CN113355291B

CN113355291B - 抗丝状支原体丝状亚种p0071蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113355291B
Application number: CN202110699407.8A
Authority: CN
Inventors: 王秀梅; 辛九庆; 曾金红
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113355291A

Abstract

本发明公开了一种抗丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoide subsp.mycoides,Mmm)P0071蛋白的单克隆抗体及其应用，还公开了分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。所述的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No：22309的杂交瘤细胞株3C4A1分泌产生。实验证明，该杂交瘤细胞株3C4A1分泌的抗体能与Mmm发生抗原抗体反应，而与山羊支原体山羊肺炎亚种、牛鼻支原体、无乳支原体和牛支原体等其他支原体病原不发生反应，具有很高的特异性。本发明的单克隆抗体可用于制备丝状支原体丝状亚种抗原检测和抗体检测试剂盒，也可以用于丝状支原体丝状亚种的免疫学分析，为建立快速准确的牛传染性胸膜肺炎检测和诊断试剂盒开发提供了物质基础。

Description

抗丝状支原体丝状亚种P0071蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗丝状支原体丝状亚种P0071蛋白的单克隆抗体、还涉及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在检测丝状支原体丝状亚种中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

由丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoide subsp.mycoides)引起的牛传染性胸膜肺炎(Contagious Bovine Pleuropneumonia,CBPP)，又称为牛肺疫，是一种对牛危害严重的高度接触性传染病，可通过感染牛和易感牛的直接接触发生传播。因其具有高发病率和死亡率，被OIE列为A类传染病。

CBPP在新疫区常以暴发方式流行，导致高达100％的发病率和近60％的死亡率，之后发病率逐渐降低，转变为隐性或者慢性感染；带菌牛以及病牛是该病的主要传染源。丝状支原体丝状亚种可以通过病牛呼出或咳嗽喷出的飞沫、鼻腔分泌物、粪便和尿液等传播，也可通过病原污染的饲料、饮水等经口传播。成年牛感染后表现为发烧、呼吸窘迫、呼吸困难、咳嗽和鼻分泌物增多等呼吸道症状；而年轻患病犊牛则出现关节肿胀(关节炎)而不表现呼吸道症状。然而，许多呼吸道的细菌和病毒感染会出现类似的呼吸道症状，例如牛支原体、牛结核杆菌、巴氏杆菌和流感病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等。因此，仅从临床特征很难区分不同的病原体与丝状支原体丝状亚种。

CBPP于16～20世纪在世界范围内广泛分布，给全球养牛业造成重大经济损失。本病于1919年上海由澳大利亚引进奶牛时传入我国，在我国流行长达70年之久，给国民经济造成巨大损失。我国通过研制有效的弱毒疫苗及采取严格的防治措施，自1989年后再也没有发现临床病例。因为基础设施薄弱以及经济科技发展迟缓等原因，CBPP目前在我国毗邻的东南亚地区和非洲仍在流行，特别是在热带和亚热带地区(非洲西部，中部，东部，南部和其他非洲部分地区)。在过去的几十年中，非洲东部、南部和西非经历了CBPP的大规模流行。目前，它影响了非洲的27个国家，估计每年造成的损失达20亿美元。

我国已根除CBPP多年，目前尚未发现病例，但因我国牛群已停止疫苗免疫30余年，全部牛群都对CBPP易感。随着国内外经济贸易往来加剧，再加上该病在我国邻国仍在流行，传入我国的风险极高。因此，对CBPP的早期诊断与广泛监测显得尤为重要。感染早期，若能在牛群中及时准确地检测出CBPP病原并采取防控措施，可大大降低CBPP流行和暴发的风险。

目前我国尚没有CBPP病原和抗体检测试剂盒，CBPP的诊断以实验室诊断为主，包括病原分离培养、分子生物学检测及抗体检测等。其中病原分离培养是CBPP鉴别诊断的金标准，但是分离培养困难、周期长，操作需要生物安全四级实验室和一定的专业技术，不能满足临床快速诊断的需要。分子生物学方法存在假阳性或假阴性结果，需要特殊的仪器设备，多用于实验室研究，难以在基层推广应用。酶联免疫吸附法(ELISA)具有简单、快速、高通量等优点，但存在敏感性低、交叉反应强等特点。而特异性强的单克隆抗体，可以克服上述缺陷，是建立快速准确的抗原抗体检测方法必不可少的前提。因此，迫切需要制备一种特异性强的丝状支原体丝状亚种单克隆抗体，研发符合我国CBPP疫情防控需求的检测试剂盒。

