CN101982777B - 基于抗重组ul51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获elisa法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医学领域，特别涉及基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒(DPV)抗原捕获ELISA法，具体步骤包括固相抗体的制备、加待测样品、与B抗重组UL51蛋白抗体IgG反应、酶标抗体反应、显色及检测并判定；本方法特异性好，可以检测阳性DPV细胞培养液及临床采集样品泄殖腔棉拭纸中的DPV抗原，而检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E.coli菌体培养液等结果均为阴性；该方法批内和批间重复试验显示变异系数分别为0.81％～1.68％和0.99％～2.82％，小于5％，能检出16ng/mL病毒抗原。

Description

基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法。

背景技术

鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV)，DPV是一种泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4～5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，而导致许多假阳性结果出现。

ELISA方法是免疫学检验中最重要、也是最常用的方法，目前，应用抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法对病毒进行检测的研究已有许多报道。在检测DPV方法中，贾仁勇在《鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究》中公开了已有基于UL24重组蛋白抗体的AC-ELISA的报道，该方法用兔抗UL24重组蛋白多克隆抗体包被酶标板，以鸭抗重组UL24蛋白多克隆抗体作为抗原捕获抗体，建立了敏感性、特异性、重复性好的DPV抗原捕获ELISA检测方法。UL51蛋白为鸭瘟病毒的一种皮层蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性，用抗重组UL51蛋白多克隆抗体建立检测DPV的AC-ELISA方法至今无报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原检测方法，该方法特异性和敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法，其能捕获16ng/mL鸭瘟病毒抗原。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，具体步骤为：

a固相抗体的制备：将浓度大于或等于12.5μg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG与固相载体连结，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗体及杂质，得固相抗体；

b加待测样品：将待测样品与步骤a所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗复合物；

c与B抗重组UL51蛋白抗体IgG反应：将浓度大于或等于25μg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG与步骤b所得抗原-A抗复合物保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗-B抗复合物；

d与酶标抗体反应：将酶标抗体作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标抗体稀释液，将酶标抗体稀释液与步骤c所得抗原-A抗-B抗复合物保温反应，得抗原-A抗-B抗复合物-酶标抗体复合物；

e显色：在步骤d所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

f检测及结果判定：将步骤e所得显色样品液用酶标仪测定OD_450nm值，当OD_450nm值＞0.265时判为阳性，当OD_450nm≤0.265时判为阴性。

步骤a所述的A抗重组UL51蛋白抗体IgG中A为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物，步骤c所述的B抗重组UL51蛋白抗体IgG中B为免疫学研究中常规实验动物中除A外的任一种动物，步骤d中所述酶标抗体为HRP标记的免疫学研究中常规实验动物中除A和B外的动物抗B IgG。

进一步，所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，具体步骤为：

a固相抗体的制备：将浓度等于12.5μg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG与固相载体连结，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗体及杂质，得固相抗体；

b加待测样品：将待测样品与步骤a所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗复合物；

c与B抗重组UL51蛋白抗体IgG反应：将浓度等于25μg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG与步骤b所得抗原-A抗复合物保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗-B抗复合物；

d与酶标抗体反应：将酶标抗体作体积等于2000倍的稀释，得酶标抗体稀释液，将酶标抗体稀释液与步骤c所得抗原-A抗-B抗复合物保温反应，得抗原-A抗-B抗复合物-酶标抗体复合物；

e显色：在步骤d所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

f检测及结果判定：将步骤e所得显色样品液用酶标仪测定OD_450nm值，当OD_450nm值＞0.265时判为阳性，当OD_450nm≤0.265时判为阴性。

进一步，步骤a中所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG、步骤b中所述待测样品、步骤c中所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG及步骤d中酶标抗体稀释液的加入量为等体积；

进一步，步骤a中所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG、步骤b中所述待测样品、步骤c中所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG及步骤d中酶标抗体稀释液的加入量为100～200μl；

进一步，步骤a中所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG为鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG，步骤c中所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，步骤d中所述酶标抗体为羊抗兔IgG-HRP；

