CN104928258B - 犬细小病毒杂交瘤细胞、及单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了犬细小病毒抗原制备的杂交瘤细胞，其分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体具有很高的相对亲和力常数和良好的中和活性，经其制备的疫苗组合物能有效地预防和治疗犬细小病毒感染。使用两种单克隆抗体制备的犬细小病毒检测试剂盒，具有快速、简便、准确的优点，敏感性、特异性、重复性好，较胶体金标记的商业试纸条灵敏度高。

Description

犬细小病毒杂交瘤细胞、及单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及犬细小病毒杂交瘤细胞、其产生的单克隆抗体，以及其制备的疫苗组合物，免疫检测系统和应用，属于生物技术领域。

背景技术

犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)在自然界广泛存在，引发动物感染犬细小病毒病，一年四季均可发病，临床症状以呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，发病率和死亡率比较高。犬是CPV的主要自然宿主，各年龄和不同性别的犬均易感，CPV也可感染其它犬科动物如貂、狐狸、狼、丛林狼、食蟹狐、南美狗和亚洲狸和鼠鼬科动物，以幼犬最为易感，随抗原漂移，还可感染猫。CPV可随患病动物的粪便、尿液等排出体外，污染周围环境，康复犬的粪便可长期带毒。有研究表明，人、虱、苍蝇和蟑螂都可成为CPV的机械携带者。由该病毒引起的犬细小病毒病的发病率为50％～100％，死亡率为0％～50％。该病严重威胁宠物犬的健康，也给犬科经济动物养殖造成巨大经济损失。

目前，国内外犬细小病毒检测方法主要包括核酸检测法和胶体金快速检测法，其中核酸检测法检测时需要配备PCR仪等昂贵设备和专业的技术人员，从而限制了其在大规模筛查方面的应用，使得该方法偏向于实验室诊断；胶体金快速检测法的检测灵敏度较低。基于此，亟需发展一种快速、简便、灵敏度高的检测方法。

专利申请CN103604924A公开了一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其使用胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体进行检测，该检测方法快速，但是灵敏度较低。

军事医学科学院实验动物中心用该研究室研制的抗犬细小病毒单克隆抗体和多克隆抗体，采用ELISA原理，研制成功了犬细小病毒诊断试剂盒。该试剂盒检测快速、与血凝试验的符合率高，然而，其存在操作繁琐，结果判定主观性强，试纸条灵敏度低的缺点。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了两株犬细小病毒杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体，可以有效地诊断、预防和/或治疗犬细小病毒所引发的感染。

本发明还提供了一种犬细小病毒酶免检测试剂盒，可用于犬细小病毒快速、简便、准确地检测，克服了现有技术检测中灵敏度较低的问题，该试纸条比常规的胶体金快速检测试纸条具有更高的灵敏度。

术语“犬细小病毒”(Canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)，是DNA病毒中分子量最小的病毒，可感染犬、貂、狐狸犬科动物和鼠鼬科动物、猫，以幼犬最为易感，临床症状以呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，发病率和死亡率比较高。

本发明的第一方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 10B11)保藏号为CCTCC No:C201578，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日。

本发明的小鼠杂交瘤细胞10B11株由犬细小病毒CVCC AV298株抗原免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。

本发明的第二方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 10H4)保藏号为CCTCC No:C201579，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日。

本发明的小鼠杂交瘤细胞10H4株由犬细小病毒CVCC AV298株抗原免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。

本发明的第三方面在于提供所述的10B11株分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11。

本发明的小鼠杂交瘤细胞10B11株所产生的单克隆抗体10B11的相对亲和力常数为1:5120，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高；所述单克隆抗体10B11HI效价大于1:12800，与犬细小病毒具有良好的反应性；所述单克隆抗体10B11的中和抗体效价大于1:4466，具有良好的中和活性。

本发明的第四方面在于提供所述的10H4株分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。

本发明的小鼠杂交瘤细胞10H4株所产生的单克隆抗体10H4的相对亲和力常数为1:5120，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高；所述单克隆抗体10H4HI效价大于1:12800，与犬细小病毒具有良好的反应性；所述单克隆抗体10H4的中和抗体效价大于1:4466，具有良好的中和活性。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

术语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。

术语“抗体”可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

用于本发明的“单克隆抗体”可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。

术语“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制犬细小病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。

