CN105218668B - 马耳他型布氏杆菌的EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用 - Google Patents
马耳他型布氏杆菌的EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种布氏杆菌EF‑Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用，通过将EF‑Tu基因克隆到pET30a载体中构建出原核表达载体中表达携带His标签的EF‑Tu蛋白，并用纯化的EF‑Tu蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞获得抗马耳他型布氏杆菌EF‑Tu MAb；本发明在筛选时采用原核表达携带GST标签的EF‑Tu纯化可溶蛋白来包被ELISA板，这样不仅可以避免筛选到识别His标签蛋白的MAb，而且可溶的GST‑EF‑Tu蛋白活性更接近天然的布氏杆菌延伸因子Tu蛋白，保证了杂交瘤细胞的特异性,抗体MAb具有强特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域，具体提供了一种马耳他型布氏杆菌的EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用。
背景技术
布氏杆菌病(Brucellosis)又称“地中海弛张热”或“马耳他热”，简称“布病”，是由布氏杆菌(Brucella)感染引起的一种重要的人畜共患传染病。自90年代起，随着畜牧业的发展，布病在人群和畜群中的感染率随之上升，发病例数更是逐年增加，世界每年约有50万人感染，由该病造成的经济损失不可估量，这严重威胁着人的健康和畜牧业发展。目前尽管已有若干疫苗用于动物免疫，但并没有安全有效的人用疫苗。为研制更加安全、有效的布氏杆菌疫苗，迫切需要加强对布氏杆菌病病原致病分子机制与免疫机制的基础研究。
细菌的EF-Tu参与蛋白质的合成，介导氨酰-tRNA进入核糖体的空位，是一种重要的延伸因子，在原核生物中广泛存在，而且高度保守。最近的研究表明，EF-Tu是一种重要的多功能蛋白，不仅仅是作为蛋白翻译因子起作用，而且更重要的是EF-Tu参与许多重要的细胞和疾病过程，包括信号传导、翻译控制、凋亡、细胞骨架组成等。EF-Tu没有信号肽却能联合其他一些缺乏分泌信号的蛋白以类似外体(exosome)运输的方式分泌并干扰宿主细胞信号传递。幽门螺杆菌(H.pylori)感染宿主细胞，阻止表皮细胞极化，和利什曼原虫(Leishmania)采用相同途径，分泌EF-Tu下调感染细胞的炎症反应；在酿酒酵母(S.cerevisiae)和网柱菌(D.discoideum)表达的蛋白EF-Tu调理F-actin集簇干扰肌动蛋白聚合；有研究者研究大肠杆菌EF-Tu时发现，其可以作为一种新的病原相关的分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs)分子，以多蛋白复合物形式运输到胞外，而被宿主识别。
EF-Tu蛋白自身也具有较强的免疫原性，在其他多个种属细菌中已有关于其作为鉴别诊断和候选亚单位疫苗的潜力的报道。在羊种布氏杆菌(B.melitensis)M5-90致弱分子机制过程中，发现重组蛋白免疫小鼠可以部分抵抗强毒(B.melitensis M28)攻击，证明EF-Tu具有免疫原性。研究者在利用免疫蛋白组学方法研究B.melitensis时，也发现EF-Tu是一种重要免疫识别抗原；显然，EF-Tu在多种细菌中均具有诱导宿主免疫应答的能力，这就提示，EF-Tu蛋白在细菌感染宿主过程中，作为一种重要的免疫原被宿主细胞所识别和捕获，EF-Tu蛋白可能在其致病过程中发挥重要作用。为深入研究EF-Tu蛋白在布氏杆菌感染中的分子机制以及其诊断和预防中的应用，迫切需要研发针对EF-Tu蛋白单克隆抗体。
发明内容
针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用，通过将EF-Tu基因克隆到pET30a载体中构建出原核表达载体中表达携带His标签的EF-Tu蛋白，并用纯化的EF-Tu蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得抗马耳他型布氏杆菌EF-Tu MAb。本发明在筛选时采用原核表达携带GST标签的EF-Tu纯化可溶蛋白来包被ELISA板，这样不仅可以避免筛选到识别His标签蛋白的MAb，而且可溶的GST-EF-Tu蛋白活性更接近天然的布氏杆菌延伸因子Tu蛋白，保证了杂交瘤细胞的特异性。Westem blot结果表明获得的MAb能够与携带GST或His标签的布氏杆菌EF-Tu蛋白抗原反应，而不与GST标签或大肠杆菌菌体蛋白反应，抗体MAb具有强特异性。又通过肽段扫描的手段筛选出该株单抗识别的线性表位，Westem blot结果显示该株单抗特异性识别EF-Tu蛋白107-116肽段，其氨基酸序列为5’-PMPQTREHIL-3’，如SEQ ID NO.22所示。该株单抗识别线性表位的唯一性进一步证明了其特异性；同时该序列短肽可以作为临床检测血清的抗原肽，可以避免交叉反应，进一步提高检测的特异性。
