuerdo con una alternativa de esta realización, la "vacuna" de acuerdo con la presente invención está basada en la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

En una realización preferida, se utiliza como vacuna el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en particular DNA. Es sabido por las personas expertas en la técnica que la administración de DNA desnudo que aloja una casete de expresión eucariota como en la presente invención, en particular la inyección intramuscular de DNA, conduce a la expresión de la proteína codificada por la casete de expresión. La proteína se expone al sistema inmunitario y se genera una respuesta inmunitaria específica. En una realización alternativa, la vacunación se realiza por administración de un vector de acuerdo con la presente invención, en particular un vector vírico, más preferiblemente un vector de poxvirus, y muy preferiblemente un vector del virus vaccinia, v.g. un vector MVA.

Para la preparación de una vacuna basada en el virus vaccinia, el virus de acuerdo con la invención se convierte en una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para vacunación contra la viruela (como ha sido descrito por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado se guarda a -80ºC con un título de 5x10^{8} TCID_{50}/ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM, de pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, v.g., se liofilizan 10^{2}-10^{8} partículas del virus en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2% y albúmina humana al 1% en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden producirse por liofilización gradual del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (v.g. seroalbúmina humana) adecuados para administración in vivo. La ampolla de vidrio se sella luego y puede guardarse entre 4ºC y la temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, mientras que no exista necesidad alguna, la ampolla se guarda preferiblemente a temperaturas inferiores a -20ºC. Para la vacunación, el liofilizado puede disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica o tampón Tris, y administrarse sistémica o localmente, v.g. por vía parenteral, intramuscular o cualquier otra ruta de administración conocida por el profesional sanitario experto. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la técnica de manera conocida. Es muy preferida para vectores poxvíricos la administración subcutánea o
intramuscular.

Si la vacuna es un vector MVA-BN o derivado del mismo que comprende un DNA de acuerdo con la presente invención, una realización particular de la presente invención concierne a la administración de la vacuna en cantidades terapéuticamente eficaces en una primera inoculación ("inoculación de sensibilización") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo").

Si la vacuna es un vector MVA-BN o derivado del mismo que comprende un DNA de acuerdo con la presente invención, una realización particular de la presente invención concierne a un kit para vacunación que comprende un vector de virus MVA-BN de acuerdo con la presente invención para la primera vacunación ("sensibilización") en un primer vial/envase y para una segunda vacunación ("refuerzo") en un segundo vial/envase.

Así, la invención concierne en las realizaciones de vacuna a una vacuna que comprende un ácido nucleico, un vector o una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y al uso de dicho ácido nucleico, vector o proteína para la preparación de una vacuna.

De acuerdo con una realización adicional, la invención concierne a un método para proteger un animal, con inclusión de un humano, contra una infección por HIV por administración a un animal, con inclusión de un humano, que se encuentra en necesidad de ello, de una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o un vector de acuerdo con la presente invención.

Además, la invención concierne a un método de producción de una proteína de acuerdo con la presente invención, que comprende los pasos de (i) transfectar una célula hospedadora con un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención o (ii) infectar una célula hospedadora con un vector vírico de acuerdo con la presente invención, (iii) expresar la proteína de fusión en la célula hospedadora transfectada del paso (i) o la célula hospedadora infectada del paso (ii), y (iv) recuperar la proteína de fusión.

La invención se refiere adicionalmente a células hospedadoras transfectadas con un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención o infectadas con un vector vírico de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con una realización alternativa, la proteína de fusión puede comprender al menos tres proteínas de HIV diferentes seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx y Tat. La proteína de fusión puede comprender preferiblemente 4, 5 o la totalidad de dichas proteínas de HIV. Una proteína de fusión típica de acuerdo con esta realización comprende la secuencia de aminoácidos de las proteínas de HIV Vpr, Vif, Vpu, Rev y Tat o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas. Como se ha indicado anteriormente, el orden de las proteínas de HIV en la proteína de fusión no es crítico. Todas las realizaciones preferidas que se especifican anteriormente son aplicables también para esta realización alternativa.

Breve Descripción de las Figuras

Fig. 1

Representación esquemática de la reasociación de oligonucleótidos

La imagen muestra la reasociación de cuatro oligonucleótidos. Los oligonucleótidos son monocatenarios y pueden reasociarse por extremos complementarios. Las lagunas se rellenan con una polimerasa, que exhibe una actividad de corrección de lectura (v.g. polimerasa Pfx).

