ES2253675T3 - Proteina de fusion de proteinas reguladoras/accesorias de hiv. - Google Patents
Proteina de fusion de proteinas reguladoras/accesorias de hiv.Info
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Abstract
¿ Proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión y en donde un derivado de la secuencia de aminoácidos de una proteína de HIV es una secuencia de aminoácidos que exhibe una homología de al menos 50%, cuando la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína de HIV respectiva en el aislado HXB2R de HIV¿1 (número de acceso a Genebank K03455).
Description
Proteína de fusión de proteínas
reguladoras/accesorias de HIV.
La invención se refiere a proteínas de fusión que
comprenden la secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas
de HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o
derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas
proteínas, en donde la proteína de fusión no se procesa a proteínas
de HIV individuales que tengan los términos N y C naturales. La
invención concierne adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican
dichas proteínas, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y
métodos para producir dichas proteínas. La proteína de fusión, los
ácidos nucleicos y los vectores pueden utilizarse como vacunas para
la profilaxis al menos parcial contra las infecciones por HIV.
El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) es
el agente causal del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).
Al igual que todos los retrovirus, el genoma del virus codifica las
proteínas Gag, Pol y Env. Adicionalmente, el genoma vírico codifica
proteínas reguladoras adicionales, a saber Tat y Rev, así como
proteínas accesorias, a saber Vpr, Vpx, Vpu, Vif y Nef.
A pesar de los esfuerzos de la sanidad pública
para reprimir la propagación de la epidemia de SIDA, el número de
nuevas infecciones está aumentando todavía. La Organización Mundial
de la Salud estimaba la epidemia global en 36,1 millones de
individuos infectados a finales del año 2000; 50% más que lo que se
había predicho sobre la base de los datos disponibles diez años
antes (WHO & UNAIDS, UNAIDS, 2000). Globalmente, el número de
nuevas infecciones por HIV-1 en el año 2000 se
estima en 5,3 millones.
Dada la propagación continua de la epidemia,
existe todavía necesidad de proporcionar una vacuna eficaz a la
clínica. Se han desarrollado actualmente varias estrategias
diferentes de suministro de vacunas HIV-1 tales como
nuevos vectores o sistemas adyuvantes, y se han evaluado en
diferentes situaciones pre-clínicas así como en
pruebas clínicas. La primera vacuna candidato que entró en una
prueba clínica de fase III está basada en la proteína gp 120 de la
envoltura en alumbre (Francis et al., AIDS Res. Hum.
Retroviruses 1998; 14 (Suppl 3)(5): S325-31). Las
pruebas de fase III se han iniciado, aunque la vacuna no demostró
tener demasiado éxito en la prueba anterior de fase II.
Después de muchos años de esfuerzos profilácticos
en vacunación basados en antígenos de la envoltura, los esfuerzos
más recientes se han concentrado en el uso de proteínas reguladoras
tales como Tat, Nef y Rev como antígenos de vacuna candidatos. El
uso de estos antígenos reguladores en situaciones terapéuticas ha
sido continuo durante varios años (Miller et al., Nature
Medicine 1997, 3, 389-94, Calarota et al.
Lancet 1998, 351, 1320-5, Ayyavoo et al.,
AIDS, 2000, 14, 1-9). Más recientemente, el uso de
estos antígenos en estudios profilácticos de vacunación en pequeñas
pruebas pre-clínicas se ha revelado prometedor. Se
demostró que el uso de Tat y Rev, o Tat sola como candidato de
vacuna profiláctica, reprimía SIVmac (Osterhaus et al.,
Vaccine 1999, 17, 2713-4). Además, existen
indicaciones de que CTL dirigidas hacia las proteínas reguladoras
precoces del virus son importantes para eliminar células infectadas
antes que alcancen su nivel elevado de producción de viriones
maduros (van Baalen et al., J. Gen. Virol. 1997, 78,
1913-8; Addo et al., PNAS, 2001, 98,
1781-6).
Aunque las proteínas reguladoras/accesorias de
HIV inducen una respuesta inmunitaria eficaz, la mayoría, si no la
totalidad de ellas, tienen efectos secundarios graves, que limitan
hasta ahora su uso como vacuna: Se ha demostrado que Nef, Tat y Vpu
juegan un papel en la regulación decreciente de la expresión de CD4+
y/o MHC clase I (Howcroft et al., Science, 1993, 260,
1320-2; Schwartz et al., Nature Med. 1996, 2,
338-42; Swann et al., Virology, 2001, 282,
267-77; Janvier et al., J. Virol., 2001, 78,
3971-6; Weissmann et al., PNAS 1998, 95,
11601-6). Se sabe que Tat media la inmunosupresión
aguda in vivo (Cohen et al., PNAS, 1999, 96,
10842-10847). Se han descrito también efectos
inmunosupresores para Vpr (Ayyavoo et al., Nature Med., 1997,
3: 1117-1123). Se ha descrito que Vpr y Vpx tienen
efectos citostáticos y citotóxicos diferenciales en células de
levadura (Zhang et al., Virology, 1997, 230,
103-12). Así, la mayoría si no todas las proteínas
accesorias/reguladoras de HIV parecen tener propiedades funcionales
que no son deseables en una formulación de vacuna.
Intentos para reducir los efectos perjudiciales
de las proteínas de HIV se describen en el documento WO 02/06303. En
particular, WO 02/06303 describe una proteína de fusión que incluye
las secuencias de aminoácidos de Vif, Vpu y Nef de HIV, en donde las
proteínas componentes son contiguas a otra proteína componente o
están separadas por proteínas no componentes tales comos secuencias
de aminoácidos, que proporcionan sitios de escisión proteolítica. Se
expone que es preferible utilizar aquellas proteínas de fusión que
comprenden sitios de escisión proteolítica entre las proteínas
componentes. Dado que las proteínas componentes están separadas por
sitios de escisión proteolítica, se producen proteínas de HIV
nativas que se sabe son perjudiciales. Para reducir cualesquiera
efectos perjudiciales de las proteínas de HIV que resultan de la
escisión de la proteína de fusión, el documento WO 02/06303 sugiere
la utilización de proteínas atenuadas, Así, el documento WO 02/06303
propugna la utilización de una proteína de fusión que comprende las
proteínas Vif, Vpr y Nef de HIV, en donde los sitios de escisión
están insertados entre las proteínas de HIV y en donde las proteínas
de HIV son proteínas atenuadas. Sin embargo, la desventaja de las
proteínas atenuadas es que la secuencia de aminoácidos de la
proteína atenuada difiere de la secuencia de aminoácidos de la
proteína nativa por lo que una inmunización con la proteína atenuada
puede conducir a una respuesta inmunitaria que reconoce sólo
débilmente la proteína nativa, o que incluso no reconoce la proteína
nativa en absoluto.
