CN105717293A - 一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽病检测领域，特别涉及猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的单克隆抗体及包含所述单克隆抗体的试剂盒。所述单克隆试剂盒包括由杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2014199分泌产生的单克隆抗体，和/或由杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2014198分泌产生的单克隆抗体。本发明还提供了一种由杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2014199分泌产生的单克隆抗体和一种由杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2014198分泌产生的单克隆抗体，以及一种杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2014199和一种杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2014198。

Description

一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒

技术领域

本发明涉及兽病检测领域，特别涉及猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白的单克隆抗体及其试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(Circoviridae，Circovirus，Porcinecircovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒，已知的PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV1没有致病性，PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)的主要病原，它不仅可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天震颤(A2CT)、猪繁殖障碍、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)和呼吸道疾病综合征(PRDS)有关，这些疾病统称为猪圆环病毒病(PCVD)。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展，给许多国家和地区带来了巨大的损失。更为严重的是PCV2的感染可以降低抵抗力和免疫应答反应，引起其它各种病原微生物的继发感染，造成的间接损失难以估计。目前，PCV2已成为严重阻碍我国养猪业发展的重要病原之一。

PCV2及其相关的猪的疾病已在世界范围内发生和流行，死亡率10％～30％不等，较严重的地区，猪场在爆发本病时死亡淘汰率高达40％，严重影响了我国养猪业的健康发展。而且，临床上PCV2的感染普遍存在，但多数表现为隐性感染和亚临床感染，常易被忽视，在猪群受到应激反应后，可能导致PCV2的爆发，因此，做好PCV2病原学的诊断和监测，对控制PCV2的感染具有重要意义。

为了更为准确的诊断PCV2，亟需开发出一种新的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了抗猪圆环病毒2型(PCV2)的核衣壳蛋白(Cap)的单克隆抗体及检测猪圆环病毒2型的试剂盒，所述试剂盒选自ELISA检测试剂盒或酶免疫层析检测试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型试剂盒，所述试剂盒包括由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体，和/或由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体。也就是说，所述试剂盒中可单独的包括上述两种单克隆抗体，也可以同时包括上述两种单克隆抗体。在本发明中，经过发明人对筛选出的特异性强、亲和力常数高的单克隆抗体的配对研究发现，当同时包括上述两种单克隆抗体时，对PCV2的检测效果更佳。但是，当抗体组合配对使用时，并不是简单地将两个亲和力常数高的单克隆抗体配对后便能达到优良的检测效果，因为其中受限的因素很多，包括已知的或未知的因素，例如两个单克隆抗体配对使用时，要考虑两个单克隆抗体之间、两个单克隆抗体分别与抗原之间的相互关系，甚至包括所使用的单克隆抗体是否与非PCV2存在非特异性的反应和显色本底均会影响单克隆抗体的配合使用。本申请的所述两个单克隆抗体的配合使用，在优化后的条件下，ELISA试剂盒的灵敏度能够达到1.0ng/mL，酶免疫层析检测试剂盒的灵敏度能够达到2.0ng/mL。也就是说，两种试剂盒的灵敏度均显著地高于检测所述PCV2的同类别试剂盒的灵敏度。并且两种试剂盒的特异性达到了100％。这充分说明了包括所述两个单克隆抗体的试剂盒的性能显著优于现有技术中的试剂盒。

在本发明中，由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体命名为2F8，由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体命名为3G12。

术语“猪圆环病毒2型Cap全蛋白”是指猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白全蛋白(Capsidprotein，Cap)，是一种单体磷酸化的多肽，分子量大小约为27.8kDa，是PCV2的主要免疫原性蛋白(Nawagitgul.P,Morozov.I,Bolin.SR,etal.Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein.JGenVirol.,2000,81(Pt9):2281-2287)；该全蛋白具有特异性，且可以自我装配成病毒衣壳颗粒(陈燕凌等，猪圆环病毒2型ORF2基因及其编码蛋白的研究概况，湖北畜牧兽医，2013，34(1)：78-81)。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

术语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。

术语“抗体”可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

用于本发明的“单克隆抗体”可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。

在一个具体的实施方式中，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。

在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒中还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照。

在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒中的所述样品稀释液为含有脱脂奶的磷酸盐缓冲液，优选为含有10％(W/V)脱脂奶的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液为含有Tween-20的磷酸盐缓冲液，优选为含有0.05％(V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液；

所述显色液包括显色液A和显色液B，所述显色液A含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10ml，并用ddH₂O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH₂O定容至100ml；

所述终止液为2mol/LH₂SO₄。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更有选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。

用于检测PCV2的ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：

(1)克隆所述PCV2Cap全蛋白(如SEQIDNO.2所示的序列)的DNA(如SEQIDNO.1所示的序列)，并进行蛋白质表达；

(2)利用所述Cap全蛋白免疫小鼠产生杂交瘤细胞，然后通过大量的筛选，得到性能优良的分泌抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的单克隆抗体2F8和抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的单克隆抗体3G12；其中，单克隆抗体2F8由保藏号为CCTCCNO：C2014199的杂交瘤细胞分泌产生，单克隆抗体3G12由保藏号为CCTCCNO：C2014198的杂交瘤细胞分泌产生。

在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒的制备方法还包括上述步骤(2)之后的步骤(3)：将步骤(2)所制得的单克隆抗体2F8在酶标板上进行包被；将单克隆抗体3G12进行酶标记；

