CN102643835A

CN102643835A - 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

Info

Publication number: CN102643835A
Application number: CN2012101300042A
Authority: CN
Inventors: 曾令兵; 高正勇; 张辉; 周勇; 孟彦
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2012-08-22

Abstract

本发明公开了一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用，其步骤是：1)根据GSIV-MCP基因序列，设计引物；2)用EPC细胞培养GSIV，抽提病毒核酸为模板，PCR扩增；3)将纯化的PCR产物插入到PET-32(a)，得到重组表达载体；4)重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组菌株；5)使用不同IPTG浓度及不同的诱导时间诱导重组菌株，获得最佳诱导条件；6)经过诱导的重组菌株经超声波破碎处理，经蛋白纯化试剂盒纯化，得到纯化的重组蛋白；7)纯化后的重组蛋白采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。该多克隆抗体经ELISA效价检测，具有滴度高，特异性强。为GSIV的快速检测试剂盒及大鲵病毒性出血病的防治奠定基础。

Description

大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备；同时还涉及一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备方法；还涉及一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的应用。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus)俗名“娃娃鱼”，是现存个体最大的两栖动物，属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科。中国大鲵是我国珍贵特产，属于国家二级保护动物。然而随着其养殖规模的扩大以及集约化程度的提高大鲵病害越来越严重，已经成为制约大鲵产业健康发展的一个重要因素。近年来许多大鲵养殖场暴发了大鲵病毒性出血病，该病传染性强、死亡率高达90％以上，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。其病原为大鲵虹彩病毒(Chinese giantsalamander iridovirus，GSIV)，虹彩病毒的一个主要特征是具有直径为120-300nm二十面体衣壳结构，由一种分子量约50kDa的主衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)构成，该结构蛋白占病毒蛋白总量的40％-45％(ChincharV G，2005)。虹彩病毒的主衣壳蛋白不仅是病毒的抗原相关蛋白，并且在病毒的包装和感染过程中发挥重要作用。

因此GSIV-MCP基因的原核表达、多克隆抗体的制备将为GSIV现场快速检测试剂盒的研制及大鲵病毒性出血病的防治奠定一定的基础。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白基因与PET-32(a)原核表达载体融合表达的重组蛋白，简称为PET-GSIV-MCP。大鲵彩病毒主衣壳蛋白(major capsidprotein，MCP)，分子量约50kDa，占病毒蛋白总量的40％-45％(ChincharV G，2005)，是虹彩病毒的抗原相关蛋白，在病毒的包装和感染过程中发挥重要作用。本发明将MCP基因克隆到原核表达系统PET-32(a)(Novagen)中，可以方便的制备大量融合表达的重组蛋白。该重组蛋白带有6xHis Tag，便于纯化。经蛋白纯化试剂盒处理后，为一种高纯度的可溶性蛋白。该蛋白可以直接免疫实验动物进行抗血清的制备，也可以直接免疫大鲵为大鲵提供免疫保护力。MCP基因具有高度的保守性，目前本实验室已经对湖北、湖南、陕西、浙江等地的大鲵病毒进行了MCP基因的扩增及序列比对，其相互之间MCP基因核苷酸序列的同源性高达99％以上。因此GSIV-MCP基因原核表达蛋白及多克隆抗体的制备对于全国各地GSIV的检测及大鲵病毒性出血病的免疫防治提供了可能。

本发明的另一个目的是在于提供了一种重组蛋白(PET-GSIV-MCP)的多克隆抗体。该多克隆抗体经ELISA效价检测，具有滴度高，特异性强等特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备方法。表达蛋白经过纯化免疫新西兰大白兔，制备并纯化了PET-GSIV-MCP的多克隆抗体。经ELISA效价检测，制备的多克隆抗体具有滴度高，特异性强等特点。

本发明的再一个目的是在于提供了一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白的多克隆抗体在检测GSIV中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

