CN116699127A - 用于结核菌素效价标定的试剂盒、标定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药及动物病检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于结核菌素效价标定的试剂盒，包括第一单克隆抗体包被的酶标板和酶标记的第二单克隆抗体，第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2。本发明的单克隆抗体的特异性好，为准确测定致敏豚鼠血液中IFN‑γ浓度提供了良好的基础。此外，本发明还建立了一种结核菌素效价标定方法，其标定效率高，准确性高，重复性强，检测成本低。此外，本发明还公开了该试剂盒在制备用于牛/禽结核病检测的试剂盒中的应用。

Description

用于结核菌素效价标定的试剂盒、标定方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药及动物病检测技术领域，尤其涉及一种用于结核菌素效价标定的试剂盒、标定方法及其应用。
背景技术
牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要由结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosis comples，MTBC)成员——牛分枝杆菌(M.bovis)感染引起的一种人兽共患慢性传染病。禽结核病(Avian Tuberculosis)主要由血清1、2、3、6型禽分枝杆菌(Mycobacterium avium)和日内瓦分枝杆菌(Mycobacterium genavens)感染引起。禽分枝杆菌主要感染家禽、观赏鸟，猫头鹰、秃鹫等野禽，猪、宠物犬等动物，还可以感染人，特别是免疫力低下的儿童、老人、HIV感染者，引起多组织器官的结核结节。牛结核病和禽结核病不仅危害养殖业的健康发展，更引起严重的公共卫生安全问题，威胁人民的健康和生命安全，其有效防控直接关系着人类健康。
牛结核菌素皮试试验(Tuberculin Skin Test，TST)是最早被用来诊断牛结核病的方法，γ-干扰素释放试验(Interferon gamma release assay,IGRA)可以作为结核菌素皮试试验TST的替代方法，被WOAH推荐用于牛结核病的辅助诊断。禽结核病主要依赖禽结核菌素皮试试验进行检测。无论是TST还是IFN-γ释放试验，都需要使用到牛型结核菌素(PPD-B)和禽型结核菌素(PPD-A)作为检测/刺激抗原，因此经准确定量的结核菌素制品是牛结核病和禽结核病准确诊断的前提。
PPD-B和PPD-A作为牛结核病和禽结核病的诊断抗原，其诊断准确性与效价定值密切相关。提纯菌素在制备过程中受多种因素的影响，传统的结核菌素效价测定方法是利用经菌素致敏的豚鼠进行皮试试验，并根据肿胀面积计算菌素效价。效价标定结果与豚鼠品系、个体差异、致敏状况、肿胀测量误差等因素相关，导致菌素蛋白含量与效价测定之间存在较大波动，重复性差。实践中为了克服这些困难，需要进行多次蛋白和效价的测定，计算平均值。该过程费时费力、周期长、费用高。基于上述背景，迫切需要创建结核菌素效价测定新方法，实现PPD-B和PPD-A效价测定的准确快捷。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种用于结核菌素效价标定的试剂盒、标定方法及其应用，其可提升标定效率、准确性，降低检测成本。
为了解决上述问题，作为本发明的第一方面，本发明提供了一种用于结核菌素效价标定的试剂盒，其特征在于，包括：第一单克隆抗体包被的酶标板和酶标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2；
所述单克隆抗体1A2由杂交瘤细胞株GIFN-1A2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-1A2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45344；
所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN-5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
作为上述技术方案的改进，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体5G2。
作为上述技术方案的改进，所述第二单克隆抗体通过HRP酶标记。
作为上述技术方案的改进，还包括标准品、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
作为上述技术方案的改进，所述封闭液为含有5wt％脱脂乳的PBS，所述样品稀释液为含有1wt％BSA的PBS，所述酶标抗体稀释液为含有1wt％BSA的PBST，所述洗涤液为PBST，所述显色液为TMB溶液，所述终止液为2M H2SO4溶液。
作为上述技术方案的改进，所述标准品为重组表达的豚鼠IFN-γ。