Fue el objeto de la presente invención
proporcionar una vacuna que permita la generación de una respuesta
inmunitaria eficaz, en particular una respuesta eficaz a las células
T citotóxicas, contra varias o la totalidad de las proteínas
reguladoras/accesorias de HIV, en donde las proteínas
reguladoras/accesorias de HIV en la vacuna o producidas por la
vacuna son menos funcionales que las proteínas
reguladoras/accesorias nativas individuales, de tal modo que se
reduce el riesgo de que las proteínas accesorias/reguladoras en la
vacuna ejerzan efectos secundarios no deseados y en donde las
proteínas de HIV menos activas inducen una respuesta inmunitaria
similar a la de las proteínas de HIV nativas.
El objeto se ha conseguido por la provisión de
una proteína de fusión que comprende la secuencia de amino-ácidos de
al menos cuatro proteínas de HIV diferentes seleccionadas de Vif,
Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de
aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína
de fusión no se procesa a proteínas individuales de HIV que tengan
los términos N y C naturales. En particular, el objeto de la
presente invención se ha conseguido por ácidos nucleicos y vectores
que codifican dichas proteínas de fusión.
Si la proteína de fusión se produce en células
animales, con inclusión de células humanas, la proteína de fusión no
es escindida por las proteasas celulares de tal manera que se
obtengan proteínas accesorias/reguladoras con los términos N y C
nativos. Debido al hecho de que una proteína de HIV que forma parte
de una proteína de fusión tiene una estructura secundaria/terciaria
alterada en comparación con la proteína de HIV individual, la
proteína de HIV en la proteína de fusión es menos funcional que la
proteína individual, si no totalmente disfuncional. Una proteína
reguladora/accesoria que es menos funcional o incluso que no es
funcional en absoluto no produce los efectos secundarios indeseables
de la proteína de HIV en su conformación natural. En la medida en
que está implicada la inmunogenicidad, no existe diferencia
sustancial alguna cuando se compara la inmunogenicidad de la
proteína de fusión con la inmunogenicidad de las proteínas
reguladoras/accesorias de HIV individuales que forman la proteína de
fusión. En particular, no existe ninguna diferencia sustancial con
respecto a la respuesta de las células T citotóxicas (CTL) dado que
los epítopes que se presentan al sistema inmunitario son idénticos.
Las mismas consideraciones son aplicables también si la proteína de
fusión se administra al paciente.
En el contexto de la presente invención, el
término "HIV" hace referencia a cualquier grupo, subtipo
("clade"), cepa o aislado de HIV conocido por las personas
expertas en la técnica. En particular, HIV puede ser
HIV-1 o HIV-2. HIV-1
ha sido clasificado en nueve subtipos (clades A a I), en tanto que
HIV-2 ha sido clasificado en cinco subtipos (A a E),
todos los cuales están abarcados por el alcance de la presente
invención. Los clades más preferidos de HIV de acuerdo con la
presente invención son los clades A, B y C de HIV-1.
Sin embargo, la invención no está restringida a estas clades más
preferidas.
Las secuencias proteínicas de las proteínas
reguladoras de HIV Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, Vpx y Nef son conocidas
por las personas expertas en la técnica. A modo de ejemplo y sin
quedar restringido a dichas realizaciones como se hace referencia a
las diversas secuencias que se describen en la base de datos de
Genebank, en particular a la secuencia del aislado HXB2R de
HIV-1 que tiene el número de acceso a Genebank
KO3455. En esta entrada de Genebank, se especifican las secuencias
de los diversos genes de HIV-1 y de las proteínas
codificadas por dichos genes.
Preferiblemente, las proteínas de HIV que forman
la proteína de fusión se derivan de la misma clade. De acuerdo con
una realización alternativa, las proteínas de HIV que forman la
proteína de fusión se derivan de dos o más clades. Es posible
también que una o más de las proteínas de HIV que forman la proteína
de fusión sean proteínas de HIV-1 y que una o más de
las proteínas de HIV que forman la proteína de fusión sean proteínas
de HIV-2.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de
HIV que forman la proteína de fusión son preferiblemente secuencias
que están codificadas por aislados de HIV conocidos; es decir, la
secuencia de aminoácidos de las proteínas de HIV en la proteína de
fusión es idéntica a las secuencias de aminoácidos de las proteínas
correspondientes tal como son codificadas por aislados de HIV
existentes naturalmente. En una alternativa, la secuencia de
aminoácidos de una o más proteínas de HIV en la proteína de fusión
puede ser una secuencia de consenso, es decir una secuencia que
puede no encontrarse como tal en un aislado de HIV conocido, pero
que exhibe una homología óptima - en particular con respecto a
epítopes de CTL - con varios o todos los aislados de HIV conocidos.
Las personas expertas en la técnica conocen algoritmos de ordenador
para calcular una secuencia de consenso.
En una realización alternativa, la proteína de
fusión puede comprender derivados de la secuencia de aminoácidos de
una o más proteínas de HIV que son parte de la proteína de fusión.
La expresión "derivado de la secuencia de aminoácidos de una
proteína de HIV", tal como se utiliza en la presente memoria
descriptiva, se refiere a proteínas de HIV que tienen una secuencia
de aminoácidos alterada comparada con la proteína de HIV
correspondiente existente naturalmente. Una secuencia de aminoácidos
alterada puede ser una secuencia en la cual uno o más aminoácidos de
la secuencia de la proteína de HIV están sustituidos, insertados o
delecionados. Más particularmente, un "derivado de la secuencia de
aminoácidos de una proteína de HIV" es una secuencia de
aminoácidos que exhibe una homología de al menos 50%, más
preferiblemente de al menos 70%, todavía más preferiblemente de al
menos 80%, muy preferiblemente de al menos 90% cuando la parte
correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de
fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína de
HIV respectiva de aislados de HIV conocidos. Se considera que una
secuencia de aminoácidos tiene la homología de secuencia arriba
indicada aun cuando la homología se encuentre para la proteína
correspondiente de un solo aislado de HIV, con indiferencia del
hecho de que pudieran existir proteínas correspondientes en otros
aislados que exhiban una homología menor. A modo de ejemplo, si un
derivado de Vpr en la proteína de fusión exhibe una homología de 95%
con la secuencia Vpr de un solo aislado de HIV, pero sólo una
homología de 50-70% para "todos" los demás
aislados de HIV, se considera que la homología de dicho derivado de
Vpr es de al menos 90%.