进一步，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺；

进一步，步骤e中避光显色的时间为20分钟；

进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。

本发明的有益效果在于：本发明基于抗重组UL51蛋白抗体建立的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)法，其特异性好，可以检测阳性DPV(鸭瘟病毒)细胞培养液及临床采集样品泄殖腔棉拭纸中的DPV抗原，而检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E.coli菌体培养液等结果均为阴性；该方法批内和批间重复试验显示变异系数分别为0.81％～1.68％和0.99％～2.82％，小于5％，能检出16ng/mL病毒抗原。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1-A为DPV UL51基因的PCR扩增：M指DL2000相对分子质量标准，1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物，2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图1-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图1-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组表达载体pET28a-UL51，2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。

图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准，1为阴性对照(未加IPTG诱导)，2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-7的IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L；图2-C为不同温度诱导pET28a-UL51表达结果：1-3的温度分别为20、30和37℃；图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果：1-7的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。

图3-A为重组UL51蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析：M为蛋白质分子量，1为IPTG诱导的1ml菌液，2为粗提的UL51蛋白包涵体，3为50mM咪唑洗脱峰(不含纯化的重组UL51蛋白)；4为300mM咪唑洗脱峰(含有纯化的重组UL51蛋白)；图3-B为纯化的兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的SDS-PAGE分析：M指标准蛋白质分子量，1指过柱纯化的兔抗UL51蛋白抗体IgG。

图4为琼脂糖凝胶扩散试验检测兔抗重组UL51蛋白高免血清效价测定。

图5为纯化的抗重组UL51蛋白抗体的SDS-PAGE分析：M.标准蛋白质分子量(KD)；1.过柱纯化兔抗UL51蛋白抗体IgG；2.过柱纯化鼠抗UL51蛋白抗体IgG。

图6为本方法的特异性试验结果照片图。

图7为本方法的敏感性试验结果照片图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例中将所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀，再通过超声波破碎菌体、重组UL51蛋白包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；用所述重组UL51蛋白对兔和鼠进行常规免疫程序和纯化，获得兔抗重组UL51蛋白抗体IgG和鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG；进一步确定了兔抗重组UL51蛋白抗体IgG和鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG的最佳浓度范围及酶标抗体最适浓度及阴阳性临界值的确定，制定了一种特异性和敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法，其能捕获16ng/mL鸭瘟病毒抗原。

实施例基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA检测方法

一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及UL51蛋白的纯化

1材料准备

1.1菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.2试验动物

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；健康雄性白兔4只，体重2-3kg/只，购自雅安某兔场；健康Vista大鼠20只，购自四川大学。

2实验方法

2.1DPV UL51基因的克隆

2.1.1引物设计

利用Primer Premier5.0软件，参考UL51基因序列(GenBank登录号：DQ072725)，由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL51F：

5’-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3’(划线部分为EcoRI位点)；引物DPV-UL51R：5’-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’(划线部分为XhoI位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

2.1.2DPV基因组DNA的提取

a、正常鸭胚成纤维细胞(DEF)的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用5％碘酒和75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(2.5％胰蛋白酶)150μl/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

b、DPV增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2～3mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附120min后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

c、DNA提取方法：直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60％～70％的DEF(100mL细胞瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10min；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/LNaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60min；(6)13000r/min离心20min，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30min，-20℃保存备用。

2.1.3PCR扩增DPV UL51基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取4μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，设DL2000和空白对照，观察扩增片段的长度。

2.1.4UL51基因PCR产物的回收

按北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。

2.1.5纯化的UL51基因与pMD18-T的连接

连接反应体系如下：

将上述试剂加入0.2mL的EP管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

2.1.6DH5a感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5a株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5a单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2)取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃200r/min振荡培养2.5～3h，使OD₆₀₀＝0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃4000r/min离心8min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为200μL/管，直接用于转化或置于-70℃冰箱中保存备用。

2.1.7转化感受态细胞

将10μL连接体系全部取出加到200μL DH5a感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入0.8mL LB培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μL涂于含(X-gal/IPTG/Kan)的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于5mL LB(含50μg/mL Kan)中，37℃水浴振荡培养18h后进行质粒抽提。

2.1.8质粒的抽提

按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。

2.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD18-UL51，分别以EcoR I/XhoI双酶切消化与Xho I单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

2.1.10UL51基因序列测定

将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

2.2原核表达质粒pET28a-UL51的构建、诱导表达与表达条件优化

2.2.1原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定

a目的片段的酶切与连接：限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切pMD18-UL51质粒和原核表达载体pET28a(+)，酶切体系均为：