(4)配制样品稀释液、洗涤液、显色液A液、显色液B液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照；(5)将步骤(3)和/或(4)所制备的各成分组装成ELISA检测试剂盒。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的所述ELISA检测试剂盒的制备方法中，所述步骤(3)中包被时所用的包被液为碳酸盐缓冲液，优选为pH9.6的碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜或37℃包被2小时，封闭时所用的封闭液为1％(W/V)BSA的磷酸盐缓冲液、5％(W/V)脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1.5％(V/V)明胶的磷酸盐缓冲液或5％(V/V)犊牛血清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种，37℃封闭2小时，洗涤时所用洗涤液为含有Tween-20的磷酸盐缓冲液，优选为含有0.05％(V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液。

本发明的所述ELISA检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)将待检血清按100μl/孔加入包被有单克隆抗体2F8的酶标板上，37℃反应60min，加入200μl/孔洗涤液洗3-5次，1min/次，洗完后在吸水纸上拍干。

(2)将100μl/孔的1:8000倍(V/V)稀释的HRP标记的单克隆抗体3G12加入至包被有单克隆抗体2F8的酶标板上，37℃反应60min，之后加入200μl/孔洗涤液洗3-5次，1min/次，洗完后在吸水纸上拍干。

(3)加入底物显色液A和显色液B的混合液100μl/孔，室温避光放置15min。

(4)加入50μl/孔终止液以终止反应。

(5)在酶标仪上读取OD₄₅₀的值，并按照判定标准进行计算和判定。

在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒的使用方法还包括：与上述步骤(1)同时进行的步骤(I)：将阴性猪血清对照、阳性猪血清按100μl/孔加入包被有单克隆抗体2F8的酶标板上，37℃反应60min，加入200μl/孔洗涤液洗3-5次，1min/次，洗完后在吸水纸上拍干。

在一个具体的实施方式中，本发明提供的试剂盒为酶免疫层析检测试剂盒，其包括缓冲液供应单元和检测单元，所述缓冲液供应单元用于将底物缓冲液供给所述检测单元。

在一个具体的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒中，所述缓冲液供应单元通过展开液垫用于将底物缓冲液供给所述检测单元；所述展开液垫的第一端与缓冲液供应单元接触，所述展开液垫的第二端与所述检测单元的第一端接触。

在一个具体的实施方式中，所述检测单元包括：

基板；和在基板上依次设置的底物供应区、样品供应区和检测区；

所述底物供应区包括底物垫，所述底物垫位于远离检测线方向的基板的一端，且所述底物垫上吸附有酶底物；所述展开液垫位于所述底物供应区之上，

所述样品供应区包括酶标垫，所述酶标垫上吸附有酶标记的由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体，以及

所述检测区包括检测线和对照线，且所述检测线固定化包被由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体，所述对照线远离所述基板第一端，且所述对照线在所述基板的长度方向上的紧随所述检测线，所述对照线固定化有羊抗鼠多抗。

其中，基板可以是硝酸纤维素膜。所述底物垫上的酶底物可以为干燥的酶底物。在使用时，所述酶底物溶于底物缓冲液中，并在硝酸纤维素膜上向所述检测单元的第二端迁移；所述酶标垫上包被的单克隆抗体溶于底物缓冲液中并在硝酸纤维素膜上向所述检测单元的第二端迁移。且吸附在所述酶标垫上的单克隆抗体相对于固定化在所述检测线上的单克隆抗体是过量的。

在一个具体的实施方式中，在远离所述基板第一端的所述基板的长度方向上还包括紧随对照线的吸水垫；且所述吸水垫与所述检测区位于所述基板的同一面。其中，检测线和对照线之间，以及对照线和吸水垫之间可以存在适当的距离，例如该距离可以为0.5-1cm；吸水垫可以部分或全部与基板重叠，且该吸水垫位于基板的上面。也就是说，吸水垫至少要和基板部分接触才能起到使缓冲液供应单元的底物缓冲液向试纸条第二端迁移的目的。

在一个优选的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒中，所述缓冲液供应单元包括底物缓冲液槽、放置于底物缓冲液槽中的底物缓冲液和底物缓冲液按钮，所述底物缓冲液按钮位于底物缓冲液槽的上方，按下所述底物缓冲液按钮可将所述展开液垫浸入底物缓冲液中。

在一个具体的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒中的所述检测单元固定在支撑物上。

在一个具体的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒中的检测样品加入的位置为所述酶标垫的位置。

在一个优选的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒中的展开液垫的第二端覆盖在底物垫之上，且其第一端位于底物缓冲液槽的第一端。底物缓冲液槽的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液渗漏，展开液垫的第一端在铝箔纸上方，展开液垫上有底物缓冲液按钮，按下底物缓冲液按钮可刺破铝箔纸，并将展开液垫的第一端浸入到底物缓冲液中。

在一个优选的实施方式中，所述酶标记中的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶中的任一种。

本发明的酶标记的单克隆抗体可按照本领域的常规方法制备，如参照文献(曹雪涛，精编免疫学实验指南.北京：科学出版社，2009；酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法)公开的方法制备。作为示例，本发明采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

(1)将所述单克隆抗体经硫酸铵沉淀，过柱纯化，获得纯化的所述单克隆抗体；

(2)用改良过碘酸钠氧化法对步骤(1)制备的纯化的所述单克隆抗体进行HRP标记，制备HRP标记的所述单克隆抗体；

(3)在HRP标记的上述单克隆抗体中加入等体积的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。

在一个具体的实施方式中，在本发明的酶免疫层析检测试剂盒中，所述底物缓冲液为水性缓冲液，包括磷酸缓冲液、表面活性剂、防腐剂和糖类中的一种或几种。

在一个具体的实施方式中，酶免疫层析检测试剂盒中还包括样品采集管，所述样品采集管含有样品处理液。

在一个具体的实施方式中，在酶免疫层析检测试剂盒中，所述样品处理液为表面活性剂溶液。优选所述表面活性剂包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、卵磷脂、脂肪酸甘油酯和CHAPS中的任一种。

