CN106434568A - 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106434568A
CN106434568A CN201610828630.7A CN201610828630A CN106434568A CN 106434568 A CN106434568 A CN 106434568A CN 201610828630 A CN201610828630 A CN 201610828630A CN 106434568 A CN106434568 A CN 106434568A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
mouse
hybridoma
monoclonal antibody
hybridoma cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610828630.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106434568B (zh
Inventor
陈瑞爱
王亚欣
赵大伟
唐满华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co Ltd
South China Agricultural University
Original Assignee
Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co Ltd
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co Ltd, South China Agricultural University filed Critical Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610828630.7A priority Critical patent/CN106434568B/zh
Publication of CN106434568A publication Critical patent/CN106434568A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106434568B publication Critical patent/CN106434568B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201660。本发明通过生物技术手段制备的抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株7D3F11，为检测PEDV的感染建立了基础。

Description

一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）首次报道于英国，随后比利时，德国，加拿大，日本，瑞士等多个国家相继报道，我国于1976年发现此病并陆续报道。猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的，以猪呕吐，严重腹泻脱水为主要临床症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100%，死亡率高达95%以上。
PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段的单股正链RNA,基因组全长约28033bp，编码的结构蛋白主要有纤突(spike)蛋白(即S蛋白)，囊膜（Membrane）蛋白（即M蛋白），核衣壳（nucleocapsid）蛋白(即N蛋白)。其中S蛋白由1383个氨基酸组成,分子质量为180～220ku,是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白,在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞,在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用。目前,孙东波等通过对克隆的S基因序列进行分析,并与部分冠状病毒S蛋白抗原表位区进行比对,预测到S蛋白的一个抗原表位区(83～276 aa),同时通过构建原核表达载体证明预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。
近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，危害比较严重，给养猪业带来巨大经济损失，已成为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染病之一。由于PED与其他腹泻性传染病尤其是TGE在流行病学，临床症状和病理剖检等变化上难以区分。目前，我国PEDV的诊断主要还是依赖于常规实验室诊断，其操作过程复杂，耗时，并且需要昂贵的仪器，因此，针对PEDV敏感性强、特异性高并能应用于基层临床的快速诊断方法的建立是十分必要的。S蛋白为PEDV的主要结构蛋白，对介导中和抗体的产生起重要作用，同时也是病毒刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白，是研制新型诊断试剂的重要前提。ELISA法是目前应用比较广泛的检测方法之一，其具有简单易操作等特点但是耗时较长，胶体金免疫层析技术作为一种新的简单快速准确直观的检测方法正在为大家所熟知，结合单克隆抗体技术又具有良好的特异性和敏感性。
用杂交瘤细胞生产单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb）是近年来在免疫学和分子生物学领域中显著成就之一，自1975年报道了淋巴细胞杂交瘤技术依赖，其理论和试用研究取得了惊人的进展。McAb纯度高，专一性强、重复性好且能在动物体外或体内产生同质性抗体，较常规的免疫学方法优越，为标准化提供了机会。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201660，保藏日期：2016年4月21日。