作为上述技术方案的改进，所述结核菌素为牛结核菌素或禽结核菌素。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种结核菌素效价标定的方法，其包括以下步骤：
(1)制备单克隆抗体1A2和单克隆抗体5G2；
(2)采用第一单克隆抗体包被酶标板，将第二单克隆抗体采用酶标记；其中，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2；
(3)在所述酶标板中加入待测样品，进行反应；
(4)将酶标记的第二单克隆抗体加入酶标板，进行反应，反应后显色、终止；
所述单克隆抗体1A2由杂交瘤细胞株GIFN-1A2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-1A2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45344；
所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN-5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了上述的试剂盒在制备用于牛结核病检测的试剂盒中的应用。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了上述的试剂盒在制备用于禽结核病检测的试剂盒中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明利用特异性高的单克隆抗体1A2和单克隆抗体5G2作为捕获抗体和检测抗体，其特异性好，为准确测定致敏豚鼠血液中IFN-γ浓度提供了良好的基础。此外，本发明的标定方法标定效率高，准确性高，重复性强，检测成本低。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测纯化的重组豚鼠IFN-γ蛋白图。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：纯化后的豚鼠IFN-γ。
图2为SDS-PAGE检测纯化的鼠抗豚鼠IFN-γ单克隆抗体蛋白图。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：纯化后的1A2；泳道2：纯化后的3B5；泳道3：纯化后的3B7；泳道4：纯化后的5G2；泳道5：纯化后的4F7。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
实施例1重组豚鼠IFN-γ的表达与纯化
1、重组质粒的构建及鉴定
利用Signal IP5.0在线分析GenBank中豚鼠IFN-γ的碱基序列(AY151287)，去除1-25氨基酸的信号肽序列，人工合成IFN-γ基因片段(426bp)，其序列为(SEQ NO：1)：
agatttacaaatgaaatacgcattctaaagaactactttaatgcagataactcagatgtaggagacaatgggacgctctttgtaggcattttgaagaattgccaagaggagagtgaaagaaaaatatttcagagccaaatcgtctccttctacttcaaactctttgaaaaacattttacagacaatcagactgtccaaaatagcatgaacaccatcaaggaacaaattattactaagttcttcaaagacaacagcagcaacaaggtgcaggctttcaaaaacctgattcaaatttcggtcaatgacgagcatgtccagcgccaagcgatcattgaactcaaaaaagtgatagatgacctgtcaccgaaccagaggaaacgaagaaggactcagatgctgtttcagagccggagagcatccaaataa
以合成序列为模板，利用IFN-F/R引物扩增豚鼠IFN-γ基因片段作为模板进行PCR扩增。具体的，PCR反应体系为：
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。将PCR产物与10×loading buffer混合，进行琼脂糖凝胶电泳，115V，30min，紫外凝胶成像仪下观察条带，切胶条，用胶回收试剂盒(天根生物)回收目的条带。
表1豚鼠IFN-γ基因序列引物
注：小写字母为酶切位点，斜体为Kozack序列。
用BamH I和Xba I双酶切pFastBacTM-HTA质粒(购自Thermofisher公司，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)和回收的PCR产物。酶切体系如下：
1)酶切反应Ⅰ：
充分混匀后置于金属恒温仪上，37℃温育2小时；反应结束后用胶回收试剂盒(天根生物)回收酶切产物。
2)酶切反应Ⅱ：
充分混匀后置于金属恒温仪上，37℃温育2小时；反应结束后用胶回收试剂盒(天根生物)按照操作说明回收酶切产物。
