CN102360008B - 基于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的试剂盒及其运用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，特别涉及检测鸭瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法，所述ELISA试剂盒由固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液组成，所述抗体捕获剂为鸭瘟病毒gG截段重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示;检测方法包括：固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色、检测并判定几步骤；本试剂盒特异性、敏感性及稳定性好；本检测方法操作简单。

Description

基于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的试剂盒及其运用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及检测鸭瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法。

背景技术

鸭瘟(Duck Plague,DP)是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、接触性传染的败血性传染病。该病可导致商品水禽产蛋量下降及死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的临床表现为精神沉郁，高热稽留，两腿麻痹、下痢、流泪，部分病鸭头颈肿大,是一种广泛嗜全身性感染的传染病，临床以急性败血症过程为特征；病理剖解特征是血管损伤，组织器官出血，消化道出血、炎症和坏死，消化道粘膜某些特定部位有疹状损害，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化，其发病率和死亡率都甚高。近年来，随着养鸭业生产向集约化、规模化的方向发展，鸭瘟作为威胁养鸭业最严重的接触性传染病之一，造成了巨大的经济损失。

过去对鸭瘟病毒血清抗体的检测方法主要是利用全病毒作为抗原进行检测，但传统的病毒分离鉴定方法大约需要4～5天，方法繁琐，费时费力，且纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，导致假阳性结果出现。

发明内容

本发明的目的之一在于提供鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的应用，该应用为鸭瘟病毒的抗体检测提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白在制备鸭瘟病毒抗体的诊断试剂中的应用,所述鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之二在于提供一种ELISA试剂盒，其用于检测鸭瘟病毒时特异性、敏感性及稳定性高。

为实现上述方案，本发明的技术方案为：

基于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，所述抗体捕获剂为如SEQ ID NO:1所示的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白。

进一步，所述抗体捕获剂为浓度≥25μg/mL的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白。

进一步，所述酶标二抗为作2000倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。

本发明的目的之三在于提供一种鸭瘟病毒抗体的检测方法，该方法操作简单，适用于大规模应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为:

用所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，所述方法还包括平行的阴性实验，具体为：

A、将鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

B、将待检血清通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测测OD_450nm值，待检血清的OD_450nm值＞阴性样品OD_450nm值的临界值，即X+3SD时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品OD_450nm值的均值，SD为阴性样品OD_450nm值的标准方差。

进一步，所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法具体为：

A、将浓度≥25μg/mL的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

B、将待检血清作80倍稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将羊抗鸭IgG-HRP作2000倍体积稀释的后与与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测测OD_450nm值，待检血清的OD450nm值＞0.22时则为阳性，反之则为阴性。

进一步，步骤A中所述鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积。

本发明的有益效果在于：鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白是选取鸭瘟病毒（DPV）gG基因编码蛋白的主要抗原域（68aa-377aa），并命名为gGM；然后利用基因工程技术，将其进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是gGM/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为50kDa，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。

采用本发明的方法生产的产品可用于：

① 本产品可作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法的检测抗原。

② 可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。

本发明的产品优点体现在：

① 由于该检测抗原是鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白，并非全病毒，以此应用该检测抗原进行检测时无散毒危险。

② 作为ELISA抗原检测鸭瘟病毒抗体，特异性强，无交叉反应。

③ 性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。

附图说明

     图1为gG截段基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为gG截段基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带，M为DNA Marker。

    图2为重组质粒pMD18-gGM的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为DNA Marker，1为重组质粒pMD18-gGM 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。

图3为pET32a-gGM的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为DNA Marker，1为重组表达质粒pET32a-gGM用XhoⅠ单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的一条特异性条带，2为重组表达质粒pET32a-gGM用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。

图4为重组表达质粒pET32a-gGM表达的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1为重组表达质粒pET32a-gGM用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果，2为重组表达质粒pET32a-gGM用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果，3为重组表达质粒pET32a-gGM未用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，4为重组表达质粒pET32a-gGM用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果，5为空载体pET-32a(+)未用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，6为空载体pET-32a(+)用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果。