本发明还提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上所述的杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生。
本发明所述的单克隆抗体，其中，在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
本发明所述的单克隆抗体，其中，是由以下方法制备而获得的：
（1）免疫小鼠
取6-8周龄BALB/c小鼠用纯化的PEDV S蛋白（636-789aa片段）加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠50ug；2周后用弗氏不完全佐剂乳化，剂量同前，经皮下多点注射加强免疫2次；2周后腹腔注射，剂量同前；从免疫后3周开始进行小鼠断尾采血测抗体效价（ELISA），四免10天后选择ELISA效价最高的小鼠准备融合，融合前3天加强免疫1次；
（2）ELISA方法建立
以纯化的PEDV S蛋白（636-789aa片段）为包被抗原，HRP标记羊抗鼠为二抗，建立PEDV S蛋白间接ELISA方法；
（3）细胞融合
（3.1）饲养细胞的准备
取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；
（3.2）致敏脾细胞的准备
将免疫后的小鼠处死后置于75%酒精浸泡10min；无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；放置在不锈钢网上，用注射器加DMEM培养液助推器轻轻研磨脾脏，获细胞悬液；将细胞悬液转移至12ml离心管中，1000rpm，10min，备用；
（3.3）融合细胞
按常规方法融合，取预先准备好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和免疫鼠脾细胞以（5-10）：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基；轻轻使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热，然后取1ml 40℃预热的50%PEG3500作为融合剂，缓慢滴加至细胞混合物中，时间控制在1min内，静置融合2min,然后用无血清的DMEM培养基终止融合，经1500rpm，5min，沉淀用HAT培养基重悬，分别接种于96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，3天后观察细胞融合情况，适当换液，融合14d后，取细胞培养上清液以备检测；
（4）杂交瘤细胞的筛选
按照此前所建立的间接ELISA方法检测细胞培养上清液，筛选阳 性细胞克隆株，阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为SP2/0细胞培养上清液，杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗使用HRP标记的羊抗鼠IgG；
使用间接免疫荧光法对细胞上清进行进一步的检测：将ELISA检测阳性的10株杂交瘤细胞的上清进行间接免疫荧光法的筛选，即筛选能够识别PEDV病毒表达立体构象的单抗；杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG，置于荧光倒置显微镜观察结果；结果显示只有一株杂交瘤细胞株的细胞上清可以检测到PEDV在Vero细胞上的感染，即7D3F11杂交瘤细胞株；
（5）有限稀释法克隆杂交瘤细胞
通过有限稀释方法（limited dilution method）来进行克隆；将细胞接种至96孔板并培养，随后对包含1个集落的孔的培养物上清液进行ELISA检测筛选，筛选阳性细胞克隆，反复进行有限稀释，直到筛选到杂交瘤细胞株7D3F11，并进行扩大培养及冻存；
（6）单克隆抗体的制备
分别将BALB/C小鼠腹腔注射完全弗氏佐剂，注射剂量0.5ml/只，2周后，分别将5株杂交瘤细胞株7D3F11按106个/只的剂量注射到小鼠腹腔内，每天观察小鼠腹部的变化，待腹部膨大后，用注射器采集腹水，收获的腹水经3000rpm离心10min后，收集上清液，即得单克隆抗体。
本发明所述的单克隆抗体，其中，步骤（2）ELISA方法的建立 如下：经方阵试验测到PEDV重组S蛋白抗原包被浓度为5ug/孔，酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1：2000，培养上清的作用时间为1h，底物显色时间为20min。
本发明所述的单克隆抗体，其中，步骤（3.1）的取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，具体操作如下：将正常的BALB/c小鼠处死后置于75%酒精浸泡10min；将小鼠固定于解剖台上，手术剪在小鼠腹部皮肤开一个小口，用镊子慢慢剥离皮肤，露出腹腔；在细胞培养皿中倒入40ml双抗HAT培养液，使用10ml注射器将5mL培养液注入小腹腔内，小心反复洗涤并抽取腹腔液体；充分收集腹腔洗液后，分装至3块96孔板中，100μl/孔，37℃CO2培养箱中培养。
实施本发明的抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，具有以下有益效果：
（1）本发明通过生物技术手段制备的抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株7D3F11，为检测PEDV的感染建立了基础；
（2）本发明为能更好的对PED进行疾病监测奠定了基础,利用本发明制备的杂交瘤细胞株7D3F11可以生产抗猪流行性腹泻病毒S蛋白的单克隆抗体,进而建立抗原诊断的ELISA监测方法，制备快诊膜等,为建立快速监测病毒抗原的诊断方法奠定物质基础。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是为由杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生的单克隆抗体的Western-blot结果；
