CN104845939A - 抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分泌抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体。本发明还公布了由单克隆抗体组成的试剂盒，使用本发明提供的试剂盒可快速检测抗大鲵虹彩病毒的存在，特异性好，敏感性高，除在实验室定量分析使用外，且方便地在生产企业使用，快速判断虹彩病毒是否存在，在大鲵虹彩病毒诊断上有广阔应用前景。

Description

抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用

发明所属领域

本发明涉及杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体技术领域，具体说，本发明涉及针对大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

大鲵(Andrias davidianus)属于有尾目(Caudata)隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)大鲵属(Andrias)，为国家二级野生保护动物，已被列入CITES公约附录Ⅰ中。由于大鲵具有极高的经济价值和科学意义，为科学保护和合理利用这一珍稀物种资源，自1978年报道首例大鲵人工繁育成功以来，我国许多有大鲵自然分布的地区都积极开展了大鲵的人工繁育和养殖。目前大鲵已经成为一种珍贵的水产养殖品种，在全国20多个省市都有养殖。随着大鲵养殖业规模的不断增加和集约化程度的提高，疾病成为制约大鲵养殖业持续发展的瓶颈。

自2010年首次报道在陕西省发现大鲵病毒性疾病以来，随着大鲵苗种的交流和贸易的兴盛，全国有越来越多的大鲵养殖场都暴发了该种病毒性疾病。病原学研究发现，此病的病原为病毒，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)，即大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)，由其感染大鲵而患病，称之为大鲵虹彩病毒病(Chinese giant salamander iridovirusdisease,CGSIVD)。感染CGSIV的大鲵表现的病理特征主要有全身性的出血和局部溃疡两种。其中全身性的出血特征较为明显；以溃疡为主的病症主要表现为：患病大鲵发病初期头部和四肢后肢肿大，随病情发展，吻部、背部以及后肢出现溃疡，并伴有出血点，到后期，后肢部位的溃疡发展到肌肉几乎全部烂掉以至于露出骨头。该病传染性强且发病死亡率高，往往可高达90％以上，给许多大鲵养殖户造成了巨大的经济损失。

该病毒性疾病的发病时期不定，一年四季均可发病，但一般夏季的发病频率更高。因为夏季气温高，而大鲵属于变温动物，温度过高对其生长发育不利，而且此时水中细菌繁殖旺盛，为疾病的爆发创造了一定的条件。CGSIV感染对象选择性不强，从幼鲵到种鲵均可感染。大鲵虹彩病毒病传播的方式表现为水平传播或兼有垂直传播。水平传播主要通过病鲵的代谢活动将病毒由粪便、尿液等释放到体外，再通过水体、养殖用具以及人体等途径将病毒传染给其他健康大鲵。

目前，尚无有效的药物治疗该疾病。较为有效的防控措施主要还是通过及早发现、及时采取隔离、消毒等预防方法来减少疾病进一步蔓延带来的损失。为了及时掌握我国养殖大鲵虹彩病毒病的潜伏感染和发病状况，强化大鲵虹彩病毒病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立CGSIV的高通量快速检测方法。目前已有的CGSIV的检测方法有病毒分离和核酸检测。其中病毒分离是CGSIV的金标准，但该方法费时且对于实验室的条件要求较高。核酸检测方法有常规PCR检测方法、巢式PCR检测方法和已授权的专利检测方法-LAMP检测方法，该类检测方法比传统的病毒分离方法更灵敏、快速，但分子诊断操作尤其是样品的前处理相对繁琐，对操作人员的技术水平要求较高，而且较易发生污染导致假阳性结果，尤其是LAMP检测方法，其检测结果更容易出现假阳性和假阴性结果，导致其在实际生产中应用效果十分有限。

发明技术内容：

本发明的一个目的是提供特异性的针对大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体，使用该抗体可快速地检测大鲵虹彩病毒的存在，方便快速，且成本低廉。

