CN105330729A - 一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法。制备方法包括：以SEQ？ID？No：3~4为引物，GenBank登录号NC_001802的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶Nde？I和Xba？I对PCR产物和pColdII载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，培养后用诱导物诱导表达，经超声破碎后对蛋白质进行分离纯化。本发明获得的人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富，可以应用于HIV-1？Vpr抗体检测，以及可溶性Vpr蛋白的功能研究。

Description

一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒1型（humanimmunodeficiencyvirustype1，HIV-1）感染导致的获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）是在全球广泛流行的严重疾病。HIV-1基因组包含gag（编码基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白等）、pol（编码蛋白酶、反转录酶和整合酶等）、env（编码包膜蛋白gp120和gp41等）三种结构基因，以及tat、rev、nef、vpr、vpu、vif六种调节/辅助基因[1]（[1]FrankelAD,YoungJA.HIV-1:fifteenproteinsandanRNA[J].Annualreviewofbiochemistry.1998,67:1-25.），这些基因各自以不同的方式调节着HIV-1的生物学功能。
病毒蛋白R（viralproteinR，Vpr）是由96个氨基酸组成、分子量大小约为14kD的辅助蛋白，通过与Gag蛋白p6区域直接作用而包装于HIV-1病毒颗粒[2]（[2]MullerB,TessmerU,SchubertU,KrausslichHG.Humanimmunodeficiencyvirustype1Vprproteinisincorporatedintothevirioninsignificantlysmalleramountsthangagandisphosphorylatedininfectedcells[J].Journalofvirology.2000,74(20):9727-31.）。Vpr在HIV-1病毒复制与致病过程中发挥着重要作用，如促进整合前复合体的核运输[3]（[3]VodickaMA,KoeppDM,SilverPA,EmermanM.HIV-1Vprinteractswiththenucleartransportpathwaytopromotemacrophageinfection[J].Genes&development.1998,12(2):175-85.）、加强逆转录过程的保真度[4]（[4]RogelME,WuLI,EmermanM.Thehumanimmunodeficiencyvirustype1vprgenepreventscellproliferationduringchronicinfection[J].Journalofvirology.1995,69(2):882-8.）、诱导细胞周期阻滞于G2/M期从而抑制细胞增殖[5]（[5]AndersenJL,LeRouzicE,PlanellesV.HIV-1Vpr:mechanismsofG2arrestandapoptosis[J].Experimentalandmolecularpathology.2008,85(1):2-10.）、反式激活HIV-1长末端重复序列以诱导病毒基因转录和翻译等[6]（[6]WangL,MukherjeeS,JiaF,NarayanO,ZhaoLJ.InteractionofvirionproteinVprofhumanimmunodeficiencyvirustype1withcellulartranscriptionfactorSp1andtrans-activationofvirallongterminalrepeat[J].TheJournalofbiologicalchemistry.1995,270(43):25564-9.）。目前研究发现，Vpr蛋白在HIV-1感染细胞的胞浆与胞核中均有表达[7-8]（[7]JacquotG,LeRouzicE,DavidA,MazzoliniJ,BouchetJ,BouazizS,etal.LocalizationofHIV-1Vprtothenuclearenvelope:impactonVprfunctionsandvirusreplicationinmacrophages[J].Retrovirology.2007,4:84.[8]SubbramanianRA,Kessous-ElbazA,LodgeR,ForgetJ,YaoXJ,BergeronD,etal.Humanimmunodeficiencyvirustype1Vprisapositiveregulatorofviraltranscriptionandinfectivityinprimaryhumanmacrophages[J].TheJournalofexperimentalmedicine.1998,187(7):1103-11.）