CN104694480B - 一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其所产生的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体。本发明提供的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，对猪流行性腹泻病毒具有预防和/或治疗作用，解决了现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪流行性腹泻病毒感染，并且弥补现有疫苗单一的预防作用；还可用于开发猪流行性腹泻病毒的诊断试剂产品。

Description

一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、其所分泌的单克隆抗体、使用分泌的单克隆抗体制备的药物组合物、试剂盒及应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性、接触性、高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水，感染7日龄以内仔猪死亡率高达80％-100％。对我国养猪业造成巨大的损失。自2010年以来，我国秋冬季节大面积爆发腹泻疾病，与此同时，韩国、日本、台湾、美国等地也大范围爆发此病。分子生物学研究表明，猪流行性腹泻病毒发生了变异，已有的疫苗株对流行毒株的感染起不到很好的保护作用。

目前，国内外已有的商品化疫苗均为经典的疫苗株，对控制本病虽有一定的效果，但仍不能提供给仔猪很好的被动保护。同时，仔猪获得母源抗体的水平不均一，易引起部分仔猪再次发病并使病原迅速传播。虽已有用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒的卵黄抗体，但卵黄抗体是高蛋白质，不仅成本较高，在生产过程中还易发生细菌感染而不易规模化生产(张家峥，施萍，牛桂玲.使用高免卵黄抗体液利弊及前景.中国家禽，2003,25(23):45)。基于此，亟需一种新的途径解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的猪流行性腹泻病毒感染，以及现有疫苗单一的预防作用。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种杂交瘤细胞株、其所产生的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及应用，该单克隆抗体可以预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒所引发的感染，还可用于检测猪流行性腹泻病毒。

本发明的第一方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞8A3A10株保藏号为CCTCC No.C2014197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2014年11月3日。

本发明的小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株由猪流行性腹泻病毒HN1301株抗原免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。其所产生的单克隆抗体的中和抗体效价大于1:512，具有良好的中和活性；单克隆抗体的相对亲和力常数为1:5120，与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高。

本发明的第二方面在于提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生。

所述单克隆抗体能有效抵抗猪流行性腹泻病毒，所述单克隆抗体是由所述杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生。所述单克隆抗体的中和抗体效价大于1:512，也就是说，所述单克隆抗体具有良好的中和活性，可抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞；所述单克隆抗体的相对亲和力常数为1:5120，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现有技术中的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的结合强度。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

术语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。

术语“抗体”可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

用于本发明的“单克隆抗体”可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。

术语“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。

本发明的第三方面在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包括有效量的所述杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合，以及药学上可接受的载体。

术语“单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体”，又可称为“单克隆抗体之保守性变异体或活性片段”，所述保守性变异体或活性片段的氨基酸序列中与本发明所述单克隆抗体之氨基酸序列相比存在一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与猪流行性腹泻病毒特异性结合。术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽。但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任一组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

术语“有效量”当理解为“预防有效量”时，是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”。

术语“有效量”当理解为“治疗有效量”时，是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

本发明的第四方面在于提供一种制备所述的药物组合物的方法，所述方法包括：(1)使用所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达单克隆抗体；以及(2)将所述步骤(1)中表达的单克隆抗体加入药学上可接受的载体。

本发明的第五方面在于提供一种试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合，所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合用于和猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应。

上文中，当术语“有效量”当理解为“诊断有效量”时，是指能够利用本发明所述单克隆抗体有效检测样品中是否存在猪流行性腹泻病毒的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够知晓，所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同，根据公知文献的教导，本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量，以用于诊断样品中是否存在猪流行性腹泻病毒。本领域技术人员知晓，适当地该试剂盒中还应当包括适当的载体，缓冲液/剂，和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括对所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合和猪流行性腹泻病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

本发明的试剂盒用于检测样品中猪流行性腹泻病毒时，包括以下几步：(1)将检测样品与所述单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或其任意组合进行接触；(2)检测所述单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合与样品中所述猪流行性腹泻病毒的反应。

