CN109897830B - 马泰勒虫ema1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供马泰勒虫EMA1单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201926的杂交瘤细胞分泌产生。本发明提供的马泰勒虫EMA1单克隆抗体效价高、特异性强、反应性好。利用该单克隆抗体制备快速免疫胶体金检测试纸条，具有操作简单、检测成本低、灵敏度高、特异性强的特点。现场检测5‑10min便可以读取结果，给养马产业针对马泰勒虫病的检测提供极大便利，特别适合于马产业的泰勒虫的快速诊断以及牧区等大规模的马匹流行病病学调查。

Description

马泰勒虫EMA1单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及马泰勒虫EMA1单克隆抗体及其应用。

背景技术

马泰勒虫病是由马泰勒虫寄生于马属动物(马、驴、骡和斑马)红细胞、淋巴细胞内引起的一种蜱传原虫病。在我国文献报道的马泰勒虫媒介蜱有草原革蜱、森林革蜱和镰形扇头蜱。在临床上表现主要呈发热，可视黏膜黄染，下颌淋巴结肿大，流黏液性鼻液，喜卧等症状。此病流行具有一定的季节性，多发于春季和秋季；新疆由于其独特地理环境,媒介硬蜱分布广,马泰勒虫病的感染情况可达90％,部分地区死亡率可达30％。马驹刚出生时体内有母源性抗体免疫，当带虫蜱侵扰时可起到保护作用，而被引入另一马梨形虫流行病区或没有该病发生但存在感染性蜱虫时，可能会感染该病。该病对马驹及进口的马属动物、纯种马的危害极大。及早发现马匹患病可尽早进行预防。

由于马泰勒虫(Theileria equi)寄生于红细胞中，在临床上的诊断通常通过血涂片染色进行观察红细胞的染虫情况，但是在马属动物感染的潜伏期、慢性感染(带虫期)及大批量检测时，血液涂片检测基本是很困难也是不准确的。另一方面，补体结合实验(CFT)，间接免疫荧光抗体实验(IFAT)和酶联免疫吸附实验(ELISA)均有效检测阳性样品，但是CFT和IFAT等检测方法存在耗时久、成本高等局限性，不适于基层临床检测。马泰勒虫裂殖子表面抗原1(EMA-1)是用于马梨形虫病诊断的重要靶抗原之一，能使机体产生特异性中和抗体反应，引起保护性免疫现象。马泰勒虫EMA1蛋白的单克隆抗体的成功制备为马泰勒虫特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了一定的重要基础。此外，用马泰勒虫EMA1制备单克隆抗体并制备成单克隆抗体以及重组蛋白EMA1包被NC膜组装试纸条并用于检测马血清，适用于马场现场方便、快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供马泰勒虫EMA1单克隆抗体及其应用。

本发明的另一目的是提供马泰勒虫胶体金检测试纸条。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株杂交瘤细胞，保藏号为CCTCCNO:C201926，其分泌产生新疆地方株马泰勒虫EMA1单克隆抗体。

第二方面，本发明提供新疆地方株马泰勒虫EMA1单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO:C201926的杂交瘤细胞分泌产生。

第三方面，本发明提供所述单克隆抗体的以下任一应用：

1)在非诊断目的检测马泰勒虫中的应用；

2)在制备马泰勒虫检测免疫层析试纸条中的应用；

3)在制备马泰勒虫胶体金检测试纸条中的应用；

4)在检测马泰勒虫病感染中的应用；

5)在制备用于检测马泰勒虫病感染的免疫层析试纸条中的应用；

6)在制备用于检测马泰勒虫病感染的胶体金试纸条中的应用。

第四方面，本发明提供一种马泰勒虫胶体金检测试纸条，所述试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板(如PVC板)；胶体金垫上包被有EMA1蛋白-胶体金复合物；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有EMA1蛋白，所述质控线包被有所述单克隆抗体。

进一步地，所述胶体金检测试纸条的制备方法如下：

(1)胶体金溶液的制备；优选地，所述胶体金颗粒的粒径约40nm；

(2)EMA1蛋白-胶体金复合物溶液的制备；

(3)胶体金垫的制备：将步骤(2)制备的EMA1蛋白-胶体金复合物溶液包被在聚酯纤维膜上，得到胶体金垫；

(4)制备硝酸纤维素膜：将所述EMA1蛋白和所述单克隆抗体分别包被于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线；