以EPC细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCGDC0174)培养GSIV。病毒DNA提取试剂盒(OMEGA，Viral DNA Kit)抽提病毒核酸为模板，PCR扩增得到GSIV-MCP基因。将GSIV-MCP基因克隆至原核表达载体PET-32(a)(Novagen)，采用的载体PET-32(a)(Novagen)含有6个His标签，外源基因与载体融合表达，但不影响其免疫原性，因此制备的多克隆抗体特异性不受影响。重组表达载体PET-32(a)-MCP转化至感受态细胞E.coli.BL21(DE3)(Novagen)中，构建了重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，通过诱导表达条件(IPTG浓度、时间)的优化，PET-32(a)-MCP在E.coli.BL21(DE3)(Novagen)中得到了高效表达。融合表达的重组蛋白经过简单处理，经蛋白纯化试剂盒(Promega，HisLink SpinProtein Purification System)纯化得到了高纯度的可溶性蛋白。以此蛋白免疫新西兰大白兔，制备了PET-GSIV-MCP的抗血清，抗血清经过抗体亲和纯化，得到纯度较高的PET-GSIV-MCP的多克隆抗体。

一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白、多克隆抗体的制备方法，其步骤是：

1)根据GSIV-MCP基因序列(GenBank accession number：JN615141.1)，设计特异性引物：PET-MCP-FP：5′-CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG-3′含有EcoRI酶切位点；PET-MCP-RP：5′-CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3′含有HindIII酶切位点。所述GSIV-MCP基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，经翻译后为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2)用EPC细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCGDC0174)培养GSIV，病毒DNA提取试剂盒(OMEGA，Viral DNA Kit)抽提病毒核酸为模板，进行PCR扩增。扩增产物经PCR产物及胶回收试剂盒(Promega，Wizard Sv Gel and PCR Clean upSystem)回收纯化。PCR采用50μL反应体系：10×PCR Buffer 5μL，10mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L PET-MCP-FP和10μmol/L PET-MCP-RP各1μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板为1μL，ddH₂O补足至50μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR产物及胶回收试剂盒回收纯化。

其中大鲵虹彩病毒(GSIV)，其制备步骤是：于T-25细胞培养瓶中接种EPC细胞，培养至汇合单层，弃去培养液，用无菌的Hank′s液洗涤细胞1次，取保存的细胞培养病毒液，以感染复数(Multiplicity ofInfection，MOI)为5的量接种到细胞培养瓶中，加入适量的助感染剂Polybrene(终浓度10μg/mL)，置于25℃培养箱中吸附1h，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶3-5次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后，弃去病毒液，每瓶加人5mL细胞维持液(含2％血清的MEM培养基)，置于25℃培养箱中继续培养，逐日观察细胞病变情况。当细胞单层出现70％-80％细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时，收获细胞培养物，-80℃-室温条件下冻融2次，于4℃条件下以4000r/min离心20min，弃去沉淀，病毒液分装于冻存管中-80℃保存备用。

3)将纯化的PCR产物和PET-32(a)(Novagen)分别用EcoRI和HindIII双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体PET-32(a)-MCP。

4)重组表达载体PET-32(a)-MCP转化大肠杆菌感受态细胞E.coli.BL21(DE3)(Novagen)，PCR筛选阳性菌株，得到重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，将PET-32(a)-MCP/BL21接种于LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃200r/min培养过夜。按1∶100的比例接种到新鲜LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃200r/min至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入1mM IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析。将诱导后的菌体进行超声破碎处理，收集处理后的上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，以确定原核表达蛋白的表达形式。

所述的E.coli.BL21(DE3)(Novagen)菌株是以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。所述重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21可以LB培养基中快速增殖，在IPTG的诱导下高效表达目的蛋白。

5)重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，分别使用不同IPTG浓度(1mM、0.5mM、0.1mM、0mM)及不同诱导时间(0h、2h、4h、6h、8h)进行诱导表达，以确定最佳的诱导表达条件。

6)经过诱导的重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21经超声波破碎处理，离心去上清，沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液(含8mol/L尿素)中，然后参照蛋白纯化试剂盒(Promega，HisLinkSpin Protein Purification System)对融合表达的重组蛋白进行纯化。经Bradford法测定并调整蛋白的浓度为250μg/ml。

7)取纯化后的重组蛋白2ml采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔(遗传资源表见附件)(免疫前采集正常血清作为阴性对照)，以后每2周加强免疫一次，共4次。首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂。末次加强免疫7d后，心脏采血，分离血清。抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的PET-GSIV-MCP多克隆抗体，浓度为3mg/ml。