其中，M为Protein Ladde；另一泳道为S蛋白片段，显示由杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生的单克隆抗体可以检测到该目的片段；
图2是杂交瘤细胞7D3F11上清液与PEDV感染细胞的间接免疫荧光图；
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株
一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201660，保藏日期：2016年4月21日。
实施例2由杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生的单克隆抗体
所述的单克隆抗体，是由以下方法制备而获得的：
（1）免疫小鼠
取6-8周龄BALB/c小鼠用纯化的PEDV S蛋白加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠50ug；2周后用弗氏不完全佐剂乳化，剂量同前，经皮下多点注射加强免疫2次；2周后腹腔注射，剂量同前；从免疫后3周开始进行小鼠断尾采血测抗体效价（ELISA），四免10天后选择ELISA效价最高的小鼠准备融合，融合前3天加强免疫1次；
（2）ELISA方法建立
以纯化的PEDV S蛋白为包被抗原，HRP标记羊抗鼠为二抗，建立PEDV S蛋白间接ELISA方法；经方阵试验测到PEDV重组S蛋白抗原包被浓度为5ug/孔，酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1：2000，培养上清的作用时间为1h，底物显色时间为20min。
（3）细胞融合
（3.1）饲养细胞的准备
取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。操作如下：将正常的BALB/c小鼠处死后置于75%酒精浸泡10min。将小鼠固定于解剖台上，手术剪在小鼠腹部皮肤开一个小口，用镊子慢慢剥离皮肤（注意：不能弄破腹膜），露出腹腔。在细胞培养皿中倒入40ml双抗HAT培养液，使用10ml注射器将5mL培养液注入小腹腔内，小心反复洗涤并抽取腹腔液体。充分收集腹腔洗液后，分装至3块96孔板中，100μl/孔，37℃CO2培养箱中培养。
（3.2）致敏脾细胞的准备
将免疫后的小鼠处死后置于75%酒精浸泡10min；无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；放置在不锈钢网上，用注射器加DMEM培养液助推器轻轻研磨脾脏，获细胞悬液；将细胞悬液转移至12ml离心管中，1000rpm，10min，备用；
（3.3）融合细胞
按常规方法融合，取预先准备好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和免疫鼠脾细胞以（5-10）：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀， 1500rpm离心5min，去除培养基；轻轻使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热，然后取1ml 40℃预热的50%PEG3500作为融合剂，缓慢滴加至细胞混合物中，时间控制在1min内，静置融合2min,然后用无血清的DMEM培养基终止融合（先加入5ml,再加入10ml,最后加至50ml），经1500rpm，5min，沉淀用HAT培养基重悬，分别接种于96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，3天后观察细胞融合情况，适当换液，融合14d后，取细胞培养上清液以备检测；
（4）间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞
将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫鼠脾细胞融合后，共接种了192孔，8-9d后有84孔有杂交瘤细胞生长，融合率为43.7%。用间接ELISA检测，即按照此前所建立的间接ELISA方法检测细胞培养上清液，筛选阳性细胞克隆株，阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为SP2/0细胞培养上清液，杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗使用HRP标记的羊抗鼠IgG。
（5）间接免疫荧光法再次筛选杂交瘤细胞株：
将ELISA检测阳性的10株杂交瘤细胞的上清进行间接免疫荧光法的筛选，即筛选能够识别PEDV病毒表达立体构象的单抗，后续可以用于PEDV毒株分离及PEDV体外感染的鉴定。具体操作为：将PEDVCV777株接种于48孔板vero细胞，当细胞出现病变后，将上清液收走；用PBS清洗，弃去；加入4%的多聚甲醛，室温下静置10min；用 PBS洗两次，后弃去；用0.2%的TritonX-100透化固定后的细胞,室温2min。再用PBS洗4次。风箱烘干，倒置于-20度备用。小鼠腹水为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，检测vero细胞中CV777的感染：杂交瘤细胞培养上清液加入到细胞孔中，0.1ml/孔，37℃温箱避光放置1h,PBST洗涤5次，2min/次；然后加入FITC标记的羊抗鼠IgG,按1：2000稀释后加入到细胞孔中，0.1ml/孔，37℃温箱避光放置1h,PBST洗涤5次，2min/次，置于荧光倒置显微镜观察结果。
结果显示只有一株杂交瘤细胞株的细胞上清可以检测到PEDV在Vero细胞上的感染，即7D3F11杂交瘤细胞株。
（6）有限稀释法克隆杂交瘤细胞
通过有限稀释方法（limited dilution method）来进行克隆；将杂交瘤细胞7D3F11接种至96孔板并培养，随后对包含1个集落的孔的培养物上清液进行ELISA检测筛选，筛选阳性细胞克隆，采用有限稀释法进行亚克隆，杂交瘤细胞进行连续多次稀释和单克隆抗体测试，并且最后3次抗体测试，全部阳性率空穴达100%，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D3F11，并进行扩大培养及冻存；