优选地，所述检测方法步骤(1)中的所述单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合附着在固相上；进一步优选地，所述固相为微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒、硝化纤维素膜中的任一种。

优选地，所述检测方法步骤(2)中所述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定。

术语“检测方法”可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、胶体金检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原。

术语“竞争法”是比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合本发明所述单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把本发明所述单克隆抗体包被到固相支持物上而得以进行的。同时加入预先定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后，冲洗固相支持物，检测结合到该支持物上的标记物的活性。

术语“夹心法”是指样品中的目标抗原被夹在包被单克隆抗体和标记单克隆抗体之间，然后再加入标记物比如酶的底物，通过底物颜色的变化检测并判定抗原的存在。开展基于夹心法的免疫学检测，例如，先把含有一种未知数量目标抗原的样品加入到用物理或化学方法预先包被了本发明中所述单克隆抗体的固相支持物上进行反应。然后，加入本发明所述的标记单克隆抗体进行反应。孵育后，冲洗该支持物，再对结合到该支持物上的标记物的活性进行检测。标记物可以是放射性同位素如¹²⁵碘、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯二胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯-β-D-半乳糖和甲基伞形酮-B-D-半乳糖(针对β半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点(quantum dot)标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、表位标记如FLAG或HA表位、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；荧光基团如伞形三糖(umbellifcrone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、cascade蓝、二氯三嗪基荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系络合物如包括铕和铽、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其荧光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子点：或放射性材料如¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、Tc99m、³⁵S或³H；或球珠(spherical shell)，以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所编的Principles of F1uorescenceSpectroscopy，Plenum Pub Corp，笫二版(July1999)和Richard P.Hoagland的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子点，参见美国专利U.S.P 6207392。量子点可从QuantumDot Corporation购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括II-V族半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及III-V族半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs、InP、Inas和其混合物。IV族半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于III-V族化合物、II-VI族化合物、IV族元素和其组合物的半导体。在某些实施方式中，荧光能量受体连接到检测探针作为标记物。在一实施方式中，荧光能量受体可以通过化合物与单线态氧反应形成荧光化合物而形成，或通过化合物与一辅助化合物反应并将其转化为荧光化合物而形成。这类化合物可以包括于本发明装置中的缓冲液中。在其它的实施方式中，荧光能量受体可以是包括化学发光剂或基团的化合物的一部分，例如，荧光能量受体可以包括稀土金属如铕、钐、碲等金属络合物。这些材料因其具有尖锐的发光谱带而较受青睐；而且，镧系标记物如铕(III)可以提供有效的长时间的信号发射，同时不易光漂白，因而可以使得含有处理/反应样品的测试装置在需要的情况下可以放置较长一段时间。在各种异源和同源免疫测定法中，已经使用长寿命的荧光铕(III)络合物纳米微粒作为标记物，例如可以参见Huhtinon et al.Clin.Chem.2004Oct；50(10)：1935-6。但这些内部标记的纳米微粒与时间分辨荧光检测一起使用时，测定性能可以改善。在异源测定中，低浓度下测定的动态范围可以扩展；而且，通过使用检测抗体涂敷的高特异活性纳米微粒标记物，而不是使用常规标记的检测抗体，测定的动力学特性也可以改善。在同源测定中，对于荧光共振能量转移来说，铕(III)纳米微粒是很有效的供体，从而可以进行简单、快速和高效的筛选。在一实施方式中，标记物如此处披露的荧光标记物，包括与生物分子偶联的纳米微粒标记物。换句话说，纳米微粒可以用作检测或捕捉探针。例如，本发明中，可以利用连接到单克隆抗体或链霉抗生物素蛋白(SA)的铕(III)-标记的纳米微粒来检测样品中特定的分析物，如纳米微粒基的免疫测定。纳米微粒可以作为附着特定结合剂的底物，这些特定结合剂是针对分析物和检测(如标记物)或捕捉成分的。有关标记物的实例可以参见美国专利U.S.P 4695554、U.S.P 4863875、U.S.P 4373932和U.S.P 4366241。U.S.P 4313734和U.S.P 4373932中则披露了胶体金属和染色颗粒。而U.S.P 4954452中则披露了如何制备和使用非金属的胶体；U.S.P 4252459中披露了用作标记物的有机聚合物乳胶颗粒。