用Nanodrop测定载体和目的基因片段的酶切产物浓度，按照摩尔比4-6:1的比例进行连接，并将连接产物电转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中。从LB平板上随机挑选5个菌落做以IFN-F/R作为引物进行PCR鉴定，将阳性菌落接种于含Amp+的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取重组质粒PFastBac-IFN-γ。取1支DH10Bac感受态细胞(购自碧云天生物技术公司，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)，轻轻加入1μL重组质粒pFastBac-IFN-γ，冰浴30分钟；42℃热激90秒，迅速置于冰上静置5分钟；加入800μL LB液体培养基，37℃，160r/min培养4小时；取100μL菌液均匀的涂布于含有1‰卡那霉素、四环素和庆大霉素以及X-gal、IPTG的LB平板上；37℃温箱培养48小时，挑取白色菌落，在同样的LB平板上划线培养；37℃培养48小时左右，挑取白色菌落，接种于含有1‰卡那霉素、四环素和庆大霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养16小时。
利用杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒(碧云天)提取重组转座子Bacmid-IFN-γ，加入50μL 1×TE buffer溶解转座子，2-8℃保存备用。以提取的Bacmid-IFN-γ为模板，利用IFN-γ以及M13的上下游引物进行PCR鉴定，并将阳性质粒送上海生工测序，与GenBank公布的豚鼠IFN-γ序列(AY151287)进行比对,将测序正确的质粒转染sf21昆虫细胞。
2、转染
将对数生长期的sf21昆虫细胞(购自Thermofisher公司，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)进行细胞计数，按2×106个/well的密度铺于六孔板中，每孔加入2mL的SF 900ⅡSFM培养基，置28℃昆虫细胞培养箱中2小时，待细胞贴壁后进行转染。
溶液Ⅰ：2μg Bacmid-IFN-γ加入到100μL的SF 900ⅡSFM培养基中混匀，同时设立Bacmid作对照；
溶液Ⅱ：将8μL LipofectaminTM 2000转染试剂加入到100μL的SF 900ⅡSFM培养基中，混匀后放置时间不超过30分钟；
将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混匀，室温孵育30分钟；弃六孔板中培养基，用2mL的SF 900ⅡSFM培养基洗涤细胞，每孔加入1mL的SF-900Ⅱ培养基；向脂质体混合物中加入800μL的SF900ⅡSFM培养基，轻轻混匀；逐滴加入到培养的sf21细胞中；28℃培养5小时后弃去转染混合液，每孔加入2mL的SF 900ⅡSFM培养基；28℃培养48-72小时，收集上清中的重组杆状病毒，此为F1代毒。
将悬浮培养的sf21昆虫细胞状态调整至对数生长期，稀释细胞密度至2×106个/mL；按MOI值＝5接入F1代毒(V＝(MOI×细胞总数)/病毒滴度)，28℃，120r/min培养48小时；4℃4000r/min，离心15分钟，收集上清为F2代毒；同样的方法接F2毒，收集F3代毒。
3、蛋白表达
将悬浮培养的sf21昆虫细胞，状态调整到对数生长期后用于重组杆状病毒的表达；将细胞密度稀释至2×106个/mL，按MOI值＝5接入P3代毒，同时设置阴性对照，置于28℃摇床中，120r/min，培养48-72h；5000r/min，4℃离心10min，收集细胞沉淀，加入细胞裂解液，4℃作用30min，超声破碎5min，12000r/min离心10min，收集上清，经0.45μm滤器过滤后，用于纯化蛋白。
4、蛋白纯化
将制备的细胞裂解液上清用HisTrap FF(5mL)亲和层析柱在AKTA蛋白纯化仪上进行纯化。得到的目的蛋白用Hiprep 26/10Desulting柱子进行脱盐，将目的蛋白置换到PBS(pH值7.4)缓冲体系中，以0.22μm滤器过滤除菌后，经BCA蛋白定量法测定，纯化的IFN-γ浓度可达0.8mg/mL，SDS-PAGE显示重组IFN-γ蛋白的纯度可以达到90％以上(图1)，并将蛋白分装冻存于-80℃冰箱。
5、活性测定
采用微量细胞病变抑制法测定重组豚鼠IFN-γ的抗病毒活性。将MDBK细胞以每孔2×104个细胞铺于96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养条件下孵育4-6h，待细胞贴壁后，分别加入用测定培养液(含7％FBS的DMEM)倍比稀释后的重组IFN-γ和空载体表达蛋白做阴性对照，空白对照，平行三个重复，37℃、5％CO2条件下培养18-24h后，弃掉上清，PBS洗涤三次，以100TCID50的VSV攻毒剂量感染MDBK细胞，用攻毒培养液(含3％FBS的DMEM)，每孔100μL，同时设置阳性对照(只加VSV)、蛋白对照(只加重组IFN-γ)，1h后换成完全培养液(含10％FBS的DMEM)，37℃、5％CO2条件下作用24h，观察细胞半数病变数量，以出现50％细胞病变的最高稀释度为一个干扰素单位(IU)。按照Reed-muench法计算重组干扰素的活性(IU/mg)，结果显示，重组表达的豚鼠IFN-γ活性可以达到4×107.25IU/mg。
