CN114624452A - 一种抗大熊猫prl单克隆抗体、杂交瘤细胞株及prl酶联免疫检测方法 - Google Patents

一种抗大熊猫prl单克隆抗体、杂交瘤细胞株及prl酶联免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法。该方法以杂交瘤细胞株PRL‑1和/或杂交瘤细胞株PRL‑5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体进行检测；其中，杂交瘤细胞株PRL‑1的保藏编号为CCTCC NO:C202183；杂交瘤细胞株PRL‑5的保藏编号为CCTCCNO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。本发明以制备得到的两种抗大熊猫PRL抗体作为包被抗体和标记抗体，开发了大熊猫尿液催乳素(PRL)酶联免疫检测方法，通过对大熊猫妊娠期尿液催乳素的测定，可监控大熊猫的妊娠状态，科学指导大熊猫繁育生产工作。

Description

一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫 检测方法
技术领域
本发明属于大熊猫催乳素检测方法技术领域，具体涉及一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法。
背景技术
圈养大熊猫经有效配种后即进入妊娠期。圈养大熊猫的妊娠期长短变化很大，从83天到200天不等。关于大熊猫妊娠期的研究尤其是妊娠诊断是一项重要的大熊猫圈养繁育关键技术。多年来，它一直是个难题。人们对大熊猫妊娠机制了解甚少：配种是否有效？大熊猫是否进入妊娠状态？目前还没有办法准确检测，给饲养管理带来一定困难。其中大熊猫胚胎发育存在滞育的现象对妊娠监测造成了巨大的困难。
胚胎滞育是胚胎发育到囊胚阶段后胚胎处于休眠状态，细胞增殖停滞，当内外环境适宜时，才能激活胚胎使其重新开始发育、着床的生理现象。胚胎滞育将交配与生产两个重要的繁殖阶段分离，以确保两者都发生在物种生存最有利的时刻，它被认为是确保动物成功繁殖以及新生儿存活的进化策略之一。目前，已发现130多种动物的胚胎发育过程中存在胚胎滞育的现象，其中已确定包括大熊猫在内的现存已知的8种熊科动物全部都发现胚胎滞育。
催乳素是一种由垂体前叶腺嗜酸细胞分泌的蛋白质激素。主要作用为促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳，还有刺激卵泡促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)受体生成,启动延迟着床等作用。在专性滞育的动物中，光周期通过调节垂体催乳素的分泌来影响胚胎滞育及随后胚胎发育的重新启动。催乳素浓度通过诱导ODC基因(鸟氨酸脱羧酶)的表达对终止水貂胚胎滞育和胚胎发育起着重要作用。ODC蛋白是生产多胺(即腐胺)的速率限制酶，可以诱导水貂胚胎的再活化。在兼性滞育中，如大型有袋类动物，催乳素通过浓度的变化诱导或抑制黄体的发育和分泌。催乳素受体存在于黄体细胞表面，可通过抑制催乳素分泌来终止休眠状态。哺乳刺激通过神经系统促进催乳素的释放。在弯曲翼蝙蝠中，催乳素浓度的增加可以诱导黄体静止结束并开始植入，但孕激素对黄体功能没有影响。
目前研究表明，胚胎滞育的物种进入滞育时、滞育期间和胚胎滞育后重新激活的过程都不同程度地依赖于催乳素、雌激素及孕激素三种激素，但不同物种之间的变化差异很大，从而导致了不同的物种特征。从而导致了不同的物种特征。以水貂为典型的物种中，在交配之后由于夜间褪黑素水平高，囊胚进入滞育，导致催乳素水平降低。滞育的重新激活是由春分后光周期的增加触发的，催乳素增加随后卵巢孕激素合成也增加，此类物种只有催乳素可以终止胚胎滞育；对塔玛沙袋鼠等物种，在交配后如果有幼袋，囊胚将进入乳期滞育，由高水平催乳素维持，一旦催乳素抑制被消除，随后由孕激素脉冲重新激活滞育囊胚；在小鼠中，如果交配发生在产后，催乳素水平增加，从而抑制雌激素水平的升高，并导致囊胚进入滞育期，此过程由高水平催乳素和孕激素维持，并可由高水平雌激素终止。目前，雌激素和孕激素在大熊猫尿液中已有可靠的检测方法，缺乏针对大熊猫催乳素的检测方法，催乳素在大熊猫妊娠期的调控模式有待研究。
综上所述，建立一种大熊猫尿液中催乳素的检测方法，并通过此检测方法进一步掌握大熊猫妊娠期催乳素的变化，是一个亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法，本发明提供两种特异的抗大熊猫催乳素抗体，并利用这两种抗体作为包被抗体和标记抗体及大熊猫催乳素重组蛋白研发了大熊猫尿液催乳素的检测方法。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，以杂交瘤细胞株PRL-1和/或杂交瘤细胞株PRL-5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体进行检测；
其中，杂交瘤细胞株PRL-1的保藏编号为CCTCC NO:C202183；杂交瘤细胞株PRL-5的保藏编号为CCTCC NO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
进一步地，对大熊猫催乳素进行检测时，使用杂交瘤细胞株PRL-1和杂交瘤细胞株PRL-5产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体分别作为一抗或二抗。
进一步地，抗大熊猫PRL单克隆抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的大熊猫催乳素特异序列作为免疫原，并由杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5分泌。
进一步地，大熊猫PRL单克隆抗体的制备方法为：
(1)设计大熊猫催乳素特异序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并使其与KLH偶联，形成免疫原PRL-KLH；
(2)采用免疫原PRL-KLH免疫小鼠；
(3)细胞融和得到抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5；