把标记物结合到抗原或抗体上的方法，可以通过顺丁烯二酰亚胺法(J.Biochem.(1976)，79，233)、生物素活化法(J.Am.Chem.Soc.(1978)，100，3585)、疏水结合法、酯活化法或异氰酸酯法("Enzyme免疫测定techniques”，由Igaku Shoin发表于1987年)。如果上述标记物为放射性同位素，则需使用好的防辐射的工作台面或液体防护设备。如果上述标记物为酶，需加入底物，酶的活性通过比色法或荧光计测定。如果上述标记物为荧光物质、发光物质或有色物质，测定方法可以相应的使用本领域熟知的方法进行测定。

术语“检测样品”包括但不限于动物或患者的排泄物、口鼻腔分泌物、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。

本发明的第六方面在于提供所述单克隆抗体或其活性片段或其保守性变异体或上述的组合，用于诊断、预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染的药物的用途。

本发明的第七方面在于提供所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达的单克隆抗体在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用；或是所述的单克隆抗体制备的药物组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明制备的药物经口服给药。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪流行性腹泻病毒感染时是指抑制猪流行性腹泻病毒的复制、抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

在本发明的一种优选实施方式中，所述单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体的形式包括但不限于粉末剂、丸剂、片剂、胶囊剂。

本发明的包含杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达的单克隆抗体的药物能够有效预防和治疗猪流行性腹泻病毒相关的疾病。

术语“猪流行性腹泻病毒”为临床使用的PEDV活疫苗毒株或与疫苗毒株相似的临床流行的PEDV毒株，如：CV777株(保藏号为CCTCC-V200608，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市·武汉大学，保藏日期为2006年11月16日，该毒株已在中国专利CN101117627A中公开)；ZJ08株(保藏号为CGMCC No.7806，该毒株已在中国专利CN103725651A中公开)；韩国DR13株、CPF1074株、PFF513株、KPD-9F株、SM98株；比利时Brl/87株和日本JMe2株、P-5V株(韩国DR13株、CPF1074株、PFF513株公开于猪流行性腹泻病毒FJ-11A株的分离与ORF3基因序列分析，陈如敬，吴学敏，车勇良等，福建农业学报，2011,26(6):947-951；韩国KPD-9F株、比利时Brl/87株和日本JMe2株公开于专利申请抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法，CN103705918A；SM98株公开于2010-2012年中国猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析，王晓梦等，第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集；P-5V株公开于2014年流行性腹泻最新防控，浙江诺倍威生物技术有限公司技术期刊，2014,3)；HN1301株(保藏号为CCTCC NO：V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市·武汉大学，保藏日期为2013年9月16日)；AH2012株、BJ-2011-1株、GDYG株(AH2012株、BJ-2011-1株、GDYG株公开于猪流行性腹泻病毒变异株N基因的克隆及原核表达，孙冰等，畜牧与兽医，2014,46(5):72-76)等。

本发明的第八方面在于提供单克隆抗体在鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。

进一步优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。

本发明的第九方面在于提供所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测分析中的应用。

本发明的含有杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达的单克隆抗体的试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测等非诊断目的方面应用。

本发明具有以下突出的优点：

1.口服使用，使用途径简单；

2.目前猪流行性腹泻病毒疫苗的预防效果不能达到100％，该产品可以弥补现有疫苗的缺陷，解决了现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪流行性腹泻病毒感染问题；