本发明的第五方面在于提供一种所述疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：免疫量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11，和/或免疫量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4；以及药学上的载体。

所述单克隆抗体具有良好的中和活性，其制备的疫苗组合物可抑制犬细小病毒重复感染靶细胞。

术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时，是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”。

术语“免疫量”当理解为“治疗有效量”时，是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物经肌肉注射给药。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括但不限于粉末剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂。

术语“预防和/或治疗”在涉及犬细小病毒感染时是指抑制犬细小病毒的复制、抑制犬细小病毒的传播或防止犬细小病毒在其宿主体内定居，以及减轻犬细小病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明的疫苗组合物可使用下述方法制备：(1)使用所述杂交瘤细胞10B11株分泌表达单克隆抗体，和/或所述杂交瘤细胞10H4株分泌表达单克隆抗体；以及(2)将所述步骤(1)中表达的单克隆抗体加入药学上可接受的载体。

本发明的第六方面在于提供一种犬细小病毒检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测有效量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11，和/或检测有效量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。

术语“检测有效量”又称“诊断有效量”，是指能够利用所述单克隆抗体有效检测样品中是否存在犬细小病毒的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够知晓，所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同，根据公知文献的教导，本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量，以用于诊断样品中是否存在犬细小病毒。本领域技术人员知晓，适当地该试剂盒中还应当包括适当的载体，缓冲液/剂，和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。本发明所述试剂盒有效检测样品中是否存在犬细小病毒的量时所采用的检测方法可以使用酶联免疫吸附、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。

术语“竞争法”是比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把单克隆抗体包被到固相支持物上而得以进行的。同时加入预先定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后，冲洗固相支持物，检测结合到该支持物上的标记物的活性。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括对所述的单克隆抗体10B11和犬细小病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；或对所述的单克隆抗体10H4和犬细小病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

作为本发明的另一种实施方式，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述检测试纸条；所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区，样品供应区，检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有抗犬细小病毒抗体标记单克隆抗体10H4，所述酶底物能与所述标记单克隆抗体10H4上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述标记单克隆抗体10H4溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有抗犬细小病毒抗体固定单克隆抗体10B11。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述试剂盒中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)固定化有抗犬细小病毒抗体固定单克隆抗体10B11，在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的标记单克隆抗体10H4对于固定在检测线(6)的固定单克隆抗体10B11而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述试剂盒中，所述抗犬细小病毒抗体标记单克隆抗体10H4的标记物为辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶中的任一种。

作为本发明的一种实施方式，所述检测试纸条包括固相的硝酸纤维素膜1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10，其中2属于样品供应区，3属于底物供应区，5、8属于缓冲液供应单元，6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。检测试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段；吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端，且与硝酸纤维素膜1有重叠；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段，上面干燥有酶标记的抗犬细小病毒抗体标记单克隆抗体10H4；底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3，且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，其上有缓冲液按钮，按下缓冲液按钮可刺破铝箔纸，并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸纤维素膜1的中上端，其上固定化有抗犬细小病毒抗体固定单克隆抗体10B11。质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端、检测线6的上游，其上固定化有羊抗鼠多抗。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒还包括样品处理管，所述样品处理管含有样品处理液，所述样品处理液为表面活性剂，所述表面活性剂包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、卵磷脂、脂肪酸甘油酯、NP-40和CHAPS中的任一种。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括样品保存瓶，所述样品保存瓶中含有样品处理液，所述样品保存液为磷酸缓冲液，优选为pH7.4的磷酸盐磷酸缓冲液。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更优选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。

术语“表面活性剂”为能使目标溶液表面张力显著下降的物质，可降低两种液体-固体间的表面张力。

术语“NP-40”是乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40)，是一种细胞裂解液，用于裂解细胞，释放出细胞内的犬细小病毒。

本发明的第七方面在于提供本发明所述试剂盒检测样品中犬细小病毒的方法，所述方法包括：(1)使用样品处理管预处理样品；(2)将所述步骤(1)中预处理样品加入所述酶标垫2的位置；(3)按下缓冲液按钮，观察结果；以及(4)若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，否则为阴性。

即：质控线的有无决定了检测过程是否有效，若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效；在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，否则为阴性。