(4)扩大培养即可分别得到杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体。
进一步地，以大熊猫尿液作为检测底物。
进一步地，包括以下步骤：
(1)将大熊猫尿液加入至抗大熊猫PRL单克隆抗体包被的酶标板中，同时加入PRL重组蛋白标准品，于35～37℃孵育30～35min；
(2)用洗涤液洗涤酶标板后，加入抗大熊猫PRL单克隆抗体-HRP复合物，于35～37℃孵育30～35min；本步骤中使用的抗大熊猫PRL单克隆抗体与步骤(1)中的抗大熊猫PRL单克隆抗体来源不同；
(3)用洗涤液洗涤酶标板后，加入底物显色试剂，于室温孵育5～10min后，加入反应终止液停止反应；
(4)用酶标仪测量并计算PRL含量即可。
进一步地，底物显色试剂为TMB显色液。
进一步地，反应终止液为浓度为1M的硫酸溶液。
上述检测方法，或抗大熊猫PRL单克隆抗体在对大熊猫妊娠期的胚胎发育监测中的应用。
一种试剂盒，包括上述杂交瘤细胞株PRL-1和/或杂交瘤细胞株PRL-5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体。
一种载体，包括上述抗大熊猫PRL单克隆抗体。
上述试剂盒或载体在大熊猫催乳素检测，或对大熊猫妊娠期的胚胎发育监测中的应用。
一种抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株PRL-1和/或杂交瘤细胞株PRL-5，其中，杂交瘤细胞株PRL-1的保藏编号为CCTCC NO:C202183；杂交瘤细胞株PRL-5的保藏编号为CCTCC NO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
本发明的有益效果：
1、本发明提供抗大熊猫催乳素抗体的制备方法，并将制得的两种特异的抗体运用到大熊猫尿液催乳素的检测方法中，可对大熊猫妊娠期的胚胎发育进行监测，科学指导大熊猫繁育生产。
2、本发明利用大熊猫PRL特异的抗体建立了大熊猫尿液中PRL代谢产物的夹心式酶联免疫检测方法，此检测方法灵敏度高，可达1.2ng/mL；此检测方法重复性高，批内和批间误差均小于10％。
附图说明
图1为载体测序结果与原始目的基因序列比对；
图2为酶切后的酶切图谱；
图3为融合蛋白SDS-PAGE分析图；
图4为融合蛋白纯化SDS-PAGE分析图；
图5为本申请大熊猫催乳素检测方法的标准曲线；
图6为大熊猫妊娠期催乳素与孕激素变化趋势图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1抗大熊猫PRL单克隆抗体的制备
1、特异多肽片段的设计与合成
根据NCBI数据库大熊猫PRL氨基酸序列，登录号：NP_001291863.1，序列为：MDKKGWSLKGSLLPLLLLVSDLLLCQSVASLPICPTGAVNCQVSLRDLFDRAVILSHYIHNLSSEMFNEFDKRYAQGRGFITKAINSCHTSSLSTPEDKEQAQQIHHEDLLNLILRVLRSWNDPLYHLVTEVRGMQEAPDSILSRAIEIEEQNRRLLEGMEKIVGQVHPGVRENEVYSVWSGLPSLQMADEDTRLFAFYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIVYDSNC,并参考其它物种序列分析，设计了大熊猫PRL特异序列DRAVILSHYIHNLSSEMFNEFDKRYAQGR(PRL)(SEQ ID NO.1)，并通过人工合成，并与KLH(匙空血蓝蛋白)偶联，作文生产特异性抗体的免疫原(PRL-KLH)。对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生产出多肽片段PRL以及免疫原PRL-KLH
2、抗原小鼠免疫
用佐剂：抗原＝1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和NaCl吸进注射器中(共400μL，四只的量)，再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中(共400μL，四只的量)；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化(乳化大概10多分钟，至油包水状态即可)，最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
第1天：腹腔注射，200μL一只。(抗原量为100μg/只)
第14天：腹腔注射，200μL一只。(之后抗原都为50μg/只)
第21天：腹腔注射，200μL一只。
第27天：腹腔注射，200μL一只。
…………………
(第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rmp,8min，取血清测定其效价，以PRL-1，包被浓度为2μg/mL作为抗原，ELISA方法检测血清效价,效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。)
3、细胞融合
(1)骨髓瘤细胞(SP2)的复苏
先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15mL的离心管中，再取大概5mL的PBS，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，重复两次清洗SP2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)SP2细胞的传代
当培养瓶中的细胞长满瓶底80％左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15mL离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加PBS 5mL，吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤完后加2mL 10％完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