术语“表面活性剂”是能使目标溶液表面张力显著下降的物质，可降低两种液体或液体-固体间的表面张力。

在一个具体的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒还包括样品管、吸管。

本发明的用于检测PCV2的酶免疫层析检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：

(1)将ELISA检测试剂盒的制备所得的抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的单克隆抗体2F8在硝酸纤维素膜上进行固定化包被，将抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的单克隆抗体3G12进行酶标记，以制备酶免疫层析检测单元；

(2)配制样品处理液、样品采集管、样品管、吸管；以及

(3)将步骤(1)和/或(2)所制备的各成分组装成酶免疫层析检测试剂盒。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤(2)中样品采集管中有样品处理液，所述样品处理液优选表面活性剂，所述表面活性剂包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、卵磷脂、脂肪酸甘油酯和CHAPS的任一种。

本发明提供的用于检测PCV2的酶免疫层析检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)使用所述样品采集管预处理样品；

(2)将所述步骤(1)中预处理样品50μl加入到所述酶标垫的位置；

(3)按下底物缓冲液按钮，观察结果。

本发明用于检测PCV2的酶免疫层析检测试剂盒的优选的使用方法为：

(1)将血清加入样品采集管中，充分混匀，然后掰断样品采集管头部突起，倒置样品采集管，将样品挤到样品管中；

(2)用吸管吸取适量样品管中的血清样品，滴4滴(50μl)加入加样孔中，并迅速按下底物缓冲液按钮；

(3)室温下水平静置30分钟进行反应，并在30分钟时观察记录结果。

本发明还提供了一种由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体。所述单克隆抗体的免疫原为猪圆环病毒2型核衣壳蛋白。该抗体的亲和力常数为4.10×10^-12mol/L，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现有技术中的PCV2Cap的单克隆抗体的结合强度，因而，该抗体的应用比现有技术中的所述抗体的应用更具有优势。例如，使用其作为检测PCV2时的灵敏度会更高，因而更容易检测到病原，而不至于漏检，这将对控制PCV2的感染具有重要的意义。

分泌单克隆抗体2F8的杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCCNO：C2014199，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2014年11月3日。

本发明又提供了另一种由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体，所述单克隆抗体的免疫原为猪圆环病毒2型核衣壳蛋白。该抗体的亲和力常数为3.65×10^-12mol/L，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现有技术中的PCV2Cap的单克隆抗体的结合强度，因而，该抗体的应用比现有技术中的所述抗体的应用也更具有优势。例如，使用其作为检测PCV2时的灵敏度会更高，因而更容易检测到病原，而不至于漏检，这同样将对控制PCV2的感染具有重要的意义。

分泌单克隆抗体3G12的杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCCNO：C2014198，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2014年11月3日。

本发明又提供了一种杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014199系。

本发明最后提供了一种杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014198系。

附图说明

图1为酶免疫层析检测试纸条的在长度方向上的剖面示意图，从左至右的两端分别为试纸条的第一端和第二端，图中：1-硝酸纤维素膜，2-酶标垫，3-底物垫，4-吸水垫，5-展开液垫，6-检测线，7-对照线，8-底物缓冲液槽，9-底物缓冲液，10-支撑物，11-检测样品。

图2为SDS-PAGE凝胶电泳鉴定猪圆环病毒2型Cap全蛋白的纯度，其中泳道1为Cap全蛋白，泳道2为蛋白Maker。

图3为SDS-PAGE凝胶电泳鉴定2株抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白单克隆抗体的纯度；其中泳道1为单克隆抗体2F8，包括上端的重链和下端的轻链；泳道2为单克隆抗体3G12，包括上端的重链和下端的轻链；泳道3为蛋白Maker。

细胞保藏

分泌单克隆抗体2F8的杂交瘤细胞系：小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain2F8)的保藏号为CCTCCNO：C2014199，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2014年11月3日。

分泌单克隆抗体3G12的杂交瘤细胞系：小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain3G12)的保藏号为CCTCCNO：C2014198，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2014年11月3日。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中猪圆环病毒2型PCV2-ZJ/H已经在专利申请CN102787100A中公开。

本发明实施例中猪圆环病毒1型PCV1/G已经在专利申请CN101423836A中公开。

本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，其1L体积配方为：Na₂CO₃1.59g、NaHCO₃2.93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本实例中所用的猪圆环病毒2型抗原ELISA检测试剂盒的判定标准为：OD₄₅₀值≥0.094作为阳性，OD₄₅₀值＜0.094作为阴性。

本实例中所用的猪圆环病毒2型抗原酶免疫层析检测试剂盒的判定标准为：对照线显色，且检测线也显色，结果判定为阳性；对照线显色，而检测线不显色，结果判定为阴性；对照线不显色，而检测线显色，结果判定有两种可能：一是无效实验，另一是检测样品(特别是培养病毒样品)阳性反应强度过强，导致对照线不显色，此时建议将样品稀释后检测，直至对照线显色；对照线、检测线均不显色，结果判定为无效实验，需重检。

实施例1

猪圆环病毒2型Cap全蛋白的制备、纯化及含量测定

1.1Cap全蛋白的序列及引物设计

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪圆环病毒2型PCV2-Nanjing株(登录号为KF524259.1)中Cap全蛋白的基因序列(见序列表SEQIDNo.1)设计一对特异性引物，引物序列如下：