(5)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，即得。

步骤(1)具体为：将100mL水加热至沸腾，加入1％的柠檬酸三钠溶液0.5-2mL(优选1mL)，再次沸腾后加入1％的氯金酸溶液0.5-2mL(优选1mL)；1-3min溶液颜色由灰色变为黑色，随后由黑色变为鲜红色，待再次沸腾后继续加热8-10min；溶液冷却至室温，用水补足100mL，即得胶体金溶液。

步骤(2)具体为：取10mL胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃溶液调pH到7.5；加入0.5mg/mLEMA1蛋白溶液1.0-1.5mL(优选1.2mL)，搅拌20-40min(优选30min)后加入1mL 10％BSA，再搅拌30min，然后离心，弃上清，用1mL洗涤缓冲液洗三遍，离心后弃去上清，用1mL缓冲液重悬沉淀，得到EMA1蛋白-胶体金复合物溶液。

其中，所述缓冲液的组成为：20％蔗糖，5％海藻糖，含1％BSA的5mM Tris-HCL缓冲液，0.3％吐温20，0.04％Proclin300。

步骤(3)具体为：将EMA1蛋白-胶体金复合物溶液滴加在聚酯纤维膜上，在真空37℃烘干2h，得到胶体金垫。

所述胶体金检测试纸条的检测线和质控线上包被的EMA1蛋白和单克隆抗体的浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL。

第五方面，本发明提供所述胶体金试纸条的以下任一应用：

i)在非诊断目的检测马泰勒虫中的应用；

ii)在快速鉴定马泰勒虫病感染中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的马泰勒虫EMA1单克隆抗体效价高、特异性强、反应性好。利用该单克隆抗体制备快速免疫胶体金检测试纸条，具有操作简单、检测成本低、灵敏度高、特异性强的特点。现场检测5-10min便可以读取结果，给养马产业针对马泰勒虫病的检测提供极大便利，特别适合于马产业的泰勒虫的快速诊断以及牧区等大规模的马匹流行病病学调查。

附图说明

图1为本发明实施例1中EMA1蛋白纯化结果图。其中，M：标准分子量蛋白Marker；1：PET-28a-EMA1未诱导组；2：PET-28a-EMA1诱导后全菌；3：PET-28a-EMA1纯化后目的蛋白。

图2为本发明实施例1中IFA分析EMA1单抗与真核细胞内表达的pCMV-EMA1蛋白的反应。其中，A表示EMA1单抗与真核细胞内表达的pCMV-EMA1蛋白的反应，B表示真核细胞内表达的pCMV-EMA1蛋白与阴性血清反应(阴性对照)。

图3为本发明实施例1中IFA分析EMA1单抗与马泰勒虫的反应。其中，A、B表示EMA1单克隆抗体与血涂片中天然马泰勒虫反应，C表示EMA1单克隆抗体与阴性血液涂片(作为对照)。图中箭头表示EMA1单克隆抗体与血涂片中天然马泰勒虫反应。

图4为本发明实施例3中胶体金试纸条的特异性试验结果。

图5为本发明实施例3中胶体金试纸条的敏感性试验结果。

图6为本发明实施例3中胶体金试纸条批内重复试验结果。

图7为本发明实施例3中胶体金试纸条批间重复试验结果。

图8为本发明实施例3中马泰勒虫感染检测胶体金试纸条结构示意图。其中，1-样品垫，2-胶体金垫，3-硝酸纤维素膜，4-检测线，5-质控线，6-吸水垫，7-背板(PVC底板)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1马泰勒虫EMA1蛋白单克隆抗体的制备

1、EMA1基因的克隆、表达及纯化

根据GenBank中马泰勒虫的EMA1基因序列(AF255730.1)设计一对引物(SEQ IDNO:2-3)：

上游引物：5-CGGATCCATGATTTCCAAATCCT-3’

下游引物：5-TTGCGGCCGCTTAGTAAAATAGAGTAGAGT-3’

以阳性马泰勒虫全血抽提的DNA为模板，用上、下游引物，对EMA1基因(SEQ ID NO:1)进行扩增反应；对PCR产物进行回收纯化，回收纯化的PCR产物，连接至pMD18-T载体，然后转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，将复苏后的菌液涂布在含氨苄青霉素(100mg/L)的培养基上倒置37℃培养箱培养。8～12h后挑取单个菌落，摇菌扩大培养，提取质粒，对克隆质粒pMD18-T/EMA1进行双酶切验证。EMA1基因在大肠杆菌中经IPTG诱导表达；进行SDS-PAGE鉴定(图1)。利用KCl染色切胶纯化法纯化EMA1蛋白。纯化的蛋白经过Western blot分析EMA1重组蛋白抗原能够被阳性马泰勒血清所识别，具有良好免疫原性。