术语“检测样品”包括但不限于动物或患者的排泄物、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液、动物血液、体液、组织匀浆等。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒检测样品中犬细小病毒的方法，为(1)将采集的微生物拭子插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头这段留于瓶中；(2)将含有样品的样品处理管盖子头部折断，挤出一滴样品加入加样孔中，同时迅速按下缓冲液按钮；(3)30分钟后在所述检测试纸条的检测区观察记录结果。

本发明的第八方面在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染相关疾病中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体10B11的疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染相关疾病中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体10H4的疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染相关疾病中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体10B11和免疫量的所述单克隆抗体10H4的疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染相关疾病中的应用。

本发明的第九方面在于提供本发明所述试剂盒在用于非诊断目的的犬细小病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括检测有效量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11的试剂盒在用于非诊断目的的犬细小病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括检测有效量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4的试剂盒在用于非诊断目的的犬细小病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括检测有效量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11和抗犬细小病毒单克隆抗体10H4的试剂盒在用于非诊断目的的犬细小病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了使用本发明的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11和抗犬细小病毒单克隆抗体10H4进行夹心法检测的试剂盒在用于非诊断目的的犬细小病毒检测中的应用。

本发明所述试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测等非诊断目的方面应用。

本发明的有益效果在于：

(1)酶免检测试剂盒在硝酸纤维素膜上完成了ELISA检测过程，实现了酶联免疫级联放大效应，因此其灵敏度可以达到ELISA水平，并且操作较ELISA简便、快速、省时(仅需30分钟)；

(2)酶免检测试剂盒中的检测试纸条比胶体金试纸条灵敏度高10倍以上；

(3)可以用于紧急预防犬细小病毒引起的犬细小病毒病；

(4)弥补现有疫苗单一的预防作用，还可以用于紧急治疗犬细小病毒病。

附图说明

图1为检测试纸条的侧面示意图，图中：1-硝酸纤维素膜，2-酶标垫，3-底物垫，4-吸水垫，5-展开液垫，6-检测线，7-质控线，8-底物缓冲液槽，9-底物缓冲液，10-支撑物，11-检测样品。

图2为杂交瘤细胞株10B11和10H4分泌抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图，图中：M-Marker，1-单克隆抗体10H4，2-单克隆抗体10B11。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，其1L体积配方为：Na₂CO₃1.59g、NaHCO₃2.93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实例中所用的样品保存液为PBS磷酸缓冲液，pH值为7.4，其1L体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.24g，终浓度为10000IU/mL的青霉素、8000IU/mL的链霉素和5000IU/mL的卡那霉素，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中所用的PBS(pH7.2，0.15mol/L)为Na₂HPO₄·12H₂O 39.7g；NaH₂PO₄·2H₂O 6.72g；NaCl 9g；蒸馏水加至1000ml。充分溶解后，混合均匀，121℃30min高压灭菌。

本发明实施例中的酶标抗体以辣根过氧化物酶(HRP)为例进行标记，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1抗犬细小病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验

1.1抗犬细小病毒单克隆抗体的制备和纯化

将犬细小病毒CVCC AV298株按照Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:alaboratory manual〔M〕.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998,139-312)文献的操作方法制备杂交瘤细胞10B11株、杂交瘤细胞10H4株，进一步分别制备并纯化抗犬细小病毒单克隆抗体10B11、抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。

其中，杂交瘤细胞10B11株的保藏号为CCTCC No:C201578，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，其分泌抗犬细小病毒单克隆抗体10B11；杂交瘤细胞10H4株保藏号为CCTCC No:C201579，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，所分泌抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。

1.2抗犬细小病毒单克隆抗体的鉴定

1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定

运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定。鉴定结果见表1：

表1各单克隆抗体类型的鉴定

单克隆抗体

IgA

IgM

IgG3

IgG2b

IgG2a

IgG1

Kappa

Lambda

10H4

-

-

-

-

+

-

+

-

10B11

-

-

-

-

+

-

+

-

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

由表1可知，单克隆抗体10H4、10B11重链亚型都为IgG2a，轻链类型都为kappa。

1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定

按照秦海斌(秦海斌等，犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验方法的优化，中国比较医学杂志，2009，19(7)：49-52)所提供的HI方法分别测定单克隆抗体10H4、10B11与水貂细小病毒MEV、猫细小病毒FPV是否具有交叉反应性。

