KR20100063126A - Ｈｉｖ 조절/부속 단백질의 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat 및 Nef로부터 선택된 4개 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 상기 단백질의 아미노산 서열의 유도체를 포함하며 천연 N 및 C 말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 단백질을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 융합 단백질, 핵산 및 벡터는 HIV 감염에 대하여 적어도 부분적인 예방을 위한 백신으로서 사용가능하다.

Description

ＨＩＶ 조절/부속 단백질의 융합 단백질{FUSION PROTEIN OF HIV REGULATORY/ACCESSORY PROTEINS}

본 발명은 Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat 및 Nef로부터 선택된 4개 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열 또는 상기 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열의 유도체를 포함하고 천연 N 및 C 말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 단백질을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 융합 단백질, 핵산 및 벡터는 HIV 감염에 대하여 적어도 부분적인 예방용 백신으로 사용가능하다.

인체면역결핍 바이러스(HIV)는 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 원인 병원체이다. 모든 레트로바이러스처럼 상기 바이러스의 게놈은 Gal, Pol 및 Env 단백질을 코딩한다. 또한, 상기 바이러스 게놈은 조절 단백질 즉, Tat 및 Rev 뿐만 아니라 부속 단백질 즉, Vpr, Vpx, Vpu, Vif 및 Nef를 또한 코딩한다.

AIDS 감염의 확산을 조절하기 위한 공중 위생학의 노력에도 불구하고, 새로운 감염자 수는 여전히 증가하고 있다. 세계보건기구는 2000년도 말에 세계적으로감염자 수가 3천 6백 10만명에 이르는 것으로 추정하였는데, 이는 10년전의 데이터를 기준으로 하여 예측한 것보다 50%가 더 높은 것이다(WHO & UNAIDS. UNAIDS, 2000). 전세계적으로 2000년도에 새로운 HIV-1 감염자 수는 5백 30만으로 추정된다.

감염이 꾸준하게 증가하는 것을 고려할 때, 임상에 효과적인 백신을 도입할 필요가 여전히 요구된다. 신규한 벡터 또는 보조 계와 같은 상이한 수많은 HIV-1 백신 전달 방법이 개발되어 상이한 전임상(preclinical) 단계 뿐만 아니라 임상 실험에서도 평가되어 왔다. 제3상 임상 실험에 들어간 첫번째 백신 후보는 알룸중의등피 gp 120 단백질을 토대로 하였다(Francis 등., AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998; 14(Suppl 3)(5): S325-31). 상기 백신이 초기 제2상 실험에서 충분히 성공적인 것으로 입증되지 않았음에도 불구하고 제3상 실험을 실시하였다.

외피 항원을 기본으로 하는 수년간의 예방 백신 연구후, 최근의 연구는 백신 후보 항원으로서 Tat, Nef 및 Rev와 같은 조절 단백질의 사용에 촛점을 두고 있다. 치료단계에서 이들 조절 항원을 사용하는 것은 수년에 걸쳐 진행되어 왔다(Miller 등., Nature Medicine 1997, 3, 389-94, Calarota 등., Lancet 1998, 351, 1320-5, Ayyavoo 등., AIDS, 2000, 14, 1-9). 가장 최근에는 소규모 비임상 실험의 예방 백신 연구에서 이들 항원의 사용은 전망이 있는 것으로 나타났다. 예방 백신 후보로서 Tat 및 Rev 사용 또는 Tat 단독 사용은 SIVmac을 조절하는 것으로 입증되었다(Osterhaus 등., Vaccine 1999, 17, 2713-4). 또한, 바이러스 조기 조절 단백질에 대한 CTL은 많은 양의 성숙한 비리온을 생산하기 전에 감염 세포를 제거하는데 중요하다는 것으로 나타났다(van Baalen 등., J. Gen. Virol 1997, 78, 1913-8; Addo 등., PNAS, 2001, 98, 1781-6).

HIV 조절/부속 단백질이 효과적인 면역반응을 유도하지만, 전부는 아니더라도 이들 단백질의 대부분은 심각한 부작용을 갖는 바, 이는 지금까지 백신으로서 이들의 사용을 제한한다: Nef, Tat 및 Vpu는 CD4+ 및 MHC class I 발현을 저하하는조절에 역할을 하는 것으로 나타났다(Howcroft 등., Science, 1993, 260, 1320-2; Schwartz 등., Nature Med. 1996, 2, 338-42; Swann 등., Virology, 2001, 282, 267-77; Janvier 등., J. Virol., 2001, 78, 3971-6, Weissmann 등., PNAS 1998, 95, 11601-6). Tat는 생체내에서 급성 면역 억제를 매개하는 것으로 공지되어 있다(Cohen 등., PNAS, 1999, 96, 10842-10847). 면역억제 효과는 Vpr에 대해서도 개시되어 있다(Ayyavoo 등., Nature Med., 1997, 3: 1117-1123). Vpr 및 Vpx가 이스트 세포에서 상이한 세포성장 억제제 및 세포 독성 효과를 갖는 것으로 개시되어 있다(Zhang 등., Virology, 1997, 230, 103-12). 따라서, HIV의 조절/부속 단백질의 전부는 아니더라도 이들 대부분은 백신 조제에 있어서 바람직하지 않는 기능적 특징을 갖는 것으로 보인다.

HIV 단백질의 부작용을 줄이기 위한 시도가 WO 02/06303호에 개시되어 있다. 특히, WO 02/06303호는 HIV Vif, Vpu 및 Nef의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 발표하였는 바, 상기 구성 단백질은 다른 구성 단백질과 접촉하거나 또는 단백질 분해부위를 구성하는 아미노산 서열과 같은 비-구성 단백질에 의해 분리된다. 구성 단백질 사이의 단백질 분해부위를 포함하는 융합 단백질을 사용하는 것이 바람직한 것으로 공개되어 있다. 상기 구성 단백질은 단백질 분해 부위에 의해 분리되기 때문에 해로운 것으로 공지된 천연 HIV 단백질이 생성된다. 융합 단백질의 분열로부터 생기는 HIV 단백질의 임의의 부작용을 줄이기 위해 WO 02/06303호는 약화된 단백질을 사용할 것을 제안한다. 따라서, WO 02/06303호는 HIV Vif, Vpr 및 Nef 단백질을 포함하며 분열부위가 HIV 단백질 사이에 삽입되고, HIV 단백질이 약화된 단백질인 융합단백질을 사용할 것을 시사한다. 그러나, 약화된 단백질의 단점은 약화된 단백질의 아미노산 서열이 천연 단백질의 아미노산 서열과 상이하여 약화된 단백질에 의한 면역은 천연 단백질을 약하게만 인식하거나 또는 심지어는 천연 단백질을 전혀 인식하지 못하는 면역반응을 초래할 수도 있다.