3.可以用于紧急预防猪流行性腹泻病毒引起的腹泻或减轻发病程度；

4.弥补现有疫苗单一的预防作用,还可以用于紧急治疗猪流行性腹泻病毒引起的腹泻病；

5.可以用于开发关于猪流行性腹泻病毒的诊断试剂或用于表位鉴定研究，具有一定的学术价值和意义。

6.该单克隆抗体具有中和病毒的活性，能够用于相关联苗的鉴别检验。

附图说明

图1示出方阵滴定法中用于确定抗原和酶标二抗最佳稀释度的饱和曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的抗原为猪流行性腹泻病毒HN1301株，该毒株保藏号为CCTCC NO.V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市·武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

本实施例中所用的PBS为pH值7.4的磷酸盐缓冲液，其1L体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例所用的DMEM培养液，50×的HAT/HT选择培养液为将HAT/HT选择培养基溶于10mL DMEM培养液中；DMEM完全培养液为40mL DMEM、10mL Hyclone血清；DMEM选择培养液为39mL DMEM、10mL Hyclone、1mL 50×HAT/HT选择培养液；细胞冻存液为70mL DMEM、20mLHyclone、10mL DMSO，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1杂交瘤细胞株的获得

1.1PEDV病毒的繁殖与纯化

1.1.1抗原的制备

将长成良好单层的Vero细胞(Vero细胞来源于上海生化所)，用PBS清洗2-3次，接MOI＝0.001的接毒剂量接种PEDV HN1301株，接种时病毒液和维持液的总量为1mL，置于37℃孵育60分钟，期间每隔20分钟轻轻混匀一次，吸附后弃掉瓶内液体，加入新鲜维持液5mL，置于37℃CO₂培养箱中，待到细胞病变达到90％时收获病毒液，冻存于-20℃备用。

1.1.2抗原的纯化

取病毒液200mL加入20mL的TritonX-100，室温震荡10min，以高速冷冻离心机5000rpm离心30min,取离心上清液于超速冷冻离心机40000rpm，离心2h，沉淀充分溶解于适量0.01moL/L pH值7.4的PBS中，即为PEDV抗原，测定抗原效价为10⁷ _. ⁵TCID₅₀/mL，分装冷冻保存在-20℃。

1.2小鼠免疫

病毒液和佐剂按1:1(V/V)的比例混合，乳化。免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，采用的免疫方式为背部皮下多点注射，免疫剂量为0.2mL/只。首免用弗氏完全佐剂，之后两次加强免疫用弗氏不完全佐剂。第三次免疫后可适时检测小鼠血清的IFA抗体效价，当血清IFA效价高于1:800时可以用于第四次免疫即冲击免疫，冲击免疫时尾静脉注射纯化后的抗原。在细胞融合前三天选取血清IFA效价水平最高的小鼠进行冲击免疫，三天后取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合。此小鼠的血液可制成血清，作为阳性血清使用。

表1 小鼠的免疫程序

1.3细胞融合

1.3.1SP2/0细胞(来源于ATCC)的培养

在融合前大约10天左右，从液氮罐中复苏细胞，在基础培养基中加入20％的胎牛血清，放入CO₂培养箱中在37℃、5％CO₂下培养。

1.3.2制备饲养细胞层(选择小鼠腹腔巨噬细胞)

选择与免疫小鼠同品系的小鼠，6-8周龄，拉颈处死，在75％的酒精中浸泡3-5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5-6mL预热的DMEM培养液。反复冲洗，吸出冲洗液，放入离心管中，1000rpm离心5min，用20％的小牛血清培养液(加HAT选择培养基)重悬细胞，加入到96孔板，150μL/孔，放入37℃CO₂培养箱中培养过夜，未污染则可以使用。

1.3.3免疫小鼠脾细胞的制备

脾内免疫3天后，处死小鼠；将处死的小鼠用流动清水冲洗后，在75％酒精中浸泡3-5min，固定；消毒后打开腹腔，取出脾脏，并用DMEM培养液进行冲洗；将脾脏放置在筛网上，用无菌注射器推杆研磨；取脾细胞混悬液，离心，取沉淀，37℃备用。