8)纯化的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价大于1∶50000。

所述的MEM配方为：

一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白的多克隆抗体在检测GSIV中的应用：其检测过程是：

于T-25细胞培养瓶中接种EPC细胞，培养至汇合单层，弃去培养液，用无菌的Hank′s液洗涤细胞1次，取保存的细胞培养病毒液，以感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)为5的量接种到细胞培养瓶中，加入适量的助感染剂Polybrene(终浓度10μg/mL)，置于25℃培养箱中吸附1h，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶3-5次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后，弃去病毒液，每瓶加入5mL细胞维持液(含2％血清的MEM培养液)，置于25℃培养箱中继续培养，同时设立没有接种GSIV的EPC作为对照，分别在GSIV感染EPC细胞后的12、24、36h，以纯化的PET-GSIV-MCP多克隆抗体为一抗，红色荧光探针标记的羊抗兔IgG(H+L)抗体为二抗，参照免疫荧光染色试剂盒对感染GSIV的EPC细胞进行检测。

具体检测步骤：1)吸尽培养液，加入3mL的固定液(4％(w/v)的多聚甲醛)，固定10min或4℃过夜。2)去固定液，用TBS(含0.1％(v/v)的Trion X-100)洗3次，每次5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床。3)用封闭液(含0.1％(v/v)的Triton X-100及5％(w/v)BSA的TBS)封闭60min，可以在摇床上轻轻摇动。4)去封闭液，用稀释的一抗(1∶2000)作用60min，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4℃过夜。5)去除一抗，用TBS(含0.1％(v/v)的Triton X-100)洗涤5次，每次5min。每次洗涤都可以在摇床上轻轻摇动。6)去除洗涤液，加入2mL稀释好的荧光标记二抗避光孵育60min，可以在摇床上轻轻摇动。7)用洗涤液洗涤5次，每次5分钟，期间注意避光操作。每次洗涤可以在摇床上轻轻摇动。8)在荧光显微镜下观察红色荧光。(此步骤来源于(碧云天，免疫荧光染色试剂盒-抗兔Cy3))

结果表明：感染GSIV的EPC细胞在绿光激发下呈现出鲜光的红色，随着病毒感染时间的增长，红色荧光加强；而没有感染GSIV的EPC细胞则没有红色荧光出现。说明制备的多抗能够成功检测GSIV。结果见图7。

所述多克隆抗体通过间接荧光免疫实验，可以对感染GSIV的细胞、组织样品进行准确的检测，在荧光显微镜下，感染GSIV的细胞发出红色荧光，便于观察。所述多克隆抗体的制备将为GSIV现场快速检测试剂盒的研制及大鲵病毒性出血病的防治奠定一定的基础。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

本发明提供了一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白，通过诱导表达条件的优化，在E.coli.BL21(DE3)中得到了高效表达；融合表达的重组蛋白经过简单处理，经蛋白纯化试剂盒纯化得到了高纯度的可溶性蛋白。融合表达的重组蛋白(PET-GSIV-MCP)免疫新西兰大白兔制备了PET-GSIV-MCP抗血清，抗血清经抗体亲和纯化得到特异性强，滴度高的多克隆抗体，以制备的多抗为一抗，Cy3标记的羊抗兔抗体为二抗，采用间接荧光免疫法对GSIV进行了检测。这将为GSIV的快速检测试剂盒的研制及大鲵病毒性出血病的防治奠定一定的基础。

附图说明

图1为一种GSIV-MCP的PCR扩增示意图。

M：Mark；1-2：GSIV-MCP PCR扩增产物。

图2为一种重组载体PET-32(a)-MCP酶切鉴定示意图。

M：Mark；1：重组表达质粒PET-32(a)-MCP；2：重组表达质粒PET-32(a)-MCP经EcoRI、HindIII双酶切产物；3：GSIV-MCP PCR扩增产物。

图3为一种PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)蛋白表达形式分析示意图。

M：蛋白Mark；1：未经诱导的PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)；2：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导4小时；3：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mMIPTG诱导4小时，超声破碎处理的上清；4：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导4小时，超声破碎处理的沉淀。

图4为一种诱导时间对PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)蛋白表达量的影响示意图。

M：蛋白Mark；1：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导0小时；2：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导2小时；3：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mMIPTG诱导4小时；4：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导6小时；5：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导8小时；6：未转入载体的BL21(DE3)；7：PET-32(a)/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导8小时。