Se ha señalado anteriormente que las proteínas de
HIV en la proteína de fusión tienen una actividad reducida, o no
tienen incluso actividad alguna en absoluto, en comparación con las
proteínas individuales, dado que la conformación de las proteínas en
la proteína de fusión es diferente a la conformación natural de las
proteínas biológicamente activas. Sin embargo, pudiera ser deseable
deducir ulteriormente el riesgo de que las proteínas de HIV en la
proteína de fusión sean biológicamente activas. A este fin,
"derivados" particularmente preferidos de una proteína de HIV
individual que forma parte de una proteína de fusión son derivados
de secuencias de aminoácidos en los cuales varios aminoácidos están
delecionados, insertados o sustituidos, más preferiblemente no más
de 10 aminoácidos, muy preferiblemente no más de 5 aminoácidos, para
obtener una proteína de HIV con actividad reducida o sin actividad
alguna en absoluto. Las personas expertas en la técnica conocen
ensayos concernientes al modo de determinar si una proteína de HIV
tiene actividad biológica reducida:
El mecanismo molecular de la proteína Vif, que es
esencial para la replicación vírica in vivo, sigue siendo
desconocido, pero Vif posee una tendencia acusada hacia la
autoasociación. Se ha demostrado que esta multimerización es
importante para la función de Vif en el ciclo vital del virus (Yang
S. et al., J Biol Chem 2001; 276: 4889-4893).
Adicionalmente, se ha demostrado que Vif se asocia específicamente
con el complejo de nucleoproteínas vírico, y esto pudiera ser
funcionalmente importante (Khan M.A. et al., J Virol. 2001;
75(16): 7252-65). Así, una proteína vif con
actividad reducida exhibe una multimerización y/o asociación
reducidas con el complejo de nucleoproteínas.
La proteína Vpr juega un papel importante en el
ciclo vital del virus. Vpr regula la importación nuclear del
complejo de preintegración vírico y facilita la infección de las
células que no se dividen tales como macrófagos (Agostini et
al., AIDS Res Hum Retroviruses 2002; 18(4):
283-8). Adicionalmente, aquélla tiene actividad de
trans-activación mediada por interacción con la LTR
(Vanitharani R. et al., Virology 2001; 289(2):
334-42). Así, una vpr con actividad reducida exhibe
una transactivación y/o interacción disminuidas o incluso nulas con
el complejo de preintegración
vírico.
vírico.
Vpx, que es altamente homóloga a Vpr, es crítica
también para la replicación vírica eficiente en células que no se
dividen. Vpx está empaquetada en partículas de virus por una
interacción con el dominio p6 de la poliproteína precursora gag. Al
igual de Vpr, Vpx está involucrada en el transporte del complejo de
preintegración al núcleo (Mahalingam et al., J. Virol 2001;
75(1): 362-74). Así, una Vpx con actividad
reducida tiene una capacidad disminuida para asociarse al complejo
de preintegración por la vía del precursor gag.
Se sabe que la proteína Vpu interacciona con la
cola citoplásmica de CD4 y causa la degradación de CD4 (Bour et
al., Virology 1995; 69(3): 1510-20). Por
esta razón, la Vpu con actividad reducida tiene una capacidad
reducida para desencadenar la degradación de CD4.
La actividad biológica relevante de la bien
caracterizada proteína Tat es la transactivación de la transcripción
por interacción con el elemento de respuesta a la transactivación
(TAR). Se ha demostrado que Tat es capaz de transactivar promotores
heterólogos que carecen de secuencias de HIV distintas de TAR (Han
P. et al., Nucleic Acid Res 1991; 19(25):
7225-9). Así, una proteína tat con actividad
reducida exhibe una transactivación reducida de los promotores por
la vía del elemento TAR.
La proteína Nef es esencial para la replicación
vírica responsable del progreso de la enfermedad por inducción de la
regulación decreciente de la superficie celular de CD4 (Lou T et
al., J Biomed Sci 1997; 4(4): 132). Esta regulación
decreciente se inicia por interacción directa entre CD4 y Nef
(Preusser A. et al., Biochem Biophys Res Commun 2002;
292(3): 734-40). Así, la proteína Nef con
función reducida exhibe una interacción reducida con CD4.
La función relevante de Rev es la transactivación
posterior a la transcripción iniciada por interacción con el
elemento de respuesta Rev (RRE) del RNA vírico (Iwai et al.,
1992; Nucleic Acids Res 1992; 20(24):
6465-72). Así, una Rev con actividad reducida exhibe
una interacción reducida con el RRE.
Las proteínas de fusión de acuerdo con la
presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de al
menos cuatro proteínas de HIV diferentes seleccionadas de Vif, Vpr,
Vpu, Rev, Vpx, Tat y Nef. La proteína de fusión puede comprender
preferiblemente 5, 6 o la totalidad de dichas proteínas de HIV. El
orden de las proteínas de HIV en la proteína de fusión no es
crítico.
Una o más de las al menos cuatro proteínas de HIV
diferentes pueden estar comprendidas en la proteína de fusión en dos
o más copias. Así, a modo de ejemplo una proteína de fusión de
acuerdo con la presente invención puede comprender Vif, Vpr, Vpu y
dos copias de Rev. La secuencia de aminoácidos de las dos o más
copias de una proteína de HIV puede ser idéntica. Alternativamente,
la secuencia de aminoácidos de las copias puede ser diferente, en
particular si se utilizan secuencias de proteína que se derivan de
cepas o clades de HIV diferentes (v.g., una copia de una
HIV-1 Rev y una copia de una HIV-2
Rev).
Las proteínas de HIV adyacentes en la proteína de
fusión pueden fusionarse sin aminoácidos adicionales o fusionarse de
tal manera que dos proteínas de HIV adyacentes en la proteína de
fusión están separadas por al menos un aminoácido adicional.
Asimismo, combinaciones de ambas están dentro del alcance de la
presente invención. A modo de ejemplo, en una proteína de fusión de
acuerdo con la presente invención que comprende la secuencia de
aminoácidos de cuatro proteínas de HIV, dos proteínas de HIV
adyacentes pueden estar enlazadas directamente una a otra, mientras
que las proteínas de HIV tercera y cuarta están enlazadas por
aminoácidos adicionales. El término "aminoácido adicional" en
el contexto de esta realización hace referencia a aminoácidos que no
se encuentran en esta posición en las proteínas de HIV existentes
naturalmente.