本发明的另一个目的是提供可分泌抗大鲵虹彩病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的再一个目的是提供大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及分泌抗体的杂交瘤细胞株的应用。

本发明的再一个目的是提供检测大鲵虹彩病毒的试剂盒及其应用。

本发明公开了一株分泌抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCP26，它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC C201533，保藏日期是2015年4月29日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。本发明公开后，细胞株处于公开状态，第三方可依法从保藏机构索取，并再现本发明。

本发明还公开了由杂交瘤细胞株MCP26分泌的单克隆抗体。本发明公开的单克隆抗体，可以特异性的识别大鲵虹彩病毒衣壳蛋白亚基和大鲵虹彩病毒，抗体亚类及亚型为IgG2b,κ链。单克隆抗体腹水的间接ELISA效价达10^-6以上。

本发明还公开了单克隆抗体在实验室条件下检测大鲵虹彩病毒衣壳蛋白和大鲵虹彩病毒的的应用。

本发明还公开了检测大鲵虹彩病毒衣壳蛋白和大鲵虹彩病毒的试剂盒，试剂盒中包括单克隆抗体。

优选的，本发明试剂盒还包括兔抗CGSIV多抗，并用其包被酶标板；杂交瘤细胞株MCP26分泌的单克隆抗体为二抗；采用针对单克隆抗体的酶标抗体为三抗；封闭液；洗涤液；显色液；终止液；抗体稀释液；阳性对照；阴性对照；试剂盒说明书。所述的兔抗CGSIV多抗为纯化的CGSIV免疫兔子获得；所述的针对单克隆抗体的酶标抗体为HRP-羊抗鼠IgG；所述的阴性对照为健康大鲵肝肾组织提取液；所述的阳性对照为感染CGSIV的大鲵肝肾组织提取液。所述方法主要包括如下步骤：

①兔抗CGSIV多抗包被酶标板，4℃过夜；

②封闭酶标板；

③加入待测样本，37℃孵育1小时，洗涤，晾干；

④加入所述单克隆抗体，37℃孵育1小时，洗涤，晾干；

⑤加入针对单克隆抗体的酶标抗体，37℃孵育1小时，洗涤，晾干；

⑥加入显色液，显色10min；

⑦加入终止液，空白孔调零后读取吸光度值OD_450nm(A值)。

所述结果的判定标准为：阳性对照A值≥0.5，阴性对照A值≤0.1，实验成立。样品A值/阴性对照A值平均值≥2.1，判为阳性，否则为阴性。

优选的，所述兔抗CGSIV的最佳稀释倍数为1:500，所述的单抗MCP26的最佳稀释倍数为1:5000,所述的针对本发明单抗的HRP-羊抗鼠IgG的最佳稀释倍数为1:500。

本发明还公开了杂交瘤细胞株在检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。

本发明还公开单克隆抗体在检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。

在本发明中CGSIV指大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)，由其感染大鲵而患病，称之为大鲵虹彩病毒病(Chinese giant salamanderiridovirus disease,CGSIVD)，SVCV指鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carpvirus,SVCV)，GCRV指草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)、IPNV指虹鳟传染性胰腺坏死病病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)、IHNV指传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、KHV指锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)。这些均为本实验室保存，病毒样本在本发明中仅作为阳性或阴性对照。第三者需要可向本实验室索取，在本发明中，也可用其它实验室保藏的此类病毒，如在中国科学院水生生物研究所，中国典型培养物保藏中心，美国典型培养物保藏中心就保藏相似的病毒，研究者也可通过正常方式从研究机构或保藏机构获取。本发明中SP2/0，EPC细胞是普通细胞，在保藏机构都有销售。