本发明所采用的具体技术方案是：
发明人想要获得EF-Tu蛋白单克隆抗体Mab，就首先需要设计引物以获得EF-Tu基因，发明人设计的引物如下：
上游引物1：5'-TTGGATCCATGGCAAAGAGTAAGTTTGAAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，
下游引物2：5'-TTCTCGAGACTCGATGATCGACGAGACGAT-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
在获得上述引物后，发明人以马耳他型布氏杆菌BM28基因组DNA作为模板进行PCR扩增，获得EF-Tu基因，之后将其克隆至原核表达载体PET30a中表达，纯化，即可得到携带His标签的马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白抗原；
通过上述获得的马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb，所述杂交瘤细胞的制备方法如下：
以所述携带His标签的马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白抗原免疫小鼠，经间接ELISA检测小鼠血清效价，选择高效价小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞株，采用间接ELISA法选择阳性株，经亚克隆筛选后出稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，即得到马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb。其中在筛选时，本发明没有以携带His标签的EF-Tu蛋白作为抗原进行间接ELISA检测杂交瘤培养上清，而是采用纯化的原核表达携带GST标签的EF-Tu可溶蛋白来包被ELISA板，单单针对His标签蛋白的抗体不能与包被抗原反应，这样不仅可以避免筛选到识别His标签蛋白的MAb，而且可溶的GST-EF-Tu蛋白活性更接近天然的布氏杆菌延伸因子Tu蛋白，保证了杂交瘤细胞的特异性。而如果用作为小鼠免疫原的原核表达携带His标签的EF-Tu蛋白来进行下一步的MAb筛选，将不可避免的筛选到特异识别His标签蛋白MAb，这样为获得特异识别EF-Tu蛋白的MAb，还需额外去除识别His标签蛋白克隆；本研究应用GST-EF-Tu蛋白作为筛选蛋白，避免了His标签蛋白的干扰。
针对上述的杂交瘤细胞株，发明人进行了生物保藏，保藏信息如下：
保藏信息
保藏时间：2015年6月30日
保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心CGMCC
保藏编号：CGMCC NO 10952
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
分类命名:抗EF-Tu鼠源骨髓瘤SP20杂交瘤细胞株
除此之外，发明人通过上述方法提供了马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体Mab。
再进一步的，发明人利用上述的马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体Mab，可以用于制备预防、诊断以及治疗布氏杆菌病的抗体药物。
综上所述，本法明提供了一种EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用，通过将EF-Tu基因克隆到PET30a载体中构建出原核表达载体中表达EF-Tu蛋白，并采用纯化的EF-Tu蛋白免疫Balb/c小鼠，获得抗马耳他型布氏杆菌EF-Tu MAb。鉴定结果表明亚型制备的MAb亚型为lgGl，轻链均为K链。Westem blot结果表明获得的MAb能够与携带GST或His标签的布氏杆菌EF-Tu蛋白反应以及布氏杆菌全菌蛋白42KDa处蛋白条带特异反应，而不与GST标签或大肠杆菌菌体蛋白反应，说明该单抗是特异性识别马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白的单克隆抗体。其识别的表位序列5’-PMPQTREHIL-3’进一步证明其抗体的特异性。
附图说明
图1是本发明实施例1中真核表达载体PET30a的构建图谱图；