Cap-F：5'CATATGATGACGTATCCAAGGAGGC3'，

Cap-R：5'CTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGT3'。

1.2Cap全蛋白的表达、纯化

按李廷栋(李廷栋，轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装，2009)文献的操作方法原核表达Cap全蛋白，并通过离子交换层析方法进行纯化。使用12％SDS-PAGE进行蛋白电泳，每泳道的上样量为10μg，检测结果如图2所示。

1.3Cap全蛋白的定量

蛋白纯化后，纯化样品在1×PBS(pH7.4)中透析过夜。透析后样品按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明书进行定量，结果表明Cap全蛋白的浓度为2mg/ml。

实施例2

抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验

2.1抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白单克隆抗体的制备和纯化

2.1.1动物免疫：向0.5ml的猪圆环病毒2型Cap全蛋白中加等量的弗氏完全佐剂并经充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的6-8周龄BALB/c健康小鼠2只，每只皮下多点注射乳化后的猪圆环病毒2型Cap全蛋白300μl，间隔2周加强一次，加强免疫使用弗氏不完全佐剂；用间接ELISA法测定其抗血清，血清效价达到1:20000后方可融合。

采用间接ELISA法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成：

a、包被：以20mmol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液将猪圆环病毒2型Cap全蛋白1:4000(V/V)稀释，包被96孔聚乙烯板，然后用洗涤液洗涤，拍干后，在4℃下真空抽干。其中聚乙烯板包被规格为200μl/孔，洗涤采用0.05％的Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤3次。

b、封闭：每孔加入pH为7.4内含10％(V/V)小牛血清的磷酸盐缓冲液200μl，在37℃下封闭2小时，然后洗涤1次；

c、加样：每板设阴性对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白对照，每孔加入第三次免疫后的第3天的1:5000(V/V)稀释后小鼠外周血清50μl，在37℃下孵育1小时，洗涤3次；

d、加入酶标羊抗鼠二抗每孔100μl，在37℃下孵育1小时，洗涤3次；

e、显色：每孔加入底物显色液A和底物显色液B的混合液100μl；室温下反应15分钟，然后使用终止液终止反应；

f、比色：以空白调零，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值；

g、结果判断：P/N＝测定标本OD均值/阴性血清OD均值，P/N≥2.1为阳性。

2.1.2分离脾细胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为2×10⁷个/毫升细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液。

2.1.3细胞融合：将处于对数期的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按10:1(V/V)比例混合，加入PEG-1500使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。

2.1.4筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第7天时，即细胞培养至覆盖10％孔底时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用间接ELISA法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价、高特异性的细胞株，扩大培养，并将高效价、高特异性的细胞株冻存。最终筛选出两株杂交瘤细胞，分别为小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain2F8)和小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain3G12)。

2.1.5腹水的制备、纯化：选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用液体石蜡对小鼠腹腔注射，两周后将5×10⁵个杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，在接种一周后收集小鼠的腹水，每只小鼠可收集5ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪及DE-52离子交换柱将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集。

最终得到两种抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的单克隆抗体，分别为单克隆抗体2F8和单克隆抗体3G12。其中，单克隆抗体2F8由小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株分泌产生，单克隆抗体3G12由小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株分泌产生。

2.2抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白单克隆抗体的鉴定

2.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定

用pH9.6碳酸缓冲液稀释纯化的猪圆环病毒2型Cap全蛋白，按100ng/孔包被，对单克隆抗体的细胞培养上清进行检测，按照KoenigR.(KoenigR.IndirectELISAmethodsforthebroadspecificitydetectionofplantviruses(J).JournalofGeneralVirology,1981,55(1):53-62)文献中的间接ELISA法进行，加入的酶分别为稀释的HRP-山羊抗鼠IgM(HRP-IgM)、HRP-山羊抗鼠IgG1(HRP-IgG1)、HRP-山羊抗鼠IgG2a(HRP-IgG2a)、HRP-山羊抗鼠IgG2b(HRP-IgG2b)和HRP-山羊抗鼠IgG3(HRP-IgG3)抗体酶标二抗，结果见表1。

表1各单克隆抗体类型的鉴定

注：+表示阳性，-表示阴性。

由表1可知，单克隆抗体2F8的亚类为IgG2a，单克隆抗体3G12的亚类为IgG2b。

2.2.2单克隆抗体特异性的鉴定

利用间接ELISA方法分别测定单克隆抗体2F8、3G12与猪圆环病毒1型PCV1/G株是否具有交叉反应性。

测定结果显示：2株单克隆抗体与猪圆环病毒1型PCV1/G株均无交叉反应，表明这2株单克隆抗体均是抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的特异性单克隆抗体。

2.2.3单克隆抗体亲和力常数Kd的测定

按照郭杰标(郭杰标等，以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究，南方医科大学学报，2006，26(7)：1057-1059)文献中的竞争ELISA方法进行，分别测定单克隆抗体2F8、3G12的OD₄₅₀值以计算各个反应溶液的抗原结合率，并计算亲和力常数。

分别计算单克隆抗体2F8、3G12的抗原结合率B/(1-抗原结合率B)，然后作图求得斜率(亲和力常数)分别为4.10×10^-12mol/L和3.65×10^-12mol/L。

2.3纯化单克隆抗体的检验

2.3.1纯化单克隆抗体的外观

灯光照射下，肉眼观察可见纯化抗体呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。

2.3.2无菌试验

采用无菌检查法，取纯化后单克隆抗体原料接种至10ml/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5ml/管)。接种后的改良马丁培养基置20-25℃培养。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。同时以0.9％无菌NaCl溶液同法操作做阴性对照。培养7天后均未观察到培养基中有微生物生长，表明单克隆抗体原料符合无菌要求。