本发明的优点：

利用本发明所制备的单克隆抗体检测大鲵虹彩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备，成本较为低廉；所述的单克隆抗体MCP26腹水间接ELISA效价达10^-6以上。利用本发明所制备的单克隆抗体建立的大鲵虹彩病毒TAS-ELISA检测方法，当确诊感染虹彩病毒的大鲵肝肾组织提取液稀释1024倍；或纯化的大鲵虹彩病毒稀释4096倍时，仍能检测到病毒。特异性分析结果表明，所述的单抗MCP26对CGSIV有特异性反应，而与GCRV、SVCV、IPNV、KHV等其他病毒均无特异性反应。因此，利用本发明所制备的单克隆抗体建立的大鲵虹彩病毒TAS-ELISA检测方法，具有特异性好、灵敏度高等优点，可实现快速、高通量地进行大鲵感染CGSIV的筛查，在大鲵虹彩病毒的检测和及时有效地防控CGSIV方面具有良好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是大鲵虹彩病毒MCP蛋白诱导和纯化SDS-PAGE图，图中BI表示诱导前；M表示低分子量蛋白Marker；AI表示诱导后；S表示上清；P表示沉淀；FT表示穿透液；E1～E6表示洗脱。

图2是纯化重组MCP蛋白SDS-PAGE图，图中1,2表示纯化的重组MCP蛋白样品；M表示低分子量蛋白Marker.

图3是单抗MCP26与CGSIV感染EPC细胞发生特异性反应的免疫荧光图。图中A表示阳性，B表示阴性。

图4是灭活CGSIV和重组MCP蛋白Western-blot图，图中M表示Marker；1表示重组MCP蛋白；2表示灭活CGSIV；3表示阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

下述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编,马学军,舒跃龙等译.北京:科学出版社,2004)中所述的方法进行。

实施例1杂交瘤细胞株的获得及其单克隆抗体的制备

1.材料和方法

1.1病毒、细胞与试验动物

大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY2011)由本实验室分离并保存，鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞和SP2/0细胞为本实验室提供；清洁级BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。pET21-MCP原核表达质粒为本实验室构建并保存。鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)、虹鳟传染性胰腺坏死病病毒(Infectious pancreaticnecrosis virus,IPNV)、传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoieticnecrosis virus，IHNV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)均为本实验室保存，这些病毒样本在本发明中仅作为阳性或阴性对照。第三者需要可向本实验室索取，在本发明中，也可用其它实验室保藏的此类病毒，如在中国典型培养物保藏中心，美国典型培养物保藏中心就保藏相似的病毒，研究者也可通过正常方式从保藏机构获取。

1.2主要材料和试验用血清

RPMI-1640购自GBICO公司；HAT培养基、HT培养基、PEG1450、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和FITC标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司。单克隆抗体分型试剂盒购自Thermo Scientific公司。

1.3免疫抗原的制备

本发明中用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组MCP蛋白。基因重组MCP蛋白是通过由本实验室保存的pET21-MCP原核表达质粒按常规实验方法经过诱导表达、纯化等制备过程获得。其中，目的基因为编码大鲵虹彩病毒MCP蛋白核苷酸序列的第334-1092位，长度为759bp，目的蛋白分子量约为29kDa。按常规实验方法经过诱导表达获得的菌体蛋白经用镍-次氮基三醋酸(Ni-NTA)(Qiagen,Cat,No.30230)亲和层析的方法进行纯化获得MCP抗原，如见图1，图2，详细的制备方法可参考使用手册。将重组MCP蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE,Cat,No.ED62976)定量。图1为大鲵虹彩病毒MCP蛋白纯化SDS-PAGE图，图2为纯化定量后的MCP蛋白SDS-PAGE图。

1.4免疫动物

用纯化的重组MCP蛋白为免疫原，加入等量弗氏完全佐剂乳化后，经腹部和背部皮下注射8-12周龄BALB/c雌性小鼠,每只100μg；用纯化的重组MCP蛋白加入等量弗氏不完全佐剂充分乳化后，每隔2周分别进行第二次和第三次免疫，剂量为每只小鼠50μg；三免后每隔2周加强免疫2次，剂量同2免。第2次加强免疫3天后脱颈处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾细胞进行融合。

1.5阳性杂交瘤细胞株的建立

取上述免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按10:1的比例用30ml无血清RPMI-1640培养基充分混匀，用50％PEG1450作为融合剂按下述步骤进行融合。将上述混匀的细胞1000rpm离心5min，弃掉上清。将细胞沉淀置37℃水浴中，在45s内缓慢加入1.0ml预热至37℃的PEG，边加边轻轻摇匀，在90s内加入20ml预热至37℃的无血清的RPMI-1640培养基，静置10min后，室温1000rpm离心5min，弃上清，加入5ml HAT培养基，轻轻吹打沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。分装细胞到96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；将培养板置37℃，5％CO₂培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出1/2培养基，7-10天后用HT培养基换出HAT培养基。待细胞长至孔底面积1/10以上时，吸出上清以纯化的重组MCP蛋白为包被抗原，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔。阳性克隆转至24孔板扩大培养，经ELISA法检测仍为强阳性的克隆进行有限稀释法克隆。克隆2～3次后至阳性率达到100％，选择能够稳定分泌抗大鲵虹彩病毒MCP蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，并将该细胞株命名为MCP26。抗大鲵虹彩病毒MCP蛋白的小鼠杂交瘤细胞株MCP26已于2015年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC No:C201533。

1.6抗MCP蛋白单克隆抗体亚类检测

按照单抗分型试剂盒(Thermo Scientific,Cat,No.37501)说明书介绍的步骤，采用间接ELISA法测定单抗MCP26的抗体亚类。用纯化的重组MCP抗原包被微孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与1：1000倍稀释的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白反应，检测结果显示，本专利发明的单克隆抗体MCP26为IgG2b，κ链。

1.7单克隆抗体腹水的制备和纯化

取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。将制备的腹水10000g离心15min后,按以下步骤进行纯化。向预处理的腹水中加入2×0.06M醋酸缓冲液(pH5.0)；室温搅拌下逐滴加入辛酸(10μl/ml腹水)，于30min内加完，4℃静置2h，取出15000g离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(孔径125μm)，加入1/10体积的0.01M PBS(pH7.2)；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，作用30min，静置1h；10000g离心30min，弃上清；沉淀溶于适量含137mM NaCl，2.6M KCl，0.2mM EDTA的PBS中，用50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出10000g离心30min，以考马斯亮蓝蛋白分析试剂测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

1.8单克隆抗体的鉴定

1.8.1单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(IFA)

准备EPC细胞，并培养于6孔培养板中，待细胞长成单层后，用大鲵虹彩病毒(CGSIV)感染细胞，同时设阴性对照孔。感染24h后，弃上清，用4％的多聚甲醛固定过夜，经PBS洗涤3次，加入5％BSA封闭1h,PBS洗涤3次，加入杂交瘤细胞培养上清，室温孵育1h，PBS洗涤3次，加入1:500稀释的FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续室温孵育1h,PBS洗涤3次，最后在荧光显微镜下观察，凡有绿色荧光着判为阳性；无荧光着判为阴性。

结果：用CGSIV感染EPC细胞，并用单抗MCP26进行间接免疫荧光试验，设未感染CGSIV为空白对照(MOCK)。试验结果显示；单抗MCP26可产生特异性的绿色荧光，如图3，表明单抗MCP26可与CGSIV的某些蛋白发生特异性结合，由此可用于检测CGSIV的存在。图3为单抗MCP26与CGSIV感染EPC细胞发生特异性反应的免疫荧光图。

1.8.2单克隆抗体的免疫印迹法鉴定(WB)

灭活的CGSIV病毒液初步纯化后和重组的MCP蛋白均用2×SDS加样缓冲溶液稀释，100℃煮沸5min，经SDS-PAGE电泳，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白转印到硝酸纤维膜上，转印膜用含7％脱脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封闭24h，将转印膜装在专门的反应板中，加入杂交瘤细胞培养上清，4℃过夜，用含有0.5％Tween-20(Sigma)的10mM PBS洗涤3次，加入1:500倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,室温反应1h，用同样的洗涤液洗涤膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。

