CN111363758A - 新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用 - Google Patents

新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用。本发明提供了一种含SGIV MCP基因的原核表达载体pET‑32a‑MCP，由SGIV MCP基因插入载体质粒pET‑32a构建得到；所述SGIV MCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该原核表达载体pET‑32a‑MCP能够表达SGIV MCP重组蛋白，进一步利用该重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备得到了能够特异性地识别SGIV的SGIV MCP多克隆抗体，该多克隆抗体的制备方法简单、成本低，且该多克隆抗体用于SGIV的检测时，检测方法简便、检测结果准确度高、特异性强；因此，该SGIV MCP多克隆抗体在检测SGIV或制备SGIV抗体检测试剂盒中具有广泛的应用前景。

Description

新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用。
背景技术
石斑鱼(Epinephelus spp.)属于鲈形目、鮨科、石斑鱼属，是我国南方重要的海水经济鱼类，其味道鲜美，营养丰富，深受广大消费者欢迎。然而，随着石斑鱼养殖规模的扩大，严重的病害问题已成为限制石斑鱼养殖业发展的主要瓶颈。病毒性疾病由于突发性强、传播速度快、致死率高，病毒变异性强等，已成为制约水产养殖业健康发展的突出问题。由新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)所造成的病毒性疾病在中国以及东南亚流行，严重影响水产养殖业发展。
SGIV是从新加坡患病石斑鱼脾脏中分离鉴定出一株高致病性虹彩病毒，SGIV的主要衣壳蛋白(MCP)分子量为49kDa，对SGIV MCP氨基酸序列与其它虹彩病毒进行系统进化分析，结果显示其与虹彩病毒科蛙病毒属蛙病毒3型(Frogvirus3，FV3)的亲缘关系最近，MCP氨基酸序列相似性为69％；因此，将SGIV列为虹彩病毒科蛙病毒属，并命名为SGIV，第10版国际病毒分类手册中正式把SGIV确定为蛙病毒属的1个新种。该SGIV病毒极易感染我国南方和东南亚等地区的石斑鱼等海水鱼类，造成鱼体脾脏出血和肿大，且鱼体感染后一周以内的致死率可达90％以上。因此，亟需提供能够快速、有效检测SGIV的方法，以尽早控制SGIV对石斑鱼等海水鱼类的危害。
目前，虽然市面上已有SGIV染料法荧光定量PCR试剂盒，但试剂盒是建立在PCR检测原理基础之上的，具有易污染、结果假阳性率较高，仪器设备较为昂贵，用时较长，现场使用不便利等缺点。因此，提供成本低、简便、快速、检测结果准确度高、特异性强的SGIV的检测方法，对于监测并有效控制SGIV对石斑鱼等海水鱼类的危害具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有SGIV检测方法的缺陷和不足，提供新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用。
本发明的目的是提供一种含SGIV MCP基因的原核表达载体pET-32a-MCP。
本发明另一目的是提供一种SGIV MCP重组蛋白。
本发明又一目的是提供所述原核表达载体pET-32a-MCP或所述SGIV MCP重组蛋白在制备SGIV MCP多克隆抗体中的应用。
本发明再一目的是提供一种SGIV MCP多克隆抗体。
本发明再一目的是提供所述SGIV MCP多克隆抗体的制备方法。
本发明再一目的是提供所述SGIV MCP多克隆抗体或所述方法制备得到的SGIVMCP多克隆抗体。
本发明再一目的是提供所述SGIV MCP多克隆抗体在检测SGIV或制备SGIV抗体检测试剂盒中的应用。
本发明再一目的是提供一种检测SGIV的方法。
本发明再一目的是提供一种SGIV抗体检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种含SGIV MCP基因的原核表达载体pET-32a-MCP，由SGIV MCP基因插入载体质粒pET-32a构建得到；所述SGIV MCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种SGIV MCP重组蛋白，由所述原核表达载体pET-32a-MCP在感受态细胞中表达得到。
优选地，所述感受态细胞为感受态BL21(DE3)细胞。
所述原核表达载体pET-32a-MCP或所述SGIV MCP重组蛋白在制备SGIV MCP多克隆抗体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种SGIV MCP多克隆抗体，由所述SGIV MCP重组蛋白免疫新西兰大白兔制备得到。
优选地，所述SGIV MCP多克隆抗体的制备方法为：将所述SGIV MCP重组蛋白纯化后，采用皮下多点免疫5～8周龄新西兰大白兔，第一次免疫大白兔时将SGIV MCP重组蛋白与完全佐剂等体积混匀并充分乳化，以后三次免疫大白兔时将SGIV MCP重组蛋白与不完全佐剂等体积混匀，每隔2～3周进行一次免疫。