图5为不同IPTG浓度下含有重组质粒pET32a-gGM的宿主菌E.coli BL21 (DE3)表达鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质Marker，1为IPTG的终浓度为1.2 mmol/L，2为IPTG的终浓度为1.0 mmol/L，3为IPTG的终浓度为0.8 mmol/L，4为IPTG的终浓度为0.5mmol/L，5为IPTG的终浓度为0.2 mmol/L，6为IPTG的终浓度为0 mmol/L。

图6为不同温度下含有重组质粒pET32a-gGM的宿主菌E.coli BL21 (DE3)表达鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质Marker，1为诱导温度为25℃，2为诱导温度为30℃，3为诱导温度为37℃；

图7为不同诱导时间下含有重组质粒pET32a-gGM的宿主菌E.coli BL21 (DE3)表达鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1为诱导12h，2为诱导6h，3为诱导5h，4为诱导4h，5为诱导3h，6为诱导2h，7为诱导0h。

图8为镍琼脂糖凝胶（Ni²⁺-NAT）亲和层析纯化后的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1为经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的gG截段重组蛋白。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺gln Q;甘氨酸 gly G；丝氨酸 ser S；丙氨酸 ala A；苏氨酸 thr T；缬氨酸 val V；异亮氨酸 ile I；亮氨酸 leu L；酪氨酸 tyr Y；苯丙氨酸 phe F；组氨酸 his H；脯氨酸 pro P；天冬酰胺 asn N；甲硫氨酸 met M；谷氨酸 glu E；色氨酸 trp W；赖氨酸 lys K；半胱氨酸 cys C；精氨酸 arg R; 天冬氨酸Asp D。

下述稀释的方式是以体积比方式进行。

     实施例1 鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的制备

一 材料准备

1 菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET32a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5α、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺（TMB）均购自美国KPL公司，羊抗鸭IgG-HRP的为冻干剂，分装为0.1mg/瓶，使用时按说明书溶解为1mL。

2 试验动物

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性。

3 实验方法

3.1 DPV gG基因的克隆

3.1.1引物设计

根据gG基因编码的氨基酸序列主要抗原域（68aa-377aa并命名为gGM），利用Primer Premier5.0 软件设计一对引物。如SEQ ID NO:3所示的上游引物: 5’- ggatcccacacaggacgatatgag -3’(划线部分为BamHⅠ 位点)；如SEQ ID NO:4所示的下游引物: 5’- ctcgagatgagggtgattgtggtag -3’(划线部分为XhoⅠ 位点)。引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

3.1.2 DPV基因组DNA的提取

a、正常鸭胚成纤维细胞（DEF）的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用体积分数为5％碘酒和体积分数为75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm³大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂（体积分数为2.5%胰蛋白酶）150μL/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min 离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用6层纱布过滤，向滤液中加入体积分数为10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

b、 DPV增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2-3mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附1h后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/mL 双抗的MEM 维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

c、 DNA提取方法：直接从感染的DEF中提取DPV基因组DNA，具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变（CPE）达80％的DEF；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10分钟；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30-60分钟；(6)13000r/分钟离心20分钟，沉淀用预冷的体积分数为70%的乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30分钟，-20℃保存备用。

3.1.3 PCR 扩增鸭瘟病毒 gG截段基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃ 5min，然后进入94℃ 50s、58℃ 50s、72℃ 90s，共30个循环，最后72℃延伸10 min，于4℃保存备用。取6μLPCR 产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度。

3.1.4 鸭瘟病毒 gG截段基因PCR产物的回收

按北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA 贮存于-20℃保存备用。

3.1.5纯化的鸭瘟病毒gG截段基因与pMD18-T 的连接

连接反应体系如下：

将上述试剂加入0.2mL 的EP 管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

3.1.6 DH5α感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5α株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5α单克隆菌落接种于5mL LB 培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2) 取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃ 200r/min 振荡培养2.5～3h，使OD600=0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃ 4000r/min离心8min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L 的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃ 4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L 的CaCl₂ 再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为200μL／管，-4℃冰箱中保存过夜以提高转化效率。