图5为一种IPTG浓度对PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)蛋白表达量的影响示意图。

M：蛋白Mark；1：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经1mM IPTG诱导6小时；2：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经0.5mM IPTG诱导6小时；3：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经0.1mM IPTG诱导6小时；4：PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)经0mM IPTG诱导6小时；5：未转入载体的BL21(DE3)。

图6为一种PET-32(a)-MCP/BL21(DE3)表达蛋白纯化示意图。

M：Mark；1：纯化的重组蛋白。

图7为一种感染GSIV的EPC细胞经免疫荧光染色示意图。

A：白光下的EPC细胞；B：绿色荧光激发下的EPC细胞；ctrl：未感染GSIV的EPC细胞；12、24、36h：GSIV感染EPC细胞的12、24、36h。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。

实施例1：重组表达载体PET-32(a)-MCP的构建：

1 材料与方法

1.1试验材料

大鲵病毒性出血病病原——大鲵虹彩病毒(GSIV)由本实验室从患典型出血病的大鲵(见遗传资源披露表)体内分离并鉴定，由武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCV201134。鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma Papilloma Cyprini，EPC)的选择来源于GSIV对不同来源细胞系的感染性试验结果。GSIV在EPC细胞中增殖速度较快(48h出现典型CPE)，滴度高。具体实施步骤：把EPC、CIK、CCK、RTG-2、CHSE、PF-Fin等细胞传至细胞培养瓶(T-25)中，培养至汇合单层，接种GSIV，培养并逐日观察CPE。7d后收获病毒，分别在EPC细胞中作TCID₅₀测定。

结果：GSIV能在EPC、CCK、RTG-2、CIK、CHSE等细胞中增殖。但在EPC细胞中增殖速度较快，2-3d出现典型的CPE，滴度也相对较高。而在CIK、CHSE等细胞中增殖速度比较慢，没有出现CPE，滴度也相对较低。

EPC细胞用于培养GSIV，收获细胞培养GSIV于-80℃保存备用。所述的鲤上皮瘤细胞系(EPC)，由武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCGDC0174。

原核表达载体PET-32(a)、表达菌株BL21(DE3)购于Novagen公司。

1.2引物：

根据GSIV-MCP基因序列，设计特异性引物：PET-MCP-FP：CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG；PET-MCP-RP：CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC。

1.3GSIV的增殖：

于T-25细胞培养瓶中接种EPC细胞，培养至汇合单层，弃去培养液，用无菌的Hank′s液洗涤细胞1次，取保存的细胞培养病毒液，以感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)为5的量接种到细胞培养瓶中，加入适量的助感染剂Polybrene(终浓度10μg/mL)，置于25℃培养箱中吸附1h，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶3-5次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后，弃去病毒液，每瓶加人5mL细胞维持液(含2％血清的MEM培养液)，置于25℃培养箱中继续培养，逐日观察细胞病变情况。当细胞单层出现70％-80％细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时，收获细胞培养物，-80℃-室温条件下冻融2次，于4℃条件下以4000r/min离心20min，弃去沉淀，病毒液分装于冻存管中-80℃保存备用。

1.4GSIV-MCP基因的PCR扩增：

用EPC细胞培养GSIV，病毒DNA提取试剂盒(OMEGA，Viral DNA Kit)抽提病毒核酸为模板，进行PCR扩增。PCR采用50μL反应体系：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(10mmol/L)1μL，Primers：PET-MCP-FP和PET-MCP-RP(F/R，10μmol/L)各1μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板为1μL，ddH₂O补足至50μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.5扩增产物的纯化：

扩增产物经PCR产物及胶回收试剂盒(Promega，Wizard Sv Gel and PCR Clean up System)回收纯化，纯化产物经1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6载体DNA和目的基因的酶切、回收：

将纯化的PCR产物和PET-32(a)(Novagen)分别用EcoRI和HindIII双酶切，酶切反应体系为：buffer：5μL；BSA：0.5μL；EcoRI：2.5μL；HindIII：2.5μL；DNA：20μL；ddH₂O：19.5μL；37℃，酶切6h。酶切产物用PCR产物及胶回收试剂盒(Promega，Wizard Sv Gel and PCR Cleanup System)进行回收，回收产物用1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7连接反应：