（7）杂交瘤细胞稳定性测定
分泌阳性抗体的杂交瘤细胞连续传代25代，每隔5代进行细胞上清液收集，然后检测阳性抗体。在连续传代过程中冻存和复苏细胞，检测复苏后的细胞是否还分泌阳性抗体。
（8）单克隆抗体的制备及效价测定
分别将BALB/C小鼠腹腔注射完全弗氏佐剂，注射剂量0.5ml/只，2周后，分别将5株杂交瘤细胞株7D3F11按106个/只的剂量注射到小鼠腹腔内，每天观察小鼠腹部的变化，待腹部膨大后，用注射器采集腹水，收获的腹水经3000rpm离心10min后，收集上清液，即得单克隆抗体，经ELISA方法测定其效果后-80℃保存，结果见表1。
表1 ELISA方法测定上清液的效价结果
检测结果表明，由杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生的单克隆抗体间接ELISA腹水效价达2430。
（9）单克隆抗体的初步应用
将收获的腹水利用IFA方法检测其特异性，操作如下：将PEDVCV777株接种于48孔板Vero细胞，感染24h,收获细胞，固定，4℃放置30min后用PBST洗涤3次，将腹水按照1：5000稀释后加入到细胞孔中，0.1ml/孔，37℃温箱避光放置1h,PBST洗涤5次，2min/次；然后加入FITC标记的羊抗鼠IgG,按1：2000稀释后加入到细胞孔中，0.1ml/孔，37℃温箱避光放置1h，PBST洗涤5次，2min/次，置于荧光倒置显微镜观察结果。
（10）单克隆抗体部分特性的鉴定
（10.1）杂交瘤细胞7D3F11上清液与PEDV S蛋白进行的Western-blot，结果见图1；如图1所示，使用上清液可以检测到目的蛋白(约16.4KD)条带。
（10.2）杂交瘤细胞上清液与PEDV感染细胞的间接免疫荧光图，见图2。
如图2所示，本发明的杂交瘤细胞7D3F11制备的单克隆抗体能够在间接免疫荧光实验中检测PEDV毒株CV777株在Vero上的感染，，说明该单克隆抗体并未受病毒构想的限制。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗猪流行性腹泻病毒S蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株7D3F11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201660。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株7D3F11分泌产生。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，是由以下方法制备而获得的：
(1)免疫小鼠
取6-8周龄BALB/c小鼠用纯化的PEDV S蛋白(636-789aa片段)加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠50ug；2周后用弗氏不完全佐剂乳化，剂量同前，经皮下多点注射加强免疫2次；2周后腹腔注射，剂量同前；从免疫后3周开始进行小鼠断尾采血测抗体效价(ELISA)，四免10天后选择ELISA效价最高的小鼠准备融合，融合前3天加强免疫1次；
(2)ELISA方法建立
以纯化的PEDV S蛋白(636-789aa片段)为包被抗原，HRP标记羊抗鼠为二抗，建立PEDVS蛋白间接ELISA方法；
(3)细胞融合
(3.1)饲养细胞的准备
取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；
(3.2)致敏脾细胞的准备
将免疫后的小鼠处死后置于75％酒精浸泡10min；无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；放置在不锈钢网上，用注射器加DMEM培养液助推器轻轻研磨脾脏，获细胞悬液；将细胞悬液转移至12ml离心管中，1000rpm，10min，备用；
(3.3)融合细胞
按常规方法融合，取预先准备好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和免疫鼠脾细胞以(5-10)：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基；轻轻使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热，然后取1ml 40℃预热的50％PEG3500作为融合剂，缓慢滴加至细胞混合物中，时间控制在1min内，静置融合2min,然后用无血清的DMEM培养基终止融合，经1500rpm，5min，沉淀用HAT培养基重悬，分别接种于96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，3天后观察细胞融合情况，适当换液，融合14d后，取细胞培养上清液以备检测；
(4)杂交瘤细胞的筛选
按照此前所建立的间接ELISA方法检测细胞培养上清液，筛选阳性细胞克隆株，阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为SP2/0细胞培养上清液，杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗使用HRP标记的羊抗鼠IgG；使用间接免疫荧光法对细胞上清进行进一步的检测：将ELISA检测阳性的10株杂交瘤细胞的上清进行间接免疫荧光法的筛选，即筛选能够识别PEDV病毒表达立体构象的单抗；杂交瘤细胞培养上清液为一抗，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG，置于荧光倒置显微镜观察结果；结果显示只有一株杂交瘤细胞株的细胞上清可以检测到PEDV在Vero细胞上的感染，即7D3F11杂交瘤细胞株；
(5)有限稀释法克隆杂交瘤细胞