발명의 목적

본 발명은 몇몇 또는 모든 HIV의 조절/부속 단백질에 대하여 효과적인 면역반응, 특히 효과적인 세포독성 T 세포 반응을 허용하는 백신을 제공하는 것인 바, 백신내의 또는 백신에 의해 생성되는 조절/부속 HIV 단백질은 천연의 개개의 조절/부속 단백질보다 덜 기능적이므로 상기 조절/부속 단백질이 백신내에서 바람직하지 않은 부작용을 나타낼 위험이 감소되며, 또 덜 활동적인 HIV 단백질은 천연 HIV 단백질보다 유사한 면역반응을 유도한다.

상기 목적은 Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat 및 Nef로부터 선택된 4개 이상의 상이한 HIV 단백질의 아미노산 서열 또는 상기 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열의 유도체를 포함하며, 천연 N 및 C 말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않는 융합 단백질을 제공함으로써 달성된다. 특히, 본 발명의 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및 벡터에 의해 달성된다.

상기 융합 단백질이 사람의 세포를 포함한 동물 세포에서 생성되어 진다면, 이 융합 단백질은 천연 N 및 C 말단을 갖는 조절/부속 단백질이 수득되는 방식으로 세포 프로테아제에 의해 분해되지 않는다.

개개의 HIV 단백질과 비교할 때, 융합 단백질의 일부분인 HIV 단백질이 변경된 2차/3차 구조를 갖는 사실 때문에, 융합 단백질중의 상기 HIV 단백질은 완전히 비기능적이 아니라면 개개의 단백질보다 덜 기능적이다. 덜 기능적이거나 또는 심지어는 전혀 기능적이지 않는 조절/부속 단백질은 그 천연 구조에서 HIV 단백질의 바람직하지 않은 부작용을 갖지 않는다. 면역원성에 관한 한, 융합 단백질의 면역원성을 융합 단백질을 형성하는 개개의 HIV 조절/부속 단백질과 비교할 때 실질적인 차이가 없다. 특히, 면역계에 제시된 항원 결정기가 일치하기 때문에, 세포독성 T 세포(CTL) 반응에 대하여 실질적인 차이가 없다. 융합 단백질이 환자에게 투여할때에도 동일한 고려가 또한 적용된다.

본원에서 “HIV”는 당업자에게 공지된 임의의 HIV 그룹, 서브타입(클레이드), 균주 또는 분리체를 의미한다. 특히, HIV는 HIV-1 또는 HIV-2일 수 있다. HIV-1은 9개 서브타입(클레이드 A부터 I)으로 분류되는 반면, HIV-2는 5개 서브타입(A부터 E)으로 분류되며, 이들은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 HIV 클레이드는 HIV-1 클레이드 A, B 및 C이다. 그러나, 본 발명은 가장 바람직한 이들 클레이드에 한정되지 않는다.

HIV 조절 단백질 Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, Vpx 및 Nef의 단백질 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 실시예 및 구체예에 제한되지 않고 유전자은행 데이터베이스에 공개된 바와 같이, 다양한 서열에 대해 특히, 유전자은행 수탁 번호 KO3455의 HIV-1 분리체 HXB2R의 서열에 대해 참고할 수 있다. 유전자은행에는 다양한 HIV1 유전자 및 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질이 명시되어 있다.

융합 단백질을 형성하는 HIV 단백질은 동일한 클레이드로부터 유도된다. 다른 구체예에 따르면, 융합 단백질을 형성하는 HIV 단백질은 두개 이상의 클레이드로부터 유도된다. 융합 단백질을 형성하는 하나 이상의 HIV 단백질은 HIV-1 단백질일 수 있이며, 융합 단백질을 형성하는 하나 이상의 HIV 단백질은 HIV-2 단백질일 수 있다.

융합 단백질을 형성하는 HIV 단백질의 아미노산 서열은 융합 단백질에서 HIV 단백질의 아미노산 서열이 자연적으로 발생하는 HIV 분리체에 의해 코딩되는 바와 같이 대응하는 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 공지된 HIV 분리체에 의해 코딩되는 서열이 바람직하다. 다르게는, 융합 단백질에서 하나 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열은 콘센서스(consensus) 서열일 수 있는 바, 공지된 HIV 분리체에서 발견되지 않지만 CTL-항원 결정기나 몇몇 또는 모든 공지된 HIV 분리체에 대하여 최적의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. 콘센서스 서열을 계산하기 위한 컴퓨터 연산은 당업자에게 공지되어 있다.

다른 구체예에서 융합 단백질은 융합 단백질의 일부분인 하나 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열의 유도체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된“HIV 단백질의 아미노산 서열의 유도체”는 상응하는 자연 발생의 HIV 단백질과 비교할 때 변경된 아미노산 서열을 갖는 HIV 단백질을 의미한다. 변경된 아미노산 서열은 HIV 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열이 치환, 삽입 또는 결실된 서열일 수 있다. 더 구체적으로“HIV 단백질의 아미노산 서열의 유도체”는 융합 단백질중의 아미노산 서열의 상응하는 부분을 공지된 HIV 분리체의 각각의 HIV 단백질의 아미노산 서열과 비교할 때 50% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 70% 이상, 더욱더 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 말한다. 낮은 상동성을 나타내는 다른 분리체에서 대응하는 단백질이 존재할 수도 있다는 사실에 관계없이, 한개만의 HIV 분리체의 대응하는 단백질에 대하여 상동성이 발견된다 하더라도 아미노산 서열은 상술한 서열 상동성을 갖는 것으로 간주된다. 예로서, 융합 단백질중의 Vpr 유도체가 한개의 HIV 분리체의 Vpr 서열에 대해 95%의 상동성을 나타내지만, (모든) 다른 HIV 분리체에 대해 50-70%의 상동성만을 나타낸다면, 상기 Vpr 유도체의 상동성은 90% 이상인 것으로 간주된다.