3.1.7转化感受态细胞

将10μl 连接体系全部取出加到200μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入0.8mL LB 培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μL涂于含Amp的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于含Amp的 LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养18h 后进行质粒抽提。

3.1.8质粒的抽提

按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。

3.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定

重组质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD18-gGM，分别以BamHⅠ／XhoⅠ双酶切消化与XhoⅠ单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

3.1.10 gG截段基因序列测定

将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

3.2原核表达质粒pET32a-gGM的构建、诱导表达与表达条件的优化

3.2.1原核表达质粒pET32a-gG的构建与鉴定

a目的片段的酶切与连接：限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gGM质粒和原核表达载体pET32a(+)，酶切体系均为：

37℃水浴4 h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

b 重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5α感受态细胞。之后，取连接液15μL加到含200μL感受态DH5α的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90sec，然后迅速冰浴2min；加入不含Amp的LB液体培养基800μL，37℃振摇（150r/min）培养1～1.5 h；取200μl培养物涂布于含Amp的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养 12～16h，同时设立空载体转化组（空载体 10μL +感受态DH5α 200μL）、无载体对照组（灭菌超纯水10μL+感受态DH5α 200μL）。

c 重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用XhoⅠ单酶切、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下： 

然后，以重组质粒为模板，如SEQ ID NO:3所示的上游引物: 5’- ggatcccacacaggacgatatgag -3’(划线部分为BamHⅠ 位点)；如SEQ ID NO:4所示的下游引物: 5’- ctcgagatgagggtgattgtggtag -3’(划线部分为XhoⅠ 位点)进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-gGM。

3.2.2重组表达质粒pET32a-gGM的诱导表达

a 重组质粒pET32a-gGM的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET32a-gGM的DH5α菌种划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于LB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16小时，离心收集菌液，按U1traPureTM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

b 重组质粒pET32a-gGM转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET32a-gGM转化到表达宿主菌E.coli BL21 (DE3)中。

c 重组质粒pET32a-gGM的诱导表达：从上述LB固体培养基上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入含Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养至OD600=0.4时，分别加入IPTG诱导培养，收集1mL培养菌液，4℃ 13000r/min 离心2 min，弃上清，沉淀中加入40μL超纯水和10μL 10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

d 重组质粒pET32a-gGM表达产物的可溶性分析：将诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min 离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl（pH8.0）悬浮；置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（600w，30sec/次，10次），4℃，10000r/min 离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2% Triton X-100）悬浮，4℃，10000r/min 离心10min后，沉淀再次用10mL 洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入40μl超纯水和10μl 10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和Quantity One软件分析诱导菌液中重组蛋白在胞浆（上清①，可溶性）和沉淀中(沉淀②，包涵体形式)的相对百分含量。

3.2.3重组质粒pET32a-gGM表达条件的优化

a 诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET32a-gGM的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中6只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L 30℃诱导2h后，按上述方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

b 温度条件优化：取含重组质粒pET32a-gGM的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的5mL LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导2h，按上述常规方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

c 诱导时间优化：取含重组质粒pET32a-gGM的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L ,30℃分别诱导0、2、3、4、5、6h、过夜后，吸取1mL培养液，按上述方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

3.3鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的大量制备、纯化与复性

3.3.1鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的大量制备（包涵体处理）

将诱导表达的500mL菌液于4℃ 10000r/min 离心10min，将菌体沉淀用40mL 20mmolTris-HCl（pH8.0）悬浮；置-20℃过夜后按1mg/mL加溶菌酶，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，5～10次），4℃ 10000r/min 离心10min。将沉淀用20mL洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2% Triton X-100）悬浮，4℃ 10000r/min 离心10min后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀，4℃保存备用。