另外，所述SGIV MCP多克隆抗体或所述方法制备得到的SGIV MCP多克隆抗体，以及其在检测SGIV或制备SGIV抗体检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种检测SGIV的方法，利用所述SGIV MCP多克隆抗体进行检测。
本发明还提供了一种SGIV抗体检测试剂盒，包括所述SGIV MCP多克隆抗体。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用。本发明将SGIV MCP基因克隆到载体质粒pET-32a中，构建得到了含SGIV MCP基因的原核表达载体pET-32a-MCP，并在感受态BL21(DE3)细胞中得到了表达，融合表达的SGIV MCP重组蛋白分子量约为67KD，与预期大小一致。
本发明用SGIV MCP重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备得到了SGIV MCP多克隆抗体，该多克隆抗体能够特异性地识别SGIV，抗血清效价为1:2000～1:1024000时能够特异性地检测出SGIV；另外，该多克隆抗体用于SGIV的检测时，其检测方法简单、成本低、检测结果准确度高；因此，该SGIV MCP多克隆抗体在检测SGIV或制备SGIV抗体检测试剂盒中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是SGIV MCP基因的扩增电泳结果图；其中，M代表蛋白质分子量标准，1、2均代表扩增产物。
图2是SGIV MCP基因的核苷酸序列与原核表达载体pET-32a-MCP的序列比对结果。
图3是SGIV MCP基因的核苷酸序列与原核表达载体pET-32a-MCP的序列比对结果；其中，M代表蛋白质分子量标准，116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4均代表蛋白质分子量标准条带大小；1代表诱导表达破碎后的上清蛋白；2代表诱导表达破碎后的不溶蛋白。
图4是纯化的SGIV MCP重组蛋白的验证结果图；其中，M代表蛋白质分子量标准，116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4均代表蛋白质分子量标准条带大小；1代表纯化的SGIV MCP重组蛋白。
图5是ELISA法测定抗血清效价的结果图。
图6是SGIV感染的细胞样品的Western blot分析结果图；其中，M代表蛋白质分子量标准，100、70、55、40均代表蛋白质分子量标准条带大小；1、2均代表SGIV感染的细胞样品。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中的各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等均购自日本宝生物工程(大连)有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒(E.Z.N.ATM Endo-freeplasmid mini kit II)购自Omega，总RNA提取试剂盒(SV Total RNA isolation System)购自Promega，逆转录试剂盒(ReverTra
Figure BDA0002426135000000041
qPCR RT Kit)购自Toyobo，其余试剂均为国产分析纯；PCR仪、凝胶电泳仪和蛋白质电泳购自BiaRad，抗生素及培养基等均为分子生物学以及基因工程实验室常用国产试剂，所有引物序列均在英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实施例1 SGIV MCP基因的原核表达载体pET-32a-MCP的构建
1、SGIV MCP基因的克隆
1)实验方法
(1)根据已知的SGIV MCP基因编码区序列(NCBI：NC_006549.1:66404-67795)，设计以下特异性引物MCP-S/R：
引物MCP-S(SEQ ID NO.2)：5’-gcggatccatgacttgtacaacgggtgctggcg-3’；
引物MCP-R(SEQ ID NO.3)：5’-cgctcgagcaagatagggaaccccatggaacc-3’；
其中，引物MCP-S含有限制性内切酶BamH I识别位点，引物MCP-R含有限制性内切酶Xho I识别位点。
(2)提取SGIV感染的石斑鱼脾脏组织的RNA，然后反转录成为cDNA，并以该cDNA为模板，利用步骤(1)设计的特异性引物MCP-S/R，按照以下PCR扩增体系、PCR扩增程序对SGIVMCP基因进行扩增，纯化回收MCP基因片段并测序；
PCR扩增体系为：模板cDNA 10ng，10μM的引物MCP-S/R各1μL，10mM dNTP混合物1μL，反应缓冲液2μL，LA Taq DNA聚合酶0.2U，ddH2O补足20μL。
PCR扩增程序为：94℃5min，94℃450s→55℃45s→72℃90s扩增30个循环后，72℃延伸8min。
然后，向每管PCR扩增产物中分别加入5μL 6×Loading Buffer，将配制好的1％的琼脂糖凝胶放进电泳池中，一个孔点marker，其他孔用移液枪每管吸取PCR扩增产物点进孔中，电泳15分钟后，观察电泳条带；切取电泳条带放入1.5mL离心管中，用Axygen DNA片段纯化试剂盒纯化回收SGIV MCP基因片段，具体操作步骤为：
