CN109517060B - 猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3。本发明的效果在于：利用噬菌体展示技术构建PEDV M蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和ELISA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度OD405值的不同表明其同M蛋白结合能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及以一种猪流行性腹泻病毒M蛋白单域抗体。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。感染PEDV的病猪主要通过粪便传播病毒，发病猪主要表现腹泻、呕吐和脱水等临床特征，是导致哺乳仔猪死亡的主要传染病之一。1971年，PED首次在英国发生，随后扩散到世界各地。我国于1980年首次分离到PEDV，2010年国内大部分养猪地区发生PED疫情，从哺乳仔猪到繁殖母猪均有发病，给养猪户造成了严重地经济损失。PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronavi ridae)冠状病毒属(Coronav irus)，基因组是单股正链具有感染性的RNA ,与其他冠状病毒相似, 基因组5′端有一个帽子结构(cap), 3′端有1个Poly (A)尾, 基因组全长为2,8033 nt，分别编码S、E、M和N等4个病毒结构蛋白。S担保存在的中和表位能够诱导机体产生中和抗体，对仔猪具有良好的保护效果。PEDV感染早期，机体能够产生抗N和N蛋白的高水平抗体，是研发病毒血清抗体诊断方法的候选抗原。E蛋白在抗病毒研究方面具有应用前景。
骆驼属外周血中存在的天然缺失轻链的重链抗体（variable domain of theheavy chain of HCAbs，VHH）具有其他陆生生物所不具备的生物学特征，它的抗原结合位点仅由重链可变区单一结构域组成，却同普通IgG抗体一样保持着良好和特异的抗原结合能力。VHH是目前可以得到的、具有完整功能的、最小IgG抗体分子片段，分子量为15kDa，是常规IgG的1/10，单克隆抗体的1/3，分子高度4.8nm，直径2.2纳米，也称为纳米抗体（nanobody）。VHH抗体抗原结合位点具有伸展的抗原互补结合区和组织穿透性，可结合普通IgG抗体无法接触的抗原表位。另外，体外重组VHH具有易表达和水溶性好等独特性质，在作为小型化基因工程抗体、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体；
本发明的另一个目的是提供一种编码所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的核苷酸序列；
本发明的再一个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E.coli中的表达。
本发明采用以下技术方案，一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。
一种重组表达载体，含有上述的核苷酸序列。
一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。
优选的，所述宿主细胞为含有上述表达载体的原核细胞。
所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E.coli中的表达。
本发明的效果在于：利用噬菌体展示技术构建PEDV M蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和ELISA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度OD405值的不同表明其同M蛋白结合能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。
附图说明
图1是是抗PEDV M蛋白VHH克隆氨基酸序列比对结果图；
图2是E.coli中抗PEDV M蛋白VHH抗体SDS-PAGE分析图。
具体实施方式
下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1、猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的制备
1.材料和方法
1.1实验动物和试剂
2峰10月龄雌性双峰驼作为实验动物，牛淋巴细胞分离液，96孔酶标板；限制性内切酶，DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA产品，镍亲和层析树脂(Qiagen)；E.coli重组表达PEDV M抗原（His标签和GST标签）；菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌TG1和BL21 Star (DE3)、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2购于NEB公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1骆驼免疫和抗体监测
首次免疫，用206佐剂（购于法国seepic公司），乳化500μg重组M蛋白皮下多点（背部，后腿和颈部两侧肌肉）接种骆驼。首免21天后加强免疫，剂量为206乳化1000μg M蛋白，与首免间隔 35天、42天和63天加强免疫，抗原接种剂量均为1000μg M蛋白。在首次免疫前和每次加强免疫前均采集静脉血并分离到血清，用M蛋白（GST标签）作为抗原的间接ELISA检测PEDV抗体。本次免疫实验过程中，骆驼饲养管理，免疫，血液样品的采集均在专业兽医工作人员监督指导下完成。
1.2.2外周血的分离
最后一次免疫后7天（即第63天）颈静脉采抗凝血10 mL（抗凝剂为肝素钠，10IU/mL），加入等量的Han`s液做1倍稀释，而后加入等体积淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心分离外周血总淋巴细胞。分离的淋巴细胞用MEM重悬中加入到六孔板中（37℃，5%CO2）静止30 min，吸附除去细胞碎片和巨噬细胞，离心收集淋巴细胞加入MEM，保存在液氮中用于细胞RNA提取。
1.2.3 VHH抗体免疫文库构建
设计3对引物（参见表1-VHH基因扩增用引物）通过三轮扩增得到编码VHH蛋白目的基因。通过Trizol试剂抽提淋巴细胞总RNA，用G1作为反转录引物，合成第一链cDNA，以cDNA为模板，H1、G1为引物扩增得到600bp和900bp大小2条DNA带，回收600bp条带作为模板，进行第2轮PCR扩增。