2、动物免疫

利用纯化后的EMA1蛋白免疫6-8周龄5只BALB/c雌性小鼠，按照100μg蛋白/只进行背部多点皮下注射；之后每隔两周进行一次免疫，共三次；隔10d后通过断尾采血分离血清检测其效价，将效价达到10⁵以上后加强免疫准备细胞融合。加强免疫时以腹腔注射的方式按照200ug/只的剂量进行，3天后即可取脾细胞进行融合。

3、饲养层细胞的制备

在融合前一天制备腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，取6-10周龄未经任何处理的阴性BALB/c雌性小鼠1只，腹腔注入10mL 1640培养基，抽回腹腔液，通过离心收集腹腔巨噬细胞，用1640培养基清洗2次后，放入37℃培养箱中培养。

4、脾细胞的制备

将超强免疫后血清抗体较高的BALB/c小鼠，摘眼球采血，制备血清备用。小鼠颈椎脱臼处死之后完全浸泡于含75％乙醇中灭菌消毒5-10min，之后在无菌操作条件下取出小鼠脾脏，用注射器向脾中注射RPMI-1640使脾细胞完全释放，至脾脏表面呈现白色，用移液枪将悬液移入50ml的离心管中，1000rpm水平离心5min去除上清(同时开始准备骨髓瘤细胞)。换用新鲜的RPMI-1640培养基重悬鼠脾脏细胞，离心，弃上清，重悬细胞。采用细胞计数仪估计细胞数，大约108个细胞。置于37℃5％CO₂的培养箱中培养。

5、骨髓瘤细胞与脾细胞融合

采用细胞计数仪估计细胞数，用于融合的脾细胞是骨髓瘤细胞数的约5-10倍，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞混合于50ml离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，加入30ml1640培养基轻轻悬浮细胞，再次1000rpm离心10min，吸去上清后，将离心管置于37℃水浴条件，在45s内用直头吸管插至离心管底轻柔地搅动待融合细胞并缓缓加入融合剂将1ml 37℃保温的50％PEG4000，边滴边摇，细胞悬液于37℃水浴中静置90s，1min内均匀加入4ml预热至37℃的1640培养基：前30s内加入1ml，后30s内加入3ml。随后2min内加入11ml 1640培养基；1000rpm低速离心5min，弃去上清，加入5ml预热至37℃的HAT完全培养基(含20％胎牛血清)轻地吹打悬浮细胞。将悬浮的细胞转移至含20％胎牛血清HAT培养基的平皿内，轻轻吹打制成细胞悬液，并铺入事先制备好的巨噬细胞的96孔板中，每孔200ul；将96孔培养板放入37℃5％CO₂的细胞培养箱中。

6、杂交瘤细胞的选择性培养

融合后的细胞用HAT选择培养基培养3-5天后，用新鲜HAT完全培养基半量换液一次；然后继续培养3-5天后，改用HT完全培养基半量换液一次，逐步替代HAT培养基，4周后再由HT培养基改为RPMI-1640完全培养基培养。一般HAT选择性培养杂交瘤细胞3-5天后即出现葡萄串状细胞团，非脾细胞与SP2/0融合的杂交瘤细胞逐渐死亡；继续培养至12-15天，筛选剩下能生长的克隆可长至占孔板孔底面积的1/3-1/2时，即可取培养上清进行抗体检测。

7、阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

融合后的细胞在培养至10天左右时，观察细胞生长状态，待细胞长满孔的1/3时收集细胞上清，吸取上清100ul/孔至包被2ug/ml原核表达的重组蛋白并封闭好的酶标板上，进行ELISA检测，同时补加完全培养基250ul到96孔板培养板中。用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。