Así, la proteína de fusión de acuerdo con la
presente invención tiene preferiblemente la fórmula general
siguiente:
+P1- - -P2- - -P3- - -P4- - -P5*- - -P6*- - -P7*+
en la cual P1 a P7 son proteínas de
HIV diferentes seleccionadas de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev y Nef,
en donde la proteína de fusión comprende al menos cuatro de dichas
proteínas de HIV diferentes a saber P1 a P4 y opcionalmente una
(P5*), dos (P5*- - -P6*) o tres
(P5*- - -P6*- - -P7*) de dichas proteínas de
HIV adicionales. La abreviatura "- - -" representa
independientemente 0 a n aminoácidos adicionales. Cuando
"- - -" representa 0 aminoácidos, las proteínas de
HIV adyacentes están fusionadas directamente una a otra sin
aminoácidos adicionales. Cuando "- - -" representa
1 a n aminoácidos, las proteínas de HIV adyacentes están separadas
por 1 a n aminoácidos. El límite superior de los aminoácidos
adicionales, es decir el número entero n, depende del tamaño máximo
de la proteína de fusión que puede producirse o expresarse en las
células.
De acuerdo con una realización, todos los
"- - -" representan independientemente 0 a 20, más
preferiblemente 0 a 10, todavía más preferiblemente 0a 5 aminoácidos
adicionales.
De acuerdo con una realización alternativa, al
menos uno de "- - -" representa la secuencia de
aminoácidos de una proteína adicional o una parte de la misma, que
no es una proteína de HIV seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev,
Tat y Nef. Así, de acuerdo con esta realización alternativa, la
proteína adicional está flanqueada por proteínas de HIV
reguladoras/accesorias. La proteína adicional puede ser cualquier
proteína. Más preferiblemente, la proteína adicional comprende
epítopes adicionales que pueden ayudar a inducir una respuesta
inmunitaria mejora contra el HIV. Así, la proteína adicional puede
ser la proteína de HIV Env, Gag y/o Pol, o partes de las mismas. En
este contexto, el término "parte" de Env, Gag y Pol hace
referencia a un tramo de aminoácidos derivado de una de dichas
proteínas, que comprende al menos un epítope. Más preferiblemente,
el término "parte" hace referencia a al menos 10, todavía más
preferiblemente a al menos 20, aún más preferiblemente a al menos 50
aminoácidos de una de dichas proteínas. De acuerdo con una
realización afín, al menos uno de "- - -"
representa la secuencia de aminoácidos de una o más de las proteínas
P1 a P7 que forman parte de la proteína de fusión. Así, en este
caso, la proteína de fusión puede comprender una o más copias de una
o más de las proteínas que forman parte de la proteína de fusión.
Como se ha reseñado, las copias de las proteínas pueden tener o no
una secuencia de aminoácidos idén-
tica.
tica.
En la fórmula anterior, la abreviatura "+"
representa independientemente de 0 a n aminoácidos adicionales
terminales. Así, la proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención puede comprender o no aminoácidos adicionales en el
término C y/o N de la proteína. De acuerdo con una realización, al
menos uno de "+" representa la secuencia de aminoácidos de una
proteína adicional o parte de la misma, que no es una proteína de
HIV seleccionada de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat y Nef. Así, de
acuerdo con esta realización, la proteína de fusión comprende en su
término C y/o N una proteína adicional, que no es Vif, Vpr, Vpx,
Vpu, Rev, Tat o Nef. La proteína adicional puede ser cualquier
proteína. Más preferiblemente, la proteína adicional comprende
epítopes adicionales que pueden ayudar a inducir una mejor respuesta
inmunitaria contra HIV. V.g., la proteína adicional puede ser la
proteína Env, Gag y/o Pol de HIV o partes de las mismas. En este
contexto, el término "parte" de Env, Gag y Pol hace referencia
a un tramo de aminoácidos derivado de una de dichas proteínas, que
comprende al menos un epítope. Más preferiblemente, el término
"parte" hace referencia a al menos 10, todavía más
preferiblemente a al menos 20, y muy preferiblemente a al menos 50
aminoácidos de una de dichas proteínas.
De acuerdo con una realización alternativa, al
menos uno de "+" representa una secuencia de aminoácidos que
permite una detección o purificación fácil de la proteína de fusión.
Así, al menos uno de "+" pudiera ser por ejemplo un marcador
tal como un marcador His.
De acuerdo con la presente invención, la proteína
de fusión no se procesa para dar proteínas de HIV individuales que
tengan los términos N y C naturales. Más particularmente, la
proteína de fusión de acuerdo con la presente invención no se
procesa para dar proteínas de HIV individuales que tengan los
términos naturales N y C, cuando se expresa en células humanas. Las
personas expertas en la técnica conocen métodos concernientes al
modo de comprobar si una proteína de fusión, una vez expresada en
células humanas se procesa a proteínas de HIV individuales que
tengan los términos N y C naturales. En este contexto, se hace
referencia a Ayyavoo et al., AIDS 2000, 14,
1-9, en particular al experimento descrito en la
Figura 2 de dicha publicación. Resumidamente, una persona experta en
la técnica pudiera expresar fácilmente la proteína de fusión
respectiva en células humanas tales como células HeLa; las células
se lisan luego y los lisados celulares se someten a experimentos de
transferencia Western o ensayos de inmunoprecipitación con
anticuerpos específicos para las proteínas de HIV individuales que
forman juntas la proteína de fusión de HIV respectiva. Para una
proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, no se
detecta cantidad significativa alguna de
proteínas de HIV cuyo tamaño corresponde al tamaño de una proteína individual reguladora/accesoria de HIV.
proteínas de HIV cuyo tamaño corresponde al tamaño de una proteína individual reguladora/accesoria de HIV.
Con objeto de asegurar que la proteína de fusión
de acuerdo con la presente invención no se procesa a proteínas de
HIV individuales que tengan los términos N y C naturales, la
proteína de fusión no debería contener secuencias de escisión
específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la
generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C
naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de
HIV que forman la proteína de fusión. Así, la secuencia de
aminoácidos "- - -", tal como se abrevia en la
fórmula general anterior, no contiene secuencias de escisión
específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la
generación de proteínas de HIV que tuvieran los términos N y C
naturales. En particular, la proteína de fusión no contiene la
secuencia de escisión REKRAVVG (código de aminoácidos de una sola
letra) entre las secuencias de aminoácidos de las diferentes
proteínas de HIV que forman la proteína de fusión. Secuencias de
escisión adicionales para proteasas celulares son conocidas por las
personas expertas en la técnica. Así, las personas expertas en la
técnica pueden evitar fácilmente la inclusión de secuencias de
escisión para proteasas (celulares) que pudieran conducir a
proteínas de HIV individuales que tuvieran términos N y C naturales.
Un ejemplo de la secuencia de escisión de una cisteinproteasa es
Ile/Leu-X-Thr-X-Gly.