实施例2小鼠抗豚鼠IFN-γ单克隆抗体的制备
1、抗豚鼠IFN-γ抗体效价检测方法
将纯化后的重组蛋白IFN-γ作为包被抗原，用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤3次后，每孔加入含5％脱脂乳的PBS封闭液200μL，4℃封闭过夜，PBST洗涤5次后，在吸水纸上轻轻拍干，于-20℃冰箱保存备用。从-20℃冰箱取出酶标板恢复至室温，每孔加入100μL杂交瘤细胞培养上清液，同时加入阳性对照(融合小鼠血清作为1:2000稀释)，阴性对照(阴性小鼠血清作为1:2000稀释)，37℃恒温箱内孵育1h，弃去培养上清，PBST洗涤5次；加入HRP-山羊抗小鼠IgG二抗(SIGMA)，最佳稀释度为1:6000，每孔100μL，37℃作用1h，用PBST洗涤5次；每孔加入单组份TMB显色液(KPL)100μL，于37℃显色15min，每孔加入50μL的2M硫酸溶液终止反应，酶标仪测定OD450nm值。判定标准：以阳性血清OD450nm值约为1.0，阴性血清OD450nm值约≤0.1时系统成立，检测时以P/N值＞2.1判定为阳性。
2、单抗制备
纯化后的重组IFN-γ，按30μg/只的剂量与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经腹部皮下多点注射6周龄雌性BALB/c小鼠，之后每隔3周用同剂量的抗原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫4次，细胞融合前3天，经腹腔加强免疫1次。
将加强免疫后的BALB/c小鼠摘眼球放血致死，收集血清作为杂交瘤细胞筛选时的阳性对照，立即将其浸泡于75％的医用酒精中，静置10min，转至超净台中，将其仰面置于无菌培养皿中；用无菌打开小鼠的腹部皮肤，充分暴露腹壁；换用另一套灭菌的剪刀和镊子打开小鼠的左侧腹壁，充分暴露脾脏；分离小鼠脾脏放入预先充有含10％FBS的DMEM培养基平皿中；用灭菌的镊子夹住脾脏一端，用5mL无菌注射器吸取平皿内的培养基从脾脏另一端刺入，反复冲洗直至脾脏被洗为苍白色；将分离的脾细胞注入50mL的无菌离心管中，充分混匀后取少许进行细胞计数。
将分离的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0按3：1-5：1比例混合，用PEG4000作为融合剂，将融合后的细胞加入预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，杂交瘤细胞在含HAT的选择培养基中培养3-4天后，半量补液(融合后前3天尽量不要移动细胞板)。至7-9天时全部换为含HT的培养基继续培养。待细胞克隆长至孔底面积的1/4-1/3时，收集细胞上清。以间接ELISA方法检测细胞上清中针对IFN-γ的抗体水平，筛选P/N高的细胞株。
3、单抗细胞株亚克隆及定株
采用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆，待细胞克隆长至孔底面积的1/4-1/3时，收集细胞上清，以间接ELISA方法检测细胞上清中针对IFN-γ的抗体水平，筛选P/N高的细胞株。经过3次亚克隆，将稳定分泌抗体的细胞定株，共获得5株单克隆细胞株，1A2、3B5、3B7、4F7和5G2，利用间接ELISA法分别测定杂交瘤细胞培养上清、腹水和纯化后的单克隆抗体的效价，细胞上清中抗体效价最高达到3200以上，腹水中抗体效价达到106，纯化后单抗效价可达到105。
表2杂交瘤细胞培养上清中抗体的效价测定
利用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(Sigma)检测单抗亚类，1A2、3B5和3B7为IgG1型，4F7、5G2为IgG2a型。
采用测相加指数法检测该5株单抗针对2个不同的抗原表位(见表3)。
产生高效价单克隆抗体1A2的杂交瘤细胞株GIFN-1A2，于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.45344，其分类学命名为豚鼠IFN-γ单抗杂交瘤细胞株。
另选定产生单克隆抗体5G2的杂交瘤细胞株GIFN-5G2，于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.45343，其分类学命名为豚鼠IFN-γ单抗杂交瘤细胞株。
表3克隆抗体的识别抗原表位AI分析结果
注：按照公式AI＝(A(1+2)-A1)/A2×100％计算两种单克隆抗体叠加后的重叠率。其中A1表示第1株单克隆抗体的OD450nm值；A2表示第2株单克隆抗体的OD450nm值；A(1+2)表示2株单克隆抗体叠加后的OD450nm值。若当两抗体叠加之后的AI值大于30％时判定两株单抗识别不同位点。
实施例3标定方法的建立
1、双抗夹心ELISA方法操作步骤