测定结果显示：单克隆抗体10H4、10B11与MEV、FPV均无交叉反应，表明这2株单克隆抗体均是抗犬细小病毒的特异性单克隆抗体。

1.3纯化单克隆抗体的检验

1.3.1纯化单克隆抗体的外观

室温下，肉眼观察可见纯化抗体呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。

1.3.2无菌试验

采用无菌检验法，取纯化后的单克隆抗体原料接种10mL/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5mL/管)。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。改良马丁培养基置于20-25℃培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未观察到培养基中有微生物生长，表明单克隆抗体10H4、10B11原料符合无菌要求。

1.3.3单克隆抗体纯度

采用SDS-PAGE电泳鉴定，上样量为10μg，检测结果如图2所示。

结果表明：单克隆抗体10H4、10B11的纯度均不低于90％。

1.3.4单克隆抗体相对亲和力的测定

对纯化的单克隆抗体进行其相对亲和力的测定:将纯化开始作倍比稀释，分别加入包被有CPV抗原(1:200倍V/V稀释)的96孔酶标板，同时设阴性血清和空白对照37℃反应30分钟，用PBST洗板3次，拍干；每孔加入山羊抗小鼠IgG-HRP(1:1×10⁴稀释)100μL/孔，反应过后洗涤同上，每孔加入100μL/孔TMB(四甲基联苯胺)底物溶液显色，用2moL/LH₂SO₄(50μL/孔)终止反应，读取OD_450nm值。结果以与包被抗原出现50％结合时的单克隆抗体的蛋白含量，即为该株单克隆抗体的相对亲和力。

以纯化单克隆抗体的稀释度与其相对应的OD_450nm值作图，曲线趋于平坦时的OD_450nm作为100％，即抗原与单克隆抗体的结合已达到饱和状态。取曲线上50％饱和度所对应的单克隆抗体浓度，即为该株单克隆抗体的相对亲和力，亲和力越大，所需单克隆抗体的量越低。计算结果表明：单克隆抗体10H4、10B11的相对亲和力均为1:5120。

1.3.5单克隆抗体HI效价的测定

参照犬细小病毒检测方法(GB/T 14926.57-2008)进行血凝和血凝抑制实验。采集纯白色，健康状况良好的架子猪全血与等体积红细胞保存液混合，用PBS(pH7.2，0.15mol/L)洗涤5次，每次均以1500rpm离心5min，最后一次为1500rpm离心10min，洗涤后用PBS配制成体积分数为1％红细胞悬液，4℃保存备用。

将待检样品，使用PBS(pH7.2，0.15mol/L)做1:10倍稀释，在96孔V型板1-12孔均加入50μL PBS，将待检CPV病毒悬液50μL加入第1孔，混匀。从第1孔吸取50μL混合液加入第2孔，混匀后吸取50μL到第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，最后弃去50μL，第12孔为血球对照；每孔均加入50μL的1％的猪红细胞悬液(将猪红细胞悬液充分摇匀后加入)，震荡均匀，在4℃下静置2h后观察结果。将微量反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。在红细胞对照成立的条件下，以50％出现凝集的病毒最高稀释倍数为血凝素(HA)的效价。

根据HA结果制备16单位抗原。在微量反应板的1-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μL PBS。吸取10倍稀释的CPV单克隆抗体25μL，分别加入第1孔和第11孔，第1孔充分混匀后吸取25μL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，最后弃去25μL，第11孔为抗体对照，第12孔为血球对照。第1至10孔均加入25μL含16单位混匀的病毒抗原液，37℃静置30min。每孔均加入50μL 1％的猪红细胞悬液(将猪红细胞悬液充分摇匀后加入)，震荡均匀，4℃静置2h后观察结果。将微量反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。在对照系统成立的条件下，以完全抑制16单位抗原的样品最高稀释倍数为该样品的血凝抑制(HI)滴度。

表2单克隆抗体的HI效价

抗体	效价
		10B11	1:12800
10H4	1:12800

1.3.6单克隆抗体中和活性的测定

按常规方法分别测定CPV的TCID₅₀，然后采用固定病毒稀释抗体法，分别测定单克隆抗体10B11、10H4对CPV的中和效价。

将腹水进行1:100开始倍比(2倍)稀释至1:12800倍，用含100个TCID₅₀的病毒与倍比稀释后的腹水等量混合，每个滴度重复4孔。同时设健康细胞、单克隆抗体和病毒对照，置37℃作用1h后，再将细胞消化后计算，用含8％血清的1640稀释至28万细胞/mL，100μL/孔加入以上96孔细胞培养板，于37℃、5％CO₂培养箱培养5d，观察细胞病变情况，病毒对照孔应符合100TCID₅₀接种孔应全部病变，0.1TCID₅₀接种孔应全部无病变。在各种对照都成立的情况下，再根据细胞病变情况计算出腹水的中和效价。