Las proteínas de acuerdo con la presente
invención no comprenden secuencias de escisión específicas que
conduzcan a proteínas de HIV que tengan ambos términos N y C
nativos. Sin embargo, esto no excluye generalmente la presencia de
sitios de escisión para proteasas celulares entre las proteínas en
la proteína de fusión con tal que estos sitios de escisión no medien
la generación de proteínas de HIV que tengan a la vez un término N
natural y un término C natural. En particular, la secuencia de
aminoácidos "- - -" tal como se abrevia en la
fórmula general anterior puede comprender sitios de escisión para
las proteasas que están implicadas en la generación de péptidos
cortos presentados en MHCI o MHCII. De acuerdo con esta realización,
el resultado de la reacción de escisión es un tramo peptídico corto
que tiene preferiblemente menos de 20 aminoácidos, cuyo término N o
C puede corresponder al término N o C de una de las proteínas
accesorias/reguladoras de HIV. Sin embargo, estos péptidos cortos,
cuando se producen durante el proceso de presentación de antígenos,
no tienen ya la actividad de la proteína de HIV de la que se
derivan.
La invención se refiere adicionalmente a ácidos
nucleicos que codifican las proteínas de fusión arriba definidas de
acuerdo con la presente invención. El ácido nucleico puede ser DNA o
RNA. Preferiblemente, el ácido nucleico es DNA si se pretende
insertar el ácido nucleico en células humanas utilizando un vector
de DNA tal como un plásmido o un vector basado en un virus de
DNA.
Las personas expertas en la técnica conocen
métodos concernientes al modo de construir un ácido nucleico que
codifique la proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención. Sin ligarse a los métodos que siguen, las personas
expertas en la técnica pueden partir de un clon de HIV genómico, de
un clon de HIV subgenómico o de cualquier material inicial, tal como
plásmidos, que comprenda la secuencia codificante de una o más de
las proteínas reguladoras/accesorias de HIV. Si la secuencia
codificante de una proteína reguladora/accesoria se encuentra en la
forma de un marco de lectura continuo, dicha secuencia codificante
puede aislarse por escisión del ácido nucleico que comprende dicha
secuencia codificante con enzimas de rescisión apropiadas. Los
fragmentos de DNA así obtenidos pueden utilizarse para clonación
ulterior. Alternativamente, las secuencias codificantes de una
proteína accesoria/reguladora pueden obtenerse utilizando los
métodos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con
iniciadores apropiados. Si las proteínas reguladoras/accesorias
están codificadas por más de un exón, como ocurre v.g. en el caso de
Tat y Rev, puede ser necesario clonar independientemente los
diferentes exones y fusionarlos para generar un marco de lectura
continua para la proteína reguladora/accesoria o utilizar
tecnología de transcripción inversa tal como
RT-PCR.
Puede proporcionarse también una secuencia
codificante por síntesis de genes, es decir por generación de un gen
utilizando una serie de oligonucleótidos complementarios y/o
solapantes.
Con objeto de obtener una proteína de fusión, el
ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión contiene
preferiblemente un marco de lectura continuo. Por consiguiente, los
codones de parada de todas menos la última secuencia que codifica
las proteínas de HIV o proteínas adicionales se someten
preferiblemente a mutación en un codón que codifica un aminoácido o
se delecionan completamente. Con preferencia, esto puede realizarse
fácilmente si se utilizan para la PCR iniciadores específicos que
amplifican la secuencia codificante sin el codón de parada. Dicho de
otro modo, de acuerdo con esta alternativa el iniciador de aguas
abajo no debería ser complementario al codón de parada. El
fragmento de DNA amplificado no contendrá por tanto un codón de
parada y puede clonarse en el vector de clonación. Alternativamente,
es también posible clonar una secuencia codificante con su codón de
parada en el vector de clonación. El codón de parada puede
delecionarse más tarde, v.g. utilizando endonucleasas específicas o
por mutagenización.
El resultado de los pasos de clonación debería
ser un marco de lectura continuo que codifique la proteína de fusión
de acuerdo con la presente invención.
Los elementos reguladores que son necesarios para
obtener la expresión de la proteína de fusión puede ser cualesquiera
elementos reguladores que impulsen la expresión en el sistema de
expresión deseado. Si se pretende producir la proteína de fusión en
células procariotas tales como Escherichia coli, es preferible
utilizar un promotor bacteriano o de fago. Si se pretende expresar
la proteína de fusión en células eucariotas, es preferible utilizar
un promotor/intensificador eucariota o vírico. Si se pretende
expresar la proteína de fusión utilizando un promotor de poxvirus
(véase más adelante), es preferible utilizar un promotor poxvírico
tal como el promotor 7.5 o el promotor ATI.
Como se ha reseñado anteriormente, la proteína de
fusión puede comprender parejas de fusión que no son proteínas de
HIV seleccionadas de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev y Nef. Así, la
proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de
otras proteínas o partes de las mismas. Ejemplos de otras proteínas
son las proteínas Gag, Pol y Env de HIV. Como consecuencia, el ácido
nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender
también las secuencias codificantes de una o más proteínas
adicionales o partes de las mismas en el marco de lectura abierto
que codifica al menos cuatro proteínas reguladoras/accesorias de HIV
o derivados de las mismas.
En una realización adicional de la presente
invención, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente casetes
de expresión independientes que codifiquen proteínas adicionales que
pueden contribuir a mejorar adicionalmente la respuesta inmunitaria
contra el HIV. En una realización preferida, el ácido nucleico puede
comprender adicionalmente casetes de expresión que comprenden la
secuencia codificante de al menos una proteína de HIV adicional
seleccionada de Gag, Pol y Env o partes de las mismas. Todavía más
preferiblemente, el ácido nucleico puede comprender además de la
secuencia codificante de la proteína de fusión, las secuencias
codificantes de todas las proteínas de HIV Gag, Pol y Env. El ácido
nucleico es preferiblemente parte de un vector. El ácido nucleico
puede ser también el genoma vírico o parte del mismo de un vector
vírico, preferiblemente un vector de poxvirus tal como MVA. De este
modo, es posible expresar a partir del vector poxvírico la proteína
de fusión así como las proteínas de HIV adicionales, v.g., al menos
una proteína de HIV adicional seleccionada de Gag, Pol y Env.
La invención se refiere adicionalmente a vectores
que comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la presente
invención. El término "vector" hace referencia a cualesquiera
vectores conocidos por las personas expertas en la técnica. Un
vector puede ser un vector plasmídico tal como pBR322 o un vector de
la serie pUC. Más preferiblemente, el vector es un vector de virus.