抗豚鼠IFN-γ单克隆抗体用的0.1M碳酸盐缓冲液(pH值9.6)稀释至1μg/mL，100μL/孔，加入酶标板置2-8℃包被16小时，次日弃去包被液，拍干，用PBST洗涤液洗板3次，250μL/孔；弃去洗涤液，加入封闭液(含有5％脱脂乳的PBS，pH值7.2-7.4)，200μL/孔，置2-8℃封闭过夜，次日弃去封闭液，拍干，用PBST洗涤液洗板3次，200μL/孔；弃去洗涤液，拍干。加入50μL样品稀释液(含1％BSA的PBS)，和50μL待检样品，轻轻混匀，封板，室温下(22-26℃)反应60min。弃去反应液，每孔加入300μL 1×洗涤液，洗涤5次，最后1次轻轻拍干。加入HRP标记的单抗每孔100μL，室温下(22-26℃)反应60min。PBST洗涤5次后，每孔加入100μL底物显色液，室温避光反应30min，每孔加入50μL的2M H2SO4终止液，测定OD450nm值。
2、捕获抗体及检测抗体筛选
分别以1A2和5G2作为捕获抗体，以5G2-HRP、1A2-HRP作为检测抗体，进行双抗夹心ELISA，检测梯度稀释的豚鼠FN-γ，结果显示以1A2作为捕获抗体、5G2-HRP作为检测抗体对IFN-γ检测灵敏度最高，可达0.315ng/ml(表4)。
表4捕获抗体及检测抗体筛选结果
3、捕获抗体包被浓度及酶标抗体最佳工作浓度的确定
用碳酸盐缓冲液(pH值9.6)将1A2单克隆抗体稀释成8μg/ml，然后再将单抗倍比稀释5个梯度，即包被浓度分别为8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml，100μl/孔，包被酶标板，2～8℃孵育16小时；酶标记抗体5G2-HRP以1％BSA的PBS进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释；按照操作步骤检测豚鼠IFN-γ。结果显示抗体包被浓度越高、酶标抗体稀释度越低，其阳性对照检测OD450nm值也越高，但其对应的阴性样品检测值也较高，当包被浓度为1μg/ml，酶抗体稀释度为1:4000时，P/N值最高(表5)，检测效果最好。
表5捕获抗体的包被浓度及酶标记抗体的最佳工作浓度的确定
4、封闭液及封闭条件的确定
以最佳包被浓度和包被条件包被酶标板，PBST洗涤6次后，分别以3％羊血清、3％BSA、1％ BSA、5％脱脂乳、1％明胶和5％鸡血清为封闭液，200μl/孔，37℃作用2小时、4小时，2～8℃作用12小时、16小时进行封闭；参照最适酶标抗体稀释度，其余按标准操作步骤进行。结果显示，5％脱脂乳封闭液的封闭效果显著优于其他封闭液，且其在2～8℃反应12小时、16小时及37℃反应2小时的P/N值相近，因此，以5％脱脂乳2～8℃封闭最佳(表6)。
表6封闭液及封闭条件的优化结果
5、酶标抗体稀释液配方优化
按以下配方配制三种缓冲溶液作为酶标抗体稀释液：
配方一(含5％马血清的PBS)：称取Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO40.27g，马血清50ml，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。
配方二(含1％BSA的PBS)：称取Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO40.27g，BSA 10g，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。
配方三(PBS)：称取Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO4 0.27g，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。
以1A2单抗包被板和5G2-HRP检测性对照及阳性对照的OD450 nm值及P/N值，结果显示配方二作为酶标抗体稀释液的P/N值最高(表7)。
表7酶标抗体稀释液配方的确定
6、待检样品反应条件的确定
在最适包被条件、封闭条件和酶标抗体稀释度条件下，优化待检样品的最佳反应温度(37℃和室温)和作用时间(30分钟、45分钟、60分钟和90分钟)，其他参照标准步骤进行。结果显示待检样品反应温度越高，其阳性对照和阴性对照的OD450mn值也越高，但是其在室温下反应30～60分钟的P/N值介于22～25之间，较为稳定，而37℃反应时，不同时间的P/N值变化较大，并且室温反应60分钟的P/N值最高(表8)，因此待检样品的最佳反应条件为室温(22～26℃)下作用60分钟。
表8待检样品反应条件的优化结果
7、酶标抗体反应条件的确定
在最适包被条件、封闭条件和酶标抗体稀释度等条件下，优化酶标抗体的最佳反应温度(37℃和室温)和作用时间(30分钟、45分钟、60分钟和90分钟)，其他参照标准步骤进行。结果显示酶标抗体反应温度越高，其阳性对照和阴性对照的OD450 mn值也越高，室温反应60分钟的P/N值最高(表9)，因此酶标抗体的最佳反应条件为室温(22～26℃)下作用60分钟。
表9酶标抗体反应条件的优化结果
8、底物作用条件的确定