；更为重要的是，Vpr蛋白可以释放入AIDS患者的血清和脑脊液中，并被多种细胞所摄取[9-10]（[9]LevyDN,RefaeliY,MacGregorRR,WeinerDB.SerumVprregulatesproductiveinfectionandlatencyofhumanimmunodeficiencyvirustype1[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1994,91(23):10873-7.[10]LevyDN,RefaeliY,WeinerDB.ExtracellularVprproteinincreasescellularpermissivenesstohumanimmunodeficiencyvirusreplicationandreactivatesvirusfromlatency[J].Journalofvirology.1995,69(2):1243-52.）。在AIDS患者血清中，Vpr浓度约为1-10ng/mL[11]（[11]HoshinoS,SunB,KonishiM,ShimuraM,SegawaT,HagiwaraY,etal.VprinplasmaofHIVtype1-positivepatientsiscorrelatedwiththeHIVtype1RNAtiters[J].AIDSresearchandhumanretroviruses.2007,23(3):391-7.）。因此Vpr蛋白在HIV-1感染过程中起到的重要作用可通过多种机制实现，其中存在于体液中的Vpr蛋白能够进入并破坏未感染的细胞，并诱导正常细胞的凋亡，可作为应用于肿瘤基因治疗的潜在蛋白。
既往对于Vpr的研究通常以完整病毒感染作为模型，但基于生物安全性方面的考虑，研究者们现在更倾向于通过单独表达的胞外Vpr蛋白来研究其生理作用。例如从患者血清和脑脊液中纯化得到具有功能的Vpr蛋白，并且纯化所得的Vpr蛋白在CD4+T细胞和神经元细胞中分别具有反式激活和细胞毒作用[9]。但从AIDS患者血清和脑脊液中获得Vpr蛋白的方法存在以下不足：一是在操作过程中仍然存在安全隐患；二是制备方法的复杂性；三是获得的Vpr蛋白纯度不够理想，抗原性不强。本发明提供的利用原核表达系统获得的HIV-1Vpr重组蛋白纯度较高，具有抗原性，能够以可溶性蛋白的形式被B淋巴细胞和内皮细胞所摄取，进入细胞后可发挥诱导细胞凋亡的功能，并且制备过程相对安全简单，能够用于Vpr抗体的检测，对于研究HIV-1的致病机制和检测方法具有重要的理论和临床意义。
发明内容
发明目的：本发明提供一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法，根据HIV-1Vpr基因构建重组原核表达质粒pColdII-Vpr，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）在大肠杆菌中诱导重组蛋白表达，并通过镍柱亲和层析法进行纯化，制备人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白。
本发明的技术方案：
一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法，包括如下步骤：以SEQIDNo：3~4为引物，GenBank登录号NC_001802的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶NdeI和XbaI对PCR产物和pColdII载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，培养后用诱导物诱导表达，经超声破碎后对蛋白质进行分离纯化。
所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃1min，62℃1min，72℃1min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7min。
所述PCR产物与pColdII载体的体积比为7:1。
所述诱导物为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白在检测人类免疫缺陷病毒Vpr抗体中的应用。
有益效果：
（1）本发明根据HIV-1Vpr基因序列制备重组蛋白，获得的重组蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富。
（2）本发明可以应用于HIV-1Vpr抗体检测，以及可溶性Vpr蛋白的功能研究。
附图说明
图1为HIV-1Vpr基因的PCR扩增。其中M：LammdaDNAMarker；1：以质粒pCI-neo-Vpr为模板的PCR扩增产物。
图2为重组原核表达质粒pColdII-Vpr的双酶切鉴定。M：LammdaDNAMarker；1：未酶切的pColdII-Vpr质粒；2：pColdII-Vpr质粒的PCR鉴定；3：pColdII-Vpr质粒双酶切后。
图3为不同浓度IPTG诱导Vpr蛋白的表达情况。M：蛋白标准参照物；1：未使用IPTG诱导；2：浓度为0.4mM的IPTG诱导；3：浓度为0.6mM的IPTG诱导；4：浓度为0.8mM的IPTG诱导；5：浓度为1.0mM的IPTG诱导。
图4为超声破碎后上清与沉淀中Vpr蛋白的SDS-PAGE鉴定。M：蛋白标准参照物；1：上清；2：包涵体。
图5为纯化后Vpr重组蛋白的SDS-PAGE鉴定。M：蛋白标准参照物；1：蛋白纯化产物。