En el contexto de la presente invención, el término "vector
vírico" o "vector de virus" hace referencia a un virus
infeccioso y/o atenuado que comprende un genoma vírico. En este
caso, el ácido nucleico de la presente invención es parte del genoma
vírico del vector vírico respectivo y/o constituye el genoma
vírico. Los vectores recombinantes pueden utilizarse para la
infección de células y líneas de células, en particular para la
infección de animales vivos, con inclusión de humanos. Vectores de
virus típicos de acuerdo con la presente invención son vectores de
adenovirus, vectores de retrovirus o vectores basados en el virus 2
adeno-asociado (AAV2). Son muy preferidos los
vectores poxvíricos. El poxvirus puede ser preferiblemente un
poxvirus de canario, un poxvirus de ave de corral o un virus
vaccinia. Es más preferido el virus vaccinia Ankara modificado (MVA)
(Sutter, G. et al., [1994], Vaccine 12:
1032-40). Una cepa de MVA típica es MVA 575 que ha
sido depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures
bajo el número de depósito ECACC V00120707. Es muy preferida la cepa
MVA-BN o un derivado de la misma, que ha sido
descrito en la solicitud PCT PCT/EP01/13628 presentada en la Oficina
Europea de Patentes en fecha 22 de noviembre de 2001, titulada
"Modified Vaccinia Ankara Virus Variant".
MVA-BN ha sido depositada en la European Collection
of Animal Cell Cultures con el número de depósito ECACC V00083008.
Por la utilización de MVA-BN o un derivado de la
misma, se ha resuelto el problema técnico adicional de proporcionar
una vacuna de virus particularmente segura contra HIV, dado que el
vector vírico de MVA-BN es un virus extremadamente
atenuado, que se deriva del virus Vaccinia Ankara Modificado y que
se caracteriza por la pérdida de su capacidad para replicarse
reproductivamente en células humanas. MVA-BN es más
segura que cualesquiera otras cepas de virus vaccinia conocidas
debido a la falta de replicación en humanos. En una realización
preferida, la invención concierne como vector vírico que contiene el
DNA de acuerdo con la presente invención a MVA-BN y
derivados de MVA-BN. Las características de
MVA-BN, la descripción de los ensayos biológicos que
permiten evaluar si un MVA es MVA-BN o un derivado
del mismo y los métodos que permiten obtener MVA-BN
o un derivado del mismo se describen en la solicitud PCT
PCT/EP01/13628 arriba citada, que se incorpora en esta memoria por
referencia.
Así, de acuerdo con estas realizaciones, la
invención concierne preferiblemente a un MVA recombinante, tal como
MVA-BN, que comprende en el genoma vírico una casete
de expresión que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la
presente invención.
Métodos para insertar el ácido nucleico de
acuerdo con la presente invención en el genoma vírico y métodos para
obtener virus recombinantes son conocidos por las personas expertas
en la técnica.
En un virus vaccinia recombinante, la expresión
del DNA de acuerdo con la presente invención está preferiblemente,
pero no de modo exclusivo, bajo el control de transcripción de un
promotor de poxvirus, más preferiblemente de un promotor del virus
vaccinia. La inserción del DNA de acuerdo con la presente invención
tiene lugar preferiblemente en una región no esencial del genoma
vírico. En otra realización preferida de la invención, la secuencia
de ácido nucleico heterólogo se inserta en un sitio de deleción
existente naturalmente del genoma poxviríco (descrito en el
documento PCT/EP96/02926). Sin embargo, la naturaleza del sitio de
inserción no es crítica para la presente invención con tal que se
obtenga un virus Vaccinia recombinante. Así, las personas expertas
en la técnica pueden idear fácilmente sitios de inserción
adicionales adecuados.
Preferiblemente, el vector vírico, en particular
el vector de poxvirus, puede comprender genes retrovíricos
adicionales seleccionados de los genes Gag, Pol y Env de HIV en el
genoma vírico, además de la secuencia codificante para la proteína
de fusión de acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente,
el vector vírico, en particular el vector poxvírico, puede
comprender todos los genes de HIV que codifican Gag, Pol y Env
además de la secuencia codificante para la proteína de fusión de
acuerdo con la presente invención. Ciertos genes adicionales
pudieran haber sido insertados con el mismo ácido nucleico de
acuerdo con la presente invención. De acuerdo con esta realización,
todos los genes de HIV pudieran estar localizados en el mismo sitio
de inserción en el genoma vírico. En una realización alternativa,
los genes adicionales están insertados en localizaciones diferentes
del genoma vírico.
En una realización preferida, la presente
invención concierne al ácido nucleico, el vector o la proteína de
fusión de acuerdo con la presente invención como una vacuna para la
profilaxis al menos parcial contra infecciones por HIV y SIDA. Una
"vacuna" es un compuesto, a saber, un ácido nucleico, una
proteína de fusión, un vector o un virus que induce una respuesta
inmunitaria específica.
De acuerdo con una alternativa de esta
realización, la "vacuna" de acuerdo con la presente invención
está basada en la proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención.
En una realización preferida, se utiliza como
vacuna el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en
particular DNA. Es sabido por las personas expertas en la técnica
que la administración de DNA desnudo que aloja una casete de
expresión eucariota como en la presente invención, en particular la
inyección intramuscular de DNA, conduce a la expresión de la
proteína codificada por la casete de expresión. La proteína se
expone al sistema inmunitario y se genera una respuesta inmunitaria
específica. En una realización alternativa, la vacunación se realiza
por administración de un vector de acuerdo con la presente
invención, en particular un vector vírico, más preferiblemente un
vector de poxvirus, y muy preferiblemente un vector del virus
vaccinia, v.g. un vector MVA.
Para la preparación de una vacuna basada en el
virus vaccinia, el virus de acuerdo con la invención se convierte en
una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose
en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus
utilizadas para vacunación contra la viruela (como ha sido descrito
por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99,
2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado se
guarda a -80ºC con un título de 5x10^{8} TCID_{50}/ml formulado
en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM, de pH 7,4. Para la
preparación de dosis de vacuna, v.g., se liofilizan
10^{2}-10^{8} partículas del virus en 100 ml de
solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona
al 2% y albúmina humana al 1% en una ampolla, preferiblemente una
ampolla de vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden
producirse por liofilización gradual del virus en una formulación.
Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como
manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u
otros aditivos tales como antioxidantes o gas inerte,
estabilizadores o proteínas recombinantes (v.g. seroalbúmina humana)
adecuados para administración in vivo. La ampolla de vidrio
se sella luego y puede guardarse entre 4ºC y la temperatura ambiente
durante varios meses. Sin embargo, mientras que no exista necesidad
alguna, la ampolla se guarda preferiblemente a temperaturas
inferiores a -20ºC. Para la vacunación, el liofilizado puede
disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente
solución salina fisiológica o tampón Tris, y administrarse sistémica
o localmente, v.g. por vía parenteral, intramuscular o cualquier
otra ruta de administración conocida por el profesional sanitario
experto. El modo de administración, la dosis y el número de
administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la
técnica de manera conocida. Es muy preferida para vectores
poxvíricos la administración subcutánea o
intramuscular.
intramuscular.