(3)滋养层巨噬细胞的制备(融合前一天可准备)
小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75％酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8mL的含双抗的不完全培养基注射入腹腔(双抗:不完全培养液＝1:100)，注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000r/min离心5min，弃去上清。再用PBS洗涤四次。将细胞重悬于10％的完全培养液中。
将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100μL,最后将96孔板放入CO2的培养箱培养。(巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。)
(4)免疫脾细胞制备
1)取小鼠脾脏
取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75％的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置(超净台中)，进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于PBS中洗涤。
2)脾细胞悬液制备
先用PBS洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加PBS洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5mLPBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次,洗涤完后加2mL不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
3)SP2细胞悬液的制备
用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜(细胞均为悬浮或轻微帖壁生长)，再将细胞液用加样抢转移至15mL离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加PBS5mL，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2mL不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
(5)PEG作用下进行细胞融合
将SP2与脾细胞按1：4(1:10至1:4之间)的比例混合在一起，离心，600rpm，3min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1min内缓慢加入37℃预热好的0.6mL 50％PEG溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。37℃预热好的不完全培养液10mL以终止PEG作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2min。离心，800rpm，5min，弃上清；再用PBS或不完全培养液洗涤2次，以去除PEG。
洗涤完后弃上清，用10mL HAT选择培养液重悬细胞。上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内(用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体)，每孔加100μL；将培养板置CO2培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含HAT的完全培养液(19.6mL 10％完全培养液+0.4mL HAT)，每孔加100μL；将培养板置CO2培养箱中培养。
(6)选择培养
1)融合培养的第四天半液法换HAT培养液
用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μL，弃掉，再加入新的每孔100μL HAT培养液(HAT培养液配制为：10％的完全培养液：HAT＝1:50)，每块板子需要在10mL完全培养液中加入200μL 50×HAT。
2)融合培养的第七天半液法换HT培养液
用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μL，弃掉，再加入新的每孔100μLHT培养液(HT培养液的配制为：10％的完全培养液：HT＝1:50)，每块板子需要在10mL完全培养液中加入200μL 50×HT。
(7)阳性克隆筛选
在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时(大概在第12天左右)，可吸取培养液检测其有无分泌抗体。
1)先将之前包被好的相应的ELISA(包被PRL-1，包被浓度为2μg/mL)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100μL每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10％的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清(融合前小鼠眼眶采血的血清)。
2)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。
3)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
4)加双抗：双抗稀释10000倍，50μL每孔。
5)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。
6)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
7)显色：每孔加显色剂TMB100μL，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10min。