发明内容

针对目前CBPP检测方法存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种单克隆抗体，用于CBPP病原丝状支原体丝状亚种的特异性检测。

本发明的目的之二在于提供上述单克隆抗体的应用。

本发明的目的之三在于提供一种能够稳定分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

更进一步地，本发明提供了上述单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株在制备丝状支原体丝状亚种检测或诊断试剂盒中的应用，从而为CBPP的防控提供一种准确的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人在对丝状支原体丝状亚种的0071蛋白(简称P0071蛋白)进行前期研究时，发现该蛋白能够与CBPP阳性血清反应，具有反应原性。进一步的，本发明将制备的重组蛋白rP0071作为免疫原，免疫4～6周龄的SPF级BALB/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定融合细胞上清，筛选获得阳性克隆，通过有限稀释法对阳性细胞孔进行三次亚克隆并进一步筛选，共获得多株能稳定分泌抗rP0071蛋白单克隆抗体的的杂交瘤细胞株。将其中能特异性识别丝状支原体丝状亚种的三株细胞分别命名为杂交瘤细胞株3C4A1、3H2A8和3H2D11，然后制备、纯化和鉴定单克隆抗体，并采用间接ELISA测定杂交瘤细胞的培养上清效价，结果发现3C4A1的效价较高且非常稳定，表明3C4A1细胞状态优于其余两株。

通过Westernblotting鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明，3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体都能与丝状支原体丝状亚种国内分离株和国际标准株发生特异性反应，而丝状支原体丝状亚种仅与3c4a1(杂交瘤细胞株3C4A1分泌的单克隆抗体简称为3c4a1)发生强烈的免疫印迹反应，与其余两株单抗的反应弱，说明3c4a1单克隆抗体能更特异地鉴别丝状支原体丝状亚种。

本发明进一步鉴定了3C4A1的抗体亚型，经鉴定其为IgG1型，轻链为κ链，该单克隆抗体具有丝状支原体丝状亚种特异性，即该单克隆抗体只与丝状支原体丝状亚种抗原反应，而与支原体属其它成员不发生特异性反应。

在上述研究的基础上，本发明提出了一株分泌抗丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoide subsp.mycoides)P0071蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为3C4A1，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No：22309，保藏时间为2021年4月25日。

进一步的，本发明还提出了一种抗丝状支原体丝状亚种P0071蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由以上所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测丝状支原体丝状亚种试剂中的应用以及所述的单克隆抗体在制备牛传染性胸膜肺炎检测试剂盒中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种牛传染性胸膜肺炎检测试剂盒，所述的试剂盒中包含本发明所述的单克隆抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒是检测牛传染性胸膜肺炎病原丝状支原体丝状亚种的酶联免疫检测试剂盒。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明的抗原蛋白P0071是发明人从丝状支原体丝状亚种全菌蛋白中筛选出来的新型免疫原性蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，研究发现该抗原蛋白P0071在丝状支原体丝状亚种中特异且高度保守；

2、本发明使用重组蛋白rP0071作为免疫原制备了抗丝状支原体丝状亚种0071蛋白的单克隆抗体，研究发现本发明制备的rP0071的单克隆抗体与山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)、牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)和牛支原体(M.bovis)等无交叉反应，具有良好的特异性。

3.本发明的rP0071单克隆抗体具有良好的特异性，能有效区分丝状支原体丝状亚种和支原体属其他成员，可广泛应用于丝状支原体丝状亚种的定性定量诊断，在CBPP疫情监测和流行病学调查中均具有较大的应用前景。

附图说明

图1为单克隆抗体3c4a1、3h2a8和3h2d11与MmmBen1株全菌体蛋白的免疫印迹结果；

其中，泳道M：蛋白marker；泳道1：rP0071重组蛋白，泳道2：Mmm Ben1；(A)3c4a1杂交瘤细胞上清；(B)3h2a8杂交瘤细胞上清；(C)3h2d11杂交瘤细胞上清；