2.3.3单克隆抗体纯度

对纯化后的单抗进行纯度的检测，使用12％SDS-PAGE蛋白电泳法，每泳道的上样量为10μg，检测结果如图3所示。

结果表明：2种单克隆抗体的纯度均不低于80％。

2.3.4单克隆抗体的效价

按照实施例2.1中的方法测定纯化单克隆抗体的效价，测得单克隆抗体2F8、3G12的效价分别为1:40000、1:45000。

实施例3

单克隆抗体的标记和配对检测

3.1单克隆抗体的辣根过氧化酶(HRP)标记

根据实施例2制备的单克隆抗体2F8和3G12，按照TijssenP等(TijssenP，KurstakE.Highlyefficientandsimplemethodsforthepreparationofperoxidaseandactiveperoxidaseantibodyconjugatesforenzymeimmunoassays.AnalBiochem,1984,136:451-457)的文献对抗猪圆环病毒2型单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。

3.2配对抗体活性检测

选择猪圆环病毒2型PCV2-ZJ/H，稀释到1.0ng/ml，对于不同搭配模式进行检测，结果见表2：

表2单克隆抗体搭配及活性检测

注：+表示阳性，-表示阴性。

结果显示：除了单克隆抗体3G12包被与HRP标记的2F8检测1.0ng/ml的PCV2-ZJ/H病毒稀释液为阴性外，其它搭配均为阳性结果。这说明了当这两个单克隆抗体配对使用时，应该为包被单克隆抗体2F8，标记单克隆抗体3G12；而反过来包被单克隆抗体3G12，标记单克隆抗体2F8不能够达到检测的目的。

3.3配对抗体的非特异性检测

选择猪圆环病毒1型PCV1/G株进行培养，病毒滴度为10ng/ml，对于不同搭配模式进行检测，结果见表3：

表3单克隆抗体搭配及非特异性检测

注：+表示阳性，-表示阴性。

结果显示：3G12包被与3G12标记、2F8包被与2F8标记，此两种搭配均出现非特异性反应，其它两种搭配均未出现非特异性反应。此项实验说明了不能同时使用3G12包被与3G12标记、2F8包被与2F8标记。但可以使用包被单克隆抗体2F8、标记单克隆抗体3G12的技术方案。

根据上述两个实验结果：选择2F8作为包被原料，选择3G12作为标记原料。

实施例4

猪圆环病毒2型试剂盒制备方法的建立

4.1ELISA检测试剂盒的制备

4.1.1方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度

(1)用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体2F8为包被抗体，单克隆抗体2F8的浓度分别为2、5、7.5、10μg/ml；

(2)每孔加入100μl包被抗体包被可拆酶联板，每种浓度包被抗体各设8孔，共32孔，于4℃放置过夜；

(3)用自动洗板机洗3次，每次浸泡30秒；每孔加入200μl的5％脱脂奶封闭液，置于37℃，封闭2小时；

(4)用自动洗板机洗3次，每次浸泡30秒；以100μl/孔的量加入样品于上述包被的反应孔中，样品阳性对照为Cap全蛋白，500ng/ml，阴性对照为PBS，置于37℃，温育1小时；

(5)用自动洗板机洗3次，每次浸泡30秒；按1:2000、1:4000、1:8000、1:12000(V/V)四种比例稀释HRP标记3G12抗作为酶标抗体，100μl/孔，每种对应各加8孔，37℃温育1小时。

整个试验加样情况和结果如表4所示。

表4方阵滴定法加样情况和结果

(6)用自动洗板机洗3次，每次浸泡30秒；于各孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色剂，100μl/孔，置37℃避光显色15分钟；

(7)加入2mol/LH₂SO₄终止液，50μl/孔，终止显色；

(8)将显色后的酶联板放入酶标仪内，设定波长为450nm，测吸光度(OD)值。

检测结果如表4所示。从而确定酶标抗体和包被抗体的最适使用浓度。选取阳性对照OD值结果约为2.0左右，阴性对照OD值结果小于0.1的条件作为最佳。最终选定单克隆抗体2F8的包被浓度为5μg/ml，酶标抗体3G12的稀释比例为1:8000(V/V)。

4.1.2酶标板的包被与封闭

用pH的9.6碳酸盐缓冲液将实施例2所制备的单克隆抗体2F8稀释至5μg/ml，100μl/孔包被于酶标板上并于4℃过夜。之后，倒去残液，并分别用含5％脱脂奶的磷酸盐缓冲液封闭液于37℃进行封闭，封闭时间为120min。

4.1.3其他试剂的制备

样品稀释液：pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有0.05％(V/V)Tween-20和10％(M/V)脱脂奶，混合均匀。

洗涤液：pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有0.05％(V/V)Tween-20，混合均匀。

底物显色液A液：含有3,3",5,5"-四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10ml，然后用ddH₂O定容至100ml。

底物显色液B：含有柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml，然后用ddH₂O定容至100ml。

终止液：配制2MH₂SO₄。

4.1.4试剂盒的组装

将实施例4.1.1-4.1.3部分制备的试剂及材料组装成猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒。

4.1.5ELISA方法临界值的确定

取50份已用病毒分离方法确定的阴性血清，用已建立的双抗体夹心ELISA方法检测，测定其OD₄₅₀值，计算出50份样品OD₄₅₀值的平均值和标准差(SD)，根据统计学原理作为该方法检测阳性临界值的下限。结果可知，50份样品OD₄₅₀值的平均值为0.052，标准方差(SD)为0.014，根据统计学原理置信区间为99％。最终确定将作为阴阳性临界值，即x≥0.094作为阳性样品。