Fig. 2

Representación esquemática de la reasociación de cuatro genes de la mancha ("blob")

El gen vif exhibe una secuencia solapante con el fragmento vpr, y el fragmento codificante vpu exhibe una secuencia solapante con el gen rev (gris). Los fragmentos PCR se desnaturalizan y los extremos complementarios solapantes se hibridan. Las lagunas resultantes se rellenan utilizando polimerasa Pfx. El fragmento vif-vpr se fusiona a una secuencia solapante del fragmento vpu-rev, que se utiliza de nuevo para fusión.

Fig. 3

Estrategia de clonación de la secuencia codificante de una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención en un vector de recombinación para inserción de genes extraños en el genoma de MVA

La región codificante de la poliproteína fusionada vif, vpr, vpu y rev se amplificó con iniciadores que comprendían un sitio de rescisión ClaI y ApaI. Este producto PCR se clonó en el vector pBNX65 cortado con ClaI/ApaI, que contiene el promotor ATI de poxvirus. La región codificante de tat se amplificó por PCR con iniciadores que contenían un sitio de restricción Acc65I y se ligó al pBNX65+vif-rev linealizado con Acc65I. La casete de expresión resultante (promotor ATI + secuencia codificante de una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención) se aisló por restricción con PacI y se insertó en el vector de recombinación para inserción de genes extraños en la región intergénica I4L del genoma de MVA (pBNX39). pBNX39 contiene secuencias homólogas a las secuencias flanqueantes del sitio de inserción del genoma de MVA (F1 I4L y F2 I4L ). Para selección de virus recombinantes después de recombinación homóloga del genoma de MVA y pBNX39, el vector contiene adicionalmente el gen gpt de E. coli (gen de la fosforribosiltransferasa). Después de purificación de los virus recombinantes, la casete de selección se deleciona por recombinación homóloga entre Flank 1 y una secuencia de repetición de flank 1
(F1rpt).

Fig. 4

Representación esquemática del genoma de MVA

MVA contiene un genoma lineal, que exhibe fragmentos característicos después de restricción con Hind III (A-O). La región no funcional entre los genes I4L e I5L está localizada en el fragmento I. La designación de genes extraños utilizando pBNX39 ocurre en la posición 56767-56768.

Ejemplos Generación de un DNA que codifica una proteína de fusión Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat de HIV

Los genes individuales del genoma de HIV se prepararon por PCR de DNA genómico utilizando protocolos estándar de PCR o sintéticamente por una técnica que está basada en la reasociación de oligonucleótidos por la vía de secuencias solapantes y rellenado de las lagunas monocatenarias resultantes.

Para la generación basada en oligonucleótidos de regiones de genes codificantes, que deben insertarse en el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, se diseñaron oligonucleótidos 40-meros con solapamientos de 15 pb. La secuencia de los oligonucleótidos está basada en el mapa genómico del aislado HXB2R de HIV1, que se deriva de la cepa IIIB. Los oligonucleótidos para la reacción de reasociación o la PCR para aislamiento de la secuencia requerida se diseñaron de tal manera, que en la región codificante resultante se delecionaron los codones de parada para terminación de la traducción. Se sintetizó el gen tat utilizando oligonucleótidos que contenían un codón de Parada, dado que este gen debía insertarse en la última posición del ácido nucleico codificante de la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y por consiguiente debería contener un triplete de parada para una terminación correcta de la traducción de la poliproteína.

Para la reacción de reasociación de oligonucleótidos, se realizaron 10 ciclos de una relación de polimerasa Pfx de dos pasos (Gibco-BRL) (desnaturalización a 95ºC y reasociación/extensión a 68ºC). Durante dicha reacción, las secuencias solapantes de los oligonucleótidos se reasociaron y las lagunas se rellenaron por medio de la polimerasa de corrección de lectura Pfx (Fig. 1).

Para la síntesis de la región codificante de vif, el primer gen codificado en la secuencia de nucleótidos que codificaba la proteína de fusión, se realizó una PCR utilizando cDNA genómico de HIV. La PCR se realizó de tal manera que la región codificante de vif se fusionó a los primeros 15 pb del gen vpr siguiente para la reasociación subsiguiente de vif y vpr. La región codificante de Vpr, que abarca los pares de bases 5559-5847 del genoma de HIV HXB2R, se preparó por reasociación de 10 oligonucleótidos. Se rellenaron las lagunas resultantes y, después de una PCR subsiguiente para amplificación, el producto contenía la región codificante de vpr fusionada a las regiones flanqueantes para vif y vpu, que debía insertarse después de la región codificante de vpr.