图2是本发明实施例2中原核表达EF-Tu蛋白SDS-PAGE电泳分析图，
图中泳道1为重组EF-Tu蛋白抗原的分子量，由图2可以看出，重组EF-Tu蛋白抗原分子量约为48KDa，蛋白条带单一，证明蛋白纯化效果较好；
图3为本发明实施例5中EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb的Western-blot鉴定结果图，
图中M为蛋白Marker；1为GST-EF-Tu蛋白；2为GST标签；3为E.coli菌体蛋白；4为EF-Tu-His蛋白；5为Brucella菌体蛋白；由图3可以看出该株单抗能够识别GST-EF-Tu蛋白、EF-Tu-His蛋白和Brucella菌体蛋白，说明该株单抗特异性识别布氏杆菌EF-Tu蛋白；
图4是本发明实施例5中EF-Tu第一次分段筛选结果Western-blot图，
图中M为Protein Marker；1为GST-EF-Tu-1-1protein；2为GST-EF-Tu-1-2protein；3为GST-EF-Tu-1-3protein，
结果显示片段EF-Tu1-1；EF-Tu1-2与EF-Tu单抗有反应原性，说明该株单抗识别的表位位于EF-Tu1-1和EF-Tu1-2的重复区域即EF-Tu(100-199aa)；
图5是本发明实施例5中EF-Tu第二次分段筛选结果Western-blot图，
图中M为Protein Marker；1为GST-EF-Tu-2-1protein；2为GST-EF-Tu-2-2protein，
结果显示片段EF-Tu-2-1与EF-Tu单抗有反应原性，而EF-Tu-2-2与EF-Tu单抗没有有反应原性这说明说明该株单抗识别的表位位于EF-Tu(100-115aa)肽段上；
图6是本发明实施例5中EF-Tu第三次分段筛选结果Western-blot图，
图中M为Protein Marker；1为GST-EF-Tu-3-1protein；2为GST-EF-Tu-3-2protein；3为GST-EF-Tu-3-3protein；4为GST-EF-Tu-3-4protein；5为GST-EF-Tu-3-5protein，
结果显示片段EF-Tu-3-4和EF-Tu-3-4与EF-Tu单抗有反应原性，而EF-Tu-3-1；EF-Tu-3-2；EF-Tu-3-3与EF-Tu单抗没有有反应原性这说明说明该株单抗识别的表位位于EF-Tu(107-116aa)肽段，短肽序列为5’-PMPQTREHIL-3’；
图7是本发明实施例5中EF-Tu表位筛选总分段设计示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1原核表达载体PET30a-EF-Tu的构建
发明人首先设计的引物如下：
上游引物1：5'-TTGGATCCATGGCAAAGAGTAAGTTTGAAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，
下游引物2：5'-TTCTCGAGACTCGATGATCGACGAGACGAT-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
以BM28基因组(GenBank序列号:CP002459.1)为模板，通过下述引物PCR扩增后，得到EF-Tu基因；具体过程如下：
PCR的反应条件为：
反应体系为50μl：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，上下游引物各1μl(10μmol/L)，Blendtaq-plus(Promega公司)0.5μl，BM28基因组DNA模板1μl，灭菌去离子水补充至50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性4min，94℃变性45s，58℃退火40s，72℃延伸60s，28个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的EF-Tu片段。
酶切反应：通过BamHⅠ(Takara公司)和XhoⅠ(Takara公司)双酶切PET30a载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；通过BamHⅠ(Takara公司)和XhoⅠ(Takara公司)双酶切PCR扩增的EF-Tu片段，通过酶切产物回收试剂盒回收EF-Tu片段。
连接反应体系(10μl)：PET30a酶切产物(50ng/μl)1μl，EF-Tu酶切产物5uL(50ng)，5×T4Bufeer2μl，T4DNA连接酶(Promega公司)1uL。加去离子水至终体积为20μl。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的原核表达载体PET30a-EF-Tu。