通过有限稀释方法(limited dilution method)来进行克隆；将细胞接种至96孔板并培养，随后对包含1个集落的孔的培养物上清液进行ELISA检测筛选，筛选阳性细胞克隆，反复进行有限稀释，直到筛选得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行扩大培养及冻存。
(6)单克隆抗体的制备
分别将BALB/C小鼠腹腔注射完全弗氏佐剂，注射剂量0.5ml/只，2周后，分别将5株杂交瘤细胞株7D3F11按106个/只的剂量注射到小鼠腹腔内，每天观察小鼠腹部的变化，待腹部膨大后，用注射器采集腹水，收获的腹水经3000rpm离心10min后，收集上清液，即得单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，步骤(2)ELISA方法的建立如下：经方阵试验测到PEDV重组S蛋白抗原包被浓度为5ug/孔，酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1：2000，培养上清的作用时间为1h，底物显色时间为20min。
6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，步骤(3.1)的取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，具体操作如下：将正常的BALB/c小鼠处死后置于75％酒精浸泡10min；将小鼠固定于解剖台上，手术剪在小鼠腹部皮肤开一个小口，用镊子慢慢剥离皮肤，露出腹腔；在细胞培养皿中倒入40ml双抗HAT培养液，使用10ml注射器将5mL培养液注入小腹腔内，小心反复洗涤并抽取腹腔液体；充分收集腹腔洗液后，分装至3块96孔板中，100μl/孔，37℃CO2培养箱中培养。
CN201610828630.7A 2016-09-18 2016-09-18 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用 Active CN106434568B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610828630.7A CN106434568B (zh) 2016-09-18 2016-09-18 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610828630.7A CN106434568B (zh) 2016-09-18 2016-09-18 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106434568A true CN106434568A (zh) 2017-02-22
CN106434568B CN106434568B (zh) 2020-08-04

Family

ID=58169242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610828630.7A Active CN106434568B (zh) 2016-09-18 2016-09-18 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106434568B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611325A (zh) * 2018-04-25 2018-10-02 南方医科大学 一种抗猪流行性腹泻病毒s1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法
CN109734802A (zh) * 2019-03-18 2019-05-10 扬州大学 一种重组猪流行性腹泻病毒n、s蛋白单克隆抗体的制备方法
CN110564696A (zh) * 2019-09-06 2019-12-13 中国农业大学 一种具有pedv中和活性的单克隆抗体
CN112899239A (zh) * 2021-04-08 2021-06-04 河南农业大学 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用
CN115261331A (zh) * 2022-07-07 2022-11-01 河南省农业科学院 一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104155454A (zh) * 2014-08-20 2014-11-19 浙江省农业科学院 一种检测猪流行性腹泻病毒流行毒株抗体的elisa试剂盒
CN104694480A (zh) * 2015-03-25 2015-06-10 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用
CN105440132A (zh) * 2014-08-07 2016-03-30 中国农业科学院上海兽医研究所 抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105440132A (zh) * 2014-08-07 2016-03-30 中国农业科学院上海兽医研究所 抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用
CN104155454A (zh) * 2014-08-20 2014-11-19 浙江省农业科学院 一种检测猪流行性腹泻病毒流行毒株抗体的elisa试剂盒
CN104694480A (zh) * 2015-03-25 2015-06-10 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU QINGSONG ET AL: "Preparation of yolk antibodies against three different antigens of porcine epidemic diarrhea virus", 《JOURNAL OF NORTHWEST A & F UNIVERSITY - NATURAL SCIENCE EDITION》 *