융합 단백질중의 HIV 단백질은, 융합 단백질중의 단백질 구조가 생물학적으로 활성인 단백질의 천연 구조와 다르기 때문에, 개개의 단백질과 비교할 때 감소된 활성을 갖거나 또는 심지어는 전혀 활성이 없다. 그러나, 융합 단백질중의 HIV 단백질이 생물학적으로 활성인 위험을 더 줄이는 것이 바람직하다. 이를 위해, 융합 단백질의 일부인 개개 HIV 단백질의 특히 바람직한“유도체”는, 감소된 활성을 갖거나 또는 활성이 전혀없는 HIV 단백질을 수득하기 위해서 몇몇 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환되고, 더 바람직하게는 10개 이하의 아미노산이거나, 가장 바람직하게는 5개 이하의 아미노산인 아미노산 서열 유도체이다. HIV 단백질이 감소된 생물학적 활성을 갖는지를 측정하는 실험은 당업자에게 공지되어 있다:

생체내에서 바이러스 복제에 필수적인 Vif 단백질의 분자 작용기전은 알려지지 않고 있으나, Vif는 자가결합에 대하여 강한 성향을 갖는다. 이 다중화는 바이러스 생활환에 있어서 Vif 기능이 중요함을 나타냈다(Yang S. 등., J Biol Chem 2001; 276:4889-4893). 또한, Vif는 바이러스 핵단백질 복합체와 특이적으로 결합하는 것으로 나타났으며 이는 기능적으로 중요할 것이다(Khan M. A. 등., J Virol. 2001; 75(16):7252-65). 따라서, 감소된 활성을 갖는 Vif 단백질은 감소된 다중화 및/또는 핵단백질 복합체와의 결합을 나타낸다.

Vpr 단백질은 바이러스 생활환에 있어서 중요한 역할을 한다. Vpr은 바이러스 예비삽입 복합체의 핵 유출을 조절하며 마크로파지와 같은 비분열 세포의 감염을 촉진시킨다(Agostini 등., AIDS Res Him Retroviruses 2002; 18(4):283-8). 또한, Vpr은 LTR과의 상호작용에 의해 매개되는 상호활성화(transactivation) 활성을 갖는다(Vanitharani R. 등., Virology 2001; 289(2):334-42). 따라서, 감소된 활성을 갖는 Vpr은 감소된 상호활성화(transactivation)를 갖거나 또는 심지어는 상호활성화(transactivation)를 전혀 갖지 않으며 및/또는 바이러스 예비삽입 복합체와의 상호작용을 나타낸다.

Vpr과 높은 상동성인 Vpx는 비-분열 세포에서 효과적인 바이러스 복제에 있어서 또한 중요하다. Vpx는 gag 전구체 폴리프로테인의 p6 도메인과의 상호작용을 통하여 바이러스 입자에서 패키지된다. Vpr처럼, Vpx는 예비삽입 복합체가 세포핵내로 운반하는데 관여한다(Mahalingam 등., J. Virol 2001; 75(1): 362-74). 따라서, 감소된 활성을 갖는 Vpx는 gag 전구체를 통해 예비삽입 보체와 결합하는 능력이 감소된다.

Vpu 단백질은 CD4의 세포질 테일(tail)과 상호작용하며 CD4 퇴화를 유발하는 것으로 공지되어 있다(Bour 등., Virology 1995; 69(3): 1510-20). 그러므로, 감소된 활성을 갖는 Vpu는 CD4 퇴화를 유발하는 능력이 감소된다.

매우 특징화된 Tat 단백질의 관련된 생물학적 활성은 상호활성화 반응요소(TAR)와의 상호작용을 통한 전사의 상호활성화이다. Tat는 TAR를 제외한 HIV 서열이 결핍된 이종의 프로모터를 상호활성화시킬 수 있다는 것이 입증되었다(Han P. 등., Nucleic Acid Res 1991; 19(25):7225-9). 따라서, 감소된 활성을 갖는 Tat 단백질은 TAR 요소를 통한 프로모터의 상호활성화가 감소됨을 나타낸다.

Nef 단백질은 CD4의 세포 표면 조절을 유도함으로써 질병 진행에 관여하는 바이러스 복제에 필수적이다(Lou T 등., J. Biomed sci 1997;4(4):132). 이 하향조절은 CD4 및 Nef간의 직접적인 상호작용에 의해 개시된다(Preusser A. 등., Biochem Biophys Res Commun 2002; 292(3): 734-40). 따라서, 감소된 기능을 갖는 Nef 단백질은 CD4와의 상호작용이 감소됨을 나타낸다.

Rev의 관련된 기능은 RNA 바이러스의 Rev-반응 요소(RRE)와의 상호작용에 의헤 개시된 후전사 상호활성화이다(Iwai 등., 1992; Nuceic Acids Res 1992: 20(24):6465-72). 따라서, 감소된 활성을 갖는 Rev는 RRE와의 상호작용이 감소됨을 나타낸다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx, Tat 및 Nef로부터 선택된 4개 이상의 상이한 HIV 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 융합 단백질은 바람직하게는 상기 HIV 단백질의 5개, 6개 또는 모두를 포함할 수 있다. 융합 단백질에서 HIV 단백질의 순서는 중요하지 않다.

상기 4개 이상의 상이한 HIV 단백질의 하나 이상은 두개 이상의 복사체로 융합 단백질에 포함될 수 있다. 따라서, 실시예에 의해 본 발명에 따른 융합 단백질은 Vif, Vpr, Vpu 및 두개의 Rev 복사체를 포함할 수 있다. HIV 단백질의 두개 이상 복사체의 아미노산 서열은 일치할 수 있다. 다르게는, 복사체의 아미노산 서열은, 특히 상이한 HIV 균주 또는 클레이드로부터 유도된 단백질 서열이 사용될 때, 상이할 수 있다(예를들면, 한개의 HIV-1 Rev 복사체 및 한개의 HIV-2 Rev 복사체).

융합 단백질내의 인접한 HIV 단백질은 추가 아미노산 없이 융합될 수 있거나 또는 융합 단백질내의 두개의 인접한 HIV 단백질이 하나 이상의 추가 아미노산에 의해 분리되는 방식으로 융합될 수 있다. 두개의 결합 또한 본 발명의 범위내이다. 일례로서, 4개의 HIV 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질에서 두개의 인접한 HIV 단백질은 서로 직접적으로 연결될 수 있는 반면, 세번째 및 네번째 HIV 단백질은 추가 아미노산을 통해 연결되어 있다. 본원에서 “추가 아미노산”은 천연산출 HIV 단백질내의 상기 위치에서 발견되지 않는 아미노산을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 하기의 화학식을 갖는다:

화학식 1

+P1…P2…P3…P4…P5*…P6*…P7*+

상기식에서,

P1 내지 P7은 Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev 및 Nef로부터 선택된 상이한 HIV 단백질이며, 상기 융합 단백질은 4개 이상의 상이한 상기 HIV 단백질, 즉 P1 내지 P4 및 상기 HIV 단백질의 임의의 한개(P5*), 두개(P5*…P6*) 또는 세개(P5*…P6*…P7*)추가 단백질을 포함한다. 약어 “…”은 개별적으로 0 내지 n의 추가 아미노산을 의미한다. “…”이 0의 아미노산을 의미할때, 인접한 HIV 단백질은 추가 아미노산없이 각각 직접적으로 융합한다. “…”이 1 내지 n의 아미노산을 의미할때, 인접한 HIV 단백질은 1 내지 n의 아미노산에 의해 분리된다. 추가 아미노산의 상한선 즉, 정수 n은 세포내에서 생성 또는 발현될 수 있는 융합 단백질의 최대 크기에 따라 다르다.