3.3.2鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的纯化

镍琼脂糖凝胶（Ni²⁺-NAT）亲和层析纯化鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白：根据融合蛋白的6-His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：

（1）装柱：镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；

（2）平衡：用平衡缓冲液Ⅰ约5个床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；

（3）上样：将0.45μm滤膜过滤的可溶性包涵体样品约5mL，加入层析柱中，流速为0.5mL/min；

（4）洗涤：用平衡缓冲液Ⅱ再洗2-5个床体积，流速为1mL/min；

（5）洗脱：分别用含50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液Ⅲ进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

（6）清洗：用超纯水洗5个柱床体积，再用25%的乙醇洗3个柱床体积，流速为1mL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4℃中保存。

4 实验结果

4.1 鸭瘟病毒 gG截段基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

4.1.1 鸭瘟病毒gG截段基因的PCR扩增结果

以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对gG截段基因进行PCR扩增，其产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约930 bp的特异性DNA条带（图1）。

4.1.2 gG截段基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-gGM。对pMD18-gGM进行PCR、酶切（图2：重组质粒pMD18-gGM 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到两个片段，小片段的分子量大小约为930 bp）和测序鉴定，结果表明T克隆所获得的gG截段基因序列（SEQ ID NO:2所示）同已知的鸭瘟病毒gG截段基因序列完全一致。

4.2 原核表达质粒pET32a-gGM的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

4.2.1重组表达质粒pET32a-gGM的构建与酶切鉴定

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切T克隆质粒后回收目的片段，与经相同酶切的pET-32a表达载体进行连接并转化DH5α，得到重组表达质粒pET32a-gGM,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到两条片段，XhoⅠ单酶切后得到一条片段，且大小与理论值相符，表明重组原核表达质粒构建成功（图3）。

4.2.2重组质粒pET32a-gGM的诱导表达

未诱导菌株没有特异性蛋白条带出现；诱导空载体pET-32a(+)转化菌株在约20kDa处出现一特异性蛋白条带，为载体本身大小；重组表达质粒pET32a-gGM表达的重组融合蛋白在大约50KDa处，与理论值相符；另外，表达蛋白可溶性分析结果显示其主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中以不溶的包涵体形式存在（图4）。

4.2.3重组质粒pET32a-gGM表达条件的优化

a IPTG浓度的优化：在30℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L诱导培养2h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量没有明显变化（图5）。因此，考虑到节约试剂材料，选择0.2 mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

b诱导温度条件的优化：IPTG终浓度为0.2mmol/L，分别于25℃、30℃、37℃诱导2h，结果显示，当温度在25℃和37℃时，诱导蛋白量较少，而当30℃时最高，因此，选择温度30℃作为最佳诱导温度（图6）。

c诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.2 mmol/L，30℃条件下，分别诱导0h、2h、3h、4h、5h、6h、过夜，结果2 h时即有大量的蛋白表达，并且诱导2-6 h及诱导过夜的重组蛋白表达量相比变化不大（图7），因此，选择2h作为最佳诱导时间。

实施例2  鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的纯化

将实施例1制得的含有鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的表达产物经过溶菌酶裂解、超声波破碎、尿素洗涤等一系列前处理后，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组gG蛋白。蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为50mmol咪唑洗脱峰，峰3为300mmol咪唑洗脱峰。同时收集不同浓度咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验纯度及浓度，结果显示：只有300mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的gG截段重组蛋白（图8）。将纯化的gG截段重组蛋白透析复性后，用Bradford法测定蛋白的终浓度，并将其稀释为1mg/mL，分装后备用。

实施例3  鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白作为鸭瘟病毒抗体捕获剂的间接ELISA试剂盒

鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白作为鸭瘟病毒抗体捕获剂的应用主要通过间接ELISA试剂盒进行说明。

固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中固相载体的材料很多，如聚苯乙烯，其必须满足具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，可制成各种形式。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。

