CN112979797B - 一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。其包括单克隆抗体2D3、5F10，其中，所述单克隆抗体2D3包括重链如SEQ IDNO：1所示序列和轻链如SEQ ID NO：2所示序列；所述单克隆抗体5F10包括重链如SEQ ID NO：5所示序列和轻链如SEQ ID NO：6所示序列。本发明制备的单克隆抗体2D3单抗仅特异性识别AKAV‑N蛋白，5F10、1F4和5D4单抗可同时与AKAV‑N和SBV‑N蛋白反应，这为AKAV‑N蛋白的相关研究以及牛羊赤羽病的治疗提供支持，同时还能为抗牛羊赤羽病的药物研发提供理论基础。

Description

一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
赤羽病(Akabane，AKA)是由赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)感染牛、山羊和绵羊等反刍动物，导致成年牛羊繁殖异常(早产、流产和死胎等)和新生牛羊先天性畸形及积水性无脑的一种虫媒传染病。该病主要通过库蠓类吸血昆虫叮咬传播，孕期牛羊感染后可传播给腹中胎儿。因此，具有季节性和地区性。研究报道AKA在美洲、非洲、中东、澳大利亚及亚洲东部的热带和亚热带地区广泛分布。近年来，我国有关AKA的血清中和试验数据显示，羊和牛AKA阳性率分别为12％和21.3％，而牦牛阳性率为0。可见AKA对我国和世界其他国家牛羊繁育和畜牧养殖造成了一定影响和经济损失。
AKAV是布尼亚病毒科、正布尼亚病毒属、辛布血清群成员之一。同属辛布血清群的病毒还有SBV、Aino、Peaton和Shuni病毒等。同其他布尼亚病毒一样，AKAV基因组是分节段的单股负链RNA，根据节段大小分为L(large)、M(medium)和S(small)三个片段，编码4种结构蛋白和2种非结构蛋白。其中，L片段约7kb，编码RNA依赖RNA聚合酶，参与调控病毒基因组复制和转录；M片段大小约4.3kb，编码糖蛋白Gn和Gc及非结构NSm蛋白，糖蛋白具有型特异性，参与病毒附着和细胞融合，能够分别诱导血凝抑制抗体和中和抗体产生；S片段约0.86kb，保守性强，编码N蛋白和非结构NSs蛋白，二者开放阅读框有重叠，但启动子不同。前人研究表明，N蛋白呈四聚体结构,分子量为25kD,包含3个抗原表位，能够诱导产生抗体，具有群特异性，是正布尼亚病毒中最为保守的蛋白，其诱导动物产生的抗体具有诊断意义，除此之外，还能够衣壳化病毒RNA，影响病毒基因组转录和复制。目前已建立的AKAV检测方法有中和实验、酶联免疫吸附试验、RT-PCR技术、RT-LAMP试验、琼脂凝胶扩散试验和胶体金试纸条检测方法等，但关于该病有效的治疗技术还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用，该单克隆抗体识别AKAV-N蛋白，能够为AKAV-N蛋白的相关研究以及牛羊赤羽病的治疗提供支持。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种抗赤羽病病毒单克隆抗体，其包括单克隆抗体2D3、5F10，其中，所述单克隆抗体2D3包括重链如SEQ ID NO：1所示序列和轻链如SEQ ID NO：2所示序列；
所述单克隆抗体5F10包括重链如SEQ ID NO：5所示序列和轻链如SEQ ID NO：6所示序列。
优选的是，所述单克隆抗体2D3还包括：对SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示序列进行化学修饰或酶修饰且具有抗赤羽病病毒活性的由如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示序列衍生的序列。
优选的是，所述单克隆抗体5F10还包括：或者为对SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示序列进行化学修饰或酶修饰且具有抗赤羽病病毒活性的由如SEQ ID NO：5和/或SEQID NO：6所示序列衍生的序列。
进一步地，编码SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的基因序列分别为如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，或为SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示基因序列经过取代、缺失或插入一个或多个碱基突变的基因序列，且突变的基因序列和原序列具有90％以上的同源性。
编码SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的基因序列分别为如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示，或为SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8所示基因序列经过取代、缺失或插入一个或多个碱基突变的基因序列，且突变的基因序列和原序列具有90％以上的同源性。
本发明还提供一种诊断剂，包含以所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体作为有效成分。
本发明还提供一种治疗剂，包含以所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体作为有效成分。
本发明还提供一种所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗动物赤羽病。
本发明还提供一种所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体的制备方法，包括获取重组赤羽病病毒核衣壳蛋白，并将所得重组赤羽病病毒核衣壳蛋白免疫动物获取单克隆抗体的步骤。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用原核表达系统对AKAV-N蛋白进行大量表达，并对其进行纯化，用来免疫小鼠制备特异性单克隆抗体。将免疫小鼠脾细胞同SP2/0细胞融合及经过ELISA和IFA方法共同筛选，最终获得4株阳性细胞株，分别将它们命名为2D3、5F10、1F4和5D4，然后分别将4株阳性细胞株的培养上清作为一抗进行WB和IFA试验以验证抗体特异性，IFA试验结果显示了2D3、1F4和5D4可以识别感染BHK-21细胞的AKAV活毒，而5F10却未能识别。WB结果显示2D3上清只与AKAV-N蛋白反应，而5F10、1F4和5D4上清即可以识别AKAV-N蛋白又可以识别SBV-N蛋白，但均不与带HIS标签的PRV-EP0蛋白反应。说明本发明制备的2D3抗体为特异性抗体，5F10、1F4和5D4抗体为通用抗体且与HIS标签无关。因此，本发明所制备的特异性单克隆抗体2D3为AKAV-N蛋白的相关研究和赤羽病的治疗提供了技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为AKAV-N基因扩增结果；其中，A：AKAV-N基因PCR扩增产物凝胶电泳结果M：DNA分子量标准；B：AKAV-N基因序列；