表3单克隆抗体10B11、10H4中和效价

单克隆抗体(0.05mL)	中和抗体效价
		10H4	1:4466
10B11	1:4466

通过上述试验证明该单克隆抗体具有很好的中和病毒的能力，中和效价均在1:5120以上。表明该株单克隆抗体所对应的抗原表位是比较重要的抗原表位，可以用于开发制备预防和治疗犬细小病毒病的药物，并用单克隆抗体提供很有价值的保护性抗原基因序列相关信息。

实施例2单克隆抗体的配对

2.1单克隆抗体配对模式的选择

筛选单克隆抗体配对组合时，主要考虑以下几个因素：一是单克隆抗体的活性；二是单克隆抗体与除犬细小病毒外其他病毒是否存在非特异性反应；三是本底显色。

2.2单克隆抗体活性检测

选择犬细小病毒CVCC AV298株，稀释到0.01HA，对于不同搭配模式进行检测，结果见表4：

表4单克隆抗体搭配检测

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

结果显示：除了固相的单克隆抗体10B11与酶标的单克隆抗体10H4检测0.01HA的犬细小病毒CVCC AV298株病毒稀释液为阳性，其它搭配检测均为阴性。

根据上述实验结果：选择单克隆抗体10B11作为固定原料，单克隆抗体10H4作为标记原料。

实施例3犬细小病毒酶免检测试剂盒的制备

3.1单克隆抗体的辣根过氧化酶(HRP)标记

根据实施例1制备的单克隆抗体10H4，按照Tijssen P等(Tijssen P，KurstakE.Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase andactive peroxidase antibody conjugates for enzyme immunoassays〔J〕.AnalBiochem,1984,136:451-457)的文献对抗犬细小病毒单克隆抗体进行辣根过氧化酶(HRP)标记。

3.2单克隆抗体的固定

用BioDot XYZ3050三维喷点平台将实施例1制备的单克隆抗体2固定在硝酸纤维素膜上。

3.3检测试剂盒的组成

检测试剂盒包含有检测试纸条、样品处理液、样品处理管、样品保存液。

(1)检测试纸条(其侧向示意图见图1)，包括硝酸纤维素膜1、酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10。

(2)样品处理液在样品处理瓶中。

(3)样品处理管。

(4)样品保存液在样品保存瓶中，为PBS缓冲液，用于暂时保存样品。

所述检测试纸条包括样品供应区，样品供应区包括酶标垫2，其上吸附有实施例3.2制备的标记单克隆抗体1；底物供应区，底物供应区包括底物垫3；缓冲液供应单元，缓冲液供应单元包括展开液垫5、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9；检测区，检测区包括检测线6、质控线7，在检测线6固定化有实施例1制备的固定单克隆抗体2，在质控线7固定化有羊抗鼠多抗。硝酸纤维素膜1粘附在所述支撑物10的全段；以及检测样品11加入的位置为所述酶标垫2的位置。

检测试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段；底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3，且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，上方为缓冲液按钮(图1中未标出)。检测线6位于硝酸纤维素膜1的中上端，质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端，并位于检测线6的上游。

当使用试剂盒时，先使用样品处理管预处理样品；然后将预处理样品加入酶标垫2的位置，同时按下缓冲液按钮，缓冲液按钮控制缓冲液9通过展开液垫5向吸水垫4的层析过程。如果预处理样品中含有犬细小病毒其将与酶标记单克隆抗体1结合，犬细小病毒与酶标记单克隆抗体1结合体以及过量的酶标记单克隆抗体1在毛细管作用下向吸水垫4方向迁移。当迁移的犬细小病毒与酶标记单克隆抗体1结合体到达检测线6位置时，被固定于检测线6位置的固定单克隆抗体2捕获，从底物供应区迁移来的底物到达检测线6时，与酶标记单克隆抗体1产生显色反应。同时，过量的酶标记单克隆抗体1继续迁移到质控线7，被固定在质控线7位置的羊抗鼠多抗捕获，并与从底物供应区迁移来的底物产生显色反应。