抗体捕获剂：由于鸭瘟病毒的全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了鸭瘟病毒的全病毒作为抗体捕获剂作为包被全病毒的ELISA方法（DPV-ELISA）的大规模应用。本发明中采用的抗体捕获剂为实施例2纯化后的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白。

酶标二抗：本发明中采用的酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)，也可采用其他非鸭动物的抗鸭IgG-HRP，除了以辣根过氧化酶标记，也可以采用其他酶标记，如磷酸酯酶。

底物：底物可选用四甲基联苯胺（TMB），邻苯二胺，2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS）及其他HRP有色结合物作为底物。当采用其他酶标记是，可采用与其有色结合物作为底物。

封闭液：封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是体积分数为0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂。

一 实验方法

1 间接ELISA步骤

① 将纯化的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白用包被液稀释至终浓度为2.5μg/100μL，依次加入酶标板中，l00μL /孔，4℃包被过夜；

② 洗涤三次，弃液体，于每孔中加入200μL封闭液，37℃封闭30min；

③ 洗涤三次，弃液体，将各待检血清稀释后并上样，100μL/孔，37℃孵育30分钟；

④ 洗涤三次，弃液体，于每孔加入稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育30分钟；

⑤洗涤三次，弃液体，于每孔加入TMB100μL，避光显色10 分钟，然后加入终止液50μL/孔，轻拍混匀，用酶标仪测OD_450nm值。

2 抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数的确定

将鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白用包被液倍比稀释并包被酶标板，100μL /孔；将DPV阳性血清和阴性血清分别用抗体稀释液体积倍比稀释（1:40、1:80、1:160、1:320、1:640），然后加入酶标板中，100μL /孔。以方阵法进行试验，选择P/N(阳性血清OD_450nm值／阴性血清OD_450nm值) 最大时，且P在1.0左右的抗原（抗体捕获剂）包被浓度和血清稀释倍数作为最佳抗原包被浓度和最适抗体稀释倍数。

3酶标抗体最佳工作浓度测定

根据已确定的抗原最佳包被浓度和抗体最适稀释倍数，将羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗（购自美国KPL公司）作不同体积倍数（1:1000, 1:2000，1:4000）稀释并进行间接ELISA试验，每个稀释度重复3次，求出平均P值和N值，从而确定羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗的最佳工作浓度。

4 阴阳性临界值判定标准的确定

取20份DPV阴性鸭血清，按照上述建立的间接ELISA方法进行检测。将20份阴性样品的OD_450nm值的平均值（X）和3倍标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限，即待检样品的OD_450nm值＞阴性样品0D_450nm值的临界值(X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性。

5特异性试验

用实施例2制备的纯化的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白作为包被抗原，通过已建立的间接ELISA方法分别将其与鸭瘟病毒阳性血清、鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis, DHV）阳性血清、禽流感病毒（AIV）阳性血清，鸭传染性浆膜炎（Riemerella anatipestifer infectious，RA）阳性血清、鸭沙门氏菌（Salmonella bacillus，SB）阳性血清、鸭大肠杆菌（E.coli）阳性血清反应，以检测其特异性。

6稳定试验

用同一批制备的纯化的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白包被酶标板，分别取三份待检血清，按照建立的间接ELISA方法进行检测，每份样品重复3孔，重复检测4次，判定批内重复性。再取不同时间制备的纯化的gG截段重组蛋白，经包被、封闭后对三份待检血清进行检测，每份血清检测3孔，重复检测4次，判定批间重复性。

6 敏感性试验

用实施例2制备的纯化的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白作为抗原（抗体捕获剂）并按最佳包被浓度进行包被，将DPV阳性血清分别按1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、l:2560、1:5120进行体积倍比稀释，然后进行间接ELISA试验。

二 实验结论

1 抗原（抗体捕获剂）包被浓度和血清稀释度的确定

通过方阵滴定试验，标准阳性血清和标准阴性血清的检测结果分别如表1和表2所示，当抗体捕获剂的包被浓度为2.5μg/100μL，血清稀释体积倍数为1:80时，阳性血清OD_450nm值为1.238，相应的阴性血清OD_450nm值为0.157，P／N 值最大（7.885）。因此，抗体捕获剂最佳包被浓度为2.5μg/100μL，抗体最适体积稀释倍数为1:80。