实施例2马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白抗原的表达及纯化
将实施例1中获得的阳性克隆转入Rosetta/BL21(DE3)，培养基选用卡那抗性LB平板。
挑取单菌落LB液体培养过夜，1:50(v/v)转接入新鲜液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600约等于0.6～0.8时加IPTG至其终浓度为1mM，继续培养4h；
诱导表达4h的细菌培养物4000r/min离心20min，收集细菌，按3mL/g菌体湿重加PBS(pH7.4)重悬，加80μL10mg/mL溶菌酶(索莱宝公司)和8μL 50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，37℃作用0.5h，加去氧胆酸20mg/g菌体湿重，室温至菌液粘稠，加脱氧核糖核酸酶I(碧云天生物技术公司)1mg/mL降解细菌释放出DNA，4000r/min离心20min弃上清，将沉淀用2％NP-40洗涤1次，再用8mol/L尿素裂解，400W超声破碎，于冰浴中打5sec，间歇10sec，至液体透明，离心取上清，经Ni-NTA进行纯化。
纯化过程如下：取500μL Ni-NTA离心去上清加入1mL的细菌裂解物，室温作用30min期间不断振摇，使Ni-NTA充分与表达蛋白结合。用pH6.3的8M尿素洗涤2次，用咪唑(250mmol/L)洗脱2次。收集洗脱液，经12％SDS-PAGE电泳检测纯化结果。
经SDS-PAGE分析，如图2所示，泳道1为重组EF-Tu蛋白抗原的分子量，由图2可以看出，重组EF-Tu蛋白抗原分子量约为48KDa，蛋白条带单一，证明蛋白纯化效果较好。
实施例3动物免疫
将纯化的蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化，腹腔免疫6周龄Balb/c小鼠(100μg/只)，两周后二免，用弗式不完全佐剂乳化蛋白，再经两周后三免，在第三次免疫后1周，尾静脉采集BALB/c小鼠的全血，自然分离血清，应用间接ELISA测定血清中抗体效价(以重组蛋白抗原包被96孔ELISA反应板)，如果血清效价高于1:10000，此时即可取小鼠脾细胞用于下一步的细胞融合试验。加强免疫：为提高抗体的效价，在融合前3d，将重组蛋白抗原溶于PBS缓冲液中，取50ug尾静脉再次免疫BALB/c小鼠。
实施例4 EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb的制备与效价测定
(1)骨髓瘤细胞的准备
取处于对数生长期的SP2/0细胞，用无钙镁离子的PBS缓冲液轻轻吹打使其脱壁，放于灭菌的50ml离心管内，于l000rpm下离心5inin，弃上清后，再次用无钙镁离子的PBS缓冲液轻轻吹打重悬细胞，于l000rpm下离心5min，弃上清后，用RPMI1640无血清培养液重悬细胞沉淀，取细胞进行计数，当细胞总数大于2*107方即可用于细胞融合试验。
(2)饲养细胞的制备
在进行细胞融合的前1天，取未免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球放血处死，放于75％的酒精内浸泡5min，在超净工作台内将小鼠固定好，用灭过菌的眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，用无菌注射器将RPMI 1640无血清培养液注入小鼠腹腔内，反复吹打冲洗小鼠腹腔，并收集小鼠腹腔内含有巨噬细胞的冲洗液。l000rpm离心5inin，弃上清，将收集的小鼠腹腔巨噬细胞悬于配好的HAT选择性培养液中，将浓度调至2*105，取细胞悬液分接种于96孔细胞培养板中，每孔加l00ul的细胞悬液，共铺2块板，将培养板置于37℃下含5vt％CO2的细胞培养箱中培养。一定时间观察细胞生长状态，当生长成单层细胞后可用于细胞融合使用。
(3)脾细胞的制备
取处死的免疫BALB/c小鼠置于75％酒精内，浸泡消毒5niin，在超净工作台内打开小鼠腹腔，无菌状态下摘取免疫小鼠脾脏，将脾脏用200目无菌蹄网碾磨，以PBS缓冲液冲洗后收集脾细胞，通过细胞计数，使稀释的脾细胞浓度与SP2/0骨髓瘤细胞浓度的比值介于4-10:1之间。
(4)细胞融合
将准备好的脾细胞与SP2/0细胞混合于50ml无菌离心管中，以1200rpm离心5min，弃上清后，将沉淀细胞重新悬起。将离心管放入37℃预温的水浴中，轻轻旋动离心管的同时，在1min内匀速缓慢的滴入1ml的50％PEG4000，之后作用1min。然后缓慢加入预热的培养液终止融合，第1min内匀速滴入1ml RPMI1640无血清培养液，在2min内匀速缓慢滴加2mlRPMI1640无血清培养液，之后，在5min内加完10ml RPMI1640无血清培养液，于37℃水浴中静置5min。