结果：本发明的特异性单抗MCP26与重组MCP蛋白和灭活的CGSIV病毒液在分子量约为29kD均可见一条很强的蛋白质结合带，如图4。图4为灭活CGSIV和重组MCP蛋白Western-blot图。

1.8.3单克隆抗体的特异性检测

用鲤春病毒血症病毒(SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、虹鳟传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)感染的细胞培养物包被96板，以SP2/0细胞培养上清液做阴性对照，以大鲵虹彩病毒(CGSIV)感染的细胞培养上清为阳性对照，用间接ELISA法测定单抗的特异性反应。结果显示，单抗MCP26对CGSIV有特异性反应，而与GCRV、SVCV、IPNV、KHV等其他病毒均无特异性反应。

表1单克隆抗体的特异性分析

表注：各样品和阴性对照的检测OD值为调零后的测定值(A值)；检测结果的判定如下：样品A值/阴性对照A值平均值≥2.1，判为阳性，否则为阴性。

1.8.4单克隆抗体效价测定

用常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清和单抗腹水效价。用重组MCP蛋白包被96孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清和单抗腹水孵育1h，PBS洗涤3次，再加入1:1000倍稀释的兔抗小鼠-HRP标记的二抗孵育1h，PBS洗涤3次，加入TMB显色液避光显色10min，加2M H₂SO₄终止显色，空白孔调零后立即读取450nm OD值。检测结果显示，单抗MCP26腹水的ELISA效价为1:131072，单抗MCP26杂交瘤细胞培养上清的效价为1：4096。

实施例2利用单抗MCP26建立免疫荧光法检测大鲵虹彩病毒

将疑似感染大鲵虹彩病毒的大鲵肝组织在洁净的载玻片上轻轻做个压迹制成触片，室温自然晾干。用4％多聚甲醛醛固定30min，PBS洗涤3次，5％BSA4℃封闭过夜，PBS洗涤3次。加入按1:1000倍稀释后的单抗MCP26孵育1h，PBS洗涤3次，加入1:500倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，孵育1h，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察。同时设SP2/0培养上清和确定未感染CGSIV的大鲵肝组织为阴性对照。

结果判定，荧光显微镜下出现绿色荧光的，判为CGSIV感染阳性，否则为阴性。

实施例3利用单抗建立免疫印迹法检测大鲵虹彩病毒MCP蛋白

将初步纯化后的CGSIV用2×SDS加样缓冲溶液稀释，100℃煮沸5min，经SDS-PAGE电泳，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白转印到硝酸纤维膜上，转印膜用含7％脱脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封闭24h，将转印膜装在专门的反应板中，加入杂交瘤细胞培养上清，4℃过夜，用含有0.5％Tween-20的10mM PBS洗涤3次，加入1:500倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,室温反应1h，用同样的洗涤液洗涤膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。

结果判定，在分子量29kD出现特异性条带的样品，可判定为病毒蛋白中有MCP蛋白。

实施例4CGSIV的三抗体-ELISA夹心检测法(TAS-ELISA)及其检测试剂盒

4.1TAS-ELISA检测步骤

1)按1:500倍稀释的用纯化的CGSIV免疫兔子获得的兔抗CGSIV多抗，包被微孔板100ul/孔，37℃，2-4h或4℃过夜。同时，以CGSIV感染的EPC细胞培养液上清为阳性对照，以相应的EPC细胞培养液上清作为阴性对照；

2)PBS洗涤3次，加3-5％BSA封闭200ul/孔于37℃封闭1h；

3)PBS洗涤3次，加入病鲵肝、肾组织匀浆上清液100ul/孔，37℃1h；

4)PBS洗涤3次，按100ul/孔加入1:5000倍稀释的单抗MCP26，37℃1h；

5)PBS洗涤3次，加入1:500倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP100ul/孔,37℃1h；