贾文龙: "猪流行性腹泻病毒rS1蛋白亲和肽的筛选与鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
雷喜梅等: "分泌抗猪流行性腹泻病毒中国变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立", 《中国兽医学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611325A (zh) * 2018-04-25 2018-10-02 南方医科大学 一种抗猪流行性腹泻病毒s1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法
CN109734802A (zh) * 2019-03-18 2019-05-10 扬州大学 一种重组猪流行性腹泻病毒n、s蛋白单克隆抗体的制备方法
CN110564696A (zh) * 2019-09-06 2019-12-13 中国农业大学 一种具有pedv中和活性的单克隆抗体
CN112899239A (zh) * 2021-04-08 2021-06-04 河南农业大学 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用
CN112899239B (zh) * 2021-04-08 2024-05-07 河南农业大学 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用
CN115261331A (zh) * 2022-07-07 2022-11-01 河南省农业科学院 一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体及其应用
CN115261331B (zh) * 2022-07-07 2024-05-10 河南省农业科学院 一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106434568B (zh) 2020-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106434568A (zh) 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用
CN106047820B (zh) 大熊猫促卵泡素β亚基单克隆抗体的制备及应用
CN104031144B (zh) 特异结合戊型肝炎病毒3、4型的抗体及其用途
CN104357401B (zh) 可分泌抗ii型登革病毒ns1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用
CN116836270B (zh) 一种抗蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途
CN109187967A (zh) 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法
CN107937352A (zh) 用于检测小反刍兽疫病毒h 蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条
CN107012127B (zh) 抗b型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体、其用途以及分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞
CN106380515A (zh) 稳定分泌抗pedv单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用
CN104761640A (zh) 具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应用
CN107312088A (zh) 猪流行性腹泻病毒特异性SIgA ELISA检测试剂盒及其应用
CN112979797B (zh) 一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用
CN114149497A (zh) 猪细小病毒中和性单克隆抗体及制备方法和应用
CN108752471A (zh) 抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用
CN103923881B (zh) 甲肝病毒单克隆抗体及其应用
CN101671655B (zh) 一种艾滋病毒p24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用
CN102229915B (zh) Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用
CN105296435B (zh) 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的特异性单克隆抗体与应用
CN1557838A (zh) Sars冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤和含此抗体的检测试剂及其用途
CN105968198A (zh) 一种念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体及其制备方法
CN103923882B (zh) 甲肝病毒单克隆抗体及其应用
CN105907724A (zh) 一种脊髓灰质炎ⅱ型病毒单克隆抗体及其应用
CN110484510A (zh) 杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用
CN116462758A (zh) 抗人ptprz1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用
CN113355291B (zh) 抗丝状支原体丝状亚种p0071蛋白的单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant