CN109799351A - 猪圆环病毒2型双抗体夹心elisa试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括：包被有抗猪圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的酶标板、封闭液、一抗、酶标二抗、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照。本发明的猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA检测周期短、操作简便、灵敏度高、特异性强，设备要求简单，能定性、半定性及定量分析，且试剂盒可以实现大批量样本的快速检测。本发明还提供使用上述试剂盒在检测猪圆环病毒2型灭活疫苗抗原中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及一种抗原检测试剂盒，具体的涉及一种猪圆环病毒2 型抗原双抗体夹心Elisa检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是一种属于圆环病毒科圆环病毒属的单股环状DNA病毒，该病主要引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征。一旦感染该病，机体出现免疫抑制，抵抗力下降，容易诱发其他疾病，严重危害养猪业。PCV2主要有两个大的开放阅读框，ORF1和ORF2。ORF1主要参与病毒的复制转录，ORF2是病毒的主要结构蛋白基因，编码主要结构蛋白Cap蛋白。Cap蛋白与宿主的免疫反应有关，且在两型PCV之间无抗原交叉反应，是研制新型疫苗的靶基因(Mankertz A,Caliskan R,Hattermann K,eral.Molecular biology of porcine circovirus:Analyses of geneexpression andviral replication[J].Vet Microbiol,2004,98(2):81-88.)，可以用于PCV2血清抗体诊断产品的研制。
灭活疫苗质量控制的关键是半成品抗原含量的确定。目前，猪圆环病毒疫苗抗原测定的方法主要有病毒分离法、间接免疫荧光法(IFA)以及免疫酶单层试验法(IMPA) 测定病毒滴度、荧光定量PCR法测定核酸含量。病毒分离、IFA及IMPA法操作繁琐耗费时间长、设备要求高、人为误差大，对操作者技术要求高；荧光定量PCR法重复性差、只能反映核酸载量，不能反映其中正确组装的病毒粒子或完整病毒颗粒的含量，且无法区分病毒是否具有活性。酶联免疫吸附法(ELISA)具有操作简便、快速、灵敏度高、对人员水平要求低、设备简单、可以定性或定量分析抗原含量等优点。
CN104749361A及CN103033622A分别公开了一种猪圆环病毒2型抗原捕获Elisa试剂盒、猪圆环病毒2型抗原Elisa检测试剂盒及其制备方法和其应用，均以抗猪圆环病毒 2型多抗和抗猪圆环病毒2型CAP蛋白单抗分别作为捕获抗体和检测抗体，该方法特异性较差、背景值高。
CN1584597A公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体Elisa检测试剂盒，其中抗原检测板为包被抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb1的96孔酶标板，酶标二抗为去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb2。该方法敏感性较差，仅能依据检测孔颜色深浅来进行阴阳性定性判断，另外采用两株单抗成本相对较高。
CN107037212A公开了一种猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，该试剂盒的检测抗体是将包被抗体进行酶标记后获得的，采用同一株单抗作捕获抗体和检测抗体，其灵敏性有待考证。
因此，开发一种快捷、简便、特异性强、敏感性高的检测方法将为PCV2的鉴别诊断、灭活疫苗的质量控制提供有效的保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA检测试剂盒及检测方法，该检测周期短、操作简便、灵敏度高、特异性强，设备要求简单，能定性、半定性及定量分析，且试剂盒可以实现大批量样本的快速检测。本发明还提供使用上述试剂盒在检测猪圆环病毒2型灭活疫苗抗原中的应用。
本发明由以下技术方案实现：
本发明所述检测试剂盒包括：包被有抗猪圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的酶标板、封闭液、一抗、酶标二抗、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照。
本发明涉及的抗猪圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体由基因重组获得，具体获得方法详见实施例。