(5)选择性培养
将上述制备好的混合细胞悬液，在800rpm下离心l0min，弃上清，之后加入HAT选择培养液，缓慢吸吹细胞沉淀，使融合细胞悬浮混匀。将混合细胞悬液滴加入上述制备的铺有饲养细胞的两块96孔培养板中，每个孔加入l00ul。将96孔培养板再次置于37℃，含5vt％C02的培养箱中培养。期间要按时观察培养板内细胞的生长状态，并及时补换培养液。
(6)阳性克隆的筛选与克隆化
A、克隆的筛选
根据96孔培养板内杂交瘤细胞的生长状态，在融合后的7-10d内，对每孔只有一株细胞的孔进行细胞上清液的检测，应用己制备的携带GST标签的EF-Tu抗原蛋白进行正筛选。检测前3天半换培养液(10天内用HAT选择培养液，10天后用HT选择培养液)。
B、杂交瘤细胞株的亚克隆
筛选出与EF-Tu蛋白反应的克隆，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。通过有限稀释法，对阳性克隆进行亚克隆筛选，在每次亚克隆后的7-l0d，应用上述方法再次筛选，同时要进行抗体检测，对呈单克隆生长、抗体效价高、形态状态良好的培养孔进行扩大培养。对完全分泌EF-Tu特异性抗体，并呈单个克隆生长的细胞，采取移入24孔培养板内进行扩增培养，扩增后再移入25cm2细胞培养瓶中进行扩大培养，在每次扩大培养过程中，都要对细胞培养上清进行抗体检测，以保证杂交瘤细胞的稳定生长，并取出一部分进行液氮冻存。
(7)杂交瘤细胞株的冻存与复苏
存对阳性原始孔的细胞和每次克隆化获得的亚克隆细胞进行及时冻存。冻存时在4℃放置30min，之后于-20℃下放置2h，随后置于-80℃过夜，第二天取出后，置于液氮灌内长期保存，要对阳性杂交瘤细胞进行定期的部分复苏。将阳性细胞于中国普通微生物保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO 10952。
复苏时，小心从液氮灌内取出杂交瘤细胞，迅速投入到37℃水浴锅内，使细胞迅速融化，在l000rpm下离心l0min，弃掉上清，用带有血清的培养液洗2次，之后用正常细胞培养液悬起细胞，转入细胞培养瓶，在37℃、5％CO2的培养箱内培养，并按时观测细胞生长状态与抗体分泌情况。
(8)腹水制备
取10周龄BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，1周后，腹腔注射0.5rnl杂交瘤细胞悬液，轻轻按揉小鼠的腹腔，使小鼠腹腔内的杂交瘤细胞均匀分散于腹内。在1周后观测小鼠产生腹水情况，并观测小鼠的体征和健康状态，当腹水涨到一定界线时，处死小鼠，用注射器将腹水抽出。在3000rpm下离心l 0min，取上清液加50vt％甘油混匀，保存于-20℃下备用。
实施例5EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb识别表位的筛选与鉴定
5.1 EF-Tu基因第一次分段表达筛选
将EF-Tu基因分成三段即EF-Tu1-1(1-199aa)；EF-Tu1-2(100-294aa)；EF-Tu1-3(212-392aa)克隆到PGEX-6P-1载体中进行原核表达，并通过Western-blot筛选反应原性区域。
①第一次分段基因的克隆
设计分段引物：
以PET30a-EF-Tu质粒为模板，通过下述引物PCR扩增后，得到EF-Tu分段基因EF-Tu1-1；EF-Tu1-2；EF-Tu1-3。具体引物如下：
EF-Tu-1-1-F：5'-TTGGATCCATGGCAAAGAGTAAGTTTGAAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
EF-Tu-1-1-R：5'-TTCTCGAGGGTCGGAATGTAGCTGTC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
EF-Tu-1-2-F：5'-TTGGATCCGTGGTTTCGGCTGCTGAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
EF-Tu-1-2-R：5'-TTCTCGAGACCCGGCTTGCAGAGAAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
EF-Tu-1-3-F：5'-TTGGATCCATCGAAGACGTGTTCTC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
EF-Tu-1-3-R：5'-TTCTCGAGTTACTCGATGATCGAC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