将经过EcoRI和HindIII双酶切的目的DNA片段和PET-32(a)载体用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系：目的DNA：7μL；载体DNA：1.6μL；buffer：1μL；酶：0.4μL；得到重组表达载体PET-32(a)-MCP。

1.8转化大肠杆菌：

取10μL重组表达载体PET-32(a)-MCP与100μL感受态细胞E.coli.BL21(DE3)(Novagen)混匀，冰浴30min；放入42℃水浴中90s；冰浴2min，加入400μL的LB，置于37℃摇床200r/min温育45min；4000r/min离心2min收集菌体，剩余约100μL的上清重悬菌体，涂布在LB(10g胰蛋白胨(Tryptone)，5g酵母浸出物(Yeast extract)，10g氯化钠(NaCl)，15g琼脂粉(agar)溶于ddH₂O中，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH值至7.0-7.5，定容至1,000mL，在121℃高压(103.4kPa)下蒸气灭菌20min，冷至50℃左右，加入适量Amp(终浓度为50μg/mL(w/v))混均，倾注灭菌平皿)平板上，倒置于37℃温箱中培养，至长出菌落，PCR筛选阳性菌株，得到重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21。

1.9重组表达载体的PET-32(a)-MCP的鉴定

取重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，接种到500mL的LB培养基(含50μg/mL Amp)中大量培养，取培养的菌液1mL加入甘油1mL，送上海生工生物工程有限公司进行测序分析。取培养菌液采用质粒提取试剂盒(Promega，Pure YieldTM Plasmid Midiprep System)提取重组质粒，同进用EcoRI和HindIII对重组质粒进行双酶切鉴定。

2、结果与分析：

2.1GSIV-MCP基因的PCR扩增：

PCR扩增(PCR采用50μL反应体系：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(10mmol/L)1μL，Primers：PET-MCP-FP和PET-MCP-RP(F/R，10μmol/L)各1μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板为1μL，ddH₂O补足至50μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。)得到一条约1400bp的片段，与预期大小一致(即为GSIV-MCP基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。)结果见图1。

2.2原核表达载体的鉴定：

提取重组质粒经EcoR I和HindIII双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果表明双酶切得到的目的片段以及PCR鉴定阳性克隆的产物均与预期大小的核酸片段相同，鉴定结果见表2。测序结果表明，重组表达载体中插入的MCP基因序列与GenBank中的大鲵虹彩病毒GSIV的主衣壳蛋白基因(GenBank accession number：JN615141.1)的序列(SEQ ID NO.1)完全相同。

实施例2：GSIV-MCP的原核表达及表达条件的优化。

1.方法：

1.1蛋白的表达及蛋白表达形式的分析：

将PET-32(a)-MCP/BL21涂布于LB固体平板，37℃培养过夜，菌落PCR鉴定阳性。挑取的阳性克隆子接种于LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃200r/min培养过夜。按1∶100的比例接种到新鲜LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃200r/min至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入1mM IPTG诱导表达。4小时后离心集菌，用100μl PBS重悬菌体，加入等量的SDS-PAGE上样缓冲液(含β巯基乙醇)，煮沸10min后取10μL进行SDS-PAGE分析。将诱导后的菌体进行超声破碎处理，收集处理后的上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE分析。

1.2蛋白表达条件的优化：

将PET-32(a)-MCP/BL21涂布于LB固体平板，37℃培养过夜，菌落PCR鉴定阳性。挑取的阳性克隆子接种于LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃200r/min培养过夜。按1∶100的比例接种到新鲜液体LB培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃200r/min至OD₆₀₀为0.4-0.6，分别使用不同IPTG浓度(1mM、0.5mM、0.1mM、0mM)及不同诱导时间(0h、2h、4h、6h、8h)进行诱导表达。分别取2mL菌液，4℃4000r/min离心5min，弃上清，将沉淀用100μL PBS重悬，加入等量的SDS-PAGE上样缓冲液(含β巯基乙醇)，煮沸10min后取10μL进行SDS-PAGE，以确定最佳表达条件。

1.3蛋白的纯化：

经过诱导表达的重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21经超声波破碎处理，离心去上清，沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液(含8mol/L尿素)中，然后参照蛋白纯化试剂盒(Promega，HisLinkSpin Protein Purification System)对融合表达的重组蛋白进行纯化。利用Bradford法测定蛋白的浓度，并取纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析。