37℃水浴4h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

b重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5a感受态细胞。之后，取连接液15μL加到含200μL感受态DH5a的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90sec，然后迅速冰浴2min；加入不含Kan的LB液体培养基800μL，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μL培养物涂布于含100μg/mL Kan的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，同时设立空载体转化组(空载体10μL+感受态DH5a 200μL)、无载体对照组(灭菌超纯水10μL+感受态DH5a 200μL)。

c重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL的LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用XhoI单酶切、EcoR I和Xho I双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下：

然后，以重组质粒为模板，利用方法2.1.1中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET28a-UL51。

2.2.2重组表达质粒pET28a-UL51的诱导表达

a重组质粒pET28a-UL51的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET28a-UL51的DH5a菌种划线接种于含Kan 50g/mL的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于5mLLB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16h，离心收集菌液，按UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

b重组质粒pET28a-UL51转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli BL(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET28a-UL51转化到表达宿主菌E.coli BL(DE3)中。

c重组质粒pET28a-UL51的诱导表达：从上述LB固体培养基(含Kan 50μg/mL)上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1∶50的比例接入5mLLB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀＝0.4时，分别加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导3h后，收集1mL培养菌液，4℃13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

d重组质粒pET28a-UL51表达产物的可溶性分析：将诱导表达的100mL菌液和未诱导表达的100mL菌液，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃，10000r/min离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用10mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和Quantity One软件分析诱导菌液中重组蛋白在胞浆(上清①，可溶性)和沉淀中(沉淀②，包涵体形式)的相对百分含量。

2.2.3重组质粒pET28a-UL51表达条件的优化

a诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mLLB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取其中7只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L 37℃诱导培养4h后，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

b温度条件优化：取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，分别置于20℃、30℃、37℃诱导培养4h，按上述常规方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

c诱导时间优化：取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)上，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)上，继续培养至OD₆₀₀值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养，分别于诱导后0、1、2、3、4、5、6、7、8h，吸取1mL培养液，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3重组UL51蛋白的大量制备、纯化与复性

2.3.1重组UL51蛋白的大量制备(包涵体处理)

将诱导表达1000mL菌液，4℃、10000r/min离心10min，将菌体沉淀用40mL20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后按1mg/mL加溶菌酶，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃、10000r/min离心10min。将沉淀用20mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100悬浮，4℃、10000r/min离心10min后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀，4℃保存备用。

2.3.2重组UL51蛋白的纯化

镍琼脂糖凝胶(Ni²⁺-NAT)亲和层析纯化重组UL51蛋白：根据融合蛋白的6-His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：(1)装柱：镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；(2)平衡：用平衡缓冲液I约5个床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；(3)上样：将0.45μm滤膜过滤的可溶性包涵体样品约5mL，加入层析柱中，流速为0.5mL/min；(4)洗涤：用平衡缓冲液II再洗2-5个床体积，流速为1mL/min；(5)洗脱：分别用含50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液III进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；(4)清洗：用超纯水洗5个柱床体积，再用25％的乙醇洗3个柱床体积，流速为1mL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4℃中保存。

2.3.3重组UL51蛋白的复性

将过柱纯化的重组UL51蛋白，于4℃在不同浓度的尿素溶液(6、4、3、2、1、0mol/L)中梯度透析，使变性蛋白逐渐复性，并用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后备用。

3实验结果

3.1DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

3.1.1UL51基因的PCR扩增结果

以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对UL51基因进行PCR扩增，其产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约760bp的特异性DNA条带，而以正常DEF基因组DNA为模板进行PCR扩增，无特异性条带，这与预期结果一致(图1-A)。

3.1.2UL51基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-UL51。对pMD18-UL51进行PCR、酶切(图1-B：重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)和测序鉴定，结果表明，T克隆获得的UL51基因序列同已知的DPV UL51基因序列完全一致。

3.2原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET28a-UL51的构建与酶切鉴定

以EcoR I和Xho I双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET-28a(+)表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET28a-UL51，该理论大小约为6130bp，经EcoR I和Xho I双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370bp和760bp(见图1-C)，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建。