图2为AKAV-N蛋白表达鉴定及纯化结果；其中，A：AKAV-N蛋白表达SDS-PAGE电泳检测结果；M，预染蛋白分子质量标准；1，16℃蛋白表达上清；2，16℃蛋白表达沉淀；3，25℃蛋白表达上清；4，25℃蛋白表达沉淀；5，37℃蛋白表达上清；6，37℃蛋白表达沉淀；7，pET-28a空载对照；B：AKAV-N蛋白表达WB检测结果；1，pET-28a空载对照；2，16℃蛋白表达上清；3，16℃蛋白表达沉淀；4，25℃蛋白表达上清；5，25℃蛋白表达沉淀；6，37℃蛋白表达上清；7，37℃蛋白表达沉淀；C：AKAV-N蛋白纯化SDS-PAGE电泳检测结果；M，预染蛋白分子质量标准；1，蛋白纯化前；2，蛋白纯化后；3，pET-28a空载对照；
图3为WB鉴定单克隆抗体结果；其中，1：AKAV-N蛋白；2：SBV-N蛋白；3：PRV-EP0蛋白；
图4为IFA鉴定单克隆抗体结果。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例
一、材料与方法
1、实验材料
6-8周龄Balb/c雌性小白鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司；幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney，BHK-21)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0cell)保存于中国检科院动物检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所；DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞、质粒pESAY-blunt、pET-28a和质粒提取试剂盒购于全式金；限制性内切酶XhoⅠ、BamHⅠ购于NEB公司；胶回收试剂盒购于Axygen。
2、AKAV-N蛋白制备
2.1 AKAV-N基因克隆及载体构建
从Genbank中获得AKAV-N基因序列与实验室质粒比对一致后设计如下引物：
F：CGGGATCCATGGCAAATCAATTCATTTTC，
R：CCGCTCGAGTTAGATCTGGATACCAAA；
以实验室AKAV全基因组质粒为模板，利用全式金高保真PCR试剂盒扩增AKAV-N基因，扩增反应体系如表1所示：
表1
Figure BDA0003043411310000041
反应程序如下：预变性95℃，2min；变性95℃，20s，退火55℃，20s，延伸72℃，20s，30个循环；再延伸72℃，5min。
将PCR产物胶回收并连接到pESAY-blunt载体后，转化至DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定和送测序分析确定连接成功的菌落扩大培养并提取pESAY-blunt-AKAV-N重组质粒。将所得重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ酶切并回收，把回收的酶切产物AKAV-N基因连接到相同内切酶剪切的pET-28a载体上，同样转化到DH5α感受态细胞内，经PCR鉴定和测序分析确定连接成功的菌落扩大培养并提取pET-28a-AKAV-N重组质粒。
2.2AKAV-N蛋白表达鉴定及纯化
pET-28a-AKAV-N重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个菌落鉴定获得阳性克隆后扩大培养至指数增长期，加入终浓度0.1mM IPTG，分别在16℃、25℃和37℃摇床中过夜诱导N蛋白表达，离心获得细菌沉淀，用PBS缓冲液重悬细菌沉淀，超声破碎后，收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE和WB进行鉴定。选取合适的蛋白表达条件大量表达蛋白并通过镍柱对蛋白进行纯化。
3、单克隆抗体制备及鉴定
3.1免疫小鼠
取纯化后的N蛋白与弗氏完全佐剂按体积1:1比例混合乳化均匀，在小鼠背部皮下多点注射进行第一次免疫，每只小鼠免疫100μg N蛋白。21天后，再用纯化的N蛋白与弗氏不完全佐剂按体积1:1比例混合乳化均匀，进行第二次免疫，同样每只小鼠皮下注射100μg蛋白。7天后，小鼠断尾采血，用IFA方法检测血清抗体效价。具体操作如下：
将BHK细胞接种到96孔板，待细胞长满孔底时，用含AKAV病毒液的培养基孵育细胞1h后更换新的培养基，继续培养30h左右，弃去培养基用冰乙醇固定20min，PBS溶液洗3次；37℃条件下，小鼠血清孵育细胞1h，PBS溶液洗3次；37℃、避光条件下，荧光二抗孵育细胞1h，PBS溶液洗3次，荧光显微镜下观察结果。与第二次免疫间隔21天，进行第三次免疫，此次免疫不需要佐剂乳化，直接将蛋白注入小鼠腹腔，3天后无菌摘取小鼠脾脏用于细胞融合。
3.2饲养层细胞准备
细胞融合前24h，取两只健康的Balb/c雌性小白鼠，摘掉眼球采血，作为阴性血清对照，拉颈使小鼠死亡，放入75％酒精中浸泡消毒5min后，取出小鼠使其仰卧，用剪子在小鼠腹部皮肤剪开一个小口，然后用镊子钝性撕开皮肤，以避免损伤腹腔完整性，暴露腹膜，用10ml注射器吸取培养基注入小鼠腹腔，反复吹吸几次，期间应防止针头刺破腹腔脏器和注意尽量不将针头取出腹腔，以避免污染培养基，最后吸出培养基加到96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱备用。
3.3细胞融合
取加强免疫的小鼠，摘眼球采血，离心获得血清，作为阳性血清对照，脱颈使小鼠死亡，将其放入75％酒精溶液中浸泡5min消毒，取出小鼠，将其仰卧放在平皿上，用剪子镊子剖开小鼠腹腔，小心取出完整脾脏，用培养基清洗后，放在新的干净的培养皿中，用注射器在脾脏一端扎2-3个孔，在另一端注入培养基吹出脾细胞至脾脏变白。离心该培养基收集脾细胞并计数备用。将脾细胞和SP2/0以5:1-10:1比例均匀混合，离心得细胞沉淀，用不含血清培养基洗一次，再次离心，将培养基吸弃干净，轻轻拨动离心管底使细胞沉淀松动。在37℃条件下，将提前37℃预热的1mL 50％PEG溶液在60s内缓慢转动地加入该离心管后静置90s，进行细胞融合。然后将提前37℃预热的5mLHAT培养基缓慢贴管壁转动地加入管中，终止细胞融合。将融合后的细胞加到前一天铺饲养层细胞的96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养5天后，每孔更换一半培养基为HT培养基，继续培养5天后，完全更换为HT培养基继续培养。