2 酶标抗体最适浓度的确定

结果见表3，当酶标羊抗鸭抗体IgG作 1:2000体积稀释时，P/N值最大为8.301，因此确定最佳酶标抗体体积稀释倍数为1:2000。

3 阴阳性临界值判定标准的确定

通过对20份DPV阴性血清样品进行检测，所得结果如表4所示。X值为0.124，SD值为0.032，确定阴阳性临界点为 X+3SD=0.124+3×0.032=0.22，因此，当待测样品的OD_450nm值大于0.22时判定为阳性，小于或等于时则判定为阴性。

4 特异性试验 

按已建立的间接ELISA方法对包括鸭瘟在内的6种阳性血清分别进行测定，结果如表5所示，除鸭瘟病毒阳性血清以外，其余5种阳性血清的OD_450nm值均小于0.22，表明除鸭瘟病毒阳性血清以外，该抗原不与上述其它5种阳性血清发生交叉反应，由此说明建立的以鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白作为抗原检测DPV抗体的ELISA方法具有较好的特异性。

5 稳定试验

分别用同一批次制备及不同批次制备的纯化的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白包被酶标板，再分别用这两种蛋白对三份待检血清进行ELISA检测，通过所得每份血清的OD_450nm值计算出平均OD_450nm值及标准方差(SD)，再计算出每份血清的批内及批间变异系数（CV），结果如表6所示。批内重复试验三组血清变异系数均低于10%，批间重复试验三组血清的变异系数也都未超过10%，由此说明本研究建立的基于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的间接ELISA方法具有较好的稳定性。

6敏感性试验

结果如表7所示，随着DPV阳性血清稀释度的增加，OD_450nm值也明显随之下降，当稀释倍数为1:2560时，血清检测结果低于阴性值，因此，用本研究制备的纯化的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白作为抗原最低可检测到的阳性血清稀释倍数为1:1280。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

<110>  四川农业大学实验动物工程技术中心

<120>  基于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的试剂盒及其运用

<160>  4

<210>  1

<211>  310

<212>  PRT

<213>  鸭（Duck）

<220> 

<223>  鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白

<400>  1

 

His Thr Gly Arg Tyr Glu Asp Ile Gly Thr Met Asp Ile Ala Val

1                      5                10               15

Qln Trp Cys Asp Leu Thr Leu Leu Ala Pro Ile Ser Ser Val Ser

              20                25             30 

Ala Gly Asn Gly Ala Pro Tyr Asp Met Ser Val Thr Trp Tyr His

              35                40               45

Ile Thr Ala Asn Cys Thr Met Pro Val Gly Tyr Val Glu Tyr Tyr

              50               55               60

Asn Cys Ser Gly Asp Qln Pro Ser Val Trp Thr Cys Gly Gly Tyr

               65              70                75

Ser His Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ile Asp Gly Qln Met Asp Thr Leu

             80              85                90

Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Ile Ile Ser Ser Gly Met Tyr Asn Ser

              95             100               105

Gly Leu Tyr Lys Phe Ile Leu Arg Thr Asp Asn Asn Thr Lys Thr

              110              115               120

Gly Thr Leu Asn Val Thr Phe Glu Thr Ser Asp Asp Pro Tyr Cys

              125              130               135

Val Asn Lys Phe Gly Arg Thr Ser Gly Ala Asp Leu Asp Ile Val

              140              145              150

Asp Ile Gly Thr Trp Met Ser Pro Asp Gly Leu Pro His Pro Asn

             155               160              165

 

Thr Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Asp Gly Lys Ile Arg Phe Ser Phe 