图6为Vpr重组蛋白的Westernblot鉴定。（A）取纯化后的Vpr重组蛋白，采用抗-His-tag抗体进行Westernblot检测。1：未经IPTG诱导的pColdII-Vpr；2：经1.0mMIPTG诱导后上清过柱纯化的蛋白产物。（B）取纯化后的Vpr重组蛋白，采用抗-Vpr抗体进行Westernblot检测。1：未经IPTG诱导的pColdII-Vpr；2.经1.0mMIPTG诱导后上清过柱纯化的蛋白产物。
图7为可溶性Vpr蛋白进入卡波氏肉瘤病毒（Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV）潜伏感染的原发性渗出性淋巴瘤（primaryeffusionlymphoma，PEL）细胞和端粒酶永生化的人脐静脉内皮细胞（long-term-infectedtelomerase-immortalizedhumanumbilicalveinendothelialcells，TIVE-LTCs）的情况。（A）100ng/mL可溶性Vpr蛋白分别加入两种PEL细胞系BC-3与BCBL-1细胞悬液6h后的IFA图片，其中KSHV编码的潜伏相关核抗原（latency-associatednuclearantigen，LANA）以红色荧光标示，可溶性Vpr蛋白以绿色荧光标示，细胞核以蓝色荧光标示，Merge代表红色荧光、绿色荧光、蓝色荧光融合后图片；（B）100ng/mL可溶性Vpr蛋白加入TIVE-LTC细胞培养液6h后的IFA图片，其中LANA以橙色荧光标示，可溶性Vpr蛋白以绿色荧光标示，骨架蛋白Tubulin以红色荧光标示，细胞核以蓝色荧光标示，Merge代表橙色荧光、绿色荧光、红色荧光、蓝色荧光融合后图片。
图8为可溶性Vpr蛋白对BC-3细胞凋亡的影响。（A）将浓度依次为0、1、10、100、200、500ng/mL的可溶性Vpr蛋白分别加入BC-3细胞悬液中，48h后通过流式细胞术进行细胞凋亡检测的散点图结果；（B）图8A的结果统计。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细介绍。
实施例1：人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备
1.材料
1.1质粒与菌株
含Vpr基因的真核表达质粒pCI-neo-Vpr的构建方法可按照参考文献（方欣,卢春,曹戌,李久明,秦娣,吕志刚.HIV-1编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响[J].南京医科大学学报(自然科学版).2008(09).）公开的方法进行制备，该质粒含全长96个氨基酸的Vpr天然序列。表达载体pColdII购自日本Takara公司。宿主菌E.coliBL21（DE3）为天根生化科技（北京）有限公司产品。
1.2试剂
核酸标准分子量Marker（LambdaDNA/HindIII+EcoRI）购自美国Thermo公司。限制性内切酶购自日本Takara公司。TaqDNA聚合酶及dNTP均购自美国Promega公司。质粒小量提取试剂盒（PlasmidMiniKitI）与凝胶纯化回收试剂盒（GelExtractionKit）购自美国Omega公司。T4DNA连接酶购自美国Fermentas公司。蛋白纯化试剂盒购自美国Novagen公司。抗-His-tag单克隆抗体（monoclonalantibody，MAb）为中国碧云天公司产品。抗-VprMAb购自美国SantaCruzBiotechnology公司。凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司。梯度PCR仪器为北京东胜创新生物科技有限公司产品。SCIENTZJY92-IN超声波细胞粉碎仪器购自宁波新芝生物公司。
2.方法
2.1引物设计与合成
根据含Vpr基因的真核表达质粒pCI-neo-Vpr序列（GenBankNC_001802）设计一对特异性引物。上游引物5’端引入NdeI限制性酶切位点，下游引物5’端引入XbaI限制性酶切位点，即上游引物：5’-GGAATTCCATATGGAACAGGCTCCGGAAGACCAGGGTCCGCAG-3’（SEQIDNo：3，下划线部分为NdeI识别序列）；下游引物：5’-AGAGTTCTAGATTAAGAACGAGAAGCACCG-3’（SEQIDNo：4，下划线部分为XbaI识别序列）。
2.2Vpr基因的PCR扩增
以pCI-neo-Vpr质粒作为模板，使用上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCRbuffer5μl，dNTP4μl，上下游引物各1μl，ddH2O37μl，DNA1μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）1μl，总体积50μl。反应条件如下：95℃预变性5min，然后95℃1min，62℃1min，72℃1min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7min。产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分析，并依照DNA凝胶电泳回收试剂盒说明书操作，纯化回收目的基因片段。
2.3原核表达载体的构建与鉴定