3.4筛选和克隆
等到融合细胞生长至20％～50％时，吸取孔内培养基通过ELISA和IFA方法进行抗体检测以筛选出阳性杂交瘤细胞，并将该细胞接种到24孔细胞培养板继续用HT培养基扩大培养，待细胞增殖到80％左右时再检测一次，若结果依然为阳性则进一步亚克隆细胞。即对阳性杂交瘤细胞稀释计数，尽量将其以每孔1个细胞的数量接种到96孔板，待细胞生长至20％～50％时进行检测，再亚克隆阳性孔细胞，直到所有亚克隆孔均为阳性。
3.5抗体鉴定
WB鉴定：选用原核表达的带HIS标签的重组蛋白AKAV-N、SBV-N和PRV-EP0对单克隆抗体特异性进行鉴定，将SDS-PAGE电泳分离的重组蛋白转到NC膜上，5％脱脂乳室温封闭1h，PBST洗膜3次，5min/次；阳性细胞株培养上清作为一抗室温孵育1h，PBST洗膜3次，5min/次；酶标二抗孵育1h，PBST洗膜3次，5min/次；与显色液反应观察结果。
IFA鉴定：阳性细胞株培养上清作为一抗，其他具体操作见“3.1”。
3.6抗体效价测定
以HIS-AKAV-N融合蛋白1μg/mL作为包被抗原，每孔100μL包被，4℃过夜。
把本发明制备的单克隆抗体做1：1000、1：2000、1：4000、1：6000……稀释，100μL/孔，37℃孵育2h。
取出酶标板TBST洗涤后加入1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育1h。
PBTS洗涤后，TMB底物显色，20min后终止液终止反应，用酶标仪读取450nm波长处的OD值。
二、结果
1、AKAV-N基因扩增结果
如图1A所示，对PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图1A所示，条带单一明亮，大小在750～500bp之间，AKAV-N基因片段为702bp(图1B)，与之相符。说明成功扩增出AKAV-N基因片段。
2、AKAV-N蛋白表达鉴定及纯化
SDS-PAGE电泳和WB方法鉴定N蛋白表达情况，结果如图2A和B所示，上清和沉淀在约28kDa处均有明显条带。
利用镍柱对16℃表达上清进行纯化，结果如图2C所示，纯化后N蛋白浓度达到95％以上，几乎没有杂蛋白。分装存放于-20℃，用于免疫小鼠。
3、单克隆抗体鉴定结果
3.1单克隆抗体筛选和亚型鉴定
细胞融合成功后经过三次亚克隆，同时利用ELISA和IFA方法对上清进行检测，筛选出四株阳性细胞株2D3、5F10、1F4和5D4。用试剂盒分别对四株阳性细胞株分泌的抗体亚型进行测定，结果显示2D3抗体为IgG2a/к型，5F10抗体为IgG1/к型，1F4抗体为IgG1/λ型，5D4抗体为IgG1/к型。
3.2 WB鉴定抗体
选用原核表达的带HIS标签的重组蛋白AKAV-N、SBV-N和PRV-EP0对单克隆抗体特异性进行鉴定，结果如图3所示，2D3单抗仅特异性识别AKAV-N蛋白，5F10、1F4和5D4单抗可同时与AKAV-N和SBV-N蛋白反应，四种单抗均不与PRV-EP0反应。
3.3 IFA鉴定抗体
将上清作为一抗与感染AKAV的BHK-21细胞进行IFA鉴定，结果如图4所示，2D3、1F4和5D4单抗均显示阳性结果，而5F10与阴性对照一致未显示阳性信号。
3.4单克隆抗体的效价
测试结果显示，本发明的单克隆抗体2D3的效价为1:128000；
单克隆抗体5F10的效价为1：61400。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Ile Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Lys Thr Glu Leu Val Arg
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Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
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Lys Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
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Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Tyr Ser Arg Gly Trp His Leu Glu Asn Leu Glu Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu
145
<210> 2
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
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Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser
145
<210> 3
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaatgca gctgggttat tctcttcctg atggcagtgg ttataggaat caattcagag 60
gttcagctgc agcagtctaa gacagagctt gtgaggtcag gggcctcagt caagttgtcc 120
tgcacagcct ctggcttcaa cattaaagac tactttattc actgggtgaa gcagaggcct 180
gaacagggcc tggagtggat tggatggatt gatcctgaga atggtgatac tgaatatgcc 240
ccgaagttcc agggcaaggc cactatgact gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300
cagctcggca gcctgacctc tgaggacact gccgtctatt attgttattc gaggggatgg 360
cacctcgaga accttgaata ttggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 420