以第2轮PCR产物为模板，H2、H3为引物得到450bp DNA带。以2轮PCR产物为模板，P1，TN为上下游引物进行第3轮扩增得到450bp带。将第3轮PCR产物经过SfiI/NotI双酶切克隆到pHEN2载体，电转化方法将连接产物转化到TG1中，37℃，180r/min培养1h，离心浓缩后涂在氨苄抗性的2×YTG平板（2%葡萄糖，100μg/mL Ampr）。同时取10μL稀释至1× 104倍涂板，37℃过夜培养，计算库容。转化后平板37℃温箱中培养16小时，用10mL的2×YT培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在-70℃备用，此为获得的抗PEDV M蛋白VHH免疫抗体库。随机挑选电转化后的克隆进行测序，根据多样性和克隆数目来计算库容量。
1.2.4 通过二次筛选过程获得特异的抗PEDV M蛋白 VHH抗体
筛选抗体操作步骤如下：
（1）抗原包被：将M抗原（GST标签）稀释至20ug/ml，50ul/孔，4℃过夜。PBS洗3次；
（2）封闭：加入300ul/孔的2%M-PBS，与37℃封闭1h，PBS洗3次；
（3）结合：取20ul phage+180ul 0.1MPBS，混匀，50ul/孔，37℃静置1h；甩出多余的噬菌体溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1%PBST洗3次；
（4）一抗：用0.1M PBS按1：1000稀释兔抗M13 50ul/孔 37℃静置1h；甩出多余的液体，倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1% PBST洗3次；
（5）二抗：用0.1M PBSS按1：10000稀释HRP-羊抗兔 50ul/孔 37℃静置1h；甩出多余的液体倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1% PBST洗4次；
（6）显色：取0.2M/L Na2HPO4 + 0.1M/L 柠檬酸各0.5ml 加入少量 OPD，10ulH2O2 混匀 50ul/孔；2M 硫酸终止25ul/孔，波长490nm检测结果。
1.2.5VHH可溶表达和ELISA检测
随机挑选40个克隆，转化到E. coli BL21 Star (DE3)表达感受态中，然后挑单克隆于1ml培养基中，快速诱导表达，TG1空菌体作为空白对照。收集诱导的1ml菌液，12000rpm离心2min，弃上清，沉淀用0.5ml TBS重悬；400W（6s超声，4是间隔）超声10 min；将加入超声上清50ul/孔，37℃静置1h，TBS洗3次；加入2%M-TBS，200ul/孔，37℃封闭1h，0.1% TBST洗4次；取1M 二乙醇胺+ 0.5mM MgCl2 加入4mg PNPP，25ul/孔，3M NaOH终止，25ul/孔。波长405nm条件检测结果。选择阳性反应克隆进行序列测定和比对。
2.结果
2.1骆驼血清中M抗体水平检测
以2峰10月龄雌性双峰驼作为实验对照动物。
四次M抗原（His标签）免疫骆驼血清抗体做1∶50稀释检测表明（参见表2-M蛋白抗体检测（OD450nm）），第2次加强免疫后，2头实验对照动物抗M的抗体已经是阳性，最后一次免疫后7天测抗体效价时，2峰骆驼的血清抗体OD450nm达到1.58和1.92，因此可以判断此时机体内体液和细胞免疫水平均处在持续上升阶段，符合采集外周血淋巴细胞的实验要求。
2.2抗M蛋白VHH免疫文库构建和筛选
经过四轮的筛选后，可以检测到较为明显的富集效应（参见表3-每一轮噬菌体筛选的富集指数）。单克隆噬菌体ELISA实验结果显示了40个阳性克隆，每个克隆的OD450nm值见表4，表4中M13KO7、1%M-PBS为阴性对照。对这些克隆进行DNA测序和核苷酸序列比对得到8个VHH基因碱基序列，通过氨基酸比对后获得6个独特型抗M蛋白VHH抗体基因。
2.3 VHH可溶表达和ELISA检测
利用M蛋白作为抗原包被酶标板，在30℃和37℃条件下同获得的6个独特型抗M蛋白VHH抗体基因进行可溶性表达和ELISA检测发现，他们均可以同M蛋白相结合，通过吸光度值（OD405nm）的高低说明其与抗原的结合能力各有不同（参见表5- M蛋白ELISA鉴定）。
2.4 抗M蛋白VHH基因序列比对和在E.coli中的表达
通过对所获得VHH基因进行核苷酸测序和序列分析见图1，氨基酸序列比对结果见图2。通过The Kabat et al. (Kabat, 1991) 比对方法进行分析，图1方框中氨基酸表示双峰驼源VHH抗体特有的标志性氨基酸，带下划线的氨基酸表示不同VHH克隆间的差异氨基酸。为了稳定获得VHH抗体，分别将VHH基因序列克隆到pET-28a载体，转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，1.0 mM IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE蛋白电泳分析发现目的条带，分子量大小在25kDa附近（VHH约13.6Kda，组氨酸标签约8～10KDa），目的条带如图中箭头所示，证实所有VHH抗体均以成功表达。
通过图1和表4说明：利用噬菌体展示技术筛选得到8株编码PEDV M蛋白VHH抗体序列，氨基酸序列比对结果表明，抗体FR2区序列具有典型的重链抗体氨基序列特征，即序列中的氨基酸残基分别为F37/E44/R45/G47（图1），证明这些抗体序列来自于重链抗体的高变区。抗体的CDR1区氨基酸残基31S和或N、32S和或N位，CDR2氨基酸残基54D或N存在变异，说明编码8株抗体的氨基酸序列的多样性存在显著差异。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体
<130> 2015
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> Camelus bactrianus
<400> 1
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Claims (5)
1.一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性VHH抗体，其特征在于，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3。
2.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求1所述的核苷酸序列的原核细胞。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求2所述的表达载体的原核细胞。
5.如权利要求1所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性VHH抗体的 编码基因用于在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达。
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| 猪流行性腹泻病毒M 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定;张志榜等;《中国预防兽医学报》;20110731;第33卷(第7期);第568-570页 * |
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