한 구체예에 따르면, 모든“…”은 개별적으로 0 내지 20을 의미하며, 더 바람직하게는 0 내지 10을, 더더욱 바람직하게는 0 내지 5의 추가 아미노산을 의미한다.

다른 구체예에 따르면, 하나 이상의“…”은 Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat 및 Nef로부터 선택된 HIV 단백질이 아닌 추가 단백질의 아미노산 서열 또는 이들의 일부를 의미한다. 따라서, 이러한 다른 구체예에 따르면 추가 단백질은 조절/부속 HIV 단백질에 의해 측면에 위치된다. 상기 추가 단백질은 임의의 단백질일 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 추가 단백질은 HIV에 대하여 더 나은 면역 반응을 유도하도록 도울 수 있는 추가 항원 결정기를 포함한다. 따라서, 추가 단백질은 HIV Env, Gag 및/또는 Pol 단백질 또는 이들의 일부일 수 있다. 본원에서 Env, Gag 및 Pol의 “일부”는 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 상기 단백질의 하나로부터 유도된 아미노산 스트레치를 의미한다. 더 바람직하게는 용어 일부는 상기 단백질의 하나로부터의 10개 이상, 더 바람직하게는 20개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 의미한다. 관련된 구체예에 따르면, 하나 이상의 “…”은 융합 단백질의 일부인 하나 이상의 단백질 P1 내지 P7의 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 이 경우 융합 단백질은 융합 단백질의 일부인 하나 이상 단백질의 하나 이상 복사체를 포함할 수 있다. 언급한 바와 같이, 단백질의 복사체는 일치된 아미노산 서열을 갖거나 또는 갖지 않을 수도 있다.

상기 화학식에서 약어 “+”은 개별적으로 0 내지 n의 추가 말단 아미노산을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 단백질의 C 및/또는 N 말단에서 추가 단백질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 한 구체예에 따르면, 하나 이상의 “+”은 Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat 및 Nef로부터 선택된 HIV 단백질이 아닌 추가 단백질의 아미노산 서열 또는 이들의 일부를 의미한다. 따라서, 이러한 구체예에 따르면, 융합 단백질은 C 및/또는 N 말단에서 Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat 또는 Nef가 아닌 추가 단백질을 포함한다. 상기 추가 단백질은 임의의 단백질일 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 추가 단백질은 HIV에 대하여 더 나은 면역 반응을 유도하도록 도울 수 있는 추가 항원 결정기를 포함한다. 예를들면, 추가 단백질은 HIV Env, Gag 및 또는 Pol 단백질 또는 이들의 일부일 수 있다. 본원에서 Env, Gag 및 Pol의 “일부”는 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 상기 단백질의 하나로부터 유도된 아미노산 스트레치를 의미한다. 더 바람직하게는 용어 일부는 상기 단백질의 하나로부터의 10개 이상, 더 바람직하게는 20개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 의미한다.

다른 구체예에 따르면, 하나 이상의“+”은 융합 단백질의 용이한 검출 또는 정제를 허용하는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 하나 이상의“+”은 예를들면, His 태그(tag)와 같은 태그일 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 천연 N- 및 C-말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않는다. 더 구체적으로, 본원에 따른 융합 단백질은 사람 세포에서 발현될 때, 천연 N- 및 C-말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않는다. 사람 세포에서 발현될 때, 융합 단백질이 천연 N- 및 C-말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되는지를 체크하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 본원에서 참고문헌은 Ayyavoo 등., AIDS 2000, 14, 1-9, 특히, 본 명세서의 도 2에 개시된 실험을 참조하였다. 간단히 말하면, 당업자는 HeLa 세포와 같은 사람 세포에서 각각의 융합 단백질을 용이하게 발현할 수 있을 것이다; 세포는 이어 분해되며 세포 분해물은 웨스턴 블러팅 실험 또는 각각의 HIV 융합 단백질을 함께 형성하는 개개의 HIV 단백질에 특이적인 항체를 사용한 면역침강 에세이로 처리된다. 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 개개의 HIV 조절/부속 단백질의 크기에 대응하는 크기의 상당한 양의 HIV 단백질이 검출되지 않았다.

본 발명에 따른 융합 단백질이 천연 N- 및 C-말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않는다는 것을 확인하기 위해서는, 상기 융합 단백질은 융합 단백질을 형성하는 HIV 단백질의 아미노산 서열간에 천연 N- 및 C-말단을 갖는 HIV 단백질 생성을 유도하는 세포 프로테아제에 대한 특이적 분해 서열을 함유하지 않아야 한다. 따라서, 상기 화학식에서 약어로 표시된 아미노산 서열“…”은 천연 N- 및 C-말단을 갖는 HIV 단백질의 발생을 유도하는 세포 프로테아제에 대한 특이적 분해 서열을 함유하지 않는다. 특히, 융합 단백질은 융합 단백질을 형성하는 상이한 HIV 단백질의 아미노산 서열간의 분해 서열 REKRAVVG(한 글자의 아미노산 코드)을 함유하지 않는다. 세포 프로테아제에 대한 분해 서열은 당업자에게 또한 공지되어 있다. 따라서, 당업자는 천연 N- 및 C-말단을 갖는 개개의 HIV 단백질을 유도하는 (세포) 프로테아제에 대한 분해 서열을 포함하는 것을 용이하게 피할 수 있다. 시스테인프로테아제의 분해 서열에 대한 예는 lle/leu-X-Thr-X-Gly이다.