用限制性内切酶NdeI和XbaI分别双酶切纯化的PCR产物和pColdII载体，37℃水浴过夜。酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收并进行纯化。取上述双酶切后纯化回收的PCR产物与pColdII载体（体积比为7：1），加入T4DNA连接酶及其buffer各1μl，4℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α：取全部连接产物共10μl，感受态细胞DH5α60μl，各自冰浴10min，混合后再冰浴25min，42℃水浴90sec，冰浴5min后加入700μl预热的LB液体培养基，37℃低速震荡50min，最后取适量涂抹于含氨苄青霉素（Amp+）的LB平板，37℃倒置培养过夜。次日挑取单个克隆菌落，37℃震荡过夜。小量提取质粒DNA后，通过NdeI与XbaI双酶切及PCR扩增鉴定，同时送DNA提取产物进行测序鉴定，将测序正确的含有人类免疫缺陷病毒Vpr基因的重组原核表达质粒命名为pColdII-Vpr。
2.4目的基因在大肠埃希菌中的融合表达
将pColdII-Vpr转化BL21（DE3）感受态细胞，次日挑取单个克隆并接种于LB液体培养基，37℃、225r/min振荡过夜。取过夜的菌液以1∶50比例再次接种至新鲜的LB液体培养基，继续振荡培养约3h。当菌液浓度（600nm处OD值）为0.4～0.5时，将菌液置于15°C孵育30min。加入体积不等的IPTG至其终浓度依次为0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM，以15℃低温继续振荡培养24h。离心收集菌体，其中沉淀用PBS洗涤2次后重悬。取适量菌液蛋白加入电泳上样缓冲液，100℃煮沸5-6min，离心后取上清用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），以考马斯亮蓝染色。
取6mL含pColdII-Vpr的诱导菌液，10000r/min，低温离心20min收集菌体。PBS洗涤2次后，重悬于250μLPBS中，对菌体进行冰上超声破碎，其后低温12000r离心15min，并分别收集上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。
2.5重组蛋白的纯化
取80mL表达菌液，3000r/min离心50min收集菌体，PBS洗涤沉淀2次，使用4mL结合缓冲液重悬上述菌体，加入3mg溶菌酶，置于30℃水浴25min，使菌体充分裂解。将菌体裂解液置于冰上，对其进行大功率超声裂解，工作3s与间歇5s交替进行，共计裂解40次。于4℃12000r/min离心10min沉淀菌体碎片，上清转移至新的离心管中。将上清加入已进行过预处理的亲和层析柱中，按照产品说明书操作进行纯化。分段收集洗脱液后再次进行SDS-PAGE电泳以鉴定纯化效果。
2.6重组蛋白的Westernblot鉴定
分别取未诱导以及诱导后重组菌全菌液经超声破碎后过柱纯化的上清，与蛋白上样缓冲液SDS混匀，100℃煮沸5-6min，冰浴3min，4℃12000r/min离心5min后取上清进行SDS-PAGE电泳：配置12%SDS-PAGE电泳凝胶，取上述制备的蛋白样品，每孔加样12μg，先以60V低电压电泳30min，待蛋白样品进入分离胶后加压至100V继续电泳90min。恒流80mA30min将蛋白以湿转法转印至0.22μmPVDF膜上，5%脱脂牛奶37℃封闭1h后，加以一抗稀释液1∶1000稀释的抗-VprMAb或抗-His-tagMAb4℃孵育过夜，TBS-T（含Tris-HCl，NaCl，Tween-20）洗涤3次，每次5min，加以5%脱脂牛奶1：4000稀释的HRP标记驴抗羊抗体或羊抗小鼠抗体37℃孵育1h，TBS-T洗涤10min×3次后，使用增强的化学发光试剂检测并采集图像。
3.实验结果
3.1重组原核表达质粒pColdII-Vpr的构建与鉴定结果
以pCI-neo-Vpr质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在312bp处出现与预期的Vpr基因片段大小相符的条带（图1）。将Vpr基因克隆至pColdII载体中，转化大肠杆菌DH5α，挑取Amp+LB平板上的单个菌落摇菌过夜并进行菌液PCR。琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约312bp处可观察到与预期相符的目的片段（图2）。以NdeI和XbaI双酶切重组质粒pColdII-Vpr，琼脂糖凝胶电泳呈现出两条特异性条带，其大小分别约为4392bp和312bp，即代表载体pColdII与Vpr基因（图2）。对重组质粒pColdII-Vpr进行核酸序列测定，经Blast比对结果显示克隆的基因序列和GenBank中已登记的Vpr序列完全一致，表明Vpr基因已被成功克隆到pColdII表达载体中。
3.2重组蛋白的表达与纯化
对由不同浓度的IPTG所诱导的菌体蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳。结果显示，相比于未诱导组，在0.4-1.0mMIPTG的诱导下，菌体蛋白在相对分子质量约为14kD处均出现特异性条带，这与重组表达融合蛋白Vpr的预期分子量大小一致；且在该浓度范围内，蛋白表达量随着IPTG用量的增大而逐渐增加，并于IPTG浓度为1.0mM时达到最大表达量（图3），故将1.0mM作为IPTG的最适诱导浓度。
将诱导菌超声破碎后，取上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。结果显示，上清和沉淀样品于14kD处均出现特异性蛋白条带，但沉淀部分的条带较浅，表明菌体表达的重组融合蛋白大部分以可溶性形式存在，另有小部分以不溶性包涵体形式存在（图4）。由于考虑到大部分重组蛋白存在于上清中，故实验通过镍柱亲和层析法纯化上清中的重组蛋白，并使用SDS-PAGE鉴定上清过柱后的蛋白表达水平（图5），结果显示纯化获得的产物具有较高的纯度。