本发明所述的Cap蛋白单克隆抗体具有天然构象表位。是用蛋白纯化试剂盒纯化抗原而非以切胶方式纯化抗原，最大限度的保持了抗原的天然构象。以PCV2感染的PK15 细胞为抗原，经间接免疫荧光法(IFA)筛选获得单克隆抗体，排除了筛选出不与全病毒反应的单克隆抗体的可能性。
优选的，本发明所述酶标板是由抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体包被的，包被稀释液为0.05M碳酸盐缓冲液(PH 9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)。
优选的，本发明所述封闭液为含1％-10％BSA或1％-10％脱脂乳的PBS溶液，更优选地，为含5％脱脂乳的PBS溶液。
优选的，本发明所述一抗为抗猪圆环病毒2型多克隆抗体。
优选的，本发明所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪酶标二抗。
优选的，本发明所述浓缩洗涤液为含0.05％Tween-20的PBS(PBST)缓冲液。
优选的，本发明所述显色液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
优选的，本发明所述终止液为2M H2S04。
优选的，本发明所述标准品为纯化的PCV2Cap蛋白。
优选的，本发明所述阳性对照为107.0TCID50的PCV2ZJ/C株病毒培养液；所述阴性对照为PK15细胞培养冻融物。
本发明建立的PCV2双抗体夹心Elisa法具体操作步骤如下：
(1)用包被稀释纯化后的单抗，100ul/孔包被酶标板，4℃作用过夜；
(2)甩去板中的液体，用洗涤液洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入封闭液，200ul/孔，置37℃孵育；
(3)洗板5次，加入一定稀释度的待检抗原样品及对照样品，100ul/孔，置37℃孵育，同时设不加抗原对照(用脱脂乳代替)；
(4)洗板5次，加入一抗，即纯化的抗猪圆环病毒多克隆抗体，100ul/孔，置37℃孵育；
(5)洗板5次，加入酶标二抗，100ul/孔，置37℃孵育；
(6)洗板5次，加入底物显色液，100ul/孔，37℃避光显色；
(7)加终止液，50ul/孔，混匀后10min内测定OD450nm值。
(8)结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)，当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立，待检样品孔P/N≥2时为阳性。
为了实现本发明，对一系列实验进行了优化。包括：比较了以单抗为捕获抗体、多抗为检测抗体和以多抗为捕获抗体、单抗为检测抗体的方法，结果表明以多抗为捕获抗体、单抗为检测抗体检测结果值高、背景颜色深、特异性较差，因此最终确定包被单抗、多抗作检测抗体的方法。
采用固定酶标二抗1:5000稀释，将单抗和多抗血清分别做倍比稀释进行方阵Elisa 滴定，以其中P/N值最大孔为最佳抗体稀释浓度，确定单抗1:400稀释、猪多抗血清1:6400 稀释为最佳抗体稀释度。
运用建立的PCV2双抗体夹心Elisa法对24份PK15细胞培养冻融液阴性样品进行检测，确定本方法的判定标准：待测样品的OD450值≥0.225为阳性，＜0.199为阴性，介于两者之间可疑。
分别用5％脱脂乳和1％BSA为封闭液进行封闭，结果表明5％脱脂乳P/N值大、封闭效果更好。采用单因素变量法，分别对封闭时间、一抗、二抗孵育时间、显色时间等进行比较，以P/N值最大为判定标准，最终确定37℃封闭、一抗、二抗作用时间均为1h， 37℃显色10min为最佳反应条件。
用纯化的PCV2Cap蛋白作标准品，建立了标准曲线，可以定性检测样本中抗原含量。将定量后的Cap蛋白用抗原稀释液按照5、10、20、40、80、160、320、640、1280 倍比稀释，采用本发明所述双抗体夹心法，测定OD450值，选择P/N≥2.1的值为本方法的灵敏度，确定本方法的最低检测值为3ug/ml。
本发明与现有技术相比，具有以下优势：
1.本发明所述的Cap蛋白在两型PCV之间无交叉反应性，因此可用于鉴别诊断；
2.本发明采用的单抗株具有天然构象表位，与天然PCV2病毒具有良好的反应原性，有中和活性；
3.本发明同样适用于基因工程重组菌表达的具有天然病毒粒子(VLP)构象的疫苗；
4.本发明采用单抗做捕获抗体、多抗做检测抗体的方法，建立的双抗体夹心Elisa法较两株相同的或不同的单抗分别做捕获抗体和检测抗体灵敏度更高、生产成本更低；本发明所述的方法较多抗做捕获抗体、单抗做检测抗体的方法特异性更强、显色背景颜色值更低。
5.本发明试剂盒具有良好的特异性。与常见猪病CSFV、PPV、PRRSV、PEDV、TGEV、JEV、RV等均无交叉反应，因此可用于鉴别诊断；
6.应用本发明可以进行定性判定，待测样品的OD450值≥0.225为阳性，＜0.199为阴性，介于两者之间可疑；
7.本发明可以定量检测样品中PCV2抗原含量，最低检测值为3ug/ml，为灭活疫苗的质量控制提供了有效的保障；