图2为Westernblotting鉴定单克隆抗体的特异性；

其中，M：蛋白marker；泳道1：纯化后的rP0071蛋白；泳道2：MmmBen1；泳道3：Mmm牧1；泳道4：Mmm PG1；泳道5：无乳支原体标准株PG2；泳道6：牛支原体标准株PG45；泳道7：牛鼻支原体。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明。

实施例1抗丝状支原体丝状亚种P0071蛋白的单克隆抗体的制备

1.建立间接ELISA测定血清效价

采用碳酸盐法将纯化的rP0071蛋白包被到酶标板上，通过棋盘法确定间接ELISA的最佳抗原抗体工作浓度。4℃过夜包被，3％BSA封闭2h，一抗二抗分别于37℃孵育1h，用0.5％PBST洗板4次，每次3min。

2.单克隆抗体制备

本部分中所有细胞处理过程使用的培养基均为不含血清的RPMI-1640基础培养基，简写为基础培养基；细胞培养时使用添加1％的青/链霉素和15％的胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，简写为完全培养基。

2.1小鼠免疫

将编码P0071蛋白的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET32a中，以原核表达纯化的rP0071重组蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)作为免疫抗原，与弗氏佐剂等体积混合充分乳化，腹腔注射4～6周龄BALB/c小鼠，每只小鼠100ug/次。基础免疫三次，间隔两周。初次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化。三免后一周，尾部静脉采血测血清效价，健康小鼠血清作阴性对照。选择抗体效价高于10^-4的小鼠，在融合前一周腹腔注射2倍剂量纯化的rP0071蛋白。

2.2骨髓瘤细胞的复苏

通常在融合前两周复苏骨髓瘤细胞SP2/0；

从液氮罐中取出冻存的SP2/0骨髓瘤细胞，迅速没入37℃水浴锅中快速晃动至完全融化；无菌操作将融化的细胞与7ml的基础培养基混合均匀，800r/min离心10min，弃掉上清；立即加入完全培养基重悬细胞，转移到细胞瓶，置5％CO2，37℃培养箱中培养，观察细胞的状态，培养至对数生长期进行传代，融合前一夜更换培养液。

2.3细胞融合

2.3.1饲养细胞制备

通常在融合前一天制备饲养细胞。取一只未免疫的BALB/C小鼠，眼球放血，收集血清，即为阴性血清。脱颈处死后浸泡于75％酒精中5～10min；转移到无菌操作台中，用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用5ml注射器注入5ml基础培养基，用镊子轻轻按压腹部，使培养基与腹腔巨噬细胞充分混匀后回抽培养基移入50ml离心管，可重复此步操作2～3次，将吸出液与40ml HAT完全培养基(完全培养基中添加1％的HAT，以下同)充分混匀，每孔100μL铺于96孔细胞培养板中，每只小鼠可铺4块板，铺好的细胞板置于细胞培养箱中培养，次日用于细胞融合。

2.3.2免疫小鼠脾细胞制备

取加强免疫后的小鼠，眼球采血收集血清即为阳性血清，脱颈处死后置于75％酒精中浸泡约5～10min；转移无菌操作台中，用灭菌手术剪刀剪开小鼠腹部皮肤，用镊子拉开皮肤，暴露腹膜，换一套新的灭菌剪刀和镊子，剪开腹膜，使脾脏暴露，再换一套新的灭菌剪刀和镊子，用镊子提起脾脏，取出暴露的脾脏，剪去脾脏周围脂肪和其它组织；用基础培养基冲洗几次，放入无菌培养皿中，置于灭菌铜网上，加入5mL的基础培养基，用2mL注射器活塞研磨至无明显红色组织，加入30ml基础培养基混匀，转入50m L离心管中，1000r/min离心10min弃掉上清，重复再洗涤一遍，收集脾细胞重悬于基础培养基，计数后备用。

2.3.3SP2/0骨髓瘤细胞的制备

弃去SP2/0细胞培养瓶中的细胞上清，用细胞基础培养基将细胞吹洗下来，转入50m L离心管中，1000r/min离心10min弃掉上清，重复洗涤一遍，重悬细胞进行计数。