La región codificante de Vpu se amplificó por PCR del mismo cDNA utilizado para la síntesis de vif, y el producto resultante contenía las regiones flanqueantes para fusión con vpr y rev.

La región codificante de rev se sintetizó por reasociación de 14 oligonucleótidos, que abarcan la región de los pares de bases 5970-6045 y 8379-8650 del genoma de HIV HXB2R y solapamientos de 15 pares de bases para reasociación con vpu y tat.

La región codificante de tat se creó utilizando 10 oligonucleótidos, que abarcan los pares de bases 5831-6045 y 8379-8466 del genoma de HIV HXB2R.

La región codificante de vif y la región codificante de vpr, así como la región codificante de vpu y la región codificante de rev se fusionaron por reasociación de los dos fragmentos por sus solapamientos con una reacción de polimerasa Pfx de dos pasos (Fig. 2). Después de amplificación adicional por PCR de los productos de fusión, los fragmentos se purificaron y se ligaron unos a otros por el solapamiento de vpr y vpu (Fig. 2). Después de amplificación por PCR del producto resultante (secuencias codificantes para vif-vpr-vpu-rev), se fusionó la región codificante de tat por clonación del fragmento vif-vpr-vpu-rev y tat en sitios de clonación adyacentes en un vector pBluescriptKS+ que contenía el promotor ATI de poxvirus (Fig. 3, pBNX65). La casete de expresión completa se aisló luego por restricción con PacI y se insertó en pBNX39 (Fig. 3). pBNX39 contiene secuencias homólogas al genoma de MVA, lo cual permite la inserción en una región no codificante (I4L) del genoma (Fig. 4) por recombinación homóloga.

Claims

1. Proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión y en donde un derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína de HIV es una secuencia de aminoácidos que exhibe una homología de al menos 50%, cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína de HIV respectiva en el aislado HXB2R de HIV-1 (número de acceso a Genebank K03455).

2. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual la homología es al menos 80%.

3. La proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión y en donde el derivado de una proteína de HIV individual que forma parte de la proteína de fusión es una secuencia de aminoácidos en la cual no más de 10 aminoácidos están delecionados, insertados o sustituidos para obtener una proteína de HIV con actividad reducida o sin actividad alguna.

4. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual las proteínas de HIV se seleccionan de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev y Tat.

5. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de las proteínas de HIV Vif, Vpr, Vpu, Rev y Tat o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas.

6. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la cual las secuencias de aminoácidos de al menos dos de las proteínas de HIV están fusionadas una a otra sin aminoácidos adicionales.

7. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la cual las secuencias de aminoácidos de al menos dos de las proteínas de HIV están separadas por al menos un aminoácido adicional.

8. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual la secuencia de aminoácidos de al menos una de las proteínas de HIV está fusionada a una pareja de fusión que no es una proteína de HIV seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat y Nef.

9. Ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual el ácido nucleico es DNA.

11. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual la expresión de la proteína de fusión a partir del DNA está controlada por elementos reguladores seleccionados de promotores eucariotas, procariotas y víricos.

12. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual el promotor vírico es un promotor de poxvirus.

13. Ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el cual el ácido nucleico comprende adicionalmente la secuencia codificante para al menos una proteína de HIV adicional seleccionada de Gag, Pol y Env.

14. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual el ácido nucleico comprende la secuencia codificante para las proteínas de HIV Gag, Pol y Env.

15. Vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.

16. Vector de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual el vector es un vector vírico.

17. Vector de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el vector vírico es un vector de poxvirus, en particular un vector del Virus Vaccinia.

18. Vector de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual el vector del Virus Vaccinia es Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA).

19. Vector de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual MVA se selecciona de MVA-575 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) bajo el número de depósito V00120707 y MVA-BN depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008.

20. Método de producción de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende los pasos de

-: transfectar una célula hospedadora con un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 15 o

-: infectar una célula hospedadora con un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19,

-: expresar la proteína de fusión en la célula hospedadora transfectada o la célula hospedadora infectada, y

-: recuperar la proteína de fusión.

21. Célula hospedadora transfectada con un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o un vector de acuerdo con la reivindicación 15 o infectada con un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

22. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 como medicamento.

23. Proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 como vacuna.

24. Vacuna que comprende una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19.

25. Uso de una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 para la preparación de una vacuna.