检测标准：整个反应进行约30分钟，反应结束后，若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，说明样品中存在A型流感病毒，否则为阴性，说明样品中不存在犬细小病毒。

实施例4样品前处理

4.1样品的采集

主要采集的样品源于犬肛门，详情如下：

使用微生物拭子采集犬肛门样品时，将拭子插入肛门1.5-2cm并轻轻转动，以获得病毒丰度较高的肛拭子样品；

4.2样品的处理

将采集完的微生物拭子插入到样品处理管中，紧靠管子内壁旋转多次使样品尽可能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头折断留与瓶中。

实施例5犬细小病毒酶免检测试剂盒的研究

犬细小病毒酶免检测方法为：

(1)将采集完的微生物拭子插入到样品处理管中，紧靠管子内壁旋转多次使样品尽可能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头折断留与瓶中。

(2)将处理过的样品液挤出一滴加入加样孔，同时迅速按下缓冲液按钮；

(3)30分钟后在观察窗观察记录结果。

5.1犬细小病毒酶免检测试剂盒灵敏度测定

测定犬细小病毒CVCC AV298株病毒液的HA，对病毒液进行一系列稀释，稀释度依次为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，然后用实施例3制备的试纸条进行检测，结果见表5：

表5犬细小病毒酶免检测试剂盒灵敏度测定

病毒稀释度

10<sup>-1</sup>

10<sup>-2</sup>

10<sup>-3</sup>

10<sup>-4</sup>

10<sup>-5</sup>

10<sup>-6</sup>

10<sup>-7</sup>

检测结果

+

+

+

+

-

-

-

注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。

犬细小病毒CVCC AV298株病毒液的HA为640，结合检测结果(表5)可知：犬细小病毒酶免检测试剂盒的灵敏度为0.064HA。

5.2犬细小病毒酶免检测试剂盒敏感性测定

犬细小病毒酶免检测试剂盒检测5份CPV强阳性样品(P1-P5)，5份CPV弱阳性样品(P11-P15)结果见表6：

表6犬细小病毒酶免检测试剂盒敏感性测定

样品

P-1

P-2

P-3

P-4

P-5

P-11

P-12

P-13

P-14

P-15

结果

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

注：+表示阳性反应。

由表6可知，10份样品均为阳性，证明该试剂盒有良好的敏感型。

5.3犬细小病毒酶免检测试剂盒特异性测定

犬细小病毒酶免检测试剂盒检测10(N1-N10)份包含健康犬粪便、犬瘟热病毒阳性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒细胞毒样品以及英特威的犬四联、犬二联苗稀释液样品，结果见表7：

表7犬细小病毒酶免检测试剂盒特异性测定

样品

N-1

N-2

N-3

N-4

N-5

N-6

N-7

N-8

N-9

N-10

结果

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

注：-表示阴性反应。

由表7可知，10份样品检测结果均为阴性，证明该试剂盒有良好的特异性。

5.4犬细小病毒酶免检测试剂盒重复性试验

用三个连续批号试剂盒由3人对包括强阳性参考品10份(P1-P10)、弱阳性参考品10份(P11-P20)和特异性参考品10份(N1-N10)的30份被检样品重复检测三次，统计检测结果之间的符合率，用5个单批号试剂盒由1人对30份被检样品进行检测，用以评价三批试剂盒的批间、批内可重复性，检验结果见表8-9。

表8 30份被检样品的批间检测结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

由表8可知：三个连续批号试剂盒对30份被检样品重复检测三次，经统计三个批号试剂盒批间检测结果之间的阳性符合率分别为98.3％，阴性符合率分别为100％，说明三批制品批间有良好的重复性。

表9 30份被检样品的批内检测结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

由表9可知：五个单批号试剂盒对30份被检样品进行检测，经统计批内检测结果之间的阳性符合率分别为98％，阴性符合率分别为100％，说明试剂盒批内具有良好的重复性。

5.5犬细小病毒酶免试剂盒保存期

将三个连续批号试剂盒分别于37±1℃放置6天后进行稳定性试验，即试剂盒热稳定性试验；为了防止37±1℃热稳定性试验与2-8℃存放条件之间存在差异，我们又将试剂盒在2-8℃分别存放6个月、9个月、12个月和15个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同保存条件的试剂盒用30份被检样品进行检验，用以评价该制品的保存期。检测方法按实施例5进行检测。