2.3.4细胞融合

将SP2/0细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例加入到50mL EP管中，混匀后，1000r/min离心5min；用吸管尽量吸净上清，以免影响PEG的浓度，手指轻弹离心管底部使细胞沉淀松散开。将细胞置于37℃的水浴，并于1分钟内加完37℃预热的50％PEG，边加边轻轻搅动以混匀，加完后37℃或置于掌心静置90秒。滴加37℃预热的基础培养基以终止融合，具体操作如下：第一分钟内匀速滴加1mL，第二分钟匀速滴加2mL，第三分钟匀速滴加3mL，第四分钟匀速滴4mL，第五分钟匀速滴加5mL，滴加时边加边轻轻搅动以混匀，继续缓慢添加至40mL。800r/min离心10min，轻弃上清。缓慢加入45mL含20％FBS的HAT完全培养基，轻轻摇匀。将融合后的细胞于每孔100uL加入到提前铺好饲养细胞的96孔板中，置细胞培养箱中培养。融合后4～6天观察细胞，用含20％FBS的HAT完全培养基半换液，继续培养。

2.4阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆

当细胞集落生长至视野的1/5～1/3时，吸取细胞培养上清，采用建立的间接ELISA方法测定抗体效价以筛选阳性杂交瘤细胞，分别用上述空白对照小鼠血清做为阴性对照和免疫小鼠的血清做为阳性对照，测定吸光值，P/N大于2.1的细胞孔判为阳性克隆。将阳性细胞孔的培养液全部吸出，用1mLHT培养基吹打悬浮细胞，转入24孔板(1孔对1孔)培养，培养基变黄时，测细胞上清效价，选P/N大于2.1的阳性孔细胞进行亚克隆。亚克隆使用含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT)的1640完全培养基。采用有限稀释法对抗体效价高的阳性细胞进行进行至少三次亚克隆。具体步骤为：将要克隆的杂交瘤细胞用1mLHT培养基轻轻吹下后计数，将细胞稀释至10～20个细胞/m L，每孔100μL加入96孔板中，置细胞培养箱中培养。培养至第5天补液50μL，第7～10天，当细胞长到视野1/5～1/3时，对有细胞克隆的孔及时进行抗体检测，选择抗体效价高、集落形态好、呈单集落生长的孔，继续第二次亚克隆。连续三次亚克隆，检测细胞培养上清，直至得到与筛选抗原呈阳性，而与阴性对照为阴性的单个细胞克隆，完成杂交瘤细胞的建株过程。选择强阳性且生长良好的单克隆孔细胞移至细胞瓶扩大培养，冻存杂交瘤细胞株和腹水制备。

2.5杂交瘤细胞的冻存与复苏

用基础培养液将扩大培养的杂交瘤细胞轻柔吹打下来混匀，800r/min离心10min弃上清，用提前预冷的细胞冻存液(含90％胎牛血清和10％DMSO)轻柔吹打混匀细胞，每个细胞冻存管内分装1mL，标好名称、日期，把冻存管放到冻存盒中放到-80℃冰箱，次日转入液氮罐中长期保存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2.6细胞复苏

从液氮罐中取出冻存的杂交瘤细胞，快速放入37℃的水浴中摇动，使其解冻。将细胞转移到离心管中并用细胞基础培养基洗涤一次，800r/min离心10min弃上清，加入细胞完全培养基重悬细胞，移入细胞瓶，置细胞培养箱中培养。

2.7单克隆抗体腹水的制备纯化及效价测定

2.7.1腹水的制备及效价的测定：

选取8～10周龄SPF的BLAB/C小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只；1周后，腹腔注射杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵个细胞；接种后10天左右小鼠腹部明显膨大，用采血针收集腹水于离心管中，4℃，2000r/min离心30min，收集中间层透明的液体，-20℃冻存。测定腹水效价后，采用辛酸硫酸铵法纯化于-80℃冻存备用。

采用ELISA法测定腹水效价：将稀释的腹水作为一抗，从1:100开始10倍稀释至1:10¹⁰，以同样方法稀释的骨髓瘤细胞诱生的小鼠腹水作为阴性对照，PBS作为空白对照，测定OD₄₅₀，腹水的效价即为P/N≥2.1时小鼠腹水的最大稀释倍数。测定结果显示3C4A1的小鼠腹水效价可达1:10⁷。