Si la vacuna es un vector MVA-BN
o derivado del mismo que comprende un DNA de acuerdo con la presente
invención, una realización particular de la presente invención
concierne a la administración de la vacuna en cantidades
terapéuticamente eficaces en una primera inoculación ("inoculación
de sensibilización") y en una segunda inoculación ("inoculación
de refuerzo").
Si la vacuna es un vector MVA-BN
o derivado del mismo que comprende un DNA de acuerdo con la presente
invención, una realización particular de la presente invención
concierne a un kit para vacunación que comprende un vector de virus
MVA-BN de acuerdo con la presente invención para la
primera vacunación ("sensibilización") en un primer vial/envase
y para una segunda vacunación ("refuerzo") en un segundo
vial/envase.
Así, la invención concierne en las realizaciones
de vacuna a una vacuna que comprende un ácido nucleico, un vector o
una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y al uso
de dicho ácido nucleico, vector o proteína para la preparación de
una vacuna.
De acuerdo con una realización adicional, la
invención concierne a un método para proteger un animal, con
inclusión de un humano, contra una infección por HIV por
administración a un animal, con inclusión de un humano, que se
encuentra en necesidad de ello, de una proteína de fusión de acuerdo
con la presente invención, un ácido nucleico de acuerdo con la
presente invención o un vector de acuerdo con la presente
invención.
Además, la invención concierne a un método de
producción de una proteína de acuerdo con la presente invención, que
comprende los pasos de (i) transfectar una célula hospedadora con un
ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención o
(ii) infectar una célula hospedadora con un vector vírico de acuerdo
con la presente invención, (iii) expresar la proteína de fusión en
la célula hospedadora transfectada del paso (i) o la célula
hospedadora infectada del paso (ii), y (iv) recuperar la proteína de
fusión.
La invención se refiere adicionalmente a células
hospedadoras transfectadas con un ácido nucleico o un vector de
acuerdo con la presente invención o infectadas con un vector vírico
de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con una realización alternativa, la
proteína de fusión puede comprender al menos tres proteínas de HIV
diferentes seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx y Tat. La
proteína de fusión puede comprender preferiblemente 4, 5 o la
totalidad de dichas proteínas de HIV. Una proteína de fusión típica
de acuerdo con esta realización comprende la secuencia de
aminoácidos de las proteínas de HIV Vpr, Vif, Vpu, Rev y Tat o
derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas
proteínas. Como se ha indicado anteriormente, el orden de las
proteínas de HIV en la proteína de fusión no es crítico. Todas las
realizaciones preferidas que se especifican anteriormente son
aplicables también para esta realización alternativa.
Fig.
1
La imagen muestra la reasociación de cuatro
oligonucleótidos. Los oligonucleótidos son monocatenarios y pueden
reasociarse por extremos complementarios. Las lagunas se rellenan
con una polimerasa, que exhibe una actividad de corrección de
lectura (v.g. polimerasa Pfx).
Fig.
2
El gen vif exhibe una secuencia solapante con el
fragmento vpr, y el fragmento codificante vpu exhibe una secuencia
solapante con el gen rev (gris). Los fragmentos PCR se
desnaturalizan y los extremos complementarios solapantes se
hibridan. Las lagunas resultantes se rellenan utilizando polimerasa
Pfx. El fragmento vif-vpr se fusiona a una secuencia
solapante del fragmento vpu-rev, que se utiliza de
nuevo para fusión.
Fig.
3
La región codificante de la poliproteína
fusionada vif, vpr, vpu y rev se amplificó con iniciadores que
comprendían un sitio de rescisión ClaI y ApaI. Este producto PCR se
clonó en el vector pBNX65 cortado con ClaI/ApaI, que contiene el
promotor ATI de poxvirus. La región codificante de tat se amplificó
por PCR con iniciadores que contenían un sitio de restricción Acc65I
y se ligó al pBNX65+vif-rev linealizado con Acc65I.
La casete de expresión resultante (promotor ATI + secuencia
codificante de una proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención) se aisló por restricción con PacI y se insertó en el
vector de recombinación para inserción de genes extraños en la
región intergénica I4L del genoma de MVA (pBNX39). pBNX39 contiene
secuencias homólogas a las secuencias flanqueantes del sitio de
inserción del genoma de MVA (F1 I4L y F2 I4L ). Para selección de
virus recombinantes después de recombinación homóloga del genoma de
MVA y pBNX39, el vector contiene adicionalmente el gen gpt de E.
coli (gen de la fosforribosiltransferasa). Después de purificación
de los virus recombinantes, la casete de selección se deleciona por
recombinación homóloga entre Flank 1 y una secuencia de repetición
de flank 1
(F1rpt).
(F1rpt).
Fig.
4
MVA contiene un genoma lineal, que exhibe
fragmentos característicos después de restricción con Hind III
(A-O). La región no funcional entre los genes I4L e
I5L está localizada en el fragmento I. La designación de genes
extraños utilizando pBNX39 ocurre en la posición
56767-56768.
Los genes individuales del genoma de HIV se
prepararon por PCR de DNA genómico utilizando protocolos estándar de
PCR o sintéticamente por una técnica que está basada en la
reasociación de oligonucleótidos por la vía de secuencias solapantes
y rellenado de las lagunas monocatenarias resultantes.
Para la generación basada en oligonucleótidos de
regiones de genes codificantes, que deben insertarse en el ácido
nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la
presente invención, se diseñaron oligonucleótidos
40-meros con solapamientos de 15 pb. La secuencia de
los oligonucleótidos está basada en el mapa genómico del aislado
HXB2R de HIV1, que se deriva de la cepa IIIB. Los oligonucleótidos
para la reacción de reasociación o la PCR para aislamiento de la
secuencia requerida se diseñaron de tal manera, que en la región
codificante resultante se delecionaron los codones de parada para
terminación de la traducción. Se sintetizó el gen tat utilizando
oligonucleótidos que contenían un codón de Parada, dado que este gen
debía insertarse en la última posición del ácido nucleico
codificante de la proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención y por consiguiente debería contener un triplete de parada
para una terminación correcta de la traducción de la
poliproteína.
Para la reacción de reasociación de
oligonucleótidos, se realizaron 10 ciclos de una relación de
polimerasa Pfx de dos pasos (Gibco-BRL)
(desnaturalización a 95ºC y reasociación/extensión a 68ºC). Durante
dicha reacción, las secuencias solapantes de los oligonucleótidos se
reasociaron y las lagunas se rellenaron por medio de la polimerasa
de corrección de lectura Pfx (Fig. 1).