a.向1.5mL离心管中加凝胶溶解液(600μL)溶解凝胶(每条收集柱大概可以装700μL的液体)，溶解之后装进收集柱中，离心(12000rmp、1min)；
b.重复步骤a；
c.加Buffer WB 700μL，离心(12000rmp、2min)，弃滤液；
d.重复步骤c；
e.空转1min(12000rmp)，静置2min；
f.悬空向中央加入无菌水(30μL)或Elution Buffer，离心1分钟，回收DNA，并测定DNA的纯度和浓度。
2)实验结果
SGIV MCP基因的扩增电泳结果图如图1所示，可以看出，本发明已成功扩增得到SGIV MCP基因，并得到了SGIV MCP基因编码框全长序列1392bp，SGIV MCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、SGIV MCP基因的原核表达载体pET-32a-MCP的构建
1)实验方法
使用限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xho I对以上步骤1纯化得到的SGIVMCP基因片段进行双酶切，获得带有两个酶切位点的SGIV MCP基因，同时用限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xho I对载体质粒pET-32a进行双酶切，连接、转化大肠杆菌，抽质粒进行PCR和双酶切检测，确定原核表达载体pET-32a-MCP是否构建成功；其构建方法具体如下：
(1)提取SGIV感染的石斑鱼脾脏组织的RNA，然后反转录成为cDNA，并以该cDNA为模板，按照以上PCR扩增体系、PCR扩增程序扩增MCP ORF全长序列，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收目的DNA片段，用Axygen DNA凝胶回收试剂回收纯化目的DNA片段，用紫外分光光度计测定PCR产物的浓度。
(2)从质粒载体菌DH5α中提取质粒pET-32a
划线培养携带pET-32a质粒的大肠杆菌，隔日挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃200rpm摇床培养14h，用质粒提取试剂盒抽提质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒，用紫外分光光度计测定所提取质粒的浓度。
(3)PCR产物和载体质粒pET-32a的双酶切及纯化
根据检测的浓度，对PCR产物及载体质粒进行双酶切反应，各自酶切体系总体积为20μL，37℃酶切5h后，取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，酶切后的PCR产物按PCR产物回收试剂盒说明书操作，酶切后的载体质粒pET-32a片段采用琼脂糖凝胶电泳、切胶、回收纯化，纯化后产物于-20℃保存。
(3)PCR产物和载体质粒pET-32a的连接
连接体系总体积为20μL：10×T4ligase buffer 2μL，T4ligase 0.5μL，PCR产物10μL，载体质粒pET-32a 5μL，以灭菌ddH2O补足20μL，16℃连接过夜。
(4)连接产物的转化
向100μL感受态BL21(DE3)细胞内加入10μL连接产物，混匀，冰浴25min以上；42℃水浴热激90s，然后马上冰浴5min；加入新鲜LB液体培养基至1mL，置摇床37℃200r/min复苏1h；室温8000rpm离心1min，吸走1mL上清，剩余100μL混匀，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上；静置平板35min，将平板倒置，置于37℃培养箱培养15h。
(5)筛选阳性克隆
从平板上挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌培养7h；取1μL菌液做模板，按照以上PCR扩增体系、PCR扩增程序进行PCR扩增，取5μL PCR产物电泳检测；根据电泳结果将筛选出的阳性克隆提取质粒送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定；用clustalx生物软件将测序公司测得的原核表达载体pET-32a-MCP的序列与SGIVMCP基因的核苷酸序列进行比对。
2)实验结果
SGIV MCP基因的核苷酸序列与原核表达载体pET-32a-MCP的序列比对结果如图2所示，可以看出，两个序列完全相同(无碱基差异)，说明本发明已成功构建得到原核表达载体pET-32a-MCP，并在感受态BL21(DE3)细胞中成功转化。
实施例2 SGIV MCP重组蛋白的表达和纯化
1、实验方法
(1)挑选实施例1制备得到的含重组质粒(原核表达载体pET-32a-MCP)的单菌落至5mL LB液体培养基(含氨苄青霉素)中，37℃震荡培养至OD600约0.6；取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)，37℃震荡培养3h；分别取两组菌液0.5mL，12000×g离心10min，菌体沉淀以40μL 1×loading buffer重悬裂解，进行SDS-PAGE检测分析。