3.3重组蛋白的鉴定
分别使用抗-VprMAb以及抗-His-tagMAb对纯化后的融合蛋白进行Westernblot检测，可见与未诱导组相比，经IPTG诱导的菌体上清在纯化后出现了相对分子质量约为14kD的蛋白产物（图6），表明纯化后的重组蛋白可与Vpr抗体以及His标签抗体作用。以上结果表明，带有His标签的重组Vpr蛋白已被成功表达，可以应用于检测人类免疫缺陷病毒Vpr抗体。
实施例2：人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的应用
1.材料
1.1细胞
PEL细胞系BC-3与BCBL-1细胞均为从PEL中分离的KSHV阳性、EBV阴性的B淋巴细胞系；BC-3与BCBL-1细胞生长于含10%灭活的胎牛血清以及2mmol/L左旋谷氨酰胺的RPMI1640培养基中。TIVE-LTCs为人工构建的稳定表达KSHV的内皮细胞系[12]（[12]AnFQ,FolarinHM,CompitelloN,RothJ,GersonSL,McCraeKR,etal.Long-term-infectedtelomerase-immortalizedendothelialcells:amodelforKaposi'ssarcoma-associatedherpesviruslatencyinvitroandinvivo[J].Journalofvirology.2006,80(10):4833-46.）。TIVE-LTC细胞生长于含10%灭活的胎牛血清以及2mmol/L左旋谷氨酰胺的DMEM培养基中。以上细胞均在5%CO2、37℃条件下培养。为防止细菌污染，常规细胞培养基中均加入青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）以及庆大霉素（100μg/mL）。本研究中细胞培养所用的培养基（RPMI1640与DMEM）以及胎牛血清均购自美国Gibco公司。
1.2试剂
细胞凋亡检测试剂盒AnnexinV：FITCApoptosisDetectionKit为美国BDBiosciences公司产品。激光共聚焦专用玻底皿购自中国NEST公司。抗-KSHVLANAMAb为美国Abcam公司产品。抗-HIV-1VprMAb、抗-α-tubulinMAb、抗-β-tubulinMAb、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记驴抗山羊IgG均购自美国SantaCruzBiotechnology公司。AlexaFluor488标记小鼠抗山羊IgG购自北京博奥森公司。AlexaFluor647标记山羊抗兔IgG、Cy3标记山羊抗大鼠IgG、Westernblot一抗稀释液与4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）均购自中国碧云天公司。
2.方法
2.1IFA检测可溶性Vpr蛋白进入潜伏感染KSHV的PEL细胞和内皮细胞的情况
将5×104个TIVE-LTC细胞接种于玻底培养皿，常规培养16-24h。待其贴壁后于培养基中加入0.12mg/ml的可溶性Vpr蛋白使其终浓度为100ng/mL；此时将BC-3与BCBL-1细胞以1×106个/孔密度接种于12孔板中，亦加入可溶性Vpr蛋白至其终浓度为100ng/mL。上述三种细胞分别与Vpr蛋白作用6h后，吸弃TIVE-LTC培养上清，用冰冷的PBS洗涤一次；同时离心收集BC-3与BCBL-1细胞，用冰冷的PBS于4℃12000r/min离心5min，取约1×105个细胞涂于玻底培养皿中。空气干燥后取预冷的丙酮固定细胞，经0.5%TritonX-100于37℃作用30min穿细胞膜，再以0.5%BSA于37℃封闭25min。对于BC-3与BCBL-1细胞加以0.5%BSA1：500稀释的抗-LANAMAb与1：500稀释的抗-VprMAb，对于TIVE-LTC细胞还需再加入0.5%BSA1：500稀释的抗-β-tubulinMAb，以上一抗均于4℃湿盒内孵育过夜。次日PBS洗涤后，对于BC-3与BCBL-1细胞加以0.5%BSA1：200稀释的AlexaFluor488标记小鼠抗羊IgG和Cy3标记山羊抗大鼠IgG；对于TIVE-LTC细胞还需再加入1：200稀释的AlexaFluor647标记山羊抗兔IgG。以上二抗均于37℃湿盒中孵育45min，再用PBS洗涤3次，每次10min。每皿内加入1mLDAPI，37℃作用10min，洗涤5min后避光送至ZeissLSM710激光扫描共聚焦显微镜进行拍照观测。
2.2流式细胞术检测细胞凋亡
将BC-3细胞以5×105个/孔细胞数接种于12孔板中，每孔加入不同体积的可溶性Vpr蛋白，使其终浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。不同浓度的可溶性Vpr蛋白与BC-3细胞共孵育48h后，将各孔细胞吹打混匀，1500r/min室温离心3min。弃上清，以BindingBuffer重悬细胞。每个样品中加入50μL异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的膜联蛋白V（AnnexinV）与50μL碘化丙啶（PI），轻柔吹打混匀，室温避光染色15min，随后用流式细胞仪对BC-3细胞进行凋亡检测。
3.实验结果
3.1可溶性Vpr蛋白能够被潜伏感染KSHV的PEL细胞和内皮细胞所摄取