1.3.4脾细胞和骨髓瘤细胞的融合

将制备好的骨髓瘤细胞和脾细胞按1:10的比例混匀，离心取沉淀，尽量使沉淀干燥；在37℃条件下加入PEG1500，缓慢加入，1分钟内加完，此过程最好在37℃水浴中作用2min(1min加完，再作用1min共计2min)；然后每隔2min加入1mL 37℃预热的不完全培养液终止反应，共加5次；800rpm离心7min；弃去上清，用20％小牛血清的HAT培养液重悬；将上述细胞加入已有饲养细胞层的96孔板中，每孔50μL；将培养板置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

1.4杂交瘤细胞的筛选与保藏

1.4.1HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞

在HAT选择培养液中培养1-2天，有大量的瘤细胞死亡，3-4天后瘤细胞消失，杂交瘤细胞形成小群落，第三天换液(HAT选择性培养基，半换)，第7天，换液(HAT选择培养基，半换)，换液后三天开始检测上清，第一次亚克隆的时候可以选择换成HT选择培养基。选择只有一个克隆生长的孔，弃掉两个以上克隆以及没有细胞生长的孔。杂交瘤细胞布满孔底约1/10时，即可开始检测特异性抗体，筛选所需的杂交瘤细胞。

1.4.2抗PEDV单克隆抗体的检测

通过检测杂交瘤细胞分泌的上清液中IFA抗体的效价进行阳性克隆的初筛，然后再通过中和实验筛选具有中和活性的单克隆抗体。

1.4.2.1IFA方法筛选分泌PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株：

(1)指示病毒

PEDV HN1301株，使用剂量为300TCID₅₀/0.1mL。

(2)病毒抗原板的制备

Vero细胞传代后，按照2万细胞/孔，铺96孔板，每孔100μL。置于37℃5％CO₂培养箱中培养24小时，将稀释好的病毒液加入到96孔板中，每孔100μL。置于37℃5％CO₂培养箱培养2天。

(3)IFA筛选分泌PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株

将上述培养2天的96孔板，弃去培养液，用预热的pH值7.4PBS洗2次，300μL/孔。弃去PBS，用80％预冷的丙酮固定，每孔100μL，置于4℃30min。弃去丙酮，用PBS洗3次，300μL/孔。用PBS将PEDV单克隆抗体进行2倍梯度稀释，将稀释的单克隆抗体加入到96孔板中，100μL/孔，置于37℃5％CO₂培养箱1h。弃去孔中液体，用PBS洗3次，300μL/孔。加入兔抗鼠的荧光二抗(FITC标记)，置于37℃5％CO₂培养箱1h。弃去孔中液体，用PBS洗3次，300μL/孔。每孔加入50μL PBS，用荧光显微镜进行观察。

1.4.2.2中和抗体检测方法：

(1)指示病毒

PEDV HN1301株，中和试验使用剂量为500TCID₅₀-1000TCID₅₀。

(2)样品处理

被检样品需56℃水浴灭活30min。

(3)操作方法

①单层细胞的制备

长满单层的Vero细胞，用无菌PBS洗三次，0.125％的胰酶37℃消化后，用含5％PAA血清的DMEM营养液分散后取样计数，铺96孔细胞培养板，2万细胞/孔，每孔100μL，置37℃培养箱培养三天；

②用稀释液1:2(V/V)倍比稀释杂交瘤细胞上清或者血清，与稀释至工作浓度的指示毒等体积混合；

③用微量振荡器振荡1min，放置37℃中和1h，期间摇匀2-3次；

④接种到制备好的96孔细胞培养板上，(接种前单层细胞用PBS洗一次)每个稀释度加4孔，每孔100μL。

⑤设病毒对照、阳性、阴性对照及细胞对照孔，将细胞板置于CO₂培养箱内培养，每天观察，96h-120h判定结果。病毒对照、阴性对照组出现细胞病变(CPE)，阳性及细胞对照组均无CPE，以能保护半数接种细胞不出现细胞病变的血清稀释度作为终点，并以抑制细胞病变的最高血清稀释度的倒数来表示中和抗体滴度。选择中和抗体滴度较高的杂交瘤细胞进行克隆化。