(2)取保存于-20℃的菌种10μL接种于1mL LB液体培养基(含氨苄青霉素)中震荡培养过夜；取300μL菌液接种于300mL LB液体培养基(含氨苄青霉素)中，37℃扩大培养至OD600约0.6；加入IPTG诱导剂至终浓度1mM，37℃继续震荡培养4h；8000rpm离心10min收集菌体，重悬于50mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30min；超声破碎菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停4s、时间30min；16000rpm 4℃离心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，剩余上清及沉淀置于4℃备用。
(3)沉淀以50mL STET缓冲液重悬，加入DTT至终浓度1mM；超声促进杂蛋白溶解，参数设置为功率200W、工作3s、暂停3s、时间10min；10000rpm 4℃离心10min，去上清；重复以上三步至上清透明；沉淀以PBS重悬，超声，参数设置为功率200W、工作3s、暂停3s、时间5min；16000rpm 4℃离心10min，去上清；以4mL SKL重悬包涵体，加DTT至终浓度5mM；220rpm37℃震荡3h至包涵体全部溶解；10000rpm 4℃离心10min，取上清蛋白溶液。
2、实验结果
SGIV MCP重组蛋白表达的SDS-PAGE检测结果图如图3所示，可以看出，实施例1构建得到的原核表达载体pET-32a-MCP在感受态BL21(DE3)细胞中得到了表达，表达出分子量约为67KD的融合蛋白条带，与预期大小一致。
纯化的SGIV MCP重组蛋白的验证结果图如图4所示，可以看出，扩增出了单一明亮的条带，说明经纯化后得到了高纯度的SGIV MCP重组蛋白。
实施例3 SGIV MCP多克隆抗体的制备
1、实验方法
取2mL实施例2制备得到的纯化的SGIV MCP重组蛋白，采用皮下多点免疫6周大小的新西兰大白兔，第一次免疫大白兔时将重组蛋白与完全佐剂等体积混匀并充分乳化，以后三次免疫大白兔时将重组蛋白与不完全佐剂等体积混匀；每隔3周进行一次免疫；抗血清经抗原亲和纯化，得到纯化的SGIV MCP多克隆抗体。
然后，采用ELISA法测定抗血清效价，具体操作步骤为：
(1)抗原包被：用包被液将10mg/mL抗原按1:2000/1:4000/1:8000/1:16000/1:32000/1:64000/1:128000/1:256000/1:512000/1:1024000/1:2048000/1:4096000/1:8192000稀释，200μL/孔包被96孔酶联反应板，4℃包被过夜；
(2)洗涤：用PBS-T将96孔酶联反应板洗涤3次，并甩干，每次5min；
(3)封闭：每孔加200μL封闭液，37℃作用1h；
(4)加待检血清：甩干96孔酶联反应板，加入用保温液稀释的的待检血清，200μL/孔，37℃保温1h；另设两孔阴性血清对照、阳性血清对照和空白对照(PBS-T)；
(5)洗涤：用PBS-T将96孔酶联反应板洗涤3次，并甩干，每次5min；
(6)加酶标二抗：每孔加入200μL HRP-标记的羊抗兔-HRP以1:10000稀释使用，25℃保温1h；
(7)洗涤：用PBS-T将96孔酶联反应板洗涤3次，并甩干，每次5min；
(8)底物显色：每孔加200μL新鲜配制的显色液，室温避光静置10min；
(9)终止及测定：每孔加100μL终止液终止反应，于405nm波长下测定反应液的OD值。
2、实验结果
ELISA法测定抗血清效价的结果图如图5所示，可以看出，本发明已成功制备得到了SGIV MCP多克隆抗体，且抗血清效价为1:2000～1:1024000时能够特异性地检测出SGIV。
实施例4 SGIV MCP多克隆抗体的应用
1、实验方法
收集SGIV感染的细胞样品，加入上样buffer混匀，煮沸10min后，12000rpm离心10分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，转移至硝酸纤维素膜上，用含有PBST(含有终浓度为0.05％的Tween-20)室温封闭1h，用实施例3制备得到的SGIV MCP多克隆抗体室温孵育1h，PBST(含有终浓度为0.05％的Tween-20)洗膜后，用HRP标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1h，再次清洗，最后用化学发光底物工作液孵育5min显色。
2、实验结果
SGIV感染的细胞样品的Western blot分析结果图如图6所示，可以看出，SGIV MCP多克隆抗体能够特异性地识别感染细胞中的SGIV。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacttgta caacgggtgc tggcgtaacc agtggcttca tagatttggc cacgtacgac 60
aatctcgaca gagcgttata cggcggaaag gacgccacta cgtactttat caaagagcat 120
tatcccgtag gatggttcac caagcttccc accatggcca ccagagtgtc tggaaaccca 180