2.结果与分析：

2.1蛋白的表达及蛋白表达形式的分析：

SDS-PAGE分析表明重组载体PET-32(a)-MCP在E coli.BL21(DE3)(Novagen)中表达出分子量约为70kDa融合蛋白条带，与预期大小一致。蛋白的表达形式分析表明，表达蛋白在菌体中主要以包涵体的形式存在。结果见图3。

2.2蛋白表达条件的优化：

以不同IPTG浓度(1mM、0.5mM、0.1mM、0mM)及不同诱导时间(0h、2h、4h、6h、8h)对重组载体PET-32(a)-MCP在E coli.BL21(DE3)(Novagen)进行诱导表达，结果表明不同诱导时间对其蛋白表达量影响，以6h为最佳；不同IPTG浓度对蛋白表达量影响，以0.5mM的IPTG最佳。因此确定了最佳的蛋白表达条件为0.5mM的IPTG诱导6h。结果见图4、图5。

2.3蛋白的纯化：

表达蛋白经蛋白纯化试剂盒(Promega，HisLink Spin Protein Purification System)纯化得到了高纯度的可溶性蛋白。结果见图6。经Bradford法测定并调整蛋白的浓度为250μg/ml。

实施例3：多克隆抗体的制备及效价检测。

1.方法：

取纯化后的重组蛋白2ml采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔(遗传资源表见附件)(免疫前采集正常血清作为阴性对照)，以后每2周加强免疫一次，共4次。首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂。末次加强免疫7d后，心脏采血，分离血清。抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体。以制备的多抗为一抗，羊抗兔抗体(ABCLONAL BIOTECHNOLOGY，INC.)为二抗，采用常规的ELISA法测定抗体效价。

2.结果：

收集经过4次免疫的新西兰大白兔抗血清，抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体，浓度为3mg/ml。经ELISA法测定，抗体效价大于1∶50000。

实施例4：一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白的多克隆抗体在检测GSIV中的应用，其检测过程是：

1.方法：

于T-25细胞培养瓶中接种EPC细胞，培养至汇合单层，弃去培养液，用无菌的Hank′s液洗涤细胞1次，取保存的细胞培养病毒液，以感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)为5的量接种到细胞培养瓶中，加入适量的助感染剂Polybrene(终浓度10μg/mL)，置于25℃培养箱中吸附1h，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶3-5次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后，弃去病毒液，每瓶加入5mL细胞维持液(含2％血清的MEM培养液)，置于25℃培养箱中继续培养，同时设立没有接种GSIV的EPC作为对照，分别以GSIV感染EPC细胞后的12、24、36h，以纯化的PET-GSIV-MCP多克隆抗体为一抗，红色荧光探针标记的羊抗兔IgG(H+L)抗体(来源免疫荧光染色试剂盒羊抗兔Cy3)为二抗，参照免疫荧光染色试剂盒(来源免疫荧光染色试剂盒羊抗兔Cy3)对感染GSIV的EPC细胞进行检测。

具体检测步骤：1)吸尽培养液，加入3mL的固定液(4％(w/v)的多聚甲醛)，固定10min或4℃过夜。2)去固定液，用TBS(含0.1％(v/v)的Trion X-100)洗3次，每次5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床。3)用封闭液(含0.1％(v/v)的Triton X-100及5％(w/v)BSA的TBS)封闭60min，可以在摇床上轻轻摇动。4)去封闭液，用稀释的一抗(1∶2000)作用60min，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4℃过夜。5)去除一抗，用TBS(含0.1％(v/v)的Triton X-100)洗涤5次，每次5min。每次洗涤都可以在摇床上轻轻摇动。6)去除洗涤液，加入2mL稀释好的荧光标记二抗避光孵育60min，可以在摇床上轻轻摇动。7)用洗涤液洗涤5次，每次5分钟，期间注意避光操作。每次洗涤可以在摇床上轻轻摇动。8)在荧光显微镜下观察红色荧光。(此步骤来源于(碧云天，免疫荧光染色试剂盒一抗兔Cy3))