본 발명에 따른 단백질은 천연 N- 및 C-말단 모두를 갖는 HIV 단백질을 유도하는 특이적 분해 서열을 포함하지 않는다. 그러나, 이것은 이들 분해 부위가 천연 N-말단 및 C-말단 모두를 갖는 HIV 단백질의 발생을 매개하지 않는 한, 융합 단백질에서 단백질간의 세포 프로테아제에 대한 분해 부위의 존재를 일반적으로 배제하지 않는다. 특히, 상기 화학식에서 약어로 표시된 아미노산 서열“…”은 MHCI 또는 MHCII상에 제시된 짧은 펩티드의 발생에 관여하는 프로테아제에 대한 분해 부위를 포함할 수 있다. 이러한 구체예에 따른 분해 반응의 결과는 바람직하게는 20개 미만의 아미노산, 하나의 HIV 조절/부속 단백질의 N- 또는 C-말단에 대응될 수 있는 N- 또는 C-말단의 짧은 펩티드 스트레치이다. 그러나, 이들 짧은 펩티드는 항원의 제공과정중에 생성될 때, 유도되는 HIV 단백질의 활성을 더 이상 갖지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기의 융합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 이 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.플라스미드 또는 DNA 바이러스에 기초한 벡터와 같은 DNA 벡터를 사용함으로써 핵산을 사람의 세포내로 삽입하려고 한다면, 상기 핵산은 바람직하게 DNA이다.

본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 작제하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 하기의 방법에 제한되지 않고, 당업자는 하나 이상의 조절/부속 HIV 단백질의 코딩서열을 포함하는, 게놈 HIV 클론, 서브게놈 HIV 클론 또는 플라스미드와 같은 임의의 개시물질로부터 시작할 수 있다. 조절/부속 단백질의 코딩서열이 연속적인 리딩 프레임의 형태라면, 상기 코딩서열은 적절한 제한 효소에 의해 상기 코딩서열을 포함하는 핵산을 분해시킴으로써 분리될 수 있다. 이렇게 수득한 DNA 단편은 추가의 클로닝을 위해 사용될 수 있다. 다르게는 조절/부속 단백질의 코딩서열은 적절한 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법을 사용함으로써 수득될 수 있다. 예를들면, Tat 및 Rev의 경우처럼 조절/부속 단백질이 하나 이상의 액손에 의해 코딩되면, 상이한 액손을 각각 클론화하며 조절/부속 단백질용 연속 리딩 프레임을 발생시키기 위해 이들을 융합시키거나 또는 RT-PCR과 같이 역전사 기술을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 코딩서열은 유전자 합성에 의해 즉, 한 세트의 상보성 및/또는 중복 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자를 생성하는 것에 의해 제공될 수 있다.

융합 단백질을 수득하기 위해, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 연속 리딩 프레임을 함유한다. 따라서, HIV 단백질 또는 추가 단백질을 코딩하는 거의 마지막 서열의 정지코돈은 바람직하게는, 아미노산에 대한 코돈으로 돌연변이되거나 또는 완전하게 결실된다. 바람직하게는, 이것은 정지코돈없이 코딩서열을 증폭시키는 PCR 특이적 프라이머가 사용된다면, 용이하게 달성될 수 있다. 즉, 상기 다른 예에 따르면, 하류 프라이머는 정지코돈에 상보적이지 않아야 한다. 따라서, 증폭된 DNA 단편은 정지코돈을 함유하지 않을 것이며 클로닝 벡터에 클론화될 수 있다. 다르게는, 정지코돈을 갖는 코딩서열을 클로닝 벡터에 클론화하는 것이 또한 가능하다. 상기 정지코돈은 예를들면, 특이적 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 또는 돌연변이발생에 의해 나중에 결실될 수 있다.

클로닝 단계의 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 연속 리딩 프레임이어야 한다.

융합 단백질의 발현을 수득하기 위해 필요한 조절인자는 원하는 발현 시스템에서 발현을 유발하는 임의의 조절인자일 수 있다. 대장균과 같은 원핵세포내에서 융합 단백질을 생성하고자 한다면, 박테리아 또는 파지 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 진핵세포내에서 융합 단백질을 발현시키려 한다면, 진핵세포 또는 바이러스 프로모터/인핸서를 사용하는 것이 바람직하다. 수두 바이러스 프로모터(하기 참조)를 사용함으로써 융합 단백질을 발현시키려 한다면, 7.5 프로모터 또는 ATI 프로모터와 같은 수두 바이러스 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.

언급한 바와 같이, 상기 융합 단백질은 Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev 및 Nef로부터 선택된 HIV 단백질이 아닌 융합 파트너를 포함할 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 다른 단백질 또는 이들 일부의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 단백질의 예는 HIV, Gag, Pol 및 Env 단백질이다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 4개 이상의 조절/부속 HIV 단백질 또는 이들의 유도체를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에서 하나 이상의 추가 단백질 또는 이들 일부에 대한 코딩서열을 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 핵산은 HIV에 대하여 면역반응을 더욱 향상하도록 도울 수 있는 추가 단백질을 코딩하는 각각의 발현 카세트를 더 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 Gag, Pol 및 Env 또는 이들의 일부로부터 선택된 하나 이상의 추가 HIV 단백질의 코딩서열을 포함하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 핵산은 융합 단백질의 코딩 서열이외에 모든 HIV 단백질 Gag, Pol 및 Env의 코딩서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 바람직하게는 벡터의 일부일 수 있다. 상기 핵산은 또한 바이러스 게놈 또는 이들 바이러스 벡터의 일부일 수 있으며, 바람직하게는 MVA와 같은 수두 바이러스 벡터일 수 있다. 따라서, 추가 HIV 단백질, 예를들면 Gag, Pol 및 Env로부터 선택된 하나 이상의 추가 HIV 단백질뿐만 아니라, 수두 바이러스 벡터로부터 융합 단백질을 발현하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 용어 “벡터”는 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 의미한다. 벡터는 pBR322와 같은 플라스미드 벡터 또는 pUC 시리즈의 벡터일 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 본원에서 “바이러스 벡터”는 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 및/또는 약화된 바이러스를 의미한다. 이 경우 본 발명의 핵산은 각각의 바이러스 벡터의 바이러스 게놈의 일부이거나 및/또는 바이러스 게놈을 구성한다. 재조합형 벡터는 세포 및 세포주의 감염 특히, 사람을 포함한 살아있는 동물의 감염에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 일반적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 2(AAV2)를 기본으로 하는 벡터이다. 가장 바람직한 것은 수두 바이러스 벡터이다. 수두 바이러스는 바람직하게는 카나리아 수두 바이러스, 가금류 수두 바이러스 또는 우두 바이러스일 수 있다. 더욱 바람직한 것은, 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)이다(Sutter, G. 등.[1994], Vaccine 12: 1032-40). 일반적인 MVA 균주는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁번호 ECACC V00120707로 기탁되어 있는 MVA 575이다. 가장 바람직한 것은 MVA-BN 또는 이들의 유도체로, 이는 유럽 특허청에 2001년 11월 22일자로 발명의 명칭“변형된 백시니아 바이러스 안카라 변이체”로 출원된 PCT 출원 PCT/EP01/13628에 개시되어 있다. MVA-BN은 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁번호 ECACC V00083008로 기탁되어 있다. MVA-BN 또는 그의 유도체를 사용함으로써 HIV에 대하여 특히 안전한 바이러스 백신을 제공하기 위한 추가적인 기술적 문제가 해결되었는데, 이것은 변형된 백시니아 안카라 바이러스로부터 유도되며 사람의 새포에서 재생적으로 복제할 수 있는 능력이 상실된 것을 특징으로 하는 MVA-BN 바이러스 벡터가 극도로 약화된 바이러스이기 때문이다. MVA-BN은 사람에서 복제성이 결핍됨으로 인하여 다른 공지된 백시니아 바이러스 균주보다 안전하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA를 함유하는 바이러스 벡터로서 MVA-BN 및 MVA-BN 유도체에 관한 것이다. MVA-BN의 특성, MVA가 MVA-BN 또는 이의 유도체인지를 평가하도록 허용하는 생물학적 에세이에 대한 설명 및 MVA-BN 또는 이의 유도체를 수득하도록 허용하는 방법은 참고문헌으로 본 명세서에 인용된 PCT 출원 PCT/EP01/13628호에 개시되어 있다.