PCR的反应条件为：
反应体系为50μl：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，上下游引物各1μl(10μmol/L)，Taq酶(全式金公司)0.5μl，模板(PET30a-EF-Tu)1μl，灭菌去离子水补充至50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的EF-Tu1-1；EF-Tu1-2；EF-Tu1-3片段。
酶切反应：通过BamH Ⅰ(Takara公司)和Xho Ⅰ(Takara公司)双酶切PGEX-6P-1载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；通过BamH Ⅰ(Takara公司)和Xho Ⅰ(Takara公司)双酶切PCR扩增的EF-Tu片段，通过酶切产物回收试剂盒回收EF-Tu片段。
连接反应体系(10μl)：PET30a酶切产物(50ng/μl)1μl，EF-Tu酶切产物5uL(50ng)，连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶(Promega公司)1uL。加去离子水至终体积为20μl。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的原核表达载体PGEX-6P-1-EF-Tu1-1；PGEX-6P-1-EF-Tu1-2；PGEX-6P-1-EF-Tu1-3；
②第一次分段基因的诱导表达
按照实施例2的方法诱导表达EF-Tu1-1；EF-Tu1-2；EF-Tu1-3分段基因。
经SDS-PAGE分析显示EF-Tu1-1；EF-Tu1-2；EF-Tu1-3均获得表达。
③Western-blot筛选阳性区域
a、1ml诱导的菌液(EF-Tu1-1；EF-Tu1-2；EF-Tu1-3)5000rpm离心3min，弃掉上清后用80ul灭菌PBS重悬，取40ul转移到灭菌的1.5ml离心管中。
b、加入10ul 5×SDS-PAGE loading Buffer，沸水中孵育6-10min。
c、将处理好的样品12000rpm离心，取15ul上清跑SDS-PAGE电泳，最后将样品转移到PVDF膜上。
d、经过转移的PVDF膜用5％含脱脂奶粉的TBST4℃封闭过夜，TBST洗涤(3次，5min/次)。
e、本发明制备的马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体，即BD6株(保藏号CGMCCNO 10952)分泌抗体作为一抗，室温孵育1h，TBST洗涤(3次，5min/次)。
f、二抗用HRP标记的羊抗鼠二抗(sigma公司)室温孵育1h，TBST洗涤(3次，5min/次)。
g、Enhanced HRP-DAB显色液(TIANGEN天根科技有限公司)显色。
Western-blot分析结果表明片段EF-Tu1-1；EF-Tu1-2与EF-Tu单抗有反应原性，说明该株单抗识别的表位位于EF-Tu1-1和EF-Tu1-2的重复区域即EF-Tu(100-199aa)，如图4所示。
5.2EF-Tu基因第二次分段表达筛选
将EF-Tu(100-199aa)分成两段即EF-Tu-2-1(100-166aa)；EF-Tu-2-2(114-199aa)；克隆到PGEX-6P-1载体中进行原核表达，并通过Western-blot筛选反应原性区域。
①第二次分段基因的克隆
设计分段引物：
以PET30a-EF-Tu质粒为模板，通过下述引物PCR扩增后，得到EF-Tu分段基因EF-Tu-2-1；EF-Tu-2-2，具体引物如下：
EF-Tu-2-1-F：5'-TTGGATCCGTGGTTTCGGCTGCTGAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；
EF-TU-2-1-R:5'-TTCTCGAG GATGATCGGGATTTCGTCG-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
EF-TU-2-2-F:5'-TTGGATCC CACATTCTGCTTGCCCGT-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；
EF-Tu-2-2-R：5'-TTCTCGAGACCCGGCTTGCAGAGAAC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；
PCR的反应条件为：
反应体系为50μl：
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，上下游引物各1μl(10μmol/L)，Taq酶(全式金)0.5μl，模板(PET30a-EF-Tu质粒)1μl，灭菌去离子水补充至50μl。