2.结果：

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

<130> 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1392

<212> DNA

<213> 大鲵虹彩病毒

<400> 1

atgtcttctg taaccggttc aggtatcaca agtggtttca tcgacttggc cacttatgac 60

aatcttgaga gagcaatgta cgggggttca gatgccacca cgtactttgt caaggagcac 120

taccccgtgg ggtggttcac caagctgccg tctctggctg ccaagatgtc gggtaacccg 180

gctttcgggc agcagttttc ggtcggcgtt cccaggtcgg gggattacat cctcaacgcc 240

tggttggtgc tcaagacccc cgaggtcaag ctcctggccg caaaccagct gggagacaac 300

ggcaccatca ggtggacaaa gaaccccatg cacaacattg tggagaacgt caacctctca 360

ttcaacgaca tcagcgccca gtcctttaac acggcatacc tggacgcctg gagcgagtac 420

accatgccag aggccaagcg cataggctac tataacatga taggcaacac cagcgatctc 480

atcaaccccg ccccggccac aggccagaac ggagccaggg tcctcccggc caagaacctg 540

gttcttcccc tcccattctt cttctccaga gacagcggcc tggccctgcc agtcgtctcc 600

ctcccctaca atgagatcag gataacagtc aagctgaggg ccatccagga cctcctgatc 660

ctccagcaca acaccacagg ggcaatcagc cccatcgtgg ccgccgacct cgagggaggt 720

ctccccgaca ccgtcgaggc caacgtctac atgaccgtcg ccctcatcac cggggacgag 780

aggcaggcca tgagcagcac agtcagggac atggtcgtgg agcaggtgca ggccgcccca 840

gtccacatgg tcaaccccag gaacgcggcc accttccaca ccgacatgcg gttctcacac 900

gcagtcaagg ccctgatgtt tatggtgcag aacgtcacac acccttccgt cggctccaat 960

tacacctgcg tcactcccgt cgtgggagtc ggcaacacgg tcctggagcc agccctggcg 1020

gtggatcccg tcaagagcgc cagcctggtg tacgaaaaca ccacaaggct ccccgacatg 1080

ggagtcgagt actactcgct ggtggagccc tggtactatg ccacctccat cccagtcagc 1140

accgggcacc acctctactc ctatgccctc agcctacagg acccccaccc atccggatcc 1200

accaattacg gcagactgac caacgccagc cttaacgtca ccctgtccgc tgaggccacc 1260

acggccgccg caggaggcgg aggtgacgac tctgggtaca ccaccgccca aaagtacgcc 1320

ctcatcgttc tggccatcaa ccacaacatt atccgcatca tgaacggctc gatgggattc 1380

ccaatcttgt aa 1392

<210> 2

<211> 463

<212> PRT

<213> 大鲵虹彩病毒

<400> 2

Met Ser Ser Val Thr Gly Ser Gly Ile Thr Ser Gly Phe Ile Asp Leu

1 5 10 15

Ala Thr Tyr Asp Asn Leu Glu Arg Ala Met Tyr Gly Gly Ser Asp Ala

20 25 30

Thr Thr Tyr Phe Val Lys Glu His Tyr Pro Val Gly Trp Phe Thr Lys

35 40 45

Leu Pro Ser Leu Ala Ala Lys Met Ser Gly Asn Pro Ala Phe Gly Gln

50 55 60

Gln Phe Ser Val Gly Val Pro Arg Ser Gly Asp Tyr Ile Leu Asn Ala

65 70 75 80

Trp Leu Val Leu Lys Thr Pro Glu Val Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gln

85 90 95

Leu Gly Asp Asn Gly Thr Ile Arg Trp Thr Lys Asn Pro Met His Asn

100 105 110

Ile Val Glu Asn Val Asn Leu Ser Phe Asn Asp Ile Ser Ala Gln Ser

115 120 125

Phe Asn Thr Ala Tyr Leu Asp Ala Trp Ser Glu Tyr Thr Met Pro Glu

130 135 140

Ala Lys Arg Ile Gly Tyr Tyr Asn Met Ile Gly Asn Thr Ser Asp Leu

145 150 155 160

Ile Asn Pro Ala Pro Ala Thr Gly Gln Asn Gly Ala Arg Val Leu Pro

165 170 175

Ala Lys Asn Leu Val Leu Pro Leu Pro Phe Phe Phe Ser Arg Asp Ser

180 185 190

Gly Leu Ala Leu Pro Val Val Ser Leu Pro Tyr Asn Glu Ile Arg Ile

195 200 205

Thr Val Lys Leu Arg Ala Ile Gln Asp Leu Leu Ile Leu Gln His Asn

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Ile Ser Pro Ile Val Ala Ala Asp Leu Glu Gly Gly