在最适包被条件、封闭条件、待检样品反应条件、酶标抗体反应条件和酶标抗体稀释度条件下，优化底物作用温度(37℃和室温)和作用时间(15分钟、30分钟、45分钟)，其它反应条件及操作步骤都不变，比较各组P/N值，结果显示底物作用温度越高、反应时间越长，则其阳性对照和阴性对照的OD450mn值也越高，但是其在室温下反应60分钟的P/N值最高(表10)，因此底物作用的最佳反应条件为室温(22～26℃)下作用30分钟。
表10酶标抗体反应条件的优化结果
9、双抗夹心ELISA方法的敏感性试验
采集20份豚鼠抗凝血，分装于24孔细胞培养板，每份抗凝血分装2孔，每孔1ml，一个孔加入40μg/mL的ConA，另一孔加入100μl的PBS，于37℃孵育24h，吸取血浆，用优化后的双抗夹心ELISA方法进行检测，结果显示这均ConA刺激的血浆样本均检测为阳性，OD450值均大于1.0，而PBS刺激样品检测均为阴性，OD450值均小于0.15。结果表明所建立的双抗夹心ELISA方法具有良好的敏感性。
10、双抗夹心ELISA方法的特异性试验
用该检测方法对犬IFN-γ、小鼠IFN-γ、牛IFN-γ、猪IFN-γ进行检测，结果均为阴性，OD450值均小于0.1，表明所建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性。
11、双抗夹心ELISA方法的重复试验
用同一批次3个不同的试剂盒检测6份阳性样本、6份阴性样本，试验结论均一致。各样品的OD450nm值的变异系数(CV，100％×OD450nm的标准差/OD450nm的平均值)均小于10％，表明本试剂盒具有良好的批内重复性(表11)。用3个不同批次试剂盒120801、120802和120803检测6份阳性样本、6份阴性样本，试验结论均一致。各份样品的OD450nm值的变异系数(CV，100％×OD450nm的标准差/OD450nm的平均值)均小于10％(表12)，表明本试剂盒具有良好的批间重复性。同一个试剂盒检测6份阳性样本、6份阴性样本，试验结论均一致。各重复孔的OD450nm值的变异系数(CV，100％×OD450nm的标准差/OD450nm的平均值)均小于10％(表13)，表明本试剂盒具有良好的板内重复性。
表11试剂盒批内重复性检验结果
221101-1 221101-2 221101-3 CV
P1 1.577 1.612 1.548 2.03％
P2 0.615 0.628 0.639 1.92％
P3 0.302 0.315 0.321 3.11％
P4 1.639 1.617 1.598 1.27％
P5 0.211 0.198 0.187 6.05％
P6 0.108 0.112 0.098 6.80％
N1 0.129 0.145 0.137 5.84％
N2 0.087 0.088 0.102 9.08％
N3 0.095 0.088 0.102 7.37％
N4 0.158 0.149 0.156 3.06％
N5 0.322 0.285 0.316 6.45％
N6 0.177 0.162 0.159 5.81％
表12试剂盒批间重复性检验结果
表13试剂盒批间板内重复性检验结果
实施例4双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备与组装
1、单克隆抗体包被酶标板的制备
将豚鼠IFN-γ单克隆抗体1A2用的0.1M碳酸盐缓冲液(pH值9.6)稀释至1μg/mL，100μL/孔，加入酶标板置2-8℃包被16小时，次日弃去包被液，拍干，用PBST洗涤液洗板3次，250μL/孔；弃去洗涤液，加入封闭液(含有5％脱脂乳的PBS，pH值7.2-7.4)，200μL/孔，置2-8℃封闭过夜，次日弃去封闭液，拍干，用PBST洗涤液洗板3次，200μL/孔；弃去洗涤液，拍干，冻存于-20℃备用。
2、HRP标记鼠抗豚鼠IFN-γ单克隆抗体的制备
将5G2单克隆抗体在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035MNaHCO3，pH9.6)中透析，其间换液2次，BCA蛋白定量法测定单抗浓度，用碳酸盐缓冲液将单抗蛋白浓度调整为2mg/mL。称取2mgHRP干粉溶于100μL超纯水中。称取NaIO4 21mg，溶于1mL的超纯水中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min，此时溶液为绿色。吸取2μL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min，此时溶液为褐色。将氧化好的HRP溶液直接加入到透析后的单克隆抗体溶液中，室温反应2h。称取0.4mg的NaBH4，溶解于20μL的超纯水中，全部加入上步反应液中，4℃静置2h，每30min摇动一次。将5G2-HRP分别转入30kDa透析袋，于PBS缓冲液中透析24h，期间换液3次。分别收集透析袋中的5G2-HRP，并用0.2μm无菌滤器过滤除菌，-80℃避光长期保存。将标记的单抗用PBS稀释，通过夹心ELISA法测定其最佳稀释度，加入酶标抗体稳定剂配成100×酶标抗体储存液，无菌分装，2-8℃避光保存。
3、标准品制备