8)比色测定：每孔加终止液50μL(终止液＝21.5mL的浓硫酸定容至200mL)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。
选取阳性结果高者(至少为阴性对照的4倍)，作为阳性克隆孔。
(8)有限稀释法筛选抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株
1)阳性孔细胞的计数
将筛选得到的阳性克隆孔孔可做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15mL的离心管中(边吹打边旋转，使细胞悬浮)，再补加10％的完全培养液至2mL；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验(由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞)。
2)将细胞液加入200mL完全培养液中，混匀，96孔板加样，200μL/孔，共十块96孔板。
3)最后将培养板置CO2培养箱中培养。
4)培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。
5)培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10％完全培养液100μL/孔。
6)第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测(ELSIA检测)，阳性强的孔即为抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明最终筛选得到一株抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5。
(9)亚型鉴定
使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 37503试剂盒进行亚型鉴定。
准备工作：将试剂盒中TBS溶于500mL双蒸水中，用于稀释样品，870mL双蒸水与30mL 30X Wash Buffer混匀，用于洗板，根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450μL的样品稀释液，吸取20μL的细胞培养液加入980μL的TBS中混匀。
实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50μL/孔，每个样需加8孔即一条，加入50μL/孔的Goat Anti-Mouse IgG+IgA+IgM HRP，轻柔的晃动板子混匀盖上封板膜，室温孵育一个小时，洗板4次，扣干水分，加入75μL/孔的TMB显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色5-15min之后加入75μL/孔的终止液终止反应，液体由蓝色变为黄色。经鉴定筛选所得到的抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5所分泌的抗体亚型为IgG1型。
(10)单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。
批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中(边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移)培养，并加600μL的10％完全培养液培养。
观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养(先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10％的完全培养液7mL)。
观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养(细胞传代)。
可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，再拿培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为Pierce Protein G Agarose，并用10000kda超滤管浓缩纯化过的抗大熊猫PRL单克隆抗体，-20℃保存备用。
(11)单克隆抗体细胞株冻存
将鉴定的抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中(细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长)，在将细胞转移至15mL的离心管中。离心，1000转/5分钟。用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液(冻存液＝5mL血清+4mLDMEM+1mLDMSO,颠倒混匀，过滤备用)，混匀。最后加入冻存管中，每管1mL细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将细胞株PRL-1和PRL-5放入液氮中长期保存备用。
实施例2
对实施例1得到的抗大熊猫催乳素抗体进行HRP标记，具体方法如下：
1、取与抗体等量的HRP溶于1mL纯水中，加入0.1mol/L NaIO4 0.5mL，4℃放置30min；
2、加入2.5％乙二醇0.5mL，室温下轻微搅拌1h；
3、加入待标记的抗体，并调节反应液pH值至9.0，混匀，置4℃过夜；
4、加入硼氢化钠溶液0.1mL，混匀，4℃放置3h；
5、滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置30min，
6、4000rpm离心15min，去上清，沉淀以适量0.01mol/l pH 7.4PBS溶解
7、4℃透析过夜，换液3次，即得到HRP标记抗体。
实施例3
大熊猫催乳素重组蛋白的制备，具体方法如下：
1.大熊猫PRL重组质粒的构建