PCR扩增程序为：
94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的EF-Tu-2-1；EF-Tu-2-2片段。
酶切反应：通过BamH Ⅰ(Takara公司)和Xho Ⅰ(Takara公司)双酶切PGEX-6P-1载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；通过BamH Ⅰ(Takara公司)和Xho Ⅰ(Takara公司)双酶切PCR扩增的EF-Tu片段，通过酶切产物回收试剂盒回收EF-Tu片段。
连接反应体系(10μl)：PET30a酶切产物(50ng/μl)1μl，EF-Tu酶切产物5uL(50ng)，连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶(Promega公司)1uL。加去离子水至终体积为20μl。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的原核表达载体PGEX-6P-1-EF-Tu-2-1；PGEX-6P-1-EF-Tu-2-2。
②第二次分段基因的诱导表达
按照实施例2的方法诱导表达EF-Tu-2-1；EF-Tu-2-2片段。
经SDS-PAGE分析显示EF-Tu-2-1；EF-Tu-2-2均获得表达。
③Western-blot
通过Western-blot分析鉴定片段EF-Tu-2-1与EF-Tu单抗有反应原性，而EF-Tu-2-2与EF-Tu单抗没有有反应原性这说明说明该株单抗识别的表位位于EF-Tu(100-115aa)肽段上，Western-blot筛选结果如图5所示。
5.3EF-Tu基因第三次分段表达筛选
将EF-Tu(100-115aa)设计8-10个氨基酸的融合短肽，即EF-Tu-3-1(100-107aa)；EF-Tu-3-2(102-110aa)；EF-Tu-3-3(105-113aa)；EF-Tu-3-4(107-116aa)；EF-Tu-3-5(109-118aa)；克隆到PGEX-6P-1载体中进行原核表达，并通过Western-blot筛选反应原性区域。设计分段引物如下：
EF-TU-3-1-F:5'-GATCCGTGGTTTCGGCTGCTGACGGCCCGC-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
EF-TU-3-1-R:5'-TCGAGCGGGCCGTCAGCAGCCGAAACCACG-3'，其核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；
EF-TU-3-2-F:5'-GATCCGACGGCCCGATGCCGCAGACCCGCGAGC-3'，其核苷酸序列如SEQID NO.14所示；
EF-TU-3-2-R:5'-TCGAGCTCGCGGGTCTGCGGCATCGGGCCGTCG-3'，其核苷酸序列如SEQID NO.15所示；
EF-TU-3-3-F:5'-GATCCTCGGCTGCTGACGGCCCGATGCCGCAGC-3'，其核苷酸序列如SEQID NO.16所示；
EF-TU-3-3-R:5'-TCGAGCTGCGGCATCGGGCCGTCAGCAGCCGAG-3'，其核苷酸序列如SEQID NO.17所示；
EF-TU-3-4-F:5'-GATCCCCGCAGACCCGCGAGCACATTCTGCTTGCCC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
EF-TU-3-4-R:5'-TCGAGGGCAAGCAGAATGTGCTCGCGGGTCTGCGGG-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
EF-TU-3-5-F:5'-GATCCCCGATGCCGCAGACCCGCGAGCACATTCTGC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
EF-TU-3-5-R:5'-TCGAGCAGAATGTGCTCGCGGGTCTGCGGCATCGGG-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
①第三次分段基因的克隆
反应条件为：
反应体系为20μl：
上下游引物各1μl(10μmol/L)，灭菌去离子水补充至20μl。
反应程序为：
94℃预变性5min，60℃退火30min，4℃延伸。
酶切反应：通过BamH Ⅰ(Takara公司)和Xho Ⅰ(Takara公司)双酶切PGEX-6P-1载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；