4.2酶免疫层析检测试剂盒的制备

4.2.1单克隆抗体的固定

用BioDotXYZ3050三维喷点平台将实施例2制备的单克隆抗体2F8固定在硝酸纤维素膜上。

4.2.2单克隆抗体的辣根过氧化酶(HRP)标记

根据实施例2制备的单克隆抗体3G12，按照TijssenP等(TijssenP，KurstakE.Highlyefficientandsimplemethodsforthepreparationofperoxidaseandactiveperoxidaseantibodyconjugatesforenzymeimmunoassays(J).AnalBiochem,1984,136:451-457)的文献对抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白单克隆抗体3G12进行辣根过氧化酶(HRP)标记。

4.2.3检测试剂盒的组成

检测试剂盒包含有酶免疫层析检测试纸条、样品处理液、样品采集管、样品管、吸管。其中，

(1)酶免疫层析检测试纸条，如图1所示。

(2)样品处理液，为含0.5％-3.5％CHAPS的pH7.4的磷酸盐缓冲液。

(3)在样品采集管中含有样品处理液。

所述酶免疫层析检测试纸条包括样品供应区，样品供应区包括酶标垫2，其上吸附有实施例2制备的标记单克隆抗体3G12；底物供应区，底物供应区包括底物垫3；缓冲液供应单元，缓冲液供应单元包括底物缓冲液槽8、底物缓冲液9；检测区，检测区包括检测线6、对照线7，在检测线6固定化有实施例2制备的固定单克隆抗体2F8，在对照线7固定化有羊抗鼠多抗。硝酸纤维素膜1粘附在所述支撑物10的全段；以及检测样品11加入的位置为所述酶标垫2的位置。所述缓冲液供应单元通过展开液垫5将底物缓冲液9供给所述检测单元。

酶免疫层析检测试纸条固定在塑料外壳中，如图1所示，从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的第一端，其上有干燥的酶底物。吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的第二端；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段；展开液垫5覆盖在底物垫3之上，且其第一端位于底物缓冲液槽8的第一端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，该铝箔纸位于展开液垫5的第一端的下方，展开液垫5上方为底物缓冲液按钮(图1中未标出)。检测线6位于硝酸纤维素膜1的上面，且在硝酸纤维素膜1长度方向上靠近硝酸纤维素膜1第二端，对照线7位于硝酸纤维素膜1的上面，且在硝酸纤维素膜1长度方向上靠近硝酸纤维素膜1第二端，并位于远离硝酸纤维素膜第一端方向的紧随检测线6的位置，也就是与检测线6所处的位置相比较，对照线7更远离缓冲液供应单元的一端。

当使用检测试剂盒时，先使用样品采集管预处理样品；然后用吸管将预处理样品加入酶标垫2的位置，同时按下底物缓冲液按钮，底物缓冲液按钮控制底物缓冲液9通过展开液垫5向吸水垫4的层析过程。如果预处理样品中含有猪圆环病毒2型，其将与酶标记单克隆抗体3G12结合，猪圆环病毒2型与酶标记单克隆抗体3G12的结合体以及过量的酶标记单克隆抗体3G12在毛细管作用下向吸水垫4方向迁移。当迁移的猪圆环病毒2型与酶标记单克隆抗体3G12的结合体到达检测线6位置时，被固定于检测线6位置的单克隆抗体2F8捕获，从底物供应区迁移来的底物到达检测线6时，与酶标记单克隆抗体2F8产生显色反应。同时，过量的酶标记单克隆抗体3G12继续迁移到对照线7，被固定在对照线7位置的羊抗鼠多抗捕获，并与从底物供应区迁移来的底物产生显色反应。

检测标准：整个反应进行约30分钟，反应结束后，对照线显色，且检测线也显色，结果判定为阳性；对照线显色，而检测线不显色，结果判定为阴性；对照线不显色，而检测线显色，结果判定有两种可能：一是无效实验，另一是检测样品(特别是培养病毒样品)阳性反应强度过强，导致对照线不显色，此时建议将样品稀释后检测，直至对照线显色；对照线、检测线均不显色，结果判定为无效实验，需重检。

实施例5

试剂盒使用方法

5.1ELISA试剂盒使用方法

5.1.1样品的采集

病死或扑杀的猪，取肺、淋巴结等组织；待检活猪，用注射器取血5ml。2-8℃保存，ELISA试剂盒检测样品送实验室检测。

5.1.2样品的处理

组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约3g，用手术剪剪碎混匀后取1.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，12000rpm离心5min，取上清液200μl于1.5ml灭菌离心管中。

全血样品处理：待血凝后取血清100μl。

5.1.3ELISA试剂盒使用方法

(1)将待检样品、阴性对照、阳性对照按100μl/孔加入包被单克隆抗体2F8的酶标板上，37℃反应60min，之后加入300μl/孔洗涤液洗3-5次，1min/次，洗完后在吸水纸上拍干。

(2)加入100μl/孔的1:8000倍(V/V)稀释的HRP标记的单克隆抗体3G12，37℃反应60min，之后加入300μl/孔洗涤液洗3-5次，1min/次，洗完后在吸水纸上拍干。

(3)加入100μl/孔底物显色液A和显色液B的混合液，室温避光放置15min。

(4)加入50μl/孔终止液以终止反应。

(5)在酶标仪上读取OD₄₅₀的值，并按照判定标准进行计算和判定。

5.2酶免疫层析试剂盒使用方法

5.2.1样品的采集

待检活猪，用注射器取血5ml，待血凝后取血清400μl。

5.2.2样品的处理

将血清与加入样品采集管中，充分混匀。然后掰断样品采集管头部突起，倒置样品采集管，将样品挤到样品管中。

5.2.3酶免疫层析检测试剂盒使用方法

(1)用吸管吸取样品管中适量处理后的血清样品(50μl，4滴)加入加样孔，并迅速按下底物缓冲液按钮；

(2)室温下水平静置30分钟进行反应，并在30分钟时观察记录结果。

实施例6

检测试剂盒的鉴定

6.1ELISA检测试剂盒的鉴定

6.1.1灵敏度

对病毒含量为10μg/ml的猪圆环病毒2型血清样品进行梯度稀释，稀释度依次为1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240(V/V)，用三个连续批号的试剂盒进行检测，确定其最低检测下限。检测结果见表5。