8.本发明试剂盒与目前常用的病毒分离、IFA及荧光定量PCR等方法相比，检测周期短、操作简便、人员技术水平要求低、主观因素误差小、设备简单、可以快速实现大批量样品的检测分析。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例所述的各病毒及阴性对照的ELISA检测结果示意图；
图2为本发明实施例所述的PCV2 Cap蛋白标准曲线示意图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明的优点和特点将会随着实施例的阐释更加清楚，但实施例仅是范例性的，对本发明不构成任何限制。本领域技术人员对本发明的技术和形式的改变，都将落入本发明保护范围。
实施例1抗PCV2 Cap单克隆抗体的制备
以PCV2b ZJ株ORF2基因序列为模板(登录号：HM776453.1)，设计以下引物：
P1：TCACTTAGGGTTAAGTGGGGG(SEQ ID No.1)
P2：ACGTATCCAAGGAGGCGTTT(SEQ ID No.2)
以PCV2b株序列为模板，以P1、P2为引物，扩增PCV2ORF2基因(扩增序列为 SEQ IDNo.3)，并将该基因和PMD-18T载体同时用BamHI、XhoI双酶切，用T7连接酶连接，得到重组质粒PMD-18T-ORF2。然后通过热转化法将重组质粒转入大肠杆菌表达系统中，构建重组表达菌pGEX-4T-1-CAP/BL21。
重组菌表达目的蛋白的发酵培养过程中，以IPTG为诱导物，37℃培养12h后收集发酵液，离心去上清，下层沉淀经超声波裂解破碎后离心取上清，后续蛋白的纯化过程使用蛋白纯化试剂盒(Pierce GST Spin Purification Kit)进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书，在此不再赘述。
将纯化的PCV2Cap蛋白常规免疫Balb/C小鼠，当小鼠血清IFA效价达到1:1000时，选取生长状态良好的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。经间接免疫荧光(IFA)筛选及有限稀释法进行3次亚克隆后，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及单克隆抗体。经Western blotting及IFA试验证明筛选获得的单克隆抗体为构象表位，中和试验表明，所获得的单抗具有中和活性。
实施例2猪抗PCV2多克隆抗体的制备
仔猪2头，经PCR和血清抗体检测，确定未感染PCV2。分开饲养，1头作为对照组，1头为实验组。使用PCV2强毒株进行感染，感染7d、14d、21d后分别采血，收集血清。用猪圆环病毒2-dCap-Elisa抗体检测试剂盒(瑞普(保定)生物药业有限公司) 进行抗体检测，详细步骤参照说明书。结果表明，PCV2感染7d后仔猪体内即可产生特异性抗体，S/P值＞0.25，可以作为标准阳性血清；而未感染对照猪血清抗体S/P＜0.16，为阴性。
实施例3单抗及多抗的纯化
1材料与方法
1.1实验材料
0.06M醋酸钠-醋酸缓冲液(PH5.0)，0.01M的HAC，1M的NaOH，饱和(NH4)2SO4， PBS(0.01M，PH＝7.4)，透析袋(Biotopped，截留分子量8000-14000)，辛酸，PH计。
1.2实验方法
抗PCV2多抗猪血清经3000rpm离心10min，吸出上清。按1:2的比例加入醋酸盐缓冲液(0.06M，PH＝5.0)，边加边搅拌，用0.01mol/L的HAC调至pH＝4.5。边搅拌边加入辛酸(每ml血清加入75μl辛酸)，继续搅拌30min，4℃静止2h。4℃12000rpm 离心30min，弃沉淀；上清液用1M NaOH调PH值至7.4。边搅拌边加入4℃放置的饱和(NH4)2SO4，使其浓度达45％，继续搅拌30min，4℃静置2h。4℃12000RPM离心30min弃上清，沉淀用少量PBS(0.01M，PH＝7.4)溶解。在0.01M，PH＝7.4PBS溶液中4℃透析过夜，期间换液3-5次。4℃12000rpm离心30min，除去不溶沉淀，留上清。进一步用Protein G亲和层析柱参照说明书进行纯化，SDS-PAGE鉴定并测其浓度；分装至EP管,于—80℃冻存。
抗PCV2Cap蛋白单克隆抗体的提纯：步骤同上述多抗血清(所不同的是每ml腹水加入33ul辛酸)。
实施例4PCV2双抗体夹心Elisa检测方法的建立
1包被抗体与检测抗体的确定
1.1实验材料
进口酶标板(corning)，檫手纸，TMB显色液，PCV2 CAP蛋白腹水(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，HRP-羊抗猪酶标二抗(KPL公司)，猪抗PCV2阳性血清(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，0.05M磷酸盐缓冲液(PH 9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)，含0.05％ Tween-20的PBS(PBST)缓冲液，2M H2S04终止液(ddH2O 178.3ml，加浓硫酸至200ml，在水中逐滴加入浓硫酸，边加边搅拌)终止液，5％脱脂乳(PBS稀释)。