为检测可溶性Vpr蛋白能否进入潜伏感染KSHV的BC-3、BCBL-1与TIVE-LTC细胞，将100ng/mL可溶性Vpr蛋白分别加入上述三种细胞中，作用6h后收取细胞。通过激光共聚焦显微镜观察发现，几乎所有的BCBL-1，以及部分BC-3细胞与TIVE-LTC细胞的胞浆与胞核周缘区域均能够检测到Vpr蛋白的分布（图7）；并且，作用24h后至少60%的BC-3与TIVE-LTC细胞中出现Vpr蛋白的聚集。提示，所制备的可溶性Vpr蛋白可模拟被HIV-1感染细胞所释放的Vpr蛋白，被潜伏感染KSHV的PEL细胞系BC-3、BCBL-1细胞以及内皮细胞系TIVE-LTC细胞所摄取。
3.2可溶性Vpr蛋白对BC-3细胞凋亡的影响
为了确认进入BC-3细胞的可溶性Vpr蛋白是否能够引起细胞凋亡，将不同体积的可溶性Vpr蛋白加入BC-3细胞悬液中，使其终浓度依次为0、1、10、100、200、500ng/mL，共孵育48h后通过流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测。结果显示，当Vpr蛋白浓度达到500ng/mL时，BC-3细胞中出现凋亡细胞的比例明显增加（图8）。提示所制备的可溶性Vpr蛋白具有一定的诱导凋亡作用。
另外，本发明不限于上述实施方式，只要在不超出本发明的范围内，可以采取各种方式实施本发明。
序列表
<110>南京医科大学
<120>一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法
<130>
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>292
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atggaacaagccccagaagaccaagggccacagagggagccacacaatgaatggacacta60
gagcttttagaggagcttaagaatgaagctgttagacattttcctaggatttggctccat120
ggcttagggcaacatatctatgaaacttatggggatacttgggcaggagtggaagccata180
ataagaattctgcaacaactgctgtttatccattttcagaattgggtgtcgacatagcag240
aataggcgttactcgacagaggagagcaagaaatggagccagtagatcctag292
<210>2
<211>96
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
MetGluGlnAlaProGluAspGlnGlyProGlnArgGluProHisAsn
151015
GluTrpThrLeuGluLeuLeuGluGluLeuLysAsnGluAlaValArg
202530
HisPheProArgIleTrpLeuHisGlyLeuGlyGlnHisIleTyrGlu
354045
ThrTyrGlyAspThrTrpAlaGlyValGluAlaIleIleArgIleLeu
505560
GlnGlnLeuLeuPheIleHisPheArgIleGlyCysArgHisSerArg
65707580
IleGlyValThrArgGlnArgArgAlaArgAsnGlyAlaSerArgSer
859095
<210>3
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ggaattccatatggaacaggctccggaagaccagggtccgcag43
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agagttctagattaagaacgagaagcaccg30

Claims (5)

1.一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQIDNo：3~4为引物，GenBank登录号NC_001802的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶NdeI和XbaI对PCR产物和pColdII载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，培养后用诱导物诱导表达，经超声破碎后对蛋白质进行分离纯化。
2.根据权利要求1所述一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃1min，62℃1min，72℃1min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7min。
3.根据权利要求1所述一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR产物与pColdII载体的体积比为7:1。
4.根据权利要求1所述一种人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导物为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
5.权利要求1所得人类免疫缺陷病毒Vpr蛋白在检测人类免疫缺陷病毒Vpr抗体中的应用。
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