CN103695376A

CN103695376A - 分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株

Info

Publication number: CN103695376A
Application number: CN201310560761.8A
Authority: CN
Inventors: 姜平; 翟淑燕; 白娟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2014-04-02

Abstract

本发明公开了一种分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的杂交瘤细胞株在制备猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体中的应用，其中所述杂交瘤细胞株保藏编号CGMCC No.8169，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明所涉及的杂交瘤细胞具有稳定的抗体分泌能力，所分泌的单克隆抗体与猪圆环病毒2型Cap蛋白具有良好的反应特异性。此研究为以后进行PCV2病原学及其致病机理的研究奠定了良好的物质基础。

Description

分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体而言，涉及分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起世界养猪国家经济损失的重要病原之一。临床上引起的疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)或猪圆环病毒病(PCVD)，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、繁殖障碍、肠炎、增生性坏死性肺炎和猪呼吸道病复合体(PRDC)等，已经给全世界养猪业带来了巨大损失。PCV2无囊膜，PCV2基因组含有2主要的开放阅读框，即ORF1和ORF2。ORF2编码病毒结构蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，长233个氨基酸(aa)，在抗病毒感染免疫中发挥着重要作用。目前，国内外已经制备出多个抗Cap蛋白单克隆抗体，鉴此阐明的Cap蛋白抗原表位有69-83、117-131、132-146、156-162、175-192、195-202和230-233aa，其中156-162、175-192、195-202和231-233aa包含中和表位的空间构象表位。但是，目前该蛋白的核定位信号肽序列部位(1-50aa)的抗原表位尚未报道。

PCV2抗体检测方法有ELISA、IPMA和IFA等，病毒抗原检测方法有病毒分离鉴定、IPMA和IFA和PCR等，其敏感性和特异性较好，但操作耗时费力，对技术和设备要求高，因此无法推广应用。双抗体夹心ELISA虽然在其他病原检测中有报道，但由于受到抗体的限制，在PCV2检测中尚无报道。因此，如何快速获得能够检测PCV2抗原的ELISA试剂盒是本领域亟待解决的技术难题。

微生物信息

本发明的一个优选实施方式以及具体实施方式中所使用的分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(分类命名：分泌PCV2抗体的杂交瘤细胞)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 CGMCC NO.8169，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年9月18日。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于所述杂交瘤细胞株保藏编号CGMCC NO.8169，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，或者是与CGMCC NO.8169的分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有95％以上亲缘性的杂交瘤细胞株。

在本发明的一个方面，所述的杂交瘤细胞株具有稳定分泌抗PCV2单克隆抗体的能力，体外连续培养20代，分泌的抗体ELISA效价一致(表1)；

表1不同代次杂交瘤细胞培养上清效价

分泌的抗体能与PCV2病毒粒子具有良好的反应性，可用于Western blot和间接免疫荧光试验，可用于鉴定PCV2及Cap蛋白抗原，测定PCV2滴度；

分泌的抗体具有中和病毒作用，可用于PCV2中和试验鉴定PCV2(表3)。

表2单抗中和活性的鉴定

本发明另一方面还涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体 anti-Cap-3E5，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8169的杂交瘤细胞株分泌。该单克隆抗体重链约为50kDa，轻链约为25kDa。单抗属于IgG2a亚类，轻链为κ型。如表3。

表3单抗亚型的鉴定

本发明另一方面还涉及上述猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体在制备猪圆环病毒2型Cap蛋白检测中试剂中的应用。

本发明所涉及的杂交瘤细胞具有稳定的抗体分泌能力，所分泌的单克隆抗体与猪圆环病毒2型Cap蛋白具有良好的反应特异性。此研究为以后进行PCV2病原学及其致病机理的研究奠定了良好的物质基础。

具体实施方式

1.杂交瘤细胞的制备

(1)小鼠免疫：利用纯化的PCV2病毒液为免疫原，皮下多点注射6～8周龄的雌性Balb/C小鼠，剂量100μg/只，共免疫3次，间隔3周，三免后10天，小鼠尾静脉采血用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选择效价高的小鼠在细胞融合前3天，腹腔注射50μg的PCV2纯化病毒液加强免疫。