따라서, 이들 구체예에 따른 본 발명은 바람직하게는 바이러스 게놈내에 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 MVA-BN과 같은 재조합 MVA에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산을 바이러스 게놈내로 삽입하는 방법 및 재조합 바이러스를 수득하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

재조합 백시니아 바이러스에 있어서, 본 발명에 따른 DNA의 발현은 배타적이지는 않으나, 바람직하게는 수두 바이러스 프로모터, 더 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터의 전사 조절하에서이다. 본 발명에 따른 DNA의 삽입은 바람직하게는 바이러스 게놈의 비-필수 영역내로이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 이종 핵산 서열은 천연적으로 발생하는 수두 바이러스 게놈의 결실부위에 삽입된다(PCT/EP96/02926호에 공개). 그러나, 삽입부위의 특성은 재조합 백시니아 바이러스가 수득되는 한, 본 발명에 있어서 중요하지 않다. 따라서, 당업자는 다른 적합한 삽입부위를 용이하게 생각할 수 있을 것이다.

바람직하게 바이러스 벡터, 특히 수두 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 코딩서열등에도, 바이러스 게놈내의 HIV Gag, Pol 및 Env 유전자로부터 선택된 추가 레트로바이러스 유전자를 포함할 수 있다. 더 바람직하게 바이러스 벡터, 특히 수두 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 코딩 서열외에도, 바이러스 게놈내의 Gag, Pol 및 Env를 코딩하는 모든 HIV 유전자를 포함할 수 있다. 이들 추가 유전자들은 본 발명에 따른 동일한 핵산과 함께 삽입될 것이다. 이 구체예에 따르면, 모든 HIV 유전자는 바이러스 게놈내의 동일한 삽입부위에 위치될 것이다. 다른 구체예로서, 추가 유전자들은 바이러스 게놈의 상이한 위치에 삽입되어 진다.

바람직한 구체예로서 본 발명은 HIV 감염 및 AIDS에 대하여 적어도 부분적 예방을 위한 백신으로서 본 발명에 따른 핵산, 벡터 또는 융합 단백질에 관한 것이다. “백신”은 화합물 즉, 특이적 면역반응을 유도하는 핵산, 융합 단백질, 벡터 또는 바이러스이다.

다른 구체예로서, 본 발명에 따른 “백신”은 본 발명에 따른 융합 단백질을 기본으로 한다.

바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 핵산 특히, DNA는 백신으로 사용된다. 본 발명에서와 같이 진핵세포 발현 카세트를 갖는 네이키드(Naked) DNA를 투여하는 것 특히, DNA를 근육내 투여하는 것은 발현 카세트에 의해 암호화된 단백질의 발현을 유도한다. 상기 단백질은 면역 시스템에 노출되며 특이적 면역 반응이 생긴다. 다른 구체예로서, 예방접종은 본 발명에 따른 벡터, 특히 바이러스 벡터, 더 바람직하게는 수두 바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 MVA 벡터와 같은 백시니아 바이러스 백터를 투여함으로써 이루어진다.

백시니아 바이러스 기제 백신의 제조를 위해, 본 발명에 따른 바이러스는 생리학적으로 허용되는 형태로 전환되어 진다. 이는 수두에 대한 예방접종용으로 사용된 수두 바이러스 백신 제조의 경험을 토대로 행해질 수 있다(Stickl, H. 등. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). 예를들면, 약 10mM 트리스, pH 7.4의 NaCl 140mM에 조제되고 5x10⁸ TCID₅₀/ml의 역가를 갖는 정제된 바이러스를 -80℃에서 저장한다. 백신 주사의 제조를 위해 예를들면, 바이러스의 10²-10⁸ 입자는 앰플내, 바람직하게는 유리 앰플내의 1% 사람 알부민 및 2% 펩톤의 존재하의 100ml의 인산-완충 식염수(PBS)에서 동결건조된다. 다르게는, 백신 주사는 제제에서 바이러스의 순차적 동결-건조에 의해 생성될 수 있다. 이 제제는 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 추가 첨가제 또는 산화 방지제 또는 비활성 가스, 안정화제 또는 생체내 투여에 적합한 재조합 단백질(예를들면, 사람 혈청 알부민)과 같은 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 이어 유리 앰플을 밀봉하고 4℃ 및 실온사이에서 몇개월 동안 저장할 수 있다. 그러나, 다른 요구사항이 없는 한, 상기 앰플은 바람직하게는 -20℃미만에서 저장될 수 있다. 예방접종을 위해, 동결건조물은 0.1 내지 0.5ml의 수용액, 바람직하게는 생리 식염수 또는 트리스 완충액에서 용해되며 전신적으로 또는 국소적으로, 즉 비경구, 근육내 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 형태, 복용량 및 투여횟수는 공지된 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 수두 바이러스 벡터에 대하여 가장 바람직한 투여는 피하 또는 근육내 투여이다.

백신이 본 발명에 따른 DNA를 포함하는 MVA-BN 벡터 또는 이의 유도체라면, 본 발명의 특별한 구체예는 첫번째 접종(“프라이밍 접종”) 및 두번째 접종(“부스팅 접종”) 에서 치료 유효량으로 백신을 투여하는 것에 관한 것이다.