1.2实验方法
用PH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(CBS)按1:200，1：400，1:800，1:1600稀释PCV2Cap蛋白腹水(或按1:1000，1:2000，1:4000，1:8000稀释的抗猪圆环病毒2型多克隆抗体)，100ul/孔包被酶标板，4℃作用过夜；甩去板中的液体，用含0.05％Tween-20 的PBS(PBST)洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入5％脱脂乳封闭液，200ul/孔，置37℃2h；洗板5次，加入待检抗原样品，100ul/孔，置37℃孵育1h；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)按1:1000，1:2000，1:4000，1:8000稀释的抗猪圆环病毒2 型多克隆抗体(或1:200，1：400，1:800，1:1600稀释PCV2Cap蛋白腹水)，100ul/孔，置37℃孵育1h，同时设阳性、阴性、空白对照；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST) 1:5000稀释的酶标二抗，l00ul/孔，置37℃孵育45min；洗板5次，加入底物TMB，100ul/ 孔，37℃避光显色10min；加终止液2MH2S04，50ul/孔，混匀后10min内测定OD450nm 值。
结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)，当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立，待测样品孔P/N≥2时为阳性。
1.3实验结果
分别以单抗为捕获抗体、多抗为检测抗体和以多抗为捕获抗体、单抗为检测抗体的方法，结果表明以多抗为捕获抗体、单抗为检测抗体检测结果值高、背景颜色深、特异性较差，因此最终确定包被单抗、多抗作检测抗体的方法。结果见表1、表2。
表1以单抗为捕获抗体、多抗为检测抗体
表2以多抗为捕获抗体、单抗为检测抗体
2最佳单抗包被浓度及多抗稀释度的确定
2.1实验材料：
进口酶标板(corning)，檫手纸，TMB显色液，PCV2 CAP蛋白腹水(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，HRP-羊抗猪酶标二抗(KPL)，猪抗PCV2阳性血清(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，0.05M磷酸盐缓冲液(PH 9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)，含0.05％Tween-20 的PBS(PBST)缓冲液，2M H2S04终止液(ddH2O 178.3ml，加浓硫酸至200ml，在水中逐滴加入浓硫酸，边加边搅拌)终止液，5％脱脂乳(PBS稀释)。
2.2实验方法
用PH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(CBS)按1:50,1：100,1:200......1:6400稀释捕获抗体，100ul/孔包被酶标板，4℃作用过夜；甩去板中的液体，用含0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入5％脱脂乳封闭液，200ul/孔，置 37℃2h；洗板5次，加入待检抗原样品，100ul/孔，置37℃孵育1h；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)按1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400稀释的检测抗体， 100ul/孔，置37℃孵育1h，同时设阳性、阴性、空白对照；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)1:5000稀释的酶标二抗，l00ul/孔，置37℃孵育45min；洗板5次，加入底物TMB，100ul/孔，37℃避光显色10min；加终止液2M H2S04，50ul/孔，混匀后10min 内测定OD450nm值。
结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)。当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立。待测样品孔P/N≥2时为阳性。
2.3实验结果
选择阳性样品值在1.0以上，阴性样品值在0.2左右，P/N值大于2的稀释度为腹水及多抗的最佳稀释度。即腹水400倍稀释、多抗6400倍稀释为最佳稀释度。结果见表3。
表3
3封闭液的优化
3.1实验材料