6)PBS洗涤3次,加入TMB显色液避光显色10min；

7)2MH₂SO₄终止显色。

8)结果判定：以空白孔调零，于450nm处测定OD值(A值)。阳性对照A值≥0.5，阴性对照A值≤0.1，实验成立。样品A值/阴性对照A值平均值≥2.1，判为阳性，否则为阴性。

4.2TAS-ELISA方法检测灵敏度检测

1)对纯化CGSIV病毒检测的灵敏度单抗MCP26工作浓度为5000倍稀释，对纯化的CGSIV以10μg/ml开始按1:4作倍比稀释，以相应稀释度的EPC细胞培养液上清为阴性对照，进行上述TAS-ELISA方法检测。结果表明本发明建立的TAS-ELISA方法对纯化的CGSIV1:4～4096倍稀释液呈阳性反应，即对纯化的CGSIV检测灵敏度可达到1:4096。检测结果见表2。

表2 TAS-ELISA对纯化CGSIV的检测灵敏度

表注：各样品和阴性对照的检测OD值为调零后的测定值(A值)；检测结果的判定如下：样品A值/阴性对照平均A值≥2.1为阳性，否则为阴性。

2)对感染大鲵虹彩病毒的病鲵组织提取液的检测灵敏度对病鲵的肝肾组织提取液按1:4作倍比稀释，以相应健康大鲵肝肾组织提取液为阴性对照，进行上述TAS-ELISA方法检测。结果表明本发明建立的TAS-ELISA方法对病鲵的肝肾组织提取液1:4～1024倍稀释液呈阳性反应，即对纯化的CGSIV检测灵敏度可达到1:1024。检测结果见表3。

表3 TAS-ELISA对感染CGSIV大鲵肝肾组织提取液的检测灵敏度

表注：各样品和阴性对照的检测OD值为调零后的测定值(A值)；检测结果的判定如下：样品A值/阴性对照A值平均值≥2.1为阳性，否则为阴性。

4.3TAS-ELISA方法检测的特异性

以SVCV、GCRV、IPNV、IHNV、KHV和CGSIV分别感染的鲤鱼、草鱼、虹鳟、河鳟、锦鲤和大鲵的肝肾组织提取液为检测样品，以正常EPC培养液为阴性对照，进行以上TAS-ELISA检测。结果显示，单抗MCP26对CGSIV有特异性反应，而与GCRV、SVCV、IPNV、KHV等其他病毒均无特异性反应。检测结果见表4.

表4 TAS-ELISA方法的特异性检测结果

表注：各样品和阴性对照的检测OD值为调零后的测定值(A值)；检测结果的判定如下：样品A值/阴性对照A值平均值≥2.1为阳性，否则为阴性。

4.4方法的重复性

1)批内重复试验：用同一批次包被的酶标版检测不同送检的样本，一份阳性样本，一份阴性样本，每份样本重复6孔，进行TAS-ELISA检测，计算出同一样本P/N值(即样品A值与2.1倍阴性对照平均A值之比)的变异系数，以检验批内检测样品的重复性；

2)批间重复试验：用不同批次包被的酶标版6块重复检测一份送检的阳性样品和一份阴性样本，进行TAS-ELISA检测，计算出同一样本P/N值(同上)的变异系数，以检验批内检测样品的重复性；

结果：对同一批次和不同批次的TAS-ELISA进行批内和批间重复试验，其P/N值经统计学分析，变异系数均小于10％，说明本发明检测方法的重复性良好。

表5 TAS-ELISA检测方法批内重复性试验

表6 TAS-ELISA检测方法批间重复性试验

实施例5TAS-ELISA检测试剂盒的组成和应用

5.1试剂盒的组成

按表7所列的试剂盒内容，装配成试剂盒，组装后存储于相应条件。

表7大鲵虹彩病毒TAS-ELISA检测试剂盒内容

编号	内容	数量	备注
				1	待包被可拆卸酶标板	1块	8×12规格，室温保存
2	兔抗CGSIV多抗(500×)	1瓶	10μl/瓶，-20℃保存
				3	封闭液(1×)	1瓶	10ml/瓶，4℃保存
4	洗涤液(10×)	1瓶	10ml/瓶，4℃保存
				5	单抗MCP26(5000×)	1瓶	5μl/瓶，-20℃保存
6	HRP-羊抗鼠IgG(500×)	1瓶	10μl/瓶，-20℃保存
				7	抗体稀释液(1×)	1瓶	20ml/瓶，4℃保存