3.2.2重组质粒pET28a-UL51的诱导表达

a重组质粒pET28a-UL51的诱导表达将重组质粒pET28a-UL51转化表达：菌株BL21(DE3)，在含Kan的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达、未用IPTG诱导、空载体pET-28a(+)转化菌株诱导表达，结果表明：空载体pET-28a(+)转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋白条带；重组表达质粒pET28a-UL51表达的重组UL51蛋白在34KD处(图2-A)。

b重组质粒pET28a-UL51表达产物的可溶性分析：诱导表达的100mL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示：表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中大量以不溶的包涵体形式存在。同时Quantity One软件分析显示：诱导菌液中重组蛋白在胞浆上清(可溶性)和沉淀中(包涵体形式)的相对百分含量分别为6.72％和93.28％。

3.2.3重组质粒pET28a-UL51表达条件的优化

a IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L诱导培养4h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量逐渐增加，当增加到0.8mmol/L蛋白表达量达到最大；其后再增大IPTG浓度到1.0mmol/和1.2mmol/L时，其蛋白表达量与0.8mmol/L时没有明显差别(图2-B)。因此，可选择0.8mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

b诱导温度条件的优化：37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取3只灭菌试管，分装5mL/管，分别加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，分别置于20℃、30℃、37℃诱导培养4h，结果：温度在20℃时，诱导蛋白量较少，37℃时最高(图2-C)，说明随着温度升高，蛋白诱导量逐渐增加。因此，选择温度37℃为最佳诱导温度。

c诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.8mmol/L，37℃条件下，采用1～8h不同诱导时间进行诱导表达，结果1h时几乎无特异的蛋白条带产生；诱导1～3h的重组蛋白表达量均低于4h诱导组；诱导5～8h，其重组蛋白表达量同4h相比无明显变化(图2-D)。因此，选择4h作为最佳诱导时间。

3.3重组UL51蛋白的纯化结果

表达产物经过溶菌酶裂解、超声波破碎、尿素洗涤等一系列前处理后，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组UL51蛋白。UL51蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为50mmol咪唑洗脱峰，峰3为300mmol咪唑洗脱峰。同时收集不同浓度咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验纯度及浓度，结果显示：只有300mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的重组UL51蛋白(图3-A)。将纯化的重组UL51蛋白透析复性后，用Bradford法测定蛋白的终浓度，并将其稀释为1mg/mL，分装后备用。

二基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原检测方法

1抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备和纯化

1.1弗氏佐剂

a弗氏不完全佐剂：液体石蜡油3份，羊毛脂1份，混合均匀，115℃，15min高压灭菌后得弗氏不完全佐剂。使用前加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理；b弗氏完全佐剂：在上述基础上添加卡介苗至终浓度1mg/mL即可，使用时将抗原溶液与其等量混合，充分乳化。

1.2兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的制备和纯化

1.2.1兔抗重组UL51蛋白抗体的制备(重复进行三次此试验，每次间隔1周，以制备三个不同批次的抗体)

a免疫原的制备：将纯化并复性后的重组UL51蛋白，首免与等量完全弗氏佐剂混合并充分乳化，第二、三免与不完全弗氏佐剂混合并充分乳化，第四免不加佐剂。

b免疫程序：选择健康雄兔4只，首免前一天分别采血，分离血清作为阴性对照。制备兔抗UL51高免血清免疫程序如下表：

四免后14d颈动脉放血，收集血液。37℃放置1h，4℃冰箱过夜。第二天析出血清，血凝块以4000r/min离心15min再次收集血清，-20℃保存备用。

按双向琼扩法，用100mL 0.85％NaCl溶液溶解1g琼脂糖，115℃高压灭菌10min后，倒入培养皿中，制成4mm后的凝胶板。用打孔器在凝胶板上打孔，将倍比稀释的血清(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32)和阴性兔血清分别滴于梅花形外周孔内，中间孔滴加纯化的重组UL51蛋白或DPV，37℃湿盒孵育24～48h，观察琼扩结果。结果显示，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32均出现清晰可见的琼扩沉淀线，而阴性兔血清无沉淀线(图4)，这表明重组UL51蛋白，具有较好的抗原性并能与DPV反应。本实施例中的稀释均按体积比稀释方式进行。