225 230 235 240

Leu Pro Asp Thr Val Glu Ala Asn Val Tyr Met Thr Val Ala Leu Ile

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Arg Gln Ala Met Ser Ser Thr Val Arg Asp Met Val

260 265 270

Val Glu Gln Val Gln Ala Ala Pro Val His Met Val Asn Pro Arg Asn

275 280 285

Ala Ala Thr Phe His Thr Asp Met Arg Phe Ser His Ala Val Lys Ala

290 295 300

Leu Met Phe Met Val Gln Asn Val Thr His Pro Ser Val Gly Ser Asn

305 310 315 320

Tyr Thr Cys Val Thr Pro Val Val Gly Val Gly Asn Thr Val Leu Glu

325 330 335

Pro Ala Leu Ala Val Asp Pro Val Lys Ser Ala Ser Leu Val Tyr Glu

340 345 350

Asn Thr Thr Arg Leu Pro Asp Met Gly Val Glu Tyr Tyr Ser Leu Val

355 360 365

Glu Pro Trp Tyr Tyr Ala Thr Ser Ile Pro Val Ser Thr Gly His His

370 375 380

Leu Tyr Ser Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Asp Pro His Pro Ser Gly Ser

385 390 395 400

Thr Asn Tyr Gly Arg Leu Thr Asn Ala Ser Leu Asn Val Thr Leu Ser

405 410 415

Ala Glu Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ser Gly

420 425 430

Tyr Thr Thr Ala Gln Lys Tyr Ala Leu Ile Val Leu Ala Ile Asn His

435 440 445

Asn Ile Ile Arg Ile Met Asn Gly Ser Met Gly Phe Pro Ile Leu

450 455 460

Claims

1.一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白GSIV-MCP的原核表达、多克隆抗体的制备方法，其步骤是：

1)根据GSIV-MCP基因序列，设计特异性引物：

PET-MCP-FP：5′-CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG-3′，含有EcoRⅠ 酶切位点；

PET-MCP-RP：5′-CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3′，含有HindⅢ 酶切位点；

GSIV-MCP基因为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；

2) 用EPC细胞培养GSIV，病毒DNA提取试剂盒抽提病毒核酸为模板，进行PCR扩增，PCR采用50μL反应体系：10×PCR Buffer 5μL，10mmol/L dNTP 1μL，Primers：10μmol/L PET-MCP-FP和10μmol/L PET-MCP-RP各1μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶0.5μL，DNA 模板为1μL，ddH₂O补足至50μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min；PCR 产物经1.0%w/v琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR产物及胶回收试剂盒回收纯化；

3) 将纯化的PCR产物和PET-32(a)分别用EcoRⅠ 和HindⅢ 双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体PET-32(a)-MCP；

4) 重组表达载体PET-32(a)-MCP转化大肠杆菌感受态细胞E.coli.BL21(DE3)，PCR筛选阳性菌株，得到重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，将PET-32(a)-MCP/BL21接种于LB液体培养基中，37℃ 200 r/min培养过夜；按1：100的比例接种到新鲜LB液体培养基中，37℃ 200 r/min至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入1mM IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析；将诱导后的菌体进行超声破碎处理，收集处理后的上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，以确定原核表达蛋白的表达形式；

5) 重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21，分别使用不同IPTG浓度：1 mM、0.5 mM、0.1 mM、0 mM及不同诱导时间：0h、2h、4h、6h、8h进行诱导表达，以确定最佳的诱导表达条件；

6) 经过诱导的重组菌株PET-32(a)-MCP/BL21经超声波破碎处理，离心去上清，沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液中，然后参照蛋白纯化试剂盒对融合表达的重组蛋白进行纯化，经Bradford法测定并调整蛋白的浓度为250μg/ml；

7) 取纯化后的重组蛋白2ml采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，并在免疫前采集正常血清作为阴性对照，以后每2周加强免疫一次，共4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂，末次加强免疫7 d后，心脏采血，分离血清；抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体，浓度为3mg/ml；

8) 纯化的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价大于1：50000。

2.权利要求1所述的一种GSIV-MCP基因原核表达蛋白的多克隆抗体在检测GSIV中的应用。