8	TMB显色液(1×)	1瓶	10ml/瓶，4℃保存
				9	终止液(1×)	1瓶	10ml/瓶，4℃保存
10	阴性对照	1瓶	500μl/瓶，-20℃保存
				11	阳性对照	1瓶	500μl/瓶，-20℃保存
12	试剂盒说明书	1份

5.2本发明试剂盒的使用方法：

1)使用步骤

A包被：于检测前一天用1×兔抗CGSIV多抗包被待包被可拆卸酶标板，即将上述试剂盒中的500×兔抗CGSIV多抗用抗体稀释液按1:500倍稀释，每孔100μl，同时用阳性对照和阴性对照作为质控样；4℃过夜，次日取出后，用1×洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min；

B封闭：封闭液每孔200μl,37℃1h，1×洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min；

C加入待检样品100μl/孔，即待检大鲵肝肾组织匀浆上清液，37℃1h；1×洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min；

D加入已预先按1:5000倍稀释的5000×单抗MCP26每孔100μl，37℃1h；1×洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min；

E加入已预先按1:500倍稀释的500×HRP-羊抗鼠IgG，每孔100μl，37℃1h；1×洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min；

F加入TMB显色液100/孔，避光显色10min；

G加入终止液100μl/孔，以空白孔调零，立即在酶标仪上读取450nm的OD值(A值)。

H结果判定：阳性对照A值≥0.5，阴性对照A值≤0.1，实验成立。样品A值/阴性对照A值平均值≥2.1，判为阳性，否则为阴性。

5.3本发明试剂盒的应用

用发明的TAS-ELISA检测试剂盒对来自广东、广西、四川等省份的不同大鲵养殖场的150份送检大鲵进行了检测，结果显示，在150份送检样品中，阳性样品94份，阴性样品56份，阳性率62.67％。

Claims (10)

1.一株分泌抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCP26，它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC C201533。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株MCP26分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测大鲵虹彩病毒的试剂盒中的应用。

5.检测大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的试剂盒，包括权利要求2所述的单克隆抗体。

6.检测大鲵虹彩病毒的试剂盒，包括权利要求2所述的单克隆抗体。

7.一种检测待测样品中是否含有大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的方法，是应用权利要求5所述的试剂盒通过三抗夹心ELISA检测待测样本中是否含有大鲵虹彩病毒衣壳蛋白；所述三抗夹心ELISA中的三抗的一抗为兔抗大鲵虹彩病毒多克隆抗体；所述双抗夹心ELISA中用兔抗大鲵虹彩病毒多克隆抗体包被酶标板；所述三抗夹心ELISA中的三抗中的二抗为权利要求2所述的单克隆抗体；所述三抗夹心ELISA中，采用针对所述单克隆抗体的酶标三抗。

8.一种检测待测样品中是否含有大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的方法，是应用权利要求6所述的试剂盒通过三抗夹心ELISA检测待测样本中是否含有大鲵虹彩病毒；所述三抗夹心ELISA中的三抗中的一抗为兔抗大鲵虹彩病毒多克隆抗体；所述双抗夹心ELISA中用兔抗大鲵虹彩病毒多克隆抗体包被酶标板；所述三抗夹心ELISA中的三抗中的二抗为权利要求2所述的单克隆抗体；所述三抗夹心ELISA中，采用针对所述单克隆抗体的酶标三抗。

9.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。

10.权利要求2中所述单克隆抗体在检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。