1.2.2兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的纯化

a正辛酸-硫酸铵法粗提兔抗重组UL51蛋白抗体IgG：粗提兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，步骤如下：(1)取分离的10mL血清加入等量的0.06mol/LpH4.8醋酸盐缓冲液，混匀；(2)室温搅拌下逐滴加入正辛酸75μg/mL血清，室温搅拌30min，4℃静置＞3h，使其充分沉淀后，13000r/min离心30min；(3)取上清用滤纸过滤，向滤液中加入1/10体积的10mmol/LpH7.4的PBS，用2mol/L NaOH调节pH＝7.4；(4)冰浴下向液体中缓缓加入饱和硫酸铵0.277g/mL使其终浓度达到45％，搅拌30min，置4℃静置＞3h或过夜，13000r/min离心30min弃上清液；(4)按1∶4的比例向沉淀中加入PBS，充分吹打使其充分溶解；(5)将溶解液装入透析袋中，在4℃下用10mmol/L pH7.4PBS透析，每6h换液一次，直至奈氏试剂检测透析液中无沉淀产生为止。

b High Q柱阴离子交换色谱法纯化兔抗重组UL51蛋白抗体IgG：纯化抗体IgG，步骤如下：(1)样品前处理：将粗提IgG用0.45μm滤膜过滤去除杂质，以缓冲液A(pH8.0，20mmol/L Tris-HCl缓冲液)在4℃条件下进行透析平衡过夜；(2)色谱柱前处理：经过0.5mol/LNaOH、水洗、1.0mol/LNaCl、水洗等前处理，且以缓冲液A平衡HighQ色谱柱；(3)上样：取5mL的粗提IgG样品；(4)清洗：用50mL缓冲液A平衡并洗下未结合的蛋白质和杂质；(5)洗脱：以缓冲液B(1.0mol/L NaCl)进行线性梯度离子强度洗脱，流速0.5mL/min，洗脱时间为200min，分部收集洗脱组分。

c抗体IgG纯度和浓度测定：将收集到的洗脱峰样品处理后，进行SDS-PAGE电泳(图3-B和图5)，测定抗体IgG的纯度，并用Bradford法测定抗体IgG的最终浓度，并将其稀释为2mg/mL，分装后于-20℃保存备用。

1.3鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG的制备和纯化(重复进行三次此试验，每次间隔1周，以制备三个不同批次的抗体)

具体包括(1)免疫原的制备：将纯化的重组UL51蛋白，首免与等量完全弗氏佐剂混合乳化充分，第二、三免与不完全弗氏佐剂混合乳化充分，第四免不加佐剂。(2)免疫程序：选择健康Vista大鼠20只，首免前一天分别采血，分离血清作阴性对照。制备鼠抗重组UL51蛋白高免血清免疫程序如表1。四免后14d摘眼球放血，收集血液。37℃放置1h，4℃冰箱过夜。第二天析出血清，血凝块以4000r/min离心15min再次收集血清，-20℃保存备用。(3)双向琼扩法测定鼠抗重组UL51蛋白高免血清的效价为1∶64。其它可参照兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的制备和纯化。

表1鼠抗重组UL51蛋白多克隆抗体的免疫程序

鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG的纯化：多克隆抗体的纯化参照兔抗纯化步骤，将得到的鼠抗重组UL51蛋白抗血清进行纯化，用Bradford法测定抗体IgG的最终浓度，并将其稀释为2mg/mL，分装后于-20℃保存备用。分别对纯化后的鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG进行SDS-PAGE鉴定(图5)，结果表明该抗体IgG具有很高的纯度。用Bradford法测定两种抗体IgG的最终浓度，并将其稀释为2mg/mL，分装后于-20℃保存备用。本实施例中，将所制备的两种重组UL51蛋白抗体的动物选为大鼠和兔，也可选用其他不同种属动物。

1.4检测菌株、毒株

正常鸭胚成纤维细胞(DEF)培养液、含DPV强毒的DEF培养液、含鸭病毒性肝炎病毒(Duck virus hepatitis，DHV)的鸭胚尿囊液、含鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)的菌体培养液和含鸭大肠杆菌(E.coli)的菌体培养液均由本实验室提供。

1.5其它试剂

ELISA相关溶液；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(羊抗兔IgG-HRP)和四甲基联苯胺(TMB)均购自美国KPL公司；其它常规试剂如0.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.2)均按常规方法配置。