(2)免疫小鼠血清效价的测定：原核表达的PCV2CapC蛋白作为ELISA包被抗原检测免疫小鼠的血清抗体效价，并设立未免疫的小鼠血清为阴性对照。最后以P/N≥2.1的最大血清稀释度为小鼠的血清效价。

(3)细胞融合：无菌采集免疫小鼠脾细胞，与SP2/0细胞按一定比例进行混合，再用PEG4000按常规方法进行细胞融合。

(4)杂交瘤细胞筛选与克隆：分别用纯化的PCV2和PK-15细胞裂解物(15μg/mL)包被聚苯乙烯板，收取融合后10天的细胞培养上清进行间接ELISA筛选阳性细胞克隆。最后选则与PCV2反应为阳性，与PK-15细胞反应为阴性的杂交瘤细胞孔采用有限稀释法进行亚克隆，3次亚克隆后，将获得的阳性杂交瘤细胞扩大培养并及时冻存。

2.杂交瘤细胞制备单克隆抗体

(1)细胞培养法：无菌收集杂交瘤细胞的培养上清，离心后备用。上清中含有单克隆抗体，可以用来做Western blot、IFA和病毒中和试验等。此方法收集的抗体效价较低，用量较少时可使用此法。

(2)小鼠腹水制备：要获得效价较高且较多的抗体时多用此法。具体方法为：取6～8周龄健康雌性Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只；7天后，每只小鼠腹腔接种1～2×10⁶个杂交瘤细胞。接种前，杂交瘤细胞弃掉培养液，用无血清的RPMI1640培养液洗涤细胞两次，尽量洗去血清蛋白，吹散细胞并配成浓度为4～5×10⁶个/mL的细胞悬液。无菌条件下，注射0.5mL细胞悬液入小鼠腹腔。杂交瘤细胞以腹水瘤的形式在小鼠腹腔内大量繁殖，7～10天后，小鼠腹部明显胀大，触之有波动感，且表现为精神萎靡、被毛凌乱的状态，此时即可收集腹水。采集腹水时，左手抓住小鼠颈背部皮肤、左后腿和尾巴，腹部朝向实验者，并使头部呈45度倾斜向下。用12号针头自腹股沟插入腹腔后，迅速使小鼠头部朝上和腹部向下，腹水自然流出而收集。过两、三天后，腹部胀大，可再次收集，一般可收集2～3次。将腹水收集至离心管，4000rpm离心10min，取中间无色透明层液体，即为腹水，-20℃冻存备用。

3.单克隆抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水，具体步骤如下：

(1)腹水在4℃，12000rpm，离心15min。

(2)吸取腹水上清，加入3倍体积的60mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)稀释后，用0.1M NaOH调pH至4.5。

(3)室温条件下，逐滴加入辛酸并搅拌(40μL/mL稀释前腹水)，加入时，待前一滴溶解后再加另一滴。加入辛酸后，在搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

(4)4℃，12000r/min，离心30min，收集上清。

(5)上清液用普通滤纸进行过滤后，收集到锥形瓶中，加入1/10体积的10×PBS(0.1M pH7.4)，并用2M NaOH调至pH7.4，冰浴至4℃放置。

(6)上述混合液加入固体硫酸铵，0.277g/mL(0℃条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵。

(7)4℃静置过夜，13000r/min，4℃离心30min，弃上清，再短暂离心，将沉淀溶解于137mM NaCl、2.6mM KCl、0.2mM EDTA的pH7.4PBS中溶解(浓缩至原腹水体积的1/5)，于50-100倍体积的上述PBS中4℃透析过夜。

(8)取少量透析后样品经适当稀释后，在核酸蛋白定量仪上测定蛋白含量，并进行SDS-PAGE电泳，分析纯化效果。其余的-70℃冻存纯化的腹水。

4.单克隆抗体的鉴定

(1)Western blot鉴定单克隆抗体的反应性：取纯化的PCV2和PK15裂解物做SDS-PAGE电泳，然后采用半干转印法将PAGE胶转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上，检测一抗分别为杂交瘤细胞培养上清，二抗羊抗小鼠IgG-HRP，最后加入ECL发光液，暗室曝光，胶片显影。

(2)单抗与PCV2的间接免疫荧光试验：无PCV1污染的PK15细胞经胰酶消化后铺96孔细胞板，细胞长至70％密度时，接种PCV2病毒液，37℃孵育1h，加入2％DMEM继续培养，同时设立未接毒的PK-15细胞为对照。37℃继续培养72h后，进行间接免疫荧光实验。80％丙酮4℃固定细胞10min，PBST洗涤3次拍干，感染PCV2及正常的PK-15细胞孔分别加入杂交瘤细胞培养上清，同时设定SP2/0上清阴性对照，抗PCV2猪血清为阳性对照。37℃孵育1h后，PBST洗涤3次拍干，加入羊抗小鼠的IgG-FITC，而阳性对照孔则加入Protein A-FITC，37℃均孵育45min后，PBST洗涤3次拍干，荧光显微镜下观察结果。

(3)单抗中和活性测定：根据荧光减少百分率来判定三株单抗对PCV2的中和活性。具体步骤为：杂交瘤细胞上清分别与10⁵TCID₅₀/mL的PCV2病毒液等量混合，37℃孵育1h，然后感染96孔细胞板中生长12h的PK-15细胞，设立三个重复孔，同时设定无关单抗的杂交瘤细胞上清和PCV2阳性猪血清(1：100)为阴阳性对照。然后37℃温箱继续培养72h，进行IFA。在200倍镜下，观察每株单抗每个视野下平均荧光点数。每个孔选取5个视野(上下左右中)拍照，每株单抗共15个视野，计算每个视野下的平均荧光点数。根据公式计算三株单抗的荧光减少百分率。荧光减少百分率(％)＝(阴性对照的平均荧光点数-PCV2单抗的平均荧光点数)/阴性对照的平均荧光点数。以荧光减少百分率≥80％，判定为此株单抗具有中和活性，否则为不具有中和活性。

(4)单抗属于Ig亚类鉴定：用the

Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit鉴定单抗亚型。

5.所述的检测猪圆环病毒2型抗原的夹心ELISA方法

(1)反应条件的优化：通过反应条件优化，其操作步骤为：①在酶标板上每孔加入终浓度为2μg/mL的纯化单抗，4℃包被过夜，PBST洗板；②加入含5％脱脂乳的PBST，200μL/孔，37℃1h封闭，PBST洗板；③加入2倍比稀释的待检抗原样品，100μL/孔，设标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，37℃1h，PBST洗板；④加入1：1000稀释的检测抗体即兔抗，100μL/孔，37℃1h，PBST洗板；⑤加入1∶10,000稀释的酶标二抗羊抗兔IgG-HRP，37℃45min，PBST洗板；⑥加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃10min。加入2M H2SO450μL/孔终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。⑦判断标准如下：当待测样品OD450nm值≥0.209时为阳性，待测样品OD450nm值＜0.191时为阴性，介于0.191～0.209之间为可疑。

A.单抗作为捕获抗体和兔抗为检测抗体：表4结果可看出，单抗作为捕获抗体和兔抗为检测抗体这种组合方式建立的夹心ELISA方法可行。3E5和3E6单抗作为包被抗原能成功的捕获PCV2抗原，制备的兔抗也能起到检测抗体的作用。OD_450nm值随着PCV2量的减少也逐渐降低，但5A6和5H7单抗的检测结果OD_450nm几乎为阴性，可能是因为两者对PCV2的亲和力不够所致。3E5和3E6单抗两者相比，3E5的捕获能力更强，每个稀释度检测的OD_450nm值均比3E6高。因此，选择3E5单抗作为夹心ELISA的捕获抗体，兔抗血清为检测抗体。

表4单抗作为捕获抗体和兔血清为检测抗体的夹心ELISA检测结果

B.单抗最佳包被浓度和兔抗血清抗体最佳稀释度的确定：表5结果表明，当单抗包被浓度为2μg/mL，兔血清稀释度为1∶8000时，阳性对照的OD_450nm值在1.0左右，P/N值最大。因此选择以上两种浓度为捕获抗体和检测抗体最佳作用浓度。

表5抗体最佳包被浓度和兔血清最佳稀释度的确定

C.单抗最佳包被时间的确定：用2μg/mL浓度包被3E5单抗和1：8000兔抗稀释度来进行检测，通过设定不同的单抗包被时间来进行夹心ELISA检测，结果发现当单抗37℃包被2h时，其P/N最大，因此即选择37℃作用2h为单抗的最佳包被时间(表6)。

表6抗体最佳包被时间的确定

D.最佳封闭液的确定：用不同的封闭液对包被的酶标板进行封闭，试验结果表明，用含5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为封闭液时，P/N值最大，所以选择5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为最佳封闭液(表7)。

表7最佳封闭剂的选择

E.最佳封闭时间确定：用含5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为封闭液时，置37℃下分别作用1h、2h和3h进行ELISA检测，试验结果表明，用含5％BSA的磷酸盐缓冲液置37℃封闭1h效果最好，所以最佳封闭时间为1h(表8)

表8最佳封闭时间的选择

F.抗原稀释度的范围的确定：由结果(表9)可知，阴性对照在2倍比稀释的时候，OD_450nm值得到明显下降，从高于0.2到比0.2小，而继续往后稀释时，OD_450nm值下降幅度不大，且在空白对照上下波动，因空白对照背景较高都在0.1以上，为了排除空白对照的干扰，选取比空白对照值较高到却低于0.2的最大稀释度，即2倍稀释作为阴性对照的最佳稀释度。

阳性对照OD_450nm值的随着稀释度的加大而变小，但为了使筛选夹心ELISA条件时阳性对照的变化较明显，选取OD_450nm值在1.0～1.5左右的稀释度为阳性对照的最佳稀释度，因1：128稀释度不好操作，因此选择较接近的1：100倍稀释作为阳性对照的最佳稀释度。

表9抗原稀释度的确定

G.抗原最佳作用时间的确定：将阴性对照按1∶2稀释、阳性对照按1：100稀释后，置37℃下分别作用0.5h、1h、1.5h及2h，选择抗原的最佳作用时间，结果发现当抗原置37℃作用2h时，P/N值最大，因此，抗原最佳的作用时间为37℃2h(表10)

表10抗原最佳反应时间的选择

H.兔抗血清最佳作用时间的确定

将兔抗血清按1：8000最佳稀释度加入反应孔，置37℃下分别作用0.5h、1h、1.5h及2h，选择兔血清的最佳作用时间，结果发现当兔抗置37℃作用1h时， P/N值最大，因此，兔抗最佳的作用时间为37℃1h(表11)。

表11兔血清最佳作用时间的选择

I.酶标二抗最佳稀释度的确定

将羊抗兔IgG-HRP用封闭液分别作1：10,000、1：20,000、1：30,000、1：40,000稀释后，置37℃下30min，选择酶标二抗的最佳稀释度。由结果可知，当羊抗兔IgG-HRP1：10,000稀释时，其P/N值最大，因此确定羊抗兔IgG-HRP最佳稀释倍数为1：10,000(表12)。

表12酶标二抗最佳稀释度的确定

J.酶标二抗最佳作用时间的确定

将羊抗兔IgG-HRP按1：10,000稀释后，置37℃下分别作用15min、30min、45min及60min，选择其酶标二抗最佳作用时间。结果表明，当酶标二抗置37℃下作用30min后，其P/N值最大，因此确定酶标二抗最佳作用时间为37℃30min(表3-11)。

表13酶标二抗最佳反应时间的选择

K.最佳显色时间的确定

在其它条件相同的情况下，TMB显色液在37℃下分别反应5min、10min、 15min及20min，选择其最佳作用时间。结果发现，当底物加入后10min，其P/N值最大，因此底物TMB的最佳反应时间为10min(表14)。

表14底物最佳反应时间的选择

(2)判定标准的确定

用建立好的夹心ELISA方法检测30份无PCV2污染的阴性样品。初步确定判定标准。详细检测结果见表15。

表1530份阴性样品的ELISA检测结果

30份阴性样求得其平均值(X)为0.155；标准偏差(SD)为0.018；根据统计学原理，确定阴阳性临界值为C_P＝X+3SD＝0.155+3×0.018＝0.209，C_N＝X+2SD＝0.155+2×0.018＝0.191，即待测样品的检测值≥0.209为阳性，小于0.191为阴性，介于两者之间为可疑。