根据NCBI PRL基因序列NM_001304934.1：ATGGACAAAAAAGGGTGGTCGCTGAAAGGGTCTCTCCTGCCCCTGCTGCTGCTGGTGTCTGACCTGCTCCTGTGCCAGAGCGTGGCCTCCCTGCCCATCTGTCCCACCGGGGCTGTCAACTGCCAGGTGTCCCTCCGAGACCTGTTTGACCGCGCGGTCATCCTGTCTCACTACATCCATAACCTCTCCTCGGAGATGTTCAACGAATTTGATAAAAGGTATGCCCAAGGCCGGGGGTTCATTACCAAGGCCATCAACAGCTGTCACACTTCCTCCCTCTCTACCCCTGAAGACAAGGAGCAAGCCCAACAGATCCATCATGAAGACCTTCTGAACCTGATACTCAGAGTGCTACGCTCGTGGAATGACCCCCTGTACCATCTAGTCACAGAAGTACGGGGTATGCAAGAAGCCCCAGATTCGATTCTGTCCAGAGCCATAGAGATTGAGGAACAAAACAGAAGACTTCTAGAGGGTATGGAGAAGATAGTTGGCCAGGTTCATCCTGGAGTCAGAGAAAATGAGGTCTACTCGGTCTGGTCAGGACTTCCATCCCTTCAGATGGCCGATGAAGACACTCGCCTTTTTGCTTTTTATAACCTGCTCCACTGCCTACGCAGGGATTCACATAAGATTGACAATTATCTCAAGCTCCTGAAGTGCCGCATCGTCTACGACAGCAACTGCTAA
以上序列切除信号肽并优化后添加酶切位点Nde I和XhoI来进行化学合成最终的目的序列，正向构建到PET28b载体上。进行测序，并用Nde I和XhoI两种酶对重组载体进行酶切鉴定。测序结果与原始目的基因序列比对见图1(图1中a和b均是基因序列比对)，酶切后的检测结果见图2。如图1和图2所示，表明本申请成功构建了大熊猫PRL重组质粒构建成功，并命名为pET28b-PRL。
2、大熊猫PRL重组蛋白的制备
(1)重组蛋白的原核表达
1)转化
取1μL重组的pET28b-PRL质粒转化Rosetta(DE3)菌株，42℃热击90s，冰上静置2min后涂平板(30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃培养过夜。
2)小试培养选择最佳的诱导条件
挑取表达菌株Rosetta(DE3)的单菌落于试管中(4mL LB培养基，30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)37℃，220rpm过夜培养。将培养的菌液按1:100比例分别接种于4mL LB培养基中，添加30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素，37℃，220rpm培养。当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，分别220rpm，20℃诱导过夜；和220rpm，37℃诱导5h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。收集菌体并用PBS缓冲液悬浮。SDS-PAGE电泳检测，选择最佳的蛋白表达诱导条件。
3)大量诱导
将培养的菌液按1:100比例接种于4L的LB液体培养基中，添加30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM IPTG，37℃，220rpm，5h，离心收集细胞菌体。
4)镍琼脂糖亲和层析
将收集的细菌菌体用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-100，PH＝8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声3S，暂停5S为一个循环)。超声完毕，12000rpm/min，4℃，离心20min。沉淀用溶解Buffer(7M盐酸胍，50mM Tris，300mMNaCl，0.1％Triton X-100，PH＝8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声3S，暂停5S为一个循环)。超声完毕，12000rpm/min，4℃，离心20min，弃沉淀，上清做下一步纯化。用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速60mL/h。样品(溶解液上清)上柱，流速为45mL/h，收集穿透液。10倍柱床体积的Wash buffer清洗柱子，流速60mL/h。
Elute Buffer洗脱，流速45mL/h，收集洗脱液。分别收集上述的洗脱液样品进行SDS-PAGE分析。注：Binding Buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，pH＝8.0)Washbuffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，10/20/50mM咪唑，pH＝8.0)Elution Buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH＝8.0)纯化后蛋白SDS-PAGE检测，将500mM咪唑洗脱液透析到50mM Tris，300mM NaCl，0.1％SKL，PH＝8.0的缓冲液中，4℃透析过夜，.过滤、分装、-80℃保存。
3、PRL重组蛋白的表达及定位
通过上述小试样品进行SDS-PAGE分析，电泳显示在37℃沉淀中相应位置(～27KD)出现特异的目的条带，表明融合蛋白在诱导后主要包涵体的形式表达，见图3。
4、PRL重组蛋白的纯化
融合蛋白经过镍琼脂糖亲和层析法进行纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置(～27KD)出现明显条带，表明融合蛋白纯化成功，制备得到了高纯度的大熊猫PRL重组蛋白(见图4)。
实施例4大熊猫催乳素检测
具体测定方法如下：