8、阳性杂交瘤细胞株的亚克隆

根据ELISA有限稀释法，将阳性细胞株进行有限稀释至新的96孔板中，具体操作为吸取适量HAT培养基，加到阳性杂交瘤孔中，轻轻吹打悬浮细胞，96孔板每孔加100ul 1640完全培养基，其中第一列200ul/孔，取适量细胞在96孔细胞培养板第一列进行倍比稀释，然后用排枪倍比稀释细胞培养板的剩余孔，将96孔板静置培养于细胞培养箱中。5天后，于倒置显微镜下观察细胞形态，并标记找到的单克隆细胞孔，补加100μl新鲜HAT完全培养基。培养至第二周，细胞克隆生长至占孔底面积的30％-40％时，将挑选出的杂交瘤孔的上清进行抗体水平检测。从被检孔中挑选出呈强阳性反应的单细胞克隆孔2-3个，然后进行第二次克隆化和保存。按照此方法连续亚克隆3次以上，直至所有被检孔均呈阳性反应，大量培养完成该杂交瘤细胞的建株筛选工作，即获得了能稳定传代并分泌预期抗体的杂交瘤细胞株。由该杂交瘤细胞株分泌的新疆地方株马泰勒虫EMA1单克隆抗体(Mouse anti-EMA1-5H2)现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，该杂交瘤细胞株的保藏编号CCTCC NO:C201926，保藏日期2019年3月14日。

9、单克隆细胞亚型鉴定

用纯化的EMA1蛋白包被ELISA酶标板对相应的各类单抗株进行抗体亚类鉴定，具体操作按照Southern Biotech公司免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒说明书进行。Mouseanti-EMA1-5H2亚型为G2b。

10、腹水的制备

将八周龄健康BALB/c雌性小鼠进行腹腔注射无菌液体石蜡0.4mL/只，5-10d后将杂交瘤细胞覆盖90％以上瓶底面积时，收集细胞沉淀，重悬与0.5mL 1640不完全培养基，通过腹腔注射，接种5-7d后待小鼠腹部明显胀大，此时收集腹水，每天采集腹水一直到小鼠死亡为止，采集好的腹水放置-40℃保存。

11、单克隆抗体的纯化

利用正辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行初步纯化，再通过亲和层析柱进行精纯，得到单克隆抗体Mouse anti-EMA1-5H2。

12、马泰勒虫EMA1蛋白单克隆抗体的鉴定

(1)利用EMA1蛋白包被间接ELISA，按照倍比稀释，对单抗腹水进行检测。取呈阳性反应相应的最大稀释倍数作为该抗体的效价值(表1)。

表1

单克隆抗体	腹水效价	亚类
			5H2	1:256000	IgG 2b

(2)96孔培养板的细胞上清进行IFA检测：使用固定好的pCMV-EMA1真核表达质粒(pCMV-EMA1是将编码EMA1的DNA片段构建到载体pCMV的EcoRI和NotI酶切位点之间得到的)转染的293T细胞的96孔板，以杂交瘤细胞上清原液做一抗，以FITC羊抗鼠IgG作为二抗，检测杂交瘤细胞上清液的阳性情况(图2)。

(3)将患马泰勒虫病的新鲜马全血制备血涂片将血液涂片放入平皿中加入一定量的固定液(甲醇:丙酮＝1:1，v/v)，-20℃固定细胞20min后取出涂片，放于滤纸上吸掉残留的固定液，通风橱内干燥，于-20℃保存备用或立即置于无菌平皿(100mm)中进行IFA试验操作(图3)。

抗体亚类鉴定结果表明，EMA1蛋白单克隆细胞株5H2重链为IgG 2b，轻链为κ链。间接ELISA测单抗株腹水效价为1:256000。该单抗能与原核表达的EMA1蛋白和马泰勒虫感染马红细胞中表达的天然EMA1蛋白有良好的反应性，表明制备的单抗既识别EMA1蛋白的B细胞线性表位又识别立体构象的表位。

实施例2马泰勒虫感染检测胶体金试纸条的制备

1、胶体金溶液的制备

取一个200mL泡酸、硅化处理的锥形瓶，利用柠檬酸三钠还原法，制备粒径约40nm的胶体金溶液。向锥形瓶中加入100mL经0.22um滤膜过滤的去离子水；在控温电磁搅拌器上边搅拌边加热，沸腾后加入1mL 1％的柠檬酸三钠溶液，等再次沸腾后迅速加入1mL的1％的氯金酸溶液；1-3min溶液颜色由灰变黑，由黑变为鲜红色，待再次沸腾后继续加热8-10min，待溶液冷却至室温，用去离子水补足100mL，即得胶体金溶液，锡箔纸避光室温保存。所制备的胶体金溶液色泽呈酒红色，质地透亮，无聚沉现象。