             170               175             180

Qln Asn Gly Thr Glu Thr Val Cys Qln Leu Val Lys Ser Leu Glu

              185              190              195

Glu Ile Arg Asp Glu Ser Glu Ser Trp Asp Glu Arg Asn Val Asp

             200              205                210

Pro Ala Met Leu Gly Phe Pro Arg Cys Gly Tyr Glu Asp Tyr Gly

              215              220               225 

Ser Thr Asp His Gly Ser Glu Cys Tyr Asp Asp Ile Asp Asn Glu

              230              235               240

Cys Val Asn Glu Thr Asp Ile Trp Thr Val Pro Lys Thr Asn Ala

               245             250              255

Asn Phe Arg Asn Qln Thr Gly Gly Tyr Leu Leu Leu Ala Ser Phe

               260              265               270

Met Val His Ser Thr Gly Arg Met Pro Arg Ile Gly Leu Lys Met

              275              280              285

Ala Asn Leu Ser Thr Cys Thr Thr Ile Asn Thr Thr Ser Thr His

              290             295              300

Ser His Gly Ser Tyr His Asn His Pro His  

             305              310                     

 

<210>  2

<211>  930

<212>  DNA

<213> 鸭（Duck）

<220> 

<223>  鸭瘟病毒 gG截段基因

<400>  2

cacacaggac gatatgagga cattggaacg atggatattg cagttcaatg gtgcgacctt      60

acactcctcg cgcctatttc cagtgtttcc gccgggaatg gtgcgccata tgacatgtct     120

gttacttggt atcacatcac cgctaattgc acgatgcctg ttggctacgt ggaatactac     180

aactgctctg gggatcagcc gtctgtatgg acctgtggcg gctattcgca tatttattcc     240

tattatattg atggacaaat ggacacgcta ccatatggta ctggcttgat tatatctagt     300

gggatgtata atagtggact atataagttt attctaagaa cagacaataa tacgaagact     360

ggaacactaa atgtaacttt tgaaacatca gacgatcctt attgcgttaa taaatttggc     420

agaacgtctg gcgctgacct ggacattgtt gatataggta cgtggatgtc tccagatggt     480

ttgccccatc ccaatacgta taatattagt acgaaagacg ggaagatacg atttagtttc     540

caaaatggca cagagaccgt ttgtcaactg gtgaagagtc tcgaagaaat cagggacgag     600

agtgagtctt gggatgaacg caatgtcgat ccggccatgc ttggtttccc ccggtgtggt     660

tatgaagact acggctctac agatcatgga tctgaatgct atgatgacat agataatgaa     720

tgtgtaaatg agacggacat atggacagta cctaaaacca atgccaattt cagaaatcaa     780

actggtgggt atttgttact cgccagtttc atggtacatt ctactggaag gatgccgcgg     840

attggtctta aaatggcgaa cctatcgaca tgtacaacta ttaataccac ctcaacacat     900

tcgcatggaa gctaccacaa tcaccctcat                                      930

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物DPV-gGM F

<400>  3

ggatc ccaca cagga cgata tgag  24

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物DPV-gGM R

<400>  4

ctcga gatga gggtg attgt ggtag  25

 

 

Claims (7)

1.鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白在制备鸭瘟病毒抗体的诊断试剂中的应用，所述鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.基于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，所述抗体捕获剂为如SEQ ID NO:1所示的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗体捕获剂为浓度≥25μg/mL的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白。

4.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为作2000倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。

5.非诊断目的的用权利要求2所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，所述方法还包括平行的阴性实验，其特征在于：

A、将鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

B、将待检血清通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测OD_450nm值，待检血清的OD_450nm值＞阴性样品OD_450nm值的临界值，即X+3SD时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品0D_450nm值的均值，SD为阴性样品OD_450nm值的标准方差。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

A、将浓度≥25μg/mL的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

B、将待检血清作80倍体积稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将羊抗鸭IgG-HRP作2000倍体积稀释后与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测OD_450nm值，待检血清的OD_450nm值＞0.22时则为阳性，反之则为阴性。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤A中所述鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积。

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