(1)测定时，将大熊猫尿液加到抗PRL抗体包被的酶标板，每孔0.05mL。同时加入样品稀释液配制成0到1250ng/mL的PRL重组蛋白标准品，共计12个标准点。37度孵育30分钟。
(2)用洗涤液将酶标板洗涤5次。
(3)加入用样品稀释液配制的1:2000的抗PRL抗体-HRP复合物，每孔0.05mL。
(4)37度孵育30分钟。
(5)用洗涤液将酶标板洗涤5次。
(6)加入TMB工作液，每孔0.1mL。在室温下孵育5到10分钟。
(7)用1M的H2SO4停止颜色反应，每孔0.1mL。
(8)用酶标仪在450/630的波长读取样品盒标准的光密度，然后从标准曲线计算样品中PRL的含量。制备得到的标准曲线如图5所示。
实施例5
本发明应用大熊猫PRL特异的抗体建立了大熊猫尿液中PRL代谢产物的夹心式酶联免疫检测方法。
本发明提供的大熊猫促黄体素检测方法，以10次重复试验0孔值的平均值加标准差的两倍来计算，可知本发明的检测方法灵敏度高，可达1.2ng/mL。
为了验证本发明检测试剂盒的可重复性，经过试验，得到表1的结果：
表1大熊猫LH检测试剂盒可重复性结果
批间误差CV％ 批内误差CV
标准曲线(n＝10) 9.2 5.37
由表1可以看出，平均各标准点的批内和批间误差均小于10％。按酶联免疫检测法公知的标准，批内误差低于10％，批间误差低于15％，即可认定该试剂盒具有可靠的可重复性(详情请参见Micallef J，Ahsan R.Immunoassaydevelopment.In:Gosling JP，BassoLV，editors.Immunoassay:laboratory analysisand clinical applications.London:Butterworth-Heinemann；1994.p.51-680)。由此可以看出：本发明提供的大熊猫PRL检测方法具有很可靠的可重复性。
实施例6
本发明提供的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，可实现对大熊猫妊娠期催乳素的监测，通过与孕激素的变化，指示出大熊猫胚胎着床发育的时间，有效指导大熊猫繁育期的饲养管理。图6为1例妊娠期孕激素与催乳素变化的趋势图，从图6中可以看出在孕激素迅速上升前出现高水平的催乳素水平，提示大熊猫的胚胎着床发育需要高催乳素水平的启动。
序列表
<110> 成都大熊猫繁育研究基地
<120> 一种抗大熊猫PRL单克隆抗体、杂交瘤细胞株及PRL酶联免疫检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Arg Ala Val Ile Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu Ser Ser Glu
1 5 10 15
Met Phe Asn Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Ala Gln Gly Arg
20 25

Claims (10)

1.一种大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，以杂交瘤细胞株PRL-1和/或杂交瘤细胞株PRL-5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体进行检测；
其中，所述杂交瘤细胞株PRL-1的保藏编号为CCTCC NO:C202183；杂交瘤细胞株PRL-5的保藏编号为CCTCC NO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，对大熊猫催乳素进行检测时，使用杂交瘤细胞株PRL-1和杂交瘤细胞株PRL-5产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体分别作为一抗或二抗。
3.根据权利要求1所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，所述抗大熊猫PRL单克隆抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的大熊猫催乳素特异序列作为免疫原，并由杂交瘤细胞株PRL-1和PRL-5分泌。
4.根据权利要求1～3任一项所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，以大熊猫尿液作为检测底物。
5.根据权利要求4所述的大熊猫催乳素酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大熊猫尿液加入至抗大熊猫PRL单克隆抗体包被的酶标板中，同时加入PRL重组蛋白标准品，于35～37℃孵育30～35min；
(2)用洗涤液洗涤酶标板后，加入抗大熊猫PRL单克隆抗体-HRP复合物，于35～37℃孵育30～35min；
(3)用洗涤液洗涤酶标板后，加入底物显色试剂，于室温孵育5～10min后，加入反应终止液停止反应；
(4)用酶标仪测量并计算PRL含量即可。
6.权利要求1～5任一项所述的检测方法，或权利要求1～3任一项所述的抗大熊猫PRL单克隆抗体在对大熊猫妊娠期的胚胎发育监测中的应用。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3中任一项所述的杂交瘤细胞株PRL-1和/或杂交瘤细胞株PRL-5分别产生的抗大熊猫PRL单克隆抗体。
8.一种载体，其特征在于，包括权利要求1～3中任一项所述的抗大熊猫PRL单克隆抗体。
9.权利要求7所述的试剂盒，或权利要求8所述的载体在大熊猫催乳素检测，或对大熊猫妊娠期的胚胎发育监测中的应用。
10.一种抗大熊猫PRL单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株PRL-1和/或杂交瘤细胞株PRL-5，所述杂交瘤细胞株PRL-1的保藏编号为CCTCCNO:C202183；杂交瘤细胞株PRL-5的保藏编号为CCTCC NO:C202172，均于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心。
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