进口酶标板(corning)，檫手纸，TMB显色液，PCV2 CAP蛋白腹水(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，HRP-羊抗猪酶标二抗(KPL)，猪抗PCV2阳性血清(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，0.05M磷酸盐缓冲液(PH 9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)，含0.05％Tween-20 的PBS(PBST)缓冲液，2M H2S04终止液(ddH2O 178.3ml，加浓硫酸至200ml，在水中逐滴加入浓硫酸，边加边搅拌)终止液，5％脱脂乳(PBS稀释)，1％BSA(PBS稀释)。
3.2实验方法
用PH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(CBS)1：400稀释PCV2Cap蛋白腹水，100ul/ 孔包被酶标板，4℃作用过夜；甩去板中的液体，用含0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入5％脱脂乳封闭液或1％BSA封闭液封闭，200ul/ 孔，置37℃2h；洗板5次，加入待检抗原，100ul/孔，置37℃孵育1h；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)按1:6400稀释的抗猪圆环病毒2型多克隆抗体，100ul/孔，置37℃孵育1h，同时设阳性、阴性、空白对照；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST) 1:5000稀释的酶标二抗，l00ul/孔，置37℃孵育45min；洗板5次，加入底物TMB，100ul/ 孔，37℃避光显色10min；加终止液2MH2S04，50ul/孔，混匀后10min内测定OD450nm 值。
结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)。当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立。待测样品孔P/N≥2时为阳性。
3.3实验结果
5％脱脂乳封闭时，P/N值更高。此外，采用1％BSA做封闭液时，阴性值高、背景颜色深。说明5％脱脂乳封闭效果更好，因此，优选地用5％脱脂乳做封闭液。
表4最佳封闭液的确定
4PCV2双抗体夹心Elisa检测方法判定标准的确定
4.1实验材料：
进口酶标板(corning)，檫手纸，TMB显色液，PCV2 CAP蛋白腹水(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，HRP-羊抗猪酶标二抗(KPL)，猪抗PCV2阳性血清(经辛酸-饱和硫酸铵纯化)，0.05M磷酸盐缓冲液(PH 9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)，含0.05％Tween-20 的PBS(PBST)缓冲液，2M H2S04终止液(ddH2O 178.3ml，加浓硫酸至200ml，在水中逐滴加入浓硫酸，边加边搅拌)终止液，5％脱脂乳(PBS稀释)。
4.2实验方法
用PH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(CBS)1：400稀释PCV2Cap蛋白腹水，100ul/ 孔包被酶标板，4℃作用过夜；甩去板中的液体，用含0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入5％脱脂乳封闭液，200ul/孔，置37℃2h；洗板5次，加入待检的24份PK15细胞培养冻融液阴性样品，100ul/孔，置37℃孵育1h；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)按1:6400稀释的抗猪圆环病毒2型多克隆抗体，100ul/孔，置37℃孵育1h，同时设阳性、阴性、空白对照；洗板5次，加入用含 5％脱脂乳PBS(PBST)1:5000稀释的酶标二抗，l00ul/孔，置37℃孵育45min；洗板5 次，加入底物TMB，100ul/孔，37℃避光显色10min；加终止液2M H2S04，50ul/孔，混匀后10min内测定OD450nm值。
结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)。当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立。待测样品孔P/N≥2时为阳性。
4.3实验结果
24份样品平均值为0.147，标准偏差为0.026，根据统计学原理确定阴阳性临界值为即待测样品的OD450值≥0.225 为阳性，＜0.199为阴性，介于两者之间可疑。24份阴性样品检测结果见表5
表5 PCV2双抗体夹心Elisa检测方法判定标准的确定
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| OD450 | 0.212 | 0.235 | 0.14 | 0.139 | 0.125 | 0.14 | 0.128 | 0.14 | 0.139 | 0.151 | 0.15 | 0.144 |