2实验方法

2.1待测样品的获得

2.1.1细胞培养液、鸭胚尿囊液或菌体培养液的处理

将待检的液体样品进行以下裂解处理：向待检样品液中加入等体积的裂解液[2％TritonX-100/PBS(0.01mol/L，PH＝7.2)溶液]作用5min(剧烈振荡)，12000r/min、4℃离心5min，收集上清液，得待测样品。

2.1.2泄殖腔棉拭子样品的处理

泄殖腔棉拭子的处理方法如下：用无菌棉拭子擦试病鸭泄殖腔后，放入盛有约500μL生理盐水的灭菌EP管中，将EP管在旋涡振荡器上剧烈振荡1～3min后，用无菌镊子将棉拭子在EP管壁上反复挤压后取出，余下的的液体按细胞培养液、鸭胚尿囊液或菌体培养液的方法处理后得待测样品。

3基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法检测DPV抗原方法的建立

3.1最佳鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG最佳浓度的确定

采用方阵滴定法，具体步骤如下：(1)将鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG用包被液倍比稀释(1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640)，包被酶标板，100μL/孔，置4℃湿盒孵育过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(2)加入100μL/孔封闭液，37℃湿盒封闭1h，洗板机洗涤1次，5min/次，拍干；(3)加入待测样品，100μL/孔，37℃湿盒作用，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(4)将兔抗重组UL51蛋白抗体IgG倍比稀释(1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640)，加入酶标板中，100μL/L，37℃湿盒孵育1h，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(5)加入1∶2000稀释的羊抗兔IgG-HRP，100μL/孔，37℃反应45min，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(6)加入TMB底物100μL/孔，25℃避光显色20min后，加入50μL/孔2mol/L硫酸终止反应；(7)检测：用酶标仪测OD_450nm值。同时以1％的BSA/PBS溶液作空白对照，以P/N值最大的鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的稀释度为最佳工作浓度。

分别将鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG作系列稀释，进行方阵试验，结果见表2。方阵滴定结果显示，当鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG 1∶160倍稀释，兔抗重组UL51蛋白抗体IgG以1∶80倍稀释时，OD_450nm值大于1.0，阴阳性血清OD_450nm比值(P/N)最大。因此选择鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG的最佳包被浓度为1∶160，即浓度为12.5μg/mL；兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的最佳稀释倍数为1∶80，即最佳包被浓度为25μg/mL，上述最佳包被浓度均为阈浓度，在大于阈浓度时，同样可以实现相同的作用，但经济成本增加。

表2鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG最佳工作浓度的确定

3.3.2酶标抗体最适浓度的确定

以浓度为12.5μg/mL鼠抗重组UL51蛋白抗体浓度包被酶标板，加入待测样品，再加入浓度为25μg/mL兔抗重组UL51蛋白抗体，将酶标抗体做1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000系列稀释后进行AC-ELISA测定，选择P/N值最大时的酶标抗体浓度作为最佳工作浓度。

根据确定的鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG最佳工作浓度，将酶标羊抗兔抗体IgG作不同的稀释，进行AC-ELISA试验，每个稀释度重复3次，求出样品的平均P值和N值，确定酶标羊抗兔抗体IgG的最佳工作浓度。结果见表3，当酶标羊抗兔抗体IgG作1∶2000稀释时，P/N值最大为7.113，因此确定最佳酶标抗体稀释倍数为2000。其中2000为稀释倍数阈值，当稀释倍数小于2000时，同样可以实现相同的作用。

表3酶标抗体最佳工作浓度的确定

3.3.3阴阳性临界值的确定

取16份DPV阴性鸭的泄殖腔棉拭子，按照上述建立的基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA的方法检测，同时以1％的BSA/PBS溶液作空白对照。将16份棉拭子样品的OD值的平均值(X)和3倍标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限，即待检棉拭子样品的OD值＞X+3SD时，判断为阳性；否则为阴性。

通过对16份DPV阴性鸭的泄殖腔棉拭子样品进行检测(表4)，求得其X值为0.131，SD值为0.045，确定阴阳性临界点为X+3SD＝0.131+3×0.045＝0.265。即待测样品的OD_450nm值大于0.265为DPV阳性，小于或等于则为阴性。

表416份DPV阴性样品的AC-ELISA检测结果

3.2.4特异性试验

取正常DEF培养液、含DPV的DEF培养液、含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E.coli菌体培养液各3份，按照本实施例中的方法进行检测，观察结果。