实施例2单克隆抗体的鉴定

1.单抗亚类鉴定

采用Southern Biotech公司生产的抗体类型及亚类鉴定试剂盒SBA ClonotypingSystem-HRP对实施例1制备得到的单克隆抗体进行亚类鉴定，具体步骤参照使用说明。经鉴定3C4A1单克隆抗体亚类为IgG1型，轻链为κ链。

2.单克隆抗体与丝状支原体丝状亚种全菌蛋白的反应性

将在生物安全四级实验室培养和灭活的丝状支原体丝状亚种分离株Ben1(中国农业科学院哈尔滨兽医研究牛肺疫国家参考实验室分离并保存)通过超声破碎提取全菌蛋白，进行SDS-PAGE电泳，经过半干转印到PVDF膜上(25V，30min)，鱼明胶在4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，用杂交瘤细胞株的培养上清作为一抗在室温下作用2小时，用TBST洗膜三次，与1:5000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP孵育1小时，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜三次，ECL显色。

如图1所示，三株杂交瘤细胞3C4A1、3H2A8和3H2D11分泌的单抗3c4a1、3h2a8和3h2d11均可识别Ben1株中约55KD大小的蛋白，与P0071天然蛋白的分子量相符，而rP0071重组蛋白大小为75kd。3C4A1杂交瘤细胞株所分泌单抗3c4a1与全菌蛋白的免疫印迹反应更强。而3h2a8和3h2d11与MmmBen1菌株的反应较弱。

将分泌抗rP0071蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C4A1，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No：22309，保藏时间为2021年4月25日。

3.单抗的特异性检验

3.1支原体菌体蛋白的制备

选取牛呼吸道常见的支原体进行特异性测定，包括山羊支原体山羊肺炎亚种、牛鼻支原体、无乳支原体标准株PG2、牛支原体和丝状支原体丝状亚种分离株(Ben 1和牧1)及其标准株PG1。除Ben1、牧1和PG1在生物安全四级实验室培养、灭活和收集菌体沉淀外，上述其他支原体菌株按1％(v/v)比例接种于100mL支原体液体培养基，37℃培养，培养基变黄后，13000r/min，30min收集菌体沉淀，用PBS重悬洗涤3次，用培养物1/10体积的PBS重悬菌体沉淀，冰浴超声破碎。13000r/min，20min收集上清，即为支原体全菌体蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。定量分装后保存于-70℃。应用Western Blotting检测所制备的单克隆抗体针对不同支原体菌株的特异性。

如图2所示，3c4a1单抗与山羊支原体山羊肺炎亚种、牛鼻支原体、无乳支原体和牛支原体没有反应条带，而与丝状支原体丝状亚种抗原出现大小均一的特异性反应条带，说明获得的单抗能与丝状支原体丝状亚种特异性结合，可有效区分丝状支原体丝状亚种与其他牛支原体相关病原,可用于检测丝状支原体丝状亚种，具有较高的特异性。

本发明单抗在用于抗原含量检测时，可以作为双抗体夹心ELISA检测试剂盒的包被抗体，也可对它进行生物标记或化学标记，作为双抗体夹心ELISA检测试剂盒的夹心酶标抗体；同时也可将它与另一物种的多抗配对使用，通过加入夹心抗体的酶标二抗制备牛丝状支原体丝状亚种抗原含量检测试剂盒。

本发明的单抗用于制备抗体检测试剂盒时，可作为包被抗体或者酶标竞争抗体，也可作为竞争抗体并加入酶标二抗的方法进行检测。

本发明的抗体具有良好的特异性，也可作为一抗用于丝状支原体丝状亚种的免疫学分析。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 抗丝状支原体丝状亚种P0071蛋白的单克隆抗体及其应用

<130> KLPI210253

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> PRT

<213> Mycoplasma mycoide subsp. mycoides

<400> 1

Met Leu Asp Asn Arg Lys Phe Ser Glu Gln Glu Leu Val Arg Arg Asn

1 5 10 15

Lys Tyr Lys Thr Leu Val Glu Gln Asn Lys Asp Pro Tyr Lys Val Thr

20 25 30

Asn Trp Lys Arg Asn Thr Thr Leu Leu Lys Leu Asn Glu Lys Tyr Lys

35 40 45

Asp Tyr Ser Lys Glu Asp Leu Leu Asn Leu Asn Gln Glu Leu Val Val

50 55 60

Val Ala Gly Arg Ile Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Gly Lys Lys Ala Ala

65 70 75 80

Phe Val Asn Ile Asp Asp Gln Asp Ser Ser Ile Gln Leu Tyr Val Arg

85 90 95

Leu Asp Glu Ile Gly Asp Gln Ser Phe Glu Asp Phe Arg Asn Phe Asp

100 105 110

Leu Gly Asp Ile Ile Gly Val Lys Gly Ile Met Met Arg Thr Asp His

115 120 125

Gly Glu Leu Ser Ile Arg Cys Lys Glu Val Val Leu Leu Ser Lys Ala

130 135 140

Leu Arg Pro Leu Pro Asp Lys His Ala Gly Ile Gln Asp Ile Glu Glu

145 150 155 160

Lys Tyr Arg Arg Arg Tyr Val Asp Leu Ile Val Asn His Asp Val Arg

165 170 175

Lys Thr Phe Gln Ala Arg Thr Lys Ile Ile Arg Thr Leu Gln Asn Phe

180 185 190

Leu Asp Asn Lys Gly Tyr Met Glu Val Glu Thr Pro Ile Leu His Ser

195 200 205

Leu Lys Gly Gly Ala Ser Ala Lys Pro Phe Ile Thr His Tyr Asn Val

210 215 220

Leu Asn Thr Asp Val Tyr Leu Arg Ile Ala Thr Glu Leu His Leu Lys

225 230 235 240

Arg Leu Ile Val Gly Gly Phe Glu Gly Val Tyr Glu Ile Gly Arg Ile

245 250 255

Phe Arg Asn Glu Gly Met Ser Thr Arg His Asn Pro Glu Phe Thr Ser

260 265 270

Ile Glu Leu Tyr Val Ala Tyr Glu Asp Met Phe Phe Leu Met Asn Leu

275 280 285

Thr Glu Glu Ile Phe Arg Val Cys Asn Ala Ala Val Asn Ser Asn Ser

290 295 300

Ile Ile Glu Tyr Asn Asn Val Lys Ile Asp Leu Ser Lys Pro Phe Lys

305 310 315 320

Arg Leu His Met Val Asp Gly Ile Lys Gln Val Thr Gly Val Asp Phe

325 330 335

Trp Lys Glu Met Thr Val Gln Gln Ala Leu Glu Leu Ala Lys Lys His

340 345 350

Lys Val His Val Glu Lys His Gln Glu Ser Val Gly His Ile Ile Asn

355 360 365

Leu Phe Tyr Glu Glu Phe Val Glu Ser Thr Ile Val Glu Pro Thr Phe

370 375 380

Val Tyr Gly His Pro Lys Glu Ile Ser Pro Leu Ala Lys Ser Asn Pro

385 390 395 400

Ser Asp Pro Arg Phe Thr Asp Arg Phe Glu Leu Phe Ile Leu Gly Arg

405 410 415

Glu Tyr Ala Asn Ala Phe Ser Glu Leu Asn Asp Pro Ile Asp Gln Tyr

420 425 430

Glu Arg Phe Lys Ala Gln Ile Glu Glu Glu Ser Lys Gly Asn Asp Glu

435 440 445

Ala Asn Asp Met Asp Ile Asp Phe Ile Glu Ala Leu Glu His Ala Met

450 455 460

Pro Pro Thr Ala Gly Ile Gly Ile Gly Ile Asp Arg Leu Val Met Leu

465 470 475 480

Leu Thr Asn Ser Glu Ser Ile Lys Asp Val Leu Leu Phe Pro Gln Met

485 490 495

Lys Pro Arg Glu

500

Claims

1. 分泌抗丝状支原体丝状亚种（Mycoplasma mycoide subsp. mycoides）P0071蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株命名为3C4A1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：22309。

2.抗丝状支原体丝状亚种P0071蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测丝状支原体丝状亚种诊断或抗体检测试剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备牛传染性胸膜肺炎检测试剂盒中的应用。

5.一种牛传染性胸膜肺炎检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含权利要求2所述的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是检测牛传染性胸膜肺炎病原丝状支原体丝状亚种的酶联免疫检测试剂盒。