| 编号 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |
| OD450 | 0.129 | 0.135 | 0.154 | 0.152 | 0.144 | 0.145 | 0.148 | 0.138 | 0.106 | 0.147 | 0.139 | 0.147 |
5封闭时间的确定
按照确定好的反应条件，分别用封闭液4℃封闭过夜、37℃封闭45min、37℃封闭1h、37℃封闭2h。选择P/N值最大的条件作为最佳封闭时间，由表6可见，37℃封闭45min 阴性值偏高，封闭效果稍差，其余三组封闭效果相差不大，考虑到节约时间，最终确定 37℃封闭1h为最佳封闭时间。具体见表6。
表6封闭时间的确定
6一抗作用时间的确定
按照确定好的反应条件，分别进行一抗37℃孵育30min、45min、1h，选择P/N值最大的条件作为最佳一抗作用时间。最终确定37℃孵育1h为最佳一抗时间。具体见表7。
表7一抗作用时间的确定
| 作用时间 | 30min | 45min | 1h |
| Ag(+) | 1.286 | 1.547 | 2.101 |
| Ag(-) | 0.256 | 0.126 | 0.109 |
| P/N | 5.023 | 12.278 | 19.275 |
7二抗作用时间的确定
按照确定好的反应条件，分别进行二抗37℃孵育30min、45min、1h，选择P/N值最大的条件作为最佳二抗作用时间。最终确定37℃孵育1h为最佳一抗时间。具体见表8。
表8一抗作用时间的确定
| 作用时间 | 30min | 45min | 1h |
| Ag(+) | 1.083 | 1.662 | 2.384 |
| Ag(-) | 0.082 | 0.108 | 0.113 |
| P/N | 13.207 | 15.389 | 21.097 |
8显色时间的确定
按照确定好的反应条件，分别进行37℃显色5min，37℃显色10min，室温显色10min，选择P/N值最大的条件作为最佳显色时间时间。最终确定37℃孵育10min为最佳显色时间。具体见表9。
表9显色时间的确定
| 作用时间 | 37℃，5min | 37℃，10min | 室温10min |
| Ag(+) | 0.836 | 1.897 | 1.212 |
| Ag(-) | 0.079 | 0.105 | 0.096 |
| P/N | 10.582 | 18.067 | 12.625 |
实施例5本发明试剂盒的特异性、灵敏性以及标准曲线的建立实验
1特异性实验
采用实施例4中确定好的检测方法，对常见猪病猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪乙脑病毒(JEV)、猪轮状病毒(RV)进行检测，结果表明所建立的猪圆环病毒双抗体夹心Elisa法对除PCV2以外的其他猪病毒均无交叉反应，试剂盒特异性良好。结果见图1。
2敏感性实验
按照本实施例1中活化PCV2Cap蛋白重组菌，纯化Cap蛋白。将纯化后的Cap蛋白采用BCA法进行蛋白定量。将定量后的Cap蛋白用抗原稀释液按照5、10、20、40、 80、160、320、640、1280倍比稀释，采用本发明所述双抗体夹心法，测定OD450值，选择P/N≥2.1的值为本方法的灵敏度，根据表10可以看出，本方法的最低检测值为 3ug/ml。
表10敏感性实验
3标准曲线的建立
按照本实施例1中活化PCV2Cap蛋白重组菌，纯化Cap蛋白。将纯化后的Cap蛋白采用BCA法进行蛋白定量。将定量后的Cap蛋白用PBS按照5、10、20、40、80、160、 320、640、1280倍比稀释，采用本发明所述双抗体夹心法，测定OD450值，选择R2值大于0.99的范围为标准曲线测定范围，所建立的标准曲线见图2。
实施例6本发明试剂盒在检测PCV2抗原半成品中的应用
应用本发明建立的PCV2双抗体夹心ELISA试剂盒，检测不同制备方法、不同来源的29份PCV2半成品抗原含量。具体步骤为：用PH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液 (CBS)1：400稀释PCV2Cap蛋白腹水，100ul/孔包被酶标板，4℃作用过夜；甩去板中的液体，用含0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入5％脱脂乳封闭液，200ul/孔，置37℃2h；洗板5次，加入待检的29份PCV2半成品抗原， 100ul/孔，置37℃孵育1h；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)按1:6400稀释的抗猪圆环病毒2型多克隆抗体，100ul/孔，置37℃孵育1h，同时设阳性、阴性、空白对照；洗板5次，加入用含5％脱脂乳PBS(PBST)1:5000稀释的酶标二抗，l00ul/孔，置37℃孵育1h；洗板5次，加入底物TMB，100ul/孔，37℃避光显色10min；加终止液 2M H2S04，50ul/孔，混匀后10min内测定OD450nm值。