按照建立的AC-ELISA方法，分别对正常DEF培养液、含DPV的DEF培养液、含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E.coli菌体培养液进行检验，结果见表5和图6。

表5AC-ELISA特异性试验结果

3.2.5敏感性检测结果

将含DPV的DEF培养液作倍比稀释(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280)，100μL/孔加于酶标板中，每个稀释度重复3次，按建立的AC-ELISA方法检测，同时设定阴性对照(正常DEF细胞)和空白(PBS)对照。

按照建立的AC-ELISA方法，将含DPV的DEF培养液作一系列倍比稀释，结果见表6和图7。将含DPV的DEF培养液稀释至1∶640倍时，浓度为0.16μg/mL时，OD_450nm值为0.268，稍大于临界值0.265，AC-ELISA呈现弱阳性反应，由于在每一酶标孔中加100μL，因此，检测含DPV的DEF培养液中病毒蛋白最低含量为16ng。

表6AC-ELISA敏感性试验结果

3.2.6重复性试验结果

(1)批内重复性测定试验：取3份不同时间收集到的含DPV的DEF培养液，按最佳稀释度稀释，加到抗原包被孔中，每份样品做3次重复ELISA测定。由每份样品的OD_450nm值计算出平均OD_450nm值(X)与标准方差(SD)，进而计算出每份样品批内变异系数[CV＝(SD/X)×100％]；(2)批间重复性测定试验：在其它条件相同的情况下，用3份不同批次制备的纯化的鼠抗重组UL51蛋白抗体包被酶标板，对3份不同时间收集到的含DPV的DEF培养液进行检测。由每份样品的OD_450nm值计算出平均OD_450nm值(X)与SD，进而计算出每份样品的批间变异系数。

经统计学分析，3份不同时间收集到的含DPV的DEF培养液之间批内重复试验OD_450nm值的变异系数(CV)为0.81％～1.68％，小于5％；3份不同时间收集到的含DPV的DEF培养液的3次批间重复试验OD_450nm值的CV为0.99％～2.82％，小于5％(表7)。表明建立的AC-ELISA方法具有很好的批内及批间重复性。

表7重复性试验结果

4讨论

本实施例建立的AC-ELISA法应用了双抗体夹心法的工作原理，此法是检测抗原的常规方法，具有较强的特异性，非常适合于检验各种大分子抗原。传统方法中的2种抗体是用病毒免疫不同种属动物制备得到的，而本实施例中的2种抗体则是用重组UL51蛋白免疫不同种属动物制备得到的。

就基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法而言，对人工感染DPV鸭的检测结果表明，基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法的阳性率为100％；并且，本方法与常规PCR方法检测鸭瘟病毒的结果符合率为100％。然而，其中的PCR检测方法的DNA模板的制备过程非常复杂，而且很容易造成污染，导致结果为假阳性。基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法对DPV的最小检出量为16ng/mL，敏感度高。在检测鸭瘟病毒时若能同时运用基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA和其它方法，相互辅助，将会为临床DPV检测带来了很大的方便。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (3)

1.基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，其特征在于，具体步骤为：

a固相抗体的制备：将浓度等于12.5μg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG与固相载体连结，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗体及杂质，得固相抗体；

b加待测样品：将待测样品与步骤a所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗复合物；

c与B抗重组UL51蛋白抗体IgG反应：将浓度等于25μg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG与步骤b所得抗原-A抗复合物保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗-B抗复合物；

d与酶标抗体反应：将酶标抗体作体积等于2000倍的稀释，得酶标抗体稀释液，将酶标抗体稀释液与步骤c所得抗原-A抗-B抗复合物保温反应，得抗原-A抗-B抗复合物-酶标抗体复合物；

e显色：在步骤d所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

f检测及结果判定：将步骤e所得显色样品液用酶标仪测定OD_450nm值，当OD_450nm值＞0.265时判为阳性，当OD_450nm≤0.265时判为阴性；

步骤a中所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG、步骤b中所述待测样品、步骤c中所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG及步骤d中酶标抗体稀释液的加入量为等体积且为100～200μl；

步骤a中所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG为鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG，步骤c中所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，步骤d中所述酶标抗体为羊抗兔IgG-HRP，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺。

2.根据权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，其特征在于：步骤e中避光显色的时间为20分钟。

3.根据权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，其特征在于：所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。

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