表5猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒灵敏度试验结果

三个连续批号的试剂盒检测梯度稀释样品，当阳性猪血清稀释到1:10240(V/V)时，OD₄₅₀值大于0.094，结果为阳性。而阴性血清的OD₄₅₀值低于阳性判定标准。表5表明了该试剂盒可以有效检测出猪圆环病毒2型病毒滴度为1.0ng/ml的阳性样品，敏感性较好。

用三个连续批号的试剂盒对30份临床猪圆环病毒2型血清样品两个稀释度进行检测，评价该方法敏感性。同时对验证为阳性猪的肺脏、脾脏、淋巴结和肾脏组织处理液和阴性猪的肺、淋巴结、肾脏组织处理液进行检测。检测结果见表6、7。

表6猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒敏感性试验结果

注：ND表示未检测。

表7猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒检测组织样品结果

从表6、7可以看出，三个连续批号的试剂盒对30份样品均可检出，证实试剂盒敏感性好。三个连续批号的试剂盒均可检出阳性猪的肺脏、脾脏、淋巴结和肾脏组织处理液，而不与阴性猪的肺脏、脾脏、淋巴结和肾脏组织处理液发生反应，说明试剂盒检测组织样品敏感性较好。

6.1.2检测试剂盒的特异性试验

三个连续批号的试剂盒检对8份PCV2阴性血清和进行检测，评价其特异性；分别对猪圆环病毒1型(PCV1)阳性血清、猪蓝耳病病毒(PRRSV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪传染性乙型脑炎(JEV)阳性血清和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的培养液，同时设猪圆环病毒2型阳性猪血清对照、阴性猪血清对照各1孔，按实施例5所建立的检测方法进行交叉检测，每孔重复3次。检测结果见表8、9。

表8猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒检测阴性血清结果

表9猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒特异性试验结果

从表8、9可以看出，三个连续批号的试剂盒检测8份PCV2阴性血清全部为阴性，证明其特异性符合要求。三个连续批号的试剂盒检测其它猪病病毒，除阳性猪血清对照为阳性外，其余OD值均小于0.094，表明猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒与其他抗病毒均无交叉反应，该试剂盒特异性较好。

6.1.3检测试剂盒的可重复性试验

用三个连续批号试剂盒由3人对包括强阳性参考品10份(P1-P10)、弱阳性参考品10份(P11-P20)和特异性参考品10份(N1-N10)的30份被检样品重复检测三次(见表10)，即第1个人做第1批次，第2个人做第2批次，第3个人做第3批次。用5个单批号试剂盒由1人对30份被检样品进行检测(见表11)。统计检测结果之间的符合率(见表12)，用以评价三批试剂盒的批间、批内可重复性。

表1030份被检样品的批间检测结果

表1130份被检样品的批内检测结果

表12三个批次试剂盒批内、批间符合率

结果可知：三个连续批号试剂盒对30份被检样品重复检测三次，经统计三个批号试剂盒批间、批内各次检测结果之间的阳性符合率分别为100％、100％，阴性符合率分别为96.8％、94.3％，说明三批制品批间、批内均具有良好的重复性。

6.1.4检测试剂盒的稳定性试验

将三个连续批号试剂盒分别于37℃放置6天和7天后进行稳定性试验，即试剂盒热稳定性试验；为了防止37℃热稳定性试验与2-8℃存放条件之间存在差异，又将三个批次的试剂盒在2-8℃分别存放6个月、9个月、12个月和15个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同保存条件的试剂盒用35份被检样品进行检验，用以评价该制品的保存期。检测结果见表13、14。

表13试剂盒热稳定性试验结果

*P1-P10指阳性样品，N1-N10指阴性样品，S1指阴性样品，S2-S5指浓度依次降低的阳性样品，CV指精密性样品。

表14试剂盒实时稳定性试验结果

*P1-P10指阳性样品，N1-N10指阴性样品，S1指阴性样品，S2-S5指浓度依次降低的阳性样品，CV指精密性样品。

从表13、14的结果可以看出，本试剂盒在37℃条件下保存，贮存7天；在2-8℃规定条件下保存，贮存15个月，样品的符合率较高，仍能通过成品试剂盒标准，即P1-P10全部为阳性，N1-N10全部为阴性，S1为阴性，S2-S5至少检出2份，CV全部为阳性，且CV的显色强度一致。表明试剂盒有效期试验期间质量稳定，保存期至少可达12个月。

6.2酶免疫层析检测试剂盒的鉴定

6.2.1灵敏度和敏感性

对病毒含量为10μg/ml的猪圆环病毒2型血清样品进行梯度稀释，稀释度依次为1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240(V/V)，用三个连续批号的试剂盒进行检测，确定其最低检测下限。检测结果见表15。

用三个连续批号的试剂盒对30份临床猪圆环病毒2型血清样品两个稀释度进行检测，评价该方法敏感性。检测结果见表16。

表15猪圆环病毒2型酶免疫层析检测试剂盒灵敏度试验结果

注：+表示阳性，-表示阴性，±表示弱阳性。

表16猪圆环病毒2型酶免疫层析检测试剂盒敏感性试验结果

注：ND表示未检测。

三个连续批号的试剂盒对猪圆环病毒2型血清样品的最低检测下限为病毒原液稀释5120倍，该试剂盒的最低检测下限为2.0ng/ml。

三个连续批号的试剂盒对30份敏感性样品均可检出，证实试剂盒敏感性好。

6.2.2特异性

用三个连续批号试剂盒对10份PCV2阴性血清进行检测，评价其特异性。三个连续批号试剂盒对猪圆环病毒1型(PCV1)阳性血清、猪蓝耳病病毒(PRRSV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪传染性乙型脑炎(JEV)阳性血清和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的培养液进行检测，验证其特异性。检测结果见表17、18。

表17猪圆环病毒2型酶免疫层析检测试纸条检测阴性血清结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

表18猪圆环病毒2型酶免疫层析检测试纸条特异性检测结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

三个连续批号的试剂盒检测PCV2阴性血清，没有阳性出现，特异性可达到100％，证实本试剂盒具有较高的特异性。

三个连续批号的试剂盒不与猪圆环病毒1型(PCV1)阳性血清、猪蓝耳病病毒(PRRSV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪传染性乙型脑炎(JEV)阳性血清和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的培养液发生非特异性反应，特异性良好。

6.2.3可重复性

用三个连续批号试剂盒由3人对包括强阳性参考品10份(P1-P10)、弱阳性参考品10份(P11-P20)和特异性参考品10份(N1-N10)的30份被检样品重复检测三次(见表19)，即第1个人做第1批次，第2个人做第2批次，第3个人做第3批次。用5个单批号试剂盒由1人对30份被检样品进行检测(见表20)。统计检测结果之间的符合率(见表21)，用以评价三批试剂盒的批间、批内可重复性。

表1930份被检样品的批间检测结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

表2030份被检样品的批内检测结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

表21三个批次试剂盒批内和批间符合率

结果可知：三个连续批号试剂盒对30份被检样品重复检测三次，经统计三个批号试剂盒批间、批内各次检测结果之间的阳性符合率分别为100％、100％，阴性符合率分别为96.8％、96.2％，说明三批制品批间、批内均具有良好的重复性。

6.2.4保存期

将三个连续批号试剂盒分别于37℃放置6天和7天后进行稳定性试验，即试剂盒热稳定性试验；为了防止37℃热稳定性试验与2-8℃存放条件之间存在差异，我们又将试剂盒在2-8℃分别存放6个月、9个月、12个月和15个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同保存条件的试剂盒用35份被检样品进行检验，用以评价该制品的保存期。按实施例5的检测方法进行。检测结果见表22、23。

表22试剂盒热稳定性试验结果

*P1-P10指阳性样品，N1-N10指阴性样品，S1指阴性样品，S2-S5指浓度依次降低的阳性样品，CV指精密性样品。

表23试剂盒实时稳定性试验结果

*P1-P10指阳性样品，N1-N10指阴性样品，S1指阴性样品，S2-S5指浓度依次降低的阳性样品，CV指精密性样品。

本试剂盒在37℃条件下保存，贮存7天；在2-8℃规定条件下保存，贮存15月，样品符合率较高，仍能通过成品试剂盒标准，即P1-P10全部为阳性，N1-N10全部为阴性，S1为阴性，S2-S5至少检出2份，CV全部为阳性，且CV的显色强度一致。表明试剂盒有效期试验期间质量稳定，保存期至少可达12个月。

实施例7

检测试剂盒的临床应用

将经病毒分离法鉴定为阳性的200份临床感染猪圆环病毒2型的猪血清样品，用猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒和酶免疫层析检测试剂盒以及构建的检测方法(即实施例5)与猪圆环病毒2型抗原(PCV2Ag)ELISA试剂盒(购自上海慧颖生物科技有限公司)进行对比检测，检测结果为：ELISA检测试剂盒的阳性检出率为96.0％(192/200)，酶免疫层析检测试剂盒的阳性检出率为97.0％(194/200)，而猪圆环病毒2型抗原(PCV2Ag)ELISA试剂盒的阳性检出率为84.0％(168/200)。

因而，本实施例所制备的猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒和酶免疫层析检测试剂盒检测时阳性检测率高于猪圆环病毒2型抗原(PCV2Ag)ELISA试剂盒，具有较好的应用前景。

Claims (11)

1.一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒，所述试剂盒包括由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体，和/或由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶免疫层析检测试剂盒，其包括缓冲液供应单元和检测单元，所述缓冲液供应单元用于将底物缓冲液供给所述检测单元。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液供应单元通过展开液垫将底物缓冲液供给所述检测单元；所述展开液垫的第一端与缓冲液供应单元接触，所述展开液垫的第二端与所述检测单元的第一端接触。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测单元包括：

基板；和在基板上依次设置的底物供应区、样品供应区和检测区；

所述底物供应区包括底物垫，所述底物垫位于远离检测线方向的硝酸纤维素膜的一端，且所述底物垫上吸附有酶底物；所述展开液垫位于所述底物供应区之上，

所述样品供应区包括酶标垫，所述酶标垫上吸附有酶标记的由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体，以及

所述检测区包括检测线和对照线，且所述检测线固定化包被由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体，所述对照线远离所述硝酸纤维素膜第一端，且所述对照线在所述硝酸纤维素膜的长度方向上的紧随所述检测线，所述对照线固定化有羊抗鼠多抗。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在远离所述基板第一端的所述基板的长度方向上还包括紧随对照线的吸水垫；且所述吸水垫与所述检测区位于所述基板的同一面。

8.一种由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014199分泌产生的单克隆抗体。

9.一种由杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2014198分泌产生的单克隆抗体。

10.一种杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014199系。

11.一种杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014198系。