连接反应体系(10μl)：PET30a酶切产物(50ng/μl)1μl，反应产物6μl，连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶(Promega公司)1uL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的原核表达载体PGEX-6P-1-EF-Tu-3-1；PGEX-6P-1-EF-Tu-3-2；PGEX-6P-1-EF-Tu-3-3；PGEX-6P-1-EF-Tu-3-4；PGEX-6P-1-EF-Tu-3-5。
②第三次分段基因的诱导表达
按照实施例2的方法诱导表达EF-Tu-3-1；EF-Tu-3-2；EF-Tu-3-3；EF-Tu-3-4；EF-Tu-3-5片段。
经SDS-PAGE分析显示EF-Tu-3-1；EF-Tu-3-2；EF-Tu-3-3；EF-Tu-3-4；EF-Tu-3-5均获得表达。
③Western-blot筛选
通过Western-blot分析鉴定片段EF-Tu-3-4和EF-Tu-3-4与EF-Tu单抗有反应原性，而EF-Tu-3-1；EF-Tu-3-2；EF-Tu-3-3与EF-Tu单抗没有有反应原性这说明说明该株单抗识别的表位位于EF-Tu(107-116aa)肽段上，Western-blot筛选结果如图6。
相比与现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明制备的抗体MAb对EF-Tu蛋白抗原更接近天然的布氏杆菌延伸因子Tu蛋白，具有良好的特异性。
实施例6ELISA检测牛、羊血清中抗体
6.1融合表位肽的制备
①融合表位肽的诱导表达
将构建好的PGEX-6P-1-EF-Tu-3-4质粒转入BL21感受态中按照实例2中的方法进行诱导表达。
②融合短肽(GST-PMPQTREHIL)的纯化
a将诱导表达的菌液4000r离心10分钟，弃掉上清培养基，用灭菌PBS洗涤2次，沉淀用适量的PBS重悬。
b重悬菌液200w功率超声5-10分钟至菌体破裂，12000r，4℃离心30分钟取上清。
c按照GST标签纯化柱说明书进行纯化。
③蛋白浓度的测定
稀释标准品做标准曲线，根据方程求出纯化的1管和2管的蛋白浓度分别为0.2435mg/mL和0.8590mg/mL
6.2间接ELISA检测已知牛、羊血清中的抗体
①将纯化的GST-PMPQTREHIL蛋白稀释到200ng/ul，每孔用100ul的稀释液包被ELISA板。
②已知阳性血清60份(羊血清35份、牛血清25份)和阴性血清40份(羊血清20份、牛血清20份)，进行ELISA实验，同时做阴性对照(PBS)和阳性对照(实验室制备的目标单克隆抗体Mab)。
结果显示其检出率与已知完全相符，说明该线性表位可以作为体外检测布氏杆菌抗体的抗原，并且有很高的灵敏度和特异性。
实施例7 Dot-blot检测羊血清中抗原
将EF-Tu蛋白单克隆抗体Mab调整浓度为5ng/ul，在硝酸纤维膜上，每个点滴加1ul，4℃然后10％脱脂牛奶PBS溶液封闭过夜。
将已知阳性和阴性的羊血清分别与实施例6纯化获得的GST-PMPQTREHIL蛋白共孵育30min，然后与硝酸纤维膜斑点进行斑点免疫杂交。以PBS作为空白对照。之后用HRP标记抗GST二抗室温作用30min。再用DAP显色。
样品阳性血清含有抗EF-Tu抗体，从而与GST-PMPQTREHIL蛋白的5'-PMPQTREHIL-3'表位结合，孵育液中没有游离GST-PMPQTREHIL蛋白与硝酸纤维膜上的抗EF-Tu单抗斑点蛋白结合，通过PBS洗涤，硝酸纤维素斑点不存在GST蛋白，从而斑点杂交反应为阴性，判断结果为阳性样品。反之，阴性血清中GST-PMPQTREHIL蛋白处于游离状态，可与抗EF-Tu单抗斑点蛋白杂交，斑点杂交显色的阳性反应，从而判断结果为样品阴性。
取实验室保存羊阳性和阴性血清各20份，做Dot-blot实验，结果，20份阳性血清反应点不显色，20份阴性血清显色，呈清晰棕色斑点，阳性、阴性符合率100％。
Claims (2)
1.一种马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb，其特征在于：其是由保藏编号为CGMCC NO 10952的杂交瘤细胞分泌的；该抗体特异性识别EF-Tu蛋白107-116肽段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
2.权利要求1所述马耳他型布氏杆菌EF-Tu蛋白单克隆抗体Mab在用于制备预防、诊断以及治疗布氏杆菌病的抗体药物上的应用。
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