1.4.3杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)

(1)克隆前1天制备饲养细胞层；

(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹起，计数；

(3)调整细胞为3-5个细胞/mL；

(4)准备饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL，置于37℃5％CO₂培养箱中；

(5)在第7天换液，以后每2-3天换液1次；

(6)8-9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性；

(7)将阳性孔的细胞移至24孔细胞板、6孔细胞板、细胞瓶依次扩大培养，冻存筛选到的阳性株，2×10⁶/支，保存于液氮中。

1.4.4杂交瘤细胞染色体计数

用秋水仙素法，对稳定传代的杂交瘤细胞进行染色体计数，结果表明：杂交瘤细胞的染色体数均在90-105之间，染色体突变率小于5％，表明杂交瘤细胞稳定，分泌抗体的稳定性较好。

获得了一株能稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株命名为小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为：CCTCC No:C2014197，保藏地址为中国武汉·武汉大学，邮编为430072，保藏日为2014年11月3日。

实施例2单克隆抗体的制备与鉴定

2.1单克隆抗体腹水的制备先用灭菌液体石蜡致敏BALB/C雌性小鼠，0.5mL/只腹腔注入，7-10天后向腹腔注入0.5mL(约2.0×10⁶个/mL)的杂交瘤细胞。观察，当小鼠腹部明显涨大时抽取腹水。将腹水置于37℃，1h后4℃过夜。次日离心取上清，分装，-70℃保存。

2.2单克隆抗体Ig类型的鉴定

采用Sigma公司单克隆抗体分型试剂按说明书进行单克隆抗体Ig类型的鉴定，8A3A10单克隆抗体重链IgG2a亚型，轻链为Kappa链。

2.3单克隆抗体效价的测定

采用实施例1.4.2中IFA方法，测定制备的抗PEDV单克隆抗体的IFA效价为1:51200。证明该株单克隆抗体具有很好的反应性和识别病毒的能力，可用于开发诊断试剂使用。

2.4单克隆抗体中和活性的测定

该单克隆抗体与500TCID₅₀的不同来源的PEDV毒株中和后接种Vero细胞，通过中和试验测定该单克隆抗体具有中和疫苗株PEDV CV777株、疫苗株SM98株及流行毒株的代表毒株HN1301株的能力。测得的中和抗体效价均大于等于1:512，表明该单克隆抗体具有良好的中和活性。

表2 用不同毒株与单克隆抗体中和后测得的中和抗体效价

毒株(500TCID50/0.1mL)	单克隆抗体(0.1mL)	中和抗体效价
			CV777	8A3A10	1:512
SM98	8A3A10	1:512
			HN1301	8A3A10	1:1024
TGEV	8A3A10	<1:2
			RV	8A3A10	<1:2

通过上述试验证明该单克隆抗体具有很好的中和病毒的能力，中和效价均在1:512以上，该株单克隆抗体不能中和传染性胃肠炎病毒TGEV、轮状病毒RV等主要导致仔猪腹泻的病原，因此该单克隆抗体能够用于腹泻二联苗或多联疫苗中PEDV病毒含量的测定。

该株单克隆抗体具有很好的中和活性，表明该株单克隆抗体所对应的抗原表位是比较重要的抗原表位，可以用于开发制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物，并用单克隆抗体提供很有价值的保护性抗原基因序列相关信息。

2.5单克隆抗体特异性鉴定

将该单克隆抗体分别与包被有PEDV、TGEV、PRoV、PRRSV、PRV及Vero细胞的反应板进行反应，结果只有包被有PEDV抗原的反应板为阳性。表明该单克隆抗体具有较好的特异性。

2.6单克隆抗体的纯化及含量测定

按照陈丹等(陈丹,孙广瑞,柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学,2007,35(26):8105,8108)的辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体，并用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的结果进行分析，结果表明：纯化后的单克隆抗体纯度很好，可满足临床应用的需求。