表10试剂盒热稳定性试验结果

试剂盒批次	1	2	3
				条件37±1℃	6天	6天	6天
P1-P20	20/20	20/20	20/20
				N1-N10	10/10	10/10	10/10
CV	10/10	10/10	10/10

表11试剂盒实时稳定性试验结果

本试剂盒在37±1℃条件下保存，贮存7天；在2-8℃规定条件下保存，贮存15月，仍能通过成品试剂盒质控标准，表明试剂盒有效期试验期间质量稳定，保存期至少可达12个月。

实施例6酶免检测试剂盒与现有方法比对

6.1犬细小病毒酶免检测试剂盒与HA方法的比较

用犬细小病毒酶免检测试剂盒检测HA阳性样品10份(P1-P10)，结果见表12：

表12犬细小病毒酶免检测试剂盒敏感性测定

样品

P-1

P-2

P-3

P-4

P-5

P-6

P-7

P-8

P-9

P-10

结果

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

注：+表示阳性，-表示阴性。

由表12可知，检测结果表明都为阳性，两种方法阳性符合率为100％。

6.2犬细小病毒酶免检测试剂盒与进口试剂盒的比较

将已知病毒量(HA滴度640)的犬细小病毒CVCC AV298株病毒液做10^-3、10^-4、10^-5各稀释度稀释，同时用犬细小病毒酶免检测试剂盒和韩国安捷胶体金试纸条进行检测，每个稀释度重复三次，结果见表13。

表13犬细小病毒酶免检测试剂盒与进口试纸条检测不同稀释度病毒液比较

注：+表示阳性，-表示阴性。

由表13可知，犬细小病毒酶免检测试剂盒检测犬细小病毒CVCCAV298株病毒液的最低限低于安捷胶体金试纸条，证明犬细小病毒酶免检测试剂盒灵敏度(10^-4即0.064HA)高于进口试纸条(10^-3即0.64HA)。

犬细小酶免检测试剂盒与韩国安捷公司的犬细小病毒胶体金检测试纸条对50份(阳性40份，阴性10份)临床样品进行检测，同时对比临床症状，结果见表14。

表14犬细小病毒酶免检测试剂盒与进口试纸条检测临床样品比较

50份样品中40份阳性样品，均为经临床诊断和PCR鉴定的阳性，阴性样品。40份阳性样品中进口试纸条有8份为阴性，而犬细小病毒酶免检测试纸条全部检测为阳性，证明该方法敏感性优于商品化试纸条。

实施例7含一种单克隆抗体试剂盒的制备及应用

7.1以单克隆抗体10B11或10H4为原料制备试剂盒

(1)抗原的制备：用健康的F81细胞培养收取的CPV病毒，收获的病毒液进行灭活。将灭活后的病毒液超滤浓缩10倍。4℃10000r/min离心20min，去除细胞碎片后，4℃100000r/min超速离心2h，使病毒沉淀于管底。弃上清后用0.01mol/L PBS(pH 7.2)重悬沉淀。经氯化铯密度梯度离心，收集目的条带，0.01mol/L PBS(pH 7.2)透析过夜，获得纯化的犬细小病毒抗原。BCA试剂盒测定蛋白浓度，-70℃保存备用。

(2)抗原板的制备：将制备好的CPV抗原以10μg/mL 4℃包被96孔酶标板过夜，PBST洗3次。用5％的脱脂奶在37℃封闭1h，PBST洗3次。酶标板晾干后，用封板膜封板保存于-20℃。

(3)阴性对照、阳性对照的制备：阳性对照为攻毒后HI阳性犬的血清；阴性对照为无CPV感染的HI阴性犬血清。

(4)单克隆抗体：分别按照实施例1制备并纯化后的单克隆抗体10B11或10H4为原料稀释至1:200V/V，作为母液。

7.2试剂盒的应用

将经HI检测临床感染CPV病毒犬的血清样本阳性5份、阴性5份，分别用实施例7.1部分所制备的试剂盒进行检测，步骤为：将包被有CPV抗原的酶标板平衡至室温，每孔加入待测样品50μL，同时设立阳性对照及阴性对照。每孔50μL加入稀释至1:2000V/V的单克隆抗体10B11或10H4，37℃反应30min，洗涤3次，拍干；每孔加入1:10000倍稀释的商品化抗鼠的酶标二抗，37℃反应30min，洗涤3次，拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液100μL/孔加入，37℃反应15分钟；最后加入50μL/孔浓硫酸(2mol/L)终止反应，用酶标仪检测OD_450nm，其中阻断率＝【(阴性对照OD-样品OD)/阴性对照OD】×100％，判定标准：阻断率>70％为阳性，阻断率<60％为阴性，60％≤阻断率≤70％为可疑，结果见表15。

表15 HI与自制试剂盒检测结果汇总

注：+表示阳性，-表示阴性。

由表15可知：以单克隆抗体10B11或10H4为原料制备的以竞争法原理的试剂盒与HI检测结果相吻合，表明自制试剂盒可定性、定量检测临床样本中的CPV抗体。

实施例8单克隆抗体预防、治疗病毒感染的评价

8.1单克隆抗体治疗病毒感染的评价

对15只犬按1mL/只的剂量肌肉注射接种犬细小病毒。接种后连续观察临床症状。待犬出现体温升高(40-41℃)、呕吐、排便次数增多时，取病犬粪便用HA方法确定病犬细小病毒感染阳性。

随机抽取9只发病犬，分为3组，进行试验。按照2mL/只的量，1组肌肉注射单克隆抗体10B11，2组肌肉注射单克隆抗体10H4，3组注射生理盐水作为对照。并配合对症治疗措施，连续注射三天。

观察10天，计算病犬康复比率，结果见表16。

表16病犬康复比率

组别	试验犬数	注射物	治愈
				1组	3	10B11	3/3
2组	3	10H4	3/3
				3组	3	生理盐水	0/3

由表16可知：1、2组犬治愈率100％；3组中3只犬均死亡。证明单克隆抗体10B11和10H4均可治疗犬细小病毒所引发的感染。

8.2单克隆抗体预防病毒感染的评价

筛选CPV抗原、抗体双阴性犬9只，随机分为3组，第1组肌肉注射单克隆抗体10B11单克隆抗体2mL,第2组肌肉注射单克隆抗体10H4单克隆抗体2mL,第三组肌肉注射PBS缓冲液2mL，口服后24小时，所有犬按1mL/只的剂量肌肉注射接种犬细小病毒。每日观察犬的临床症状，连续观察10天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒，监测排毒天数来评价该单克隆抗体的预防犬细小病毒感染的效果，结果见表17。

表17注射单克隆抗体后24小时预防CPV感染的试验结果

由以上试验证实，两株单克隆抗体能够减轻由犬细小病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的治疗和/或预防作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株保藏号为CCTCCNo:C201578，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日。

2.小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株保藏号为CCTCC No:C201579，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日。

3.一种特异性结合犬细小病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体选自：权利要求1所述10B11株分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11；

权利要求2所述10H4株分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。

4.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求3所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11，和/或

免疫量的权利要求3所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4；以及药学上的载体。

5.一种犬细小病毒检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测有效量的权利要求3所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11，和/或检测有效量的权利要求3所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其中，所述试剂盒还包括对所述的单克隆抗体10B11和犬细小病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；和/或

对所述的单克隆抗体10H4和犬细小病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

7.根据权利要求5所述试剂盒，其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和检测试纸条；

所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述检测试纸条；

所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区，样品供应区，检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有抗犬细小病毒抗体标记单克隆抗体10H4，所述酶底物能与所述标记单克隆抗体10H4上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述标记单克隆抗体10H4溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有抗犬细小病毒抗体固定单克隆抗体10B11；

所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)固定化有抗犬细小病毒抗体固定单克隆抗体10B11，在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的标记单克隆抗体10H4对于固定在检测线(6)的固定单克隆抗体10B11而言是过量的；

所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中。

9.根据权利要求7所述试剂盒，其中，所述抗犬细小病毒抗体标记单克隆抗体10H4的标记物为辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶中的任一种。

10.根据权利要求7所述试剂盒，其中，所述试剂盒还包括样品处理管，所述样品处理管含有样品处理液，所述样品处理液为表面活性剂，所述表面活性剂包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、卵磷脂、脂肪酸甘油酯、NP-40和CHAPS中的任一种。

11.根据权利要求4所述疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。

12.根据权利要求5～10任一项所述试剂盒在用于非诊断目的的犬细小病毒检测中的应用。