取浓度为10ng/mL重组表达的豚鼠IFN-γ，用样品稀释液(1％BSA的PBS，pH值7.2-7.4)连续倍比稀释为7个梯度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625ng/mL)，检测前15min配制。
4、样品稀释液制备
含1％BSA的PBS：称取Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO40.27g，BSA10g，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。
5、酶标抗体稀释液制备
含1％BSA的PBS：称取Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO40.27g，BSA10g，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。
6、底物溶液制备
购自天根生物的TMB底物显色液，无菌避光分装。
7、终止液制备
2mol/L H2SO4浓硫酸44.5ml，双蒸水355.5ml，混匀后分装。
8、阴性样品制备
含5％马血清、0.05％proclin的PBS：称取Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，NaCl8.0g，KH2PO4 0.27g，马血清50ml，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。无菌分装后，2～8℃保存。
9、阳性样品制备
含8ng/ml豚鼠IFN-γ、5％马血清、0.05％proclin的PBS：称取Na2HPO41.42g，KCl0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO4 0.27g，马血清50ml，proclin300 0.5ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。并以该溶液将重组豚鼠IFN-γ稀释至终浓度为8ng/ml，无菌分装后，2～8℃保存。
实施例7双抗夹心试剂盒的保质期确定
将3批试剂盒2～8℃保存24个月，期间分别于保存当日(0个月)、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月取出，按照试剂盒成品的检验标准进行性状检验、无菌检验、敏感性和特异性检验，并与保存前检测数据进行比较。结果显示3个不同批次的试剂盒于2～8℃保存18个月，其各项检定指标均符合要求，而2～8℃保存24个月的试剂盒，其敏感性不符合要求。为确保试剂盒的质量，将试剂盒2～8℃保存期定为12个月。
实施例8试剂盒的应用
1、样品制备
选体重约400g的Hartley豚鼠10-12只，分别在大腿内侧深部肌肉注射结核杆菌致敏原(牛型或禽型)0.5mg。5周后将每只豚鼠臀部拔取一小块被毛(约3cm2，避开注射致敏原一侧)，第2日将PPD-B或PPD-A的国际参照品稀释至100IU/mL，于拔毛处皮内注射0.1mL，注射后24小时观察，注射部位皮肤红肿面积应不低于1cm2表示豚鼠致敏情况良好。选取致敏良好的豚鼠6只以上，无菌采集全血，置于肝素抗凝管中，20h内常温运输回实验室进行检测。将抗凝血无菌分装于48孔细胞培养板，0.5mL/孔，分别加入梯度稀释的待检PPD、100IU/mL的国际参照品PPD-B(或250IU/mL的国际参照品PPD-A)以及PBS，每孔50μL，轻轻混匀后，置于37℃5％CO2培养箱中温育16-24h，离心收集上清，可冻存于-80℃保存1年，4℃保存3天，-20℃保存1个月，避免反复冻存。
表14结核菌素加样示意图
2、加样
取单抗包被板(根据样品多少，可拆开分次使用)，每孔加入50μL样品稀释液(含1％BSA的PBS)，加入PPD刺激后的血浆样品50μL，轻轻混匀，封板，室温下(22-26℃)反应60分钟。弃去反应液，每孔加入300μL 1×洗涤液，洗涤5次，最后1次轻轻拍干。加样操作示意见表15：
表15ELISA检测加样示意表
样品 IFN-γ标准品 国际参照品PPD
1 10ng/mL 待标定PPD样品
2 5ng/mL
3 2.5ng/mL
4 1.25ng/mL
5 0.625ng/mL
6 0.3125ng/mL
7 0.15625ng/mL
8 0ng/mL
3、加入酶标抗体
用酶标抗体稀释液(1％BSA的PBST，pH值7.2-7.4)分别100倍稀释100×HRP-抗豚鼠IFN-γ单抗，100μL/孔，室温下(22-26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL 1×洗涤液，洗涤5次，最后1次轻轻拍干。
4、显色与终止
加入底物显色液，100μL/孔，从加入第1孔即开始计时，室温(22-26℃)避光反应30分钟。按底物显色液加入顺序，向各孔依次加入50μl终止液，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
5、数据分析
当空白对照的OD450nm＜0.15时，结果有效。
样品中IFN-γ浓度计算