acaacagccc catccgttta tccattg 447
<210> 4
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180
ctgcagaaac ctggccagtc tccaaaactc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttcctcgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagt 438
<210> 5
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Trp Ser Trp Val Ile Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Asn Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Asn Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Gly His Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Ile Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
130 135 140
Leu
145
<210> 6
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg
1 5 10 15
Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser
20 25 30
Ile Thr Phe Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Glu Leu Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser
145
<210> 7
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaaatgga gctgggttat cctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60
gttcagctga agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120
tgcaaggcta ctggctacac attcagtagt aactggatag agtggataaa gcagaggcct 180
ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa atggtagtag ttattacaat 240
gagaagttcc agggcaaggc cacaatcact gcagatgcat cctccaacac agcctacata 300
caactcaaca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag acccgatggt 360
cacggggact ggggccaagg caccactctc atagtctcct cagccaaaac gacaccccca 420
tccgtctatc cactg 435
<210> 8
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgatgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ttagtgctct ggattcggga aaccaacggt 60
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcgatta cctttggcca accagcctcc 120
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 180
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct ctctggtgtc tgaactggac 240
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 300
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcca 360
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacggg ctgatgctgc accaactgta 420
tccatcttcc caccatccag t 441

Claims (5)

1.一种抗赤羽病病毒单克隆抗体，其特征在于，其包括单克隆抗体2D3、5F10，其中，所述单克隆抗体2D3包括重链如SEQ ID NO：1所示序列和轻链如SEQ ID NO：2所示序列；
所述单克隆抗体5F10包括重链如SEQ ID NO：5所示序列和轻链如SEQ ID NO：6所示序列。
2.如权利要求1所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体2D3还包括：对SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示序列进行化学修饰或酶修饰且具有抗赤羽病病毒活性的由如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示序列衍生的序列。
3.如权利要求1所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体5F10还包括：对SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示序列进行化学修饰或酶修饰且具有抗赤羽病病毒活性的由如SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示序列衍生的序列。
4.一种诊断剂，其特征在于，包含以权利要求1中所述的抗赤羽病病毒单克隆抗体2D3作为有效成分。
5.一种抗赤羽病病毒单克隆抗体在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于诊断动物赤羽病，所述单克隆抗体为单克隆抗体2D3，所述单克隆抗体2D3包括重链如SEQ IDNO：1所示序列和轻链如SEQ ID NO：2所示序列。
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