结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)。当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立。待测样品孔P/N≥2时为阳性。结果可见，本方法对不同制备方法、不同来源的半成品PCV2 抗原具有良好的检测效果，见表11。
表11
| 样品名称 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 | 样品6 | 样品7 | 样品8 | 样品9 | 样品10 |
| OD450 | 1.305 | 1.277 | 1.820 | 1.230 | 1.984 | 1.193 | 1.184 | 1.131 | 1.130 | 1.733 |
| P/N | 10.520 | 10.294 | 14.677 | 9.919 | 15.996 | 9.621 | 9.544 | 9.121 | 9.113 | 13.976 |
| 样品名称 | 样品11 | 样品12 | 样品13 | 样品14 | 样品15 | 样品16 | 样品17 | 样品18 | 样品19 | 样品20 |
| OD450 | 1.966 | 2.281 | 2.183 | 2.188 | 1.915 | 1.879 | 1.773 | 2.295 | 1.689 | 2.212 |
| P/N | 15.855 | 18.395 | 17.601 | 17.641 | 15.444 | 15.153 | 14.298 | 18.504 | 13.621 | 17.835 |
| 样品名称 | 样品21 | 样品22 | 样品23 | 样品24 | 样品25 | 样品26 | 样品27 | 样品28 | 样品29 | 阴性对照 |
| OD450 | 2.034 | 2.612 | 2.032 | 1.986 | 2.338 | 2.806 | 1.616 | 1.543 | 1.202 | 0.124 |
| P/N | 16.403 | 21.065 | 16.387 | 16.016 | 18.855 | 22.629 | 13.032 | 12.444 | 9.694 | 1.000 |
Claims (10)
1.一种猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：包被有抗猪圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的酶标板、封闭液、一抗、酶标二抗、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包被稀释液为0.05M碳酸盐缓冲液(PH9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含1％-10％BSA或1％-10％脱脂乳的PBS溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述所述封闭液为含5％脱脂乳的PBS溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述一抗为抗猪圆环病毒2型多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪酶标二抗。
7.权利要求1所述的试剂盒在检测猪圆环病毒2型灭活疫苗抗原中的应用。
8.一种猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用包被稀释纯化后的单抗，100ul/孔包被酶标板，4℃作用过夜；
(2)甩去板中的液体，用洗涤液洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入封闭液，200ul/孔，置37℃孵育；
(3)洗板5次，加入一定稀释度的待检抗原样品及对照样品，100ul/孔，置37℃孵育，同时设不加抗原对照(用脱脂乳代替)；
(4)洗板5次，加入一抗，即纯化的抗猪圆环病毒多克隆抗体，100ul/孔，置37℃孵育；
(5)洗板5次，加入酶标二抗，100ul/孔，置37℃孵育；
(6)洗板5次，加入底物显色液，100ul/孔，37℃避光显色；
(7)加终止液，50ul/孔，混匀后10min内测定OD450nm值；
(8)结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值‐空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值‐空白孔OD值)，当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立，待检样品孔P/N≥2时为阳性。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：单抗1:400稀释、猪多抗血清1:6400稀释。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：封闭时间为1h。
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