以IFN-γ标准品的OD450nm为横坐标，IFN-γ标准品浓度作为纵坐标，绘制标准品的线性回归曲线，r2大于0.99时，结果有效，根据样品的OD450nm计算样品中IFN-γ浓度，再乘以其稀释倍数，即为该样品血浆中IFN-γ的浓度。
(2)待标菌素效价计算
计算每只豚鼠待标结核菌素刺激后血浆中IFN-γ浓度与国际参考品刺激后血浆中IFN-γ浓度的比值，再乘以国际参考品刺激单位则定为该结核菌素的效价，计算6只豚鼠所得的结核菌素平均效价则为待标结核菌素的最终标定效价。
计算公式为：
待标牛结核菌素效价＝100×待标牛结核菌素IFN-γ浓度÷牛结核菌素国际参照品中IFN-γ浓度
待标禽结核菌素效价＝250×待标禽结核菌素IFN-γ浓度÷禽结核菌素国际参照品中IFN-γ浓度
6、豚鼠皮试试验与IFN-γ检测法标定结核菌素效价的符合率
选取3个批次的牛结核菌素和禽结核菌素，分别按照上述方法用豚鼠皮试试验和IFN-γ检测法标定效价，结果显示两种方法均能标定结核菌素，但是皮试试验结果不稳定，与豚鼠个体状况、致敏效果相关，而本方案的稳定性、可靠性均较好，有潜力替代豚鼠皮试试验检测结核菌素效价(结果见表16)。
表16两种结核菌素标定方法结果
结核菌素批次 豚鼠皮试试验标定效价 IFN-γ检测法标定效价
PPDB-202003 110000IU/mL 100000IU/mL
PPDB-202003 100000IU/mL 100000IU/mL
PPDB-202003 105000IU/mL 100000IU/mL
PPDA-202004 58000IU/mL 60000IU/mL
PPDA-202004 59000IU/mL 60000IU/mL
PPDA-202004 62000IU/mL 60000IU/mL
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于结核菌素效价标定的试剂盒，其特征在于，包括：第一单克隆抗体包被的酶标板和酶标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2；
所述单克隆抗体1A2由杂交瘤细胞株GIFN-1A2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-1A2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45344；
所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN-5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体5G2。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二单克隆抗体通过HRP酶标记。
4.如权利要求1至3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准品、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含有5wt％脱脂乳的PBS，所述样品稀释液为含有1wt％BSA的PBS，所述酶标抗体稀释液为含有1wt％BSA的PBST，所述洗涤液为PBST，所述显色液为TMB溶液，所述终止液为2M H2SO4溶液。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为重组表达的豚鼠IFN-γ。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结核菌素为牛结核菌素或禽结核菌素。
8.一种结核菌素效价标定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备单克隆抗体1A2和单克隆抗体5G2；
(2)采用第一单克隆抗体包被酶标板，将第二单克隆抗体采用酶标记；其中，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2；
(3)在所述酶标板中加入待测样品，进行反应；
(4)将酶标记的第二单克隆抗体加入酶标板，进行反应，反应后显色、终止；
所述单克隆抗体1A2由杂交瘤细胞株GIFN-1A2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-1A2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45344；
所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN-5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN-5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
9.如权利要求1至7任一项所述的试剂盒在制备用于牛结核病检测的试剂盒中的应用。
10.如权利要求1至7任一项所述的试剂盒在制备用于禽结核病检测的试剂盒中的应用。
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