백신이 본 발명에 따른 DNA를 포함하는 MVA-BN 벡터 또는 이의 유도체라면, 본 발명의 특별한 구체예는 첫번째 바이알/용기내에는 첫번째 예방접종(“프라이밍”)용 MVA-BN 바이러스 벡터를 포함하고 또 두번째 바이알/용기내에는 두번째 예방접종(“부스팅”)용의 본 발명에 따른 MVA-BN 바이러스 벡터를 포함하는 예방접종용 키트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 백신 구체예로서, 본원에 따른 핵산, 벡터 또는 융합 단백질을 포함하는 백신 및 백신을 제조하기 위한 상기 핵산, 벡터 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.

다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본원에 따른 융합 단백질, 핵산 또는 백터를 필요로 하는 사람을 비롯한 동물에게 투여함으로써, 사람을 비롯한 동물을 HIV 감염으로부터 보호하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (i) 본원에 따른 핵산 또는 벡터를 사용하여 숙주세포를 형질감염시키는 단계 또는 (ii) 본원에 따른 바이러스 벡터를 사용하여 숙주세포를 감염시키는 단계, (iii) 단계(i)의 형질감염된 숙죽세포 또는 단계(ii)의 감염된 숙죽세포에서 융합 단백질을 발현시키는 단계 및 (iv) 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터에 의해 형질감염되거나 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 의해 감염된 숙주세포에도 관한 것이다.

다른 구체예에 따르면, 융합 단백질은 Vif, Vpr, Vpu, Rev, Vpx 및 Tat로부터 선택된 세개 이상의 상이한 HIV 단백질을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 바람직하게는 상기 HIV 단백질의 4, 5개 또는 모두를 포함할 수 있다. 이 구체예에 따른 전형적인 융합 단백질은 HIV 단백질 Vpr, Vif, Vpu, Rev, Vpx 및 Tat의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 상기 단백질의 아미노산 서열의 유도체를 포함한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 융합 단백질에서 HIV 단백질의 순서는 중요하지 않다. 상기의 특별한 모든 바람직한 구체예는 다른 구체예에 또한 적용된다.

도. 1: 올리고뉴클레오티드 어닐링의 개략도
도면은 4개의 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 나타낸다. 이들은 단일가닥이며 상보적 말단에 의해 어닐링될 수 있다. 갭은 교정 활성을 나타내는 폴리머라아제(예를들면, Pfx 폴리머라아제)로 채워진다.
도. 2: 4개 유전자 블롭의 어닐링의 개략도
vif 유전자는 vpr 단편과 중복서열을 나타내며, vpu 코딩단편은 rev 유전자(회색)와 중복서열을 나타낸다. PCR 단편은 변성되며 중복되는 상보적 말단은 잡종형성한다. 생성된 갭은 Pfx 폴리머라아제를 사용하여 채워진다. vif-vpr 단편은 vpu-rev 단편의 중복서열에 융합되며, 이것은 다시 융합에 사용된다.
도. 3: 외래 유전자를 MVA 게놈내로 삽입하기 위한 재조합 벡터에서 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 서열의 클로닝 수법
융합된 vif, vpr, vpu 및 rev 폴리프로테인 코딩 영역은 Clal Apal 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 증폭된다. 고 pCR 생성물은 수두 바이러스 ATI 프로모터를 함유하는 Clal/Apal로 절단된 벡터 pBNX65에 클론화된다. Tat 코딩 영역은 Acc651 제한부위를 함유하는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭되고 Acc651에 의해 선형으로 된 pBNX65 + vif-rev에 결찰된다. 생성된 발현 카세트(ATI 프로모터 + 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 서열)은 Pacl 제한효소에 의해 분리되어 MVA 게놈 I4L 유전자내 영역(pBNX39)에 외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 벡터내로 삽입된다. pBNX39는 MVA 게놈(F1 I4L 및 F2 I4L)의 삽입부위의 측면 서열에 상동인 서열을 함유한다. MVA 게놈 및 pBNX39의 상동 재조합 후, 재조합 바이러스를 선별하기 위하여 벡터는 대장균 gpt 유전자(포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자)를 함유한다. 재조합 바이러스의 정제 후, 선별 카세트는 Flank 1 및 Flank 1의 반복 서열(F1rpt)간의 상동 재조합에 의해 결실된다.
도. 4: MVA 게놈의 개략도
MVA는 Hind III를 사용한 제한처리 후 특징적인 단편(A-O)을 나타내는 선형 게놈을 함유한다. I4L 및 I5L 유전자간의 비 기능적 영역은 I 단편에 위치한다. pBNX39를 사용한 외래 유전자의 삽입은 56767-56768 위치에서 발생한다.

HIV Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat 융합 단백질을 코딩하는 DNA의 생성

HIV 게놈의 단일 유전자는 표준 PCR 프로토콜을 사용하는 것에 의해 게놈 DNA로부터의 PCR에 의해 또는 중복서열을 통한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 생성된 단일가닥의 갭의 충전을 토대로 하는 수법에 의해 합성적으로 제조하였다.

본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산내로 삽입되는 유전자의 코딩영역 생성을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드로는, 15bp 중복서열을 갖는 40mer 올리고뉴클레오티드를 고안하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 서열은 균주 IIIB로부터 유도된 HIV1 분리체 HXB2R의 게놈 지도를 토대로 한다. 어닐링 반응을 위한 올리고뉴클레오티드 또는 필요한 서열의 분리를 위한 PCR은 생성된 코딩영역에서 번역 종결을 위한 정지코돈이 결실되는 식으로 고안하였다. Tat 유전자는 이 유전자가 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 최종 위치에 삽입시키기 위한 것이어서 정지코돈을 함유하는 올리고를 사용하여 합성하였으므로, 폴리프로테인 번역의 정확한 종결을 위한 정지 트리플릿을 함유하여야 한다.