gcgttcgggc aagagttttc ggtcggggtt cccaggtcgg gcgattacgt gctcaacgcc 240
tggctcactc ttaaaacccc cgaaattaaa ctgctcgaaa caaataggct cggcgcaaac 300
ggtaccgtga ggtggaccaa aaacctaatg cacaacgctg tagagcacgc ttctctcacc 360
ttcaacgaca tttgcgcgca gcagtttaac acagcgtatt tagacgcttg gacacagttt 420
aacatgtgcg aaggtaaacg cataggttac gacaacatga tcgggaacac cagcgacatg 480
accaacccca ctcccgctca gggtcaggac ggcgcaagga cactaccttc caaaaattta 540
gtgctcccgt tgccgttctt tttcagcaga gactgcggat tggctctgcc caccgtagtg 600
ttgccctata atgaaatcag aatcaacatt aaactgaggt cgcttcagga gcttttagtg 660
tttcagaaca aagacaccgg aaatgtgatt cctatctctg ctaccgacat agccggcggg 720
ctcgccgaca ccgtggaagc ttacgtgtat atgaccgtgg gtctcgtttc caacgtggaa 780
aggtgcgcca tggcagggac cgtcagggat atggtcgtag aacaaatgca ggccgccccc 840
acacacatcg ttaaccctca aaacacaaat aacgtccacg tagacatgag gttctcgcac 900
gccgtgaaag ccctcttttt catggtgcaa aacgtcactt ataaatctgt gggttcaaat 960
tatacgtgtg taacaccagt taacggtccg ggcaacaccg tgatggagcc cgccatgtcc 1020
gttgatccca tcaaaagcgc cagcctcacg tacgaaaata cgaccaggtt ggcaaatatg 1080
ggtgtagagt attactctct ggtacaacct tggtattttt cagcctccat tccagtgtac 1140
accggatacc acatgtattc atacgcccta aacgtgggca gcgttcatcc ttcggggtct 1200
accaattacg gaagattgac caacgctagc atcactgtaa caatgtcccc cgagtctgtc 1260
gtcgccgcag caggaggagg taacaataat tctggttaca acgaacctca gaggttcgcg 1320
ttggtagtga tcgccgtaaa ccataacgtc atcagaatca tgaacggttc catggggttc 1380
cctatcttgt aa 1392
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggatccat gacttgtaca acgggtgctg gcg 33
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgctcgagca agatagggaa ccccatggaa cc 32

Claims (9)

1.一种含SGIV MCP基因的原核表达载体pET-32a-MCP，其特征在于，由SGIV MCP基因插入载体质粒pET-32a构建得到；所述SGIV MCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种SGIV MCP重组蛋白，其特征在于，由权利要求1所述原核表达载体pET-32a-MCP在感受态细胞中表达得到。
3.权利要求1所述原核表达载体pET-32a-MCP或权利要求2所述SGIV MCP重组蛋白在制备SGIV MCP多克隆抗体中的应用。
4.一种SGIV MCP多克隆抗体，其特征在于，由权利要求2所述SGIV MCP重组蛋白免疫新西兰大白兔制备得到。
5.权利要求4所述SGIV MCP多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述SGIV MCP重组蛋白纯化后，采用皮下多点免疫5～8周龄新西兰大白兔，第一次免疫大白兔时将SGIV MCP重组蛋白与完全佐剂等体积混匀并充分乳化，以后三次免疫大白兔时将SGIVMCP重组蛋白与不完全佐剂等体积混匀，每隔2～3周进行一次免疫。
6.权利要求4所述SGIV MCP多克隆抗体或权利要求5所述方法制备得到的SGIV MCP多克隆抗体。
7.权利要求6所述SGIV MCP多克隆抗体在检测SGIV或制备SGIV抗体检测试剂盒中的应用。
8.一种检测SGIV的方法，其特征在于，利用权利要求6所述SGIV MCP多克隆抗体进行检测。
9.一种SGIV抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述SGIV MCP多克隆抗体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113376381A (zh) * 2021-06-11 2021-09-10 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法
CN116606366A (zh) * 2023-05-17 2023-08-18 华南农业大学 一种石斑鱼白介素15及其制备方法和用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277361A (zh) * 2011-04-29 2011-12-14 中国科学院南海海洋研究所 一种石斑鱼虹彩病毒保护性抗原的筛选方法
CN102643835A (zh) * 2012-04-28 2012-08-22 中国水产科学研究院长江水产研究所 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用
CN104845939A (zh) * 2015-06-05 2015-08-19 陕西省水产研究所 抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用
CN108079287A (zh) * 2017-12-19 2018-05-29 华南农业大学 一种石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN108273053A (zh) * 2018-01-04 2018-07-13 华南农业大学 一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277361A (zh) * 2011-04-29 2011-12-14 中国科学院南海海洋研究所 一种石斑鱼虹彩病毒保护性抗原的筛选方法
CN102643835A (zh) * 2012-04-28 2012-08-22 中国水产科学研究院长江水产研究所 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用
CN104845939A (zh) * 2015-06-05 2015-08-19 陕西省水产研究所 抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用
CN108079287A (zh) * 2017-12-19 2018-05-29 华南农业大学 一种石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN108273053A (zh) * 2018-01-04 2018-07-13 华南农业大学 一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSIN-I LIU等: "Cloning of the Major Capsid Protein (MCP) of Grouper Iridovirus of Taiwan (TGIV) and Preliminary Evaluation of a Recombinant MCP Vaccine against TGIV", 《INT.J.MOL.SCI.》 *
QING YU等: "Identification of Major Capsid Protein as a Potential Biomarker of Grouper Iridovirus-Infected Cells Using Aptamers Selected by SELEX", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
YONGMINGYUAN等: "Singapore grouper iridovirus protein VP088 is essential for viral infectivity", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
周小愿等: "大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及抗血清制备", 《细胞与分子免疫学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113376381A (zh) * 2021-06-11 2021-09-10 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种石斑鱼神经坏死病高抗体水平亲本选育方法
CN116606366A (zh) * 2023-05-17 2023-08-18 华南农业大学 一种石斑鱼白介素15及其制备方法和用途
CN116606366B (zh) * 2023-05-17 2024-03-12 华南农业大学 一种石斑鱼白介素15及其制备方法和用途

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