Para la síntesis de la región codificante de vif,
el primer gen codificado en la secuencia de nucleótidos que
codificaba la proteína de fusión, se realizó una PCR utilizando cDNA
genómico de HIV. La PCR se realizó de tal manera que la región
codificante de vif se fusionó a los primeros 15 pb del gen vpr
siguiente para la reasociación subsiguiente de vif y vpr. La región
codificante de Vpr, que abarca los pares de bases
5559-5847 del genoma de HIV HXB2R, se preparó por
reasociación de 10 oligonucleótidos. Se rellenaron las lagunas
resultantes y, después de una PCR subsiguiente para amplificación,
el producto contenía la región codificante de vpr fusionada a las
regiones flanqueantes para vif y vpu, que debía insertarse después
de la región codificante de vpr.
La región codificante de Vpu se amplificó por PCR
del mismo cDNA utilizado para la síntesis de vif, y el producto
resultante contenía las regiones flanqueantes para fusión con vpr y
rev.
La región codificante de rev se sintetizó por
reasociación de 14 oligonucleótidos, que abarcan la región de los
pares de bases 5970-6045 y 8379-8650
del genoma de HIV HXB2R y solapamientos de 15 pares de bases para
reasociación con vpu y tat.
La región codificante de tat se creó utilizando
10 oligonucleótidos, que abarcan los pares de bases
5831-6045 y 8379-8466 del genoma de
HIV HXB2R.
La región codificante de vif y la región
codificante de vpr, así como la región codificante de vpu y la
región codificante de rev se fusionaron por reasociación de los dos
fragmentos por sus solapamientos con una reacción de polimerasa Pfx
de dos pasos (Fig. 2). Después de amplificación adicional por PCR de
los productos de fusión, los fragmentos se purificaron y se ligaron
unos a otros por el solapamiento de vpr y vpu (Fig. 2). Después de
amplificación por PCR del producto resultante (secuencias
codificantes para
vif-vpr-vpu-rev), se
fusionó la región codificante de tat por clonación del fragmento
vif-vpr-vpu-rev y
tat en sitios de clonación adyacentes en un vector pBluescriptKS+
que contenía el promotor ATI de poxvirus (Fig. 3, pBNX65). La casete
de expresión completa se aisló luego por restricción con PacI y se
insertó en pBNX39 (Fig. 3). pBNX39 contiene secuencias homólogas al
genoma de MVA, lo cual permite la inserción en una región no
codificante (I4L) del genoma (Fig. 4) por recombinación
homóloga.
Claims (25)
1. Proteína de fusión que comprende la secuencia
de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV seleccionadas de
Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de la secuencia de
aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en donde la proteína
de fusión no contiene secuencias de escisión específicas para
proteasas celulares, que pudieran desencadenar la generación de
proteínas de HIV que tengan los términos N y C naturales, entre las
secuencias de aminoácidos de las proteínas de HIV que forman la
proteína de fusión y en donde un derivado de la secuencia de
aminoácidos de una proteína de HIV es una secuencia de aminoácidos
que exhibe una homología de al menos 50%, cuando la parte
correspondiente de la secuencia de aminoácidos en la proteína de
fusión se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína de
HIV respectiva en el aislado HXB2R de HIV-1 (número
de acceso a Genebank K03455).
2. La proteína de fusión de acuerdo con la
reivindicación 1, en la cual la homología es al menos 80%.
3. La proteína de fusión que comprende la
secuencia de aminoácidos de al menos cuatro proteínas de HIV
seleccionadas de Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat y Nef o derivados de
la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas proteínas, en
donde la proteína de fusión no contiene secuencias de escisión
específicas para proteasas celulares, que pudieran desencadenar la
generación de proteínas de HIV que tengan los términos N y C
naturales, entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas de
HIV que forman la proteína de fusión y en donde el derivado de una
proteína de HIV individual que forma parte de la proteína de fusión
es una secuencia de aminoácidos en la cual no más de 10 aminoácidos
están delecionados, insertados o sustituidos para obtener una
proteína de HIV con actividad reducida o sin actividad alguna.
4. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual las proteínas
de HIV se seleccionan de Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev y Tat.
5. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia
de aminoácidos de las proteínas de HIV Vif, Vpr, Vpu, Rev y Tat o
derivados de la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas
proteínas.
6. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la cual las secuencias
de aminoácidos de al menos dos de las proteínas de HIV están
fusionadas una a otra sin aminoácidos adicionales.
7. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la cual las secuencias
de aminoácidos de al menos dos de las proteínas de HIV están
separadas por al menos un aminoácido adicional.
8. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual la secuencia de
aminoácidos de al menos una de las proteínas de HIV está fusionada a
una pareja de fusión que no es una proteína de HIV seleccionada de
Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat y Nef.
9. Ácido nucleico que codifica una proteína de
fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
10. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 9, en el cual el ácido nucleico es DNA.
11. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 10, en el cual la expresión de la proteína de fusión
a partir del DNA está controlada por elementos reguladores
seleccionados de promotores eucariotas, procariotas y víricos.
12. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 11, en el cual el promotor vírico es un promotor de
poxvirus.
13. Ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 12, en el cual el ácido nucleico
comprende adicionalmente la secuencia codificante para al menos una
proteína de HIV adicional seleccionada de Gag, Pol y Env.
14. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 13, en el cual el ácido nucleico comprende la
secuencia codificante para las proteínas de HIV Gag, Pol y Env.
15. Vector que comprende un ácido nucleico de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
16. Vector de acuerdo con la reivindicación 15,
en el cual el vector es un vector vírico.
17. Vector de acuerdo con la reivindicación 16,
en el cual el vector vírico es un vector de poxvirus, en particular
un vector del Virus Vaccinia.
18. Vector de acuerdo con la reivindicación 17,
en el cual el vector del Virus Vaccinia es Virus Vaccinia Ankara
Modificado (MVA).
19. Vector de acuerdo con la reivindicación 18,
en el cual MVA se selecciona de MVA-575 depositado
en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) bajo el
número de depósito V00120707 y MVA-BN depositado en
la ECACC bajo el número de depósito V00083008.
20. Método de producción de una proteína de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que
comprende los pasos de
- -
- transfectar una célula hospedadora con un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 15 o
- -
- infectar una célula hospedadora con un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19,
- -
- expresar la proteína de fusión en la célula hospedadora transfectada o la célula hospedadora infectada, y
- -
- recuperar la proteína de fusión.
21. Célula hospedadora transfectada con un ácido
nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a
14 o un vector de acuerdo con la reivindicación 15 o infectada con
un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19.
22. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ácido nucleico de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o vector de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 como
medicamento.
23. Proteína de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ácido nucleico de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o vector de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 como
vacuna.
24. Vacuna que comprende una proteína de fusión
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un
ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
9 a 14 o un vector de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19.
25. Uso de una proteína de fusión de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de un ácido nucleico
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o de un
vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19
para la preparación de una vacuna.
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