并用BCA蛋白定量试剂盒对单克隆抗体进行定量分析，测定结果表明：单克隆抗体的浓度为2mg/ml。

2.7单克隆抗体的亲和力常数测定

2.7.1方阵滴定法确定抗原和酶标记物最佳稀释度

将纯化好的病毒抗原用包被液稀释成1:200、1:400、1:800进行包被，100μL/孔，4℃过夜，取出用PBST洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶粉以100μL/孔加入，37℃封闭1小时，洗板3次，拍干；然后将阴、阳性血清用稀释液按浓度(1:5120)进行稀释，100μL/孔，37℃反应30分钟，洗涤3次，拍干，同时设空白对照；酶标二抗用稀释液按1:0.5×10⁴、1:1×10⁴、1:2×10⁴、1:4×10⁴进行稀释，然后100μL/孔加入，37℃反应30分钟，洗涤3次，拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液100μL/孔加入，37℃反应10分钟；最后加入50μL/孔硫酸(2moL/L)终止反应，用酶标仪检测OD_450nm。

结果表明，从饱和曲线(见图1)上可以看出，随着抗原和酶标抗体浓度的增加，曲线随之升高。当曲线趋于平行时，提示抗原、抗体和酶标记物的结合已达到饱和浓度。选定1:800(V/V)稀释的抗原浓度为最佳包被浓度，以1:1×10⁴稀释的酶标二抗为测定单克隆抗体相对亲和力的最佳工作浓度。

2.7.2单克隆抗体相对亲和力的测定

用实施例2.6.1方法对纯化的单克隆抗体进行效价测定，然后进行其相对亲和力的测定:将纯化开始作倍比稀释，分别加入包被有最适抗原浓度的96孔酶标板，同时设阴性血清和空白对照37℃反应30分钟，用PBST洗板3次，拍干；每孔加入山羊抗小鼠IgG-HRP(1:1×10⁴稀释)100μL/孔，反应过后洗涤同上，每孔加入100μL/孔TMB(四甲基联苯胺)底物溶液显色，用2moL/L H₂SO₄(50μL/孔)终止反应，读取OD_450nm值。结果以与包被抗原出现50％结合时的单克隆抗体的蛋白含量，即为该株单克隆抗体的相对亲和力。

以纯化单克隆抗体的稀释度与其相对应的OD_450nm值作图，曲线趋于平坦时的OD_450nm作为100％，即抗原与单克隆抗体的结合已达到饱和状态。取曲线上50％饱和度所对应的单克隆抗体浓度，即为该株单克隆抗体的相对亲和力，亲和力越大，所需单克隆抗体的量越低。计算结果表明：该株单克隆抗体的相对亲和力为1:5120。

实施例3单克隆抗体预防、治疗病毒感染的效果评价

3.1单克隆抗体预防病毒感染效果评价

筛选PEDV、RV、TGEV抗原、抗体双阴性的2-3日龄仔猪15头，随机分为3组，第一组和第二组分别口服实施例2制备的单克隆抗体2mL,第三组口服PBS缓冲液2mL，口服后24小时第一组和第三组口服PEDV流行毒株HN1301小肠毒2mL(含1000个最小发病剂量)，第二组口服CV777小肠毒(含1000个最小发病剂量)，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒监测排毒天数来评价该单克隆抗体的预防腹泻病毒感染的效果，结果见表3。

表3 服用单克隆抗体后24小时预防PEDV感染的试验结果

组别	发病情况	死亡率	排毒天数
				第一组	1/5头猪出现轻微腹泻	1/5	第9天PCR检测阴性
第二组	1/5头猪出现轻微腹泻	0/5	第8天PCR检测阴性
				第三组	5/5出现严重腹泻或呕吐	4/5	第14天PCR检测阳性