(3)特异性试验

用建立好的夹心ELISA方法包被酶标板，检测PCV2、EMCV、PCMV、PEDV、PRRSV、PCV1、Hps等猪病病原样品，根据判定标准确定阴阳性，分析该方法的特异性。检测结果(表3-15)显示，除了PCV2检测为阳性，其它病原检测均呈阴性，表明所建立的夹心ELISA方法，具有良好的特异性。

表16双抗体夹心ELISA的特异性检测结果

(4)敏感性试验

A.夹心ELISA的检测下限：新增殖的PCV2细胞毒，IFA测定其滴度为10^6.3TCID₅₀/mL。将此细胞毒从1：20(即10^5.0TCID₅₀/mL)开始依次进行连续2倍比稀释，进行夹心ELISA检测，每个稀释度设立三个重复，最后测定其每个稀释度平均OD_450nm值，根据建立的判定标准，确定其能检测的下限。最后根据结果，发现建立的双抗体夹心ELISA检测下限为390.6TCID₅₀/mL，即10^2.59TCID₅₀/mL(表17)。

B.夹心ELISA与IFA、PCR方法的比较

采用IFA和夹心ELISA同时检测相同样品。夹心ELISA检测的每个稀释度样品，从中取100μL提取DNA，进行PCV2的PCR检测，根据每个稀释度电泳条带的有无确定PCR检测的敏感性。最后综合比较夹心ELISA与PCR和IFA的敏感性。结果如表17，表明夹心ELISA敏感性小于PCR和IFA。

表17双抗体夹心ELISA的敏感性试验

(5)重复性试验

批内重复性：纯化的同一批次的捕获抗体，于不同时间包被制备ELISA板，同时检测四份已知背景样本，强阳、中阳、弱阳和阴性各1份，每个样本设立三个重复。结果见表18，其各个样本的变异系数均小于10％，说明夹心ELISA方法制备的酶标板具有良好的批内重复性。

表18夹心ELISA的批内重复性检测结果

批间重复性：三个批次的捕获抗体同时包被制备ELISA板，检测已知背景4份样本，强阳、中阳、弱阳和阴性各1份，每个样本设立三个重复。结果见表19，其各个样本的变异系数均小于10％，说明夹心ELISA方法制备的酶标板具有良好的批间重复性。

表19夹心ELISA的批间重复性检测结果

(6)定量检测-标准曲线的建立

用夹心ELISA对含不同病毒滴度的样品检测，得到相应的OD450nm值，以每个病毒滴度(TCID50/0.1mL)为横坐标，检测的OD450nm值为纵坐标，绘制检测曲线。从绘制的曲线可看出，在病毒滴度达到25000TCID50/mL以上时，曲线趋于平缓，说明结合的抗原量达到饱和，而在2500到390.6TCID50/mL时，线性关系基本趋于直线，因此，选择2500、1250、625、312.5、156.25、78.13和390.6TCID50/mL这7个滴度建立标准曲线。利用软件CurveExpert1.3绘制标准曲线，得到一个四参数拟合曲线(y＝a+bx+cx^2+dx^3+ex^4)，其r＞0.99，说明建立的标准曲线相关性良好，可以用于样品的检测。其检测范围在390.6～25000TCID50/mL之间比较准确。

(7)夹心ELISA与IFA两种定量检测方法的比较：

利用夹心ELISA方法测得标准品、待检样品及空白对照的OD450nm值，计算CS标和CS样值(表3)，利用CurveExpert1.3软件制的标准曲线，根据软件计算公式，输入样品的CS样值，计算6个细胞毒样品的TCID50，与间接免疫荧光测得滴度进行比较，结果发现两者具有明显的一致性(表4)，说明可以用夹心ELISA进行样品中PCV2病毒滴度的定量。

表20夹心ELISA对6份细胞毒样品的检测结果

表21夹心ELISA和IFA两种方法对6份细胞毒样品的检测结果比较

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于所述杂交瘤细胞株保藏编号CGMCC NO.8169，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，或者是其直接传代物；或者是与CGMCC NO.8169的分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有95％以上亲缘性的杂交瘤细胞株。

2.一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8169的杂交瘤细胞株分泌。

3.权利要求2所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体在制备猪圆环病毒2型Cap蛋白检测中试剂中的应用。