2、EMA1蛋白-胶体金复合物溶液的制备

取10mL胶体金溶液用160μL 0.1mol/L K₂CO₃混匀调节胶体金溶液的pH值为7.5，加入0.5mg/mL的EMA1蛋白(实施例1制备的EMA1重组蛋白)1.2mL，室温搅拌30min；而后加入1mL的10％BSA溶液，使终浓度为1％，室温搅拌30min；将标记好的胶体金抗体溶液于4℃，12000rpm离心30min后，弃上清。再用洗涤液(5mM Tris-HCL，1％BSA)清洗沉淀，12000rpm离心15min，重复洗3遍。用原体积1/10的浓缩缓冲液(20％蔗糖，5％海藻糖，含1％BSA的5mMTris-HCL缓冲液，0.3％吐温20，0.04％Proclin300)悬浮沉淀。所得溶液即为金标抗体(EMA1蛋白-胶体金复合物溶液)，置于4℃保存或制备胶体金垫。

3、胶体金垫的制备

将EMA1蛋白-胶体金复合物溶液滴加在聚酯纤维膜上，在真空37℃烘干2h，得到胶体金垫。

4、制备硝酸纤维素膜

将EMA1蛋白和单克隆抗体5H2分别以稀释缓冲液(20％蔗糖，1％BSA，0.3％吐温20，0.04％Proclin300)稀释至终浓度为1mg/ml和0.5mg/ml，以膜喷点系统均匀包被在硝酸纤维素膜上的检测线(T线)和质控线(C线)，喷膜用量均为1.0μL/cm，在37℃充分干燥。

5、检测试纸条组装及测试

①胶体金垫的处理

将胶体金垫浸于处理液(5mM Tris-HCL，1％PVP-K30，0.3％吐温20，0.04％Proclin300)12h，然后真空37℃烘干，室温密封保存。

②样品垫的处理

将样品垫浸于样品垫处理液(5mM Tris-HCL，0.3％酪蛋白，0.3％吐温20，0.04％Proclin300)12h，然后用真空37℃烘干，室温密封保存。

③包被T线、C线

用Biodot-XYZ点膜仪对试验参数进行选择，形状选择线型；喷点长度为330mm；速度为50mm/s；X 0mm，Y 11.0mm，Z(UP)0mm，Z(down)55mm；喷头1和喷头2之间的距离为5mm；喷点量为1μL/cm；使用完毕后，使用清洁液和双蒸水分别清洗20个循环；其中T线使用蛋白EMA1喷印，C线使用单克隆抗体Mouse anti-EMA1-5H2喷印。

④试纸条的组装

在PVC底板中间先粘贴NC膜，金标垫位于NC膜的一端并且压住NC膜2mm，样品垫压住金标垫2mm，吸水纸在NC膜的另一端并压住NC膜2mm。在用切纸机将其裁切呈宽为4mm的条状，4℃保存备用。组装后的试纸条如图8所示。

胶体金试纸条检测：

取马血清50μl滴加到样品垫上，静置5-10min后，可进行结果判定。

结果判定：

在胶体金试纸条上检测线和质控线出现两条红色条带说明为阳性，若是质控线出现一条红色条带说明该样品为阴性，若是检测线出现一条条带或者是检测线和质控线都没有出现条带说明该试纸条失效。

结果表明，检测马泰勒虫病阳性阴性血清，发现阳性样品在NC膜上出现清晰的两条带，阴性样品在NC膜上一条带。说明试纸条有效。

实施例3胶体金免疫层析试纸条性能测试

为进一步检测胶体金试纸条的试验性能，进行一系列的试验，包括特异性、敏感性、批内重复、批间重复实验。

1、特异性

本发明的胶体金试纸条的硝酸纤维膜上T线与C线分别包被了马泰勒虫EMA1重组蛋白抗原和EMA1的单克隆抗体Mouse anti-EMA1-5H2，用试纸条检测2份马驽巴贝斯虫阳性血清反应，T线均不显色而C线均显色，说明该试纸条与马驽巴贝斯虫无交叉反应(图4)。

2、敏感性

为进一步检测该试纸条的检测性能，将马泰勒虫的阳性血清进行倍比稀释，用同一批次的试纸条对稀释的血清进行两次重复试验，当稀释到1:8时，在检测线仍可见到明显红色的条带。所以该试纸条的敏感性为1:8(图5)。

3、批内重复性试验

同一批次制备的胶体金试纸条对3份马泰勒虫阳性血清样品进行检测，每个样品重复检测2次，阳性血清检测结果显示两条红色条带，试纸条的检测结果相一致。

4、批间重复性试验

将不同批次制备的胶体金试纸条对3份马泰勒阳性血清进行检测，三个不同批次的试纸条检测出阳性血清均出现两条红色条带，试纸条的检测结果相一致。胶体金试纸条批内、批间重复试验结果分别见图6、图7。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> 马泰勒虫EMA1单克隆抗体及其应用