올리고어닐링 반응을 위해, 두 단계 Pfx 폴리머라아제(Gibco-BRL) 반응(95℃에서 변성 및 68℃에서 어닐링/신장)의 10사이클을 실시하였다. 반응중에 올리고의 중복서열은 어닐링되며 갭은 Pfx 교정 폴리머라아제에 의해 충전된다(도. 1). 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 코딩된 첫번째 유전자인 vif 코딩 영역을 합성하기 위해, 게놈HIV cDNA를 사용하여 PCR을 실시하였다. vif 및 vpr의 연속적인 어닐링을 위해 다음에 오는 vpr 유전자의 첫 15bp에 vif 코딩을 융합하는 방식으로 PCR을 실시하였다. HIV HXB2R 게놈의 bp 5559-5847을 갖는 Vpr 코딩 영역은 10 올리고뉴클레오티드의 어닐링에 의해 제조하였다. 생성된 갭을 채웠으며 증폭을 위한 연속적인 PCR 후에, 생성물은 vpr 코딩영역뒤에 삽입시킬 vif 및 vpu에 대한 측면 영역에 융합된 vpr 코딩영역을 함유하였다.

vif의 합성에 사용된 동일한 cDNA로부터의 PCR에 의해 Vpu 코딩 영역을 증폭시켰으며 생성물은 vpr 및 rev와의 융합을 위한 측면 영역을 함유하였다.

rev 코딩 영역은 HIV HXB2R 게놈의 bp 5970-6045 및 8379-8650를 갖는 14 올리고뉴클레오티드 vpu 및 tat와의 어닐링을 위한 15bp 중복영역과의 어닐링에 의해 제조하였다.

HIV HXB2R 게놈의 bp 5831-6045 및 8379-8466을 갖는 10개 올리고뉴클레오티드를 사용하여 tat 코딩 영역을 만들었다.

vpu 및 rev 코딩 영역뿐만 아니라 vif 및 vpr 코딩 영역은 두 단계 Pfx 폴리머라아제 반응에 의해 이들의 중복을 통한 두개 단편을 어닐링함으로써 융합시켰다(도 2). 융합 단백질의 추가적인 PCR 증폭 후, 상기 단편들을 정제시키고 vpr 및 vpu의 중복을 통하여 서로 결찰시켰다(도 2). 생성물(vif-vpr-vpu-rev에 대한 코딩 서열)의 PCR 증폭 후, 상기 tat 코딩 영역을 vif-vpr-vpu-rev 단편 및 tat를 수두 바이러스 ATI 프로모터를 함유하는 pBluescriptKS + 벡터내의 인접한 클로닝 부위에 클로닝하는 것에 의해 융합시켰다(도 3, pBNX65). 완성된 발현 카세트는 이어 Pacl 제한에 의해 분리시켜 pBNX39내로 삽입시켰다(도 3). pBNX39는 상동 재조합에 의해 게놈(도 4)의 비 코딩 영역(I4L)내로 삽입을 허용하는 MVA 게놈과 상동인 서열을 함유한다.

Claims (26)

1. Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, 및 Tat 중에서 선택된 3개 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 상기 단백질의 아미노산 서열의 유도체를 포함하는 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질은 천연 N 및 C 말단을 갖는 개개의 HIV 단백질로 가공되지 않으며, HIV 단백질의 아미노산 서열의 유도체는 융합 단백질중의 아미노산 서열의 대응되는 부분이 공지된 HIV 분리체의 각 HIV 단백질의 아미노산 서열과 비교될 때, 50-100%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열인 융합 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 상기 상동성이 80-100 %인 융합 단백질.
3. 제 1항에 있어서, 감소된 활성을 갖거나 또는 활성을 전혀 갖지 않는 HIV 단백질을 얻기위해 공지된 HIV 분리체의 각 HIV 단백질의 아미노산 서열과 비교할 때, 아미노산 서열의 유도체에서 10개 이하의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된, 융합 단백질.
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 HIV 단백질이 Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev 및 Tat로부터 선택된 융합 단백질.
5. 제 1항에 있어서, HIV 단백질 Vif, Vpr, Vpu, Rev 및 Tat의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 상기 단백질의 아미노산 서열의 유도체를 포함하는 융합 단백질.
6. 제 1항에 있어서, 두 개 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열이 추가 아미노산 없이 서로 융합된, 융합 단백질.
7. 제 1항에 있어서, 두개 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열이 하나 이상의 추가 아미노산에 의해 분리된, 융합 단백질.
8. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 HIV 단백질의 아미노산 서열이 Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, 및 Tat 중에서 선택된 HIV 단백질이 아닌 융합 파트너에 융합된, 융합 단백질.
9. 제 1항에 기재된 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
10. 제 9항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 핵산.
11. 제 10항에 있어서, 상기 DNA로부터 융합 단백질의 발현이 진핵세포, 원핵세포 및 바이러스 프로모터로부터 선택된 조절요소에 의해 조절되는 핵산.
12. 제 11항에 있어서, 상기 바이러스 프로모터가 수두바이러스 프로모터인 핵산.
13. 제 9항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 Gag, Pol 및 Env로부터 선택된 하나 이상의 추가 HIV 단백질에 대한 코딩 서열을 더 포함하는 핵산.
14. 제 13항에 있어서, 상기 핵산이 HIV Gag, Pol 및 Env 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산.
15. 제 9항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
16. 제 15항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 벡터.
17. 제 16항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 백시니아 바이러스 벡터인 벡터.
18. 제 17항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 벡터가 MVA(Modified Vaccina Virus Ankara)인 벡터.
19. 제 18항에 있어서, 상기 MVA가 European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)에 기탁번호 V00120707로 기탁된 MVA-575 및 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁된 MVA-BN으로부터 선택된 벡터.
20. - 제 9항에 기재된 핵산 또는 제 15항에 기재된 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 또는
    - 제 16항 내지 제 17항중 어느 한 항에 기재된 바이러스 벡터로 숙주세포를 감염시키는 단계,
    - 상기 형질감염된 숙주세포 또는 상기 감염된 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    - 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1항에 기재된 단백질의 제조방법.
21. 제 9항에 기재된 핵산 또는 제 15항에 기재된 벡터로 형질감염되거나 제 16항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스 벡터로 감염된 숙주세포.
22. HIV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 의약 또는 백신으로 사용되는 제 1항에 기재된 융합 단백질.
23. HIV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 의약 또는 백신으로 사용되는 제 9항에 기재된 핵산.
24. HIV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 의약 또는 백신으로 사용되는 제 15항 내지 제 19항중 어느 한 항에 기재된 벡터.
25. 제 1항에 기재된 융합 단백질, 제 9항에 기재된 핵산 또는 제 15항 내지 제 19항에 기재된 벡터를 포함하는 백신.
26. 제 1항에 기재된 융합 단백질, 제 9항에 기재된 핵산 또는 제 15항 내지 제 19항중 어느 한 항에 기재된 벡터를 HIV 감염에 대한 보호가 필요한 사람을 제외한 동물에게 투여함으로써 사람을 제외한 동물을 HIV 감염으로부터 보호하는 방법.

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