3.2单克隆抗体治疗病毒感染效果评价

筛选PEDV、RV、TGEV抗原、抗体双阴性的2-3日龄仔猪20头，随机分为4组，第一组和第二组分别口服PEDV流行毒株HN1301小肠毒2mL(含1000个最小发病剂量)，第三组和第四组口服CV777小肠毒(含1000个最小发病剂量)，口服后12小时第一组和第三组分别口服实施例2制备的单克隆抗体2mL，第二组和第四组口服PBS，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价该单克隆抗体治疗腹泻病毒感染的效果，结果见表4。

表4 攻毒PEDV后12小时服用W1单克隆抗体治疗的试验结果

组别	发病情况	死亡率	排毒天数
				第一组	1/5头猪出现轻微腹泻	1/5	第9天PCR检测阴性
第二组	5/5出现严重腹泻或呕吐	4/5	第14天PCR检测阳性
				第三组	0/5头猪出现轻微腹泻	0/5	第6天PCR检测阴性
第四组	4/5出现严重腹泻或呕吐	3/5	第14天PCR检测阳性

由以上试验证实，该株单克隆抗体能够减轻由猪腹泻病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的治疗和/或预防作用。

实施例4单克隆抗体诊断病毒的效果评价

将经RT-PCR检测到的含猪流行性腹泻病毒的临床样本(见表5)，经ELISA检测，检测步骤为：按照实施例1.1繁殖和纯化PEDV HN1301株(10^7.5TCID₅₀/ml)，并将纯化好的病毒抗原用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释1:10000后进行包被，100μL/孔，同时做阴性对照(用PBS缓冲液代替)、阳性对照(阴性血清，用稀释液按1:5120V/V稀释)，4℃过夜，取出用PBST洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶粉以100μL/孔加入，37℃封闭1小时，洗板3次，拍干；按照实施例1.1进行繁殖和纯化PEDV CV777株(10^7.0TCID₅₀/ml)，用稀释液按照1:10V/V的比例进行梯度稀释，并按100μL/孔添加，同时将每个临床样本按照1:10V/V的比例稀释3个；将实施例2.6纯化后的单克隆抗体用稀释液稀释至100μg/mL，按100μL/孔添加，于37℃反应30分钟，洗涤3次，拍干，同时设空白对照；酶标二抗用稀释液按1:1×10⁴V/V进行稀释，然后100μL/孔加入，37℃反应30分钟，洗涤3次，拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液100μL/孔加入，37℃反应10分钟；最后加入50μL/孔的硫酸(2moL/L)终止反应，用酶标仪检测OD_450nm。

根据PEDV CV777株梯度稀释经ELISA检测后的OD_450nm值与梯度稀释的浓度绘制竞争标准曲线，并根据临床样本检测的OD_450nm结果计算其所含的PEDV含量，计算结果如表5所示：

表5 ELISA与RT-PCR检测临床样本中PEDV检测结果比对

临床样品	RT-PCR(TCID50)	ELISA(TCID50)
			1	104.0	103.9
2	103.5	103.6
			3	104.0	104.2
4	阴性(未检出)	阴性(未检出)
			5	103.5	103.5
6	104.0	104.1
			7	阴性(未检出)	阴性(未检出)
8	103.5	103.4

由表5可知：ELISA检测结果与RT-PCR检测结果相吻合，表明该单克隆抗体可用于定量检测临床样本中PEDV的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞8A3A10株保藏号为CCTCC No：C2014197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2014年11月3日。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效量的权利要求2所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

4.一种制备权利要求3所述的药物组合物的方法，所述方法包括：

(1)使用权利要求1所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达单克隆抗体；以及

(2)将所述步骤(1)中表达的单克隆抗体加入药学上可接受的载体。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的单克隆抗体，所述的单克隆抗体用于和猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对所述的单克隆抗体和猪流行性腹泻病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

7.根据权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

8.根据权利要求3所述的药物组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

9.根据权利要求2所述的单克隆抗体在鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。

11.根据权利要求5或6所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测分析中的应用。