<130> KHP191110495.1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> 马泰勒虫(Theileria equi)

<400> 1

atgatttcca aatcctttgc ttttgttttc gcatccattg ccatttcgag catcctcgcc 60

gaggaggaga aacccaaggc ctctggagct gtcgtcgact tccagttgga gtccatcaac 120

cacatcacca tcgacaagca gtccgaggag cacgtcgtct acactgccca cgagggcttc 180

gccgtcgaga aggtcaagga aggcgactcc gtcatcaaga cctttgactt gaaggaacat 240

accccaaagg ccgtcgtcag gcacatcaag gacaacaagc catacgtcgt catcgccgtt 300

gagtccgctc tccacctcgt cctccataag gacggcgata agtgggtcga gctcgacgtc 360

gccgacttct accaggaggt cctgttcaag ggcttcgagt ccatctccgt cgacttggcc 420

gccgaaatct ccgacaagtt caccgagacc acctttggct ccggcaagaa gcacatcttc 480

aaggctccag gcaagcgcgt cctcaaggtc gtcgatggca agaacgagtt gatcgatggt 540

gaaaacgaag ttgttctcga cctcgagctc tttgtctctg gtgacaagaa ggtcgccgga 600

gttgtttacc tctacaaggg cgatggcaga atcaaggaaa tcttcttgaa actcgttgag 660

aaggtctgga agagagttga ggtcaaggat gccgctgaga ctttgcacgg tatcaacagc 720

accttcccag ctgactacaa ggttgtatac gacggcttct ccgtctatgg cgcattcttg 780

gccgtcgccg ccattgcatt ctctactcta ttttactaa 819

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggatccatg atttccaaat cct 23

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgcggccgc ttagtaaaat agagtagagt 30

Claims (9)

1.新疆地方株马泰勒虫EMA1单克隆抗体，其特征在于，由保藏号为CCTCC NO:C201926的杂交瘤细胞分泌产生。

2.权利要求1所述的单克隆抗体的以下任一应用：

1）在非诊断目的检测马泰勒虫中的应用；

2）在制备马泰勒虫检测免疫层析试纸条中的应用；

3）在制备马泰勒虫胶体金检测试纸条中的应用。

3.马泰勒虫胶体金检测试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上；胶体金垫上包被有EMA1蛋白-胶体金复合物；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有EMA1蛋白，所述质控线包被有权利要求1所述单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法如下：

（1）胶体金溶液的制备；

（2）EMA1蛋白-胶体金复合物溶液的制备；

（3）胶体金垫的制备：将步骤（2）制备的EMA1蛋白-胶体金复合物溶液包被在聚酯纤维膜上，得到胶体金垫；

（4）制备硝酸纤维素膜：将所述EMA1蛋白和所述单克隆抗体分别包被于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线；

（5）将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，即得。

5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，步骤（1）具体为：将100mL水加热至沸腾，加入1%的柠檬酸三钠溶液0.5-2mL，再次沸腾后加入1%的氯金酸溶液0.5-2mL；1-3min溶液颜色由灰色变为黑色，随后由黑色变为鲜红色，待再次沸腾后继续加热8-10min；溶液冷却至室温，用水补足100mL，即得胶体金溶液。

6.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，步骤（2）具体为：取10mL胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃溶液调pH到7.5；加入0.5mg/mL EMA1蛋白溶液1.0-1.5mL，搅拌20-40min后加入1mL 10% BSA，再搅拌30min，然后离心，弃上清，用1mL缓冲液重悬沉淀，得到EMA1蛋白-胶体金复合物溶液；

其中，所述缓冲液的组成为：20%蔗糖，5%海藻糖，含1% BSA的5mM Tris-HCL缓冲液，0.3%吐温20，0.04% Proclin300。

7.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，步骤（3）具体为：将EMA1蛋白-胶体金复合物溶液滴加在聚酯纤维膜上，在真空37℃烘干2h，得到胶体金垫。

8.根据权利要求4-7任一项所述的试纸条，其特征在于，所述检测线和质控线上包被的EMA1蛋白和单克隆抗体的浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL。

9.权利要求8所述的试纸条在非诊断目的检测马泰勒虫中的应用。

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