CN104987369B - 鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白及其ELISA试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白及其ELISA试剂盒，属于生物工程领域。本发明所述ELISA试剂盒由固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液组成，所述抗体捕获剂为鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；检测方法包括：固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色、检测并判定几步骤；本试剂盒特异性、敏感性及稳定性好；本检测方法操作简单。

Description

鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白及其ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白及其ELISA试剂盒。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种革兰氏阴性菌，归于黄杆菌科(Flavobacteriaceae)，是鸭疫里默氏杆菌病的病原体，能够引起鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种慢性或急性败血症状的接触性传染疾病，呈世界性分布，发病率和死亡率高，已成为目前严重危害养鸭业的主要传染病之一。该病的临床症状主要表现为精神沉郁，瘫地、缩颈、拉黄绿色稀便等症状；病变特征是引起宿主的纤维素性气囊炎、脑膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性输卵管炎，并伴有不同程度的败血症，对养殖业的发展存在着巨大的威胁。

目前已建立的用于检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的方法有琼脂扩散试验、凝集试验、全菌破碎作包被抗原的ELISA试验、PCR检测等。这些方法在检测方面都存在诸多不足之处。如琼扩试验和凝集试验的灵敏度较低，特异性不高，只能检测个别血清；PCR检测虽然灵敏但是在实际的生产当中运用难度大，需要专业的仪器和人员；破碎全菌的ELISA方法虽然彰显了在ELISA检测方面的优势，但是作为包被抗原，在制备菌体抗原时细菌培养要求高且在菌体抗原成分复杂、特异性等方面存在不足。

OmpH属于孔蛋白，目前未见鸭疫里默氏杆菌OmpH研究和应用的相关研究报道。

发明内容

为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，该蛋白能作为鸭疫里默氏杆菌抗体的捕获剂，为鸭疫里默氏杆菌的抗体检测提供了新思路。

本发明的目的之二在于提供一种基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的ELISA试剂盒，可用于检测鸭疫里默氏杆菌的血清抗体，有着较高的敏感性、特异性和重复性。

本发明的目的之三在于提供一种鸭疫里默氏杆菌抗体的检测方法，该方法操作简单，适用于大规模应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

一种基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，所述抗体捕获剂为如SEQ ID NO:1所示的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白。

进一步，所述抗体捕获剂为浓度≥8.0μg/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白。

进一步，所述酶标二抗为作400倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。

用所述的ELISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法，所述方法还包括平行的阴性实验，具体为：

A、将鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

B、将待检血清通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤C所得抗原—抗体—二抗复合物加入底物显色液避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤D所述显色样品液用酶标仪测OD450nm值，待检血清的OD450nm值＞阴性样品OD450nm值的临界值(即X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品OD450nm值的均值，SD为阴性样品OD450nm值的标准方差。

进一步，所述的ELISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法具体为：

1)将浓度≥8.0μg/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

2)将待检血清作100倍稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤1)所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

3)将羊抗鸭IgG-HRP作400倍体积稀释后的酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

4)在步骤3)所得抗原—抗体—二抗复合物加入底物显色液避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

5)将步骤4)所述显色样品液用酶标仪测OD450nm值，待检血清的OD450nm值＞0.37时则为阳性，反之则为阴性。

进一步，步骤1)中所述鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白、步骤2)中所述稀释血清及步骤3)中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积。

本发明的有益效果在于：鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白是选取鸭疫里默氏杆菌(RA)OmpH全基因编码蛋白；然后利用基因工程技术，在对OmpH全基因克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是OmpH/His可溶性融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为38kDa，将产品设计为融合表达主要是考虑便于纯化；同时表达蛋白为可溶性表达形式，在蛋白的制备、纯化过程中避免了蛋白的变性、复性等过程，利于保持蛋白的天然活性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表明具有与天然蛋白相似的免疫反应活性；本发明运用纯化后的OmpH/His融合蛋白作为包被抗原，建立了ELISA检测试剂盒，该方法可用于几种不同血清型鸭疫里默氏杆菌血清抗体的检测，具有重复性好、敏感度高、特异性强等特点。

采用本发明的方法生产的产品可用于：

①本产品中OmpH重组蛋白可作为检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的间接ELISA方法等中的检测抗原。

②本产品中间接ELISA试剂盒可用于临床鸭血清样本中鸭疫里默氏杆菌抗体的检测。

本发明的产品优点体现在：

①由于该检测抗原是鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，并非全菌，因此应用该检测抗原进行检测时无散毒危险。

②本发明可以用于鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC 11845、RA-CH-1和RA-CH-2不同血清型的抗体检测。

③检测鸭疫里默氏杆菌抗体，特异性强、重复性好、灵敏度高。

④性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。

附图说明

图1为OmpH基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。其中1为OmpH基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带；M为DNA Marker。

图2为重组质粒pMD19-OmpH的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA Marker；1和2为重组质粒pMD19-OmpH用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。

图3为pET32a-OmpH的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA Marker；1和2为重组表达质粒pET32a-OmpH用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。

图4为重组表达质粒pET32a-OmpH表达的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白在37℃、IPTG浓度为0.4mmol/L的条件下诱导表达过夜的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker；1为重组表达质粒pET32a-OmpH用IPTG诱导，得到的菌液超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果；2为重组表达质粒pET32a-OmpH用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果；3为空载体pET-32a(+)用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果。

图5为37℃时不同IPTG浓度下含有重组质粒pET32a-OmpH的宿主菌E.coli BL21(DE3)诱导表达4小时后鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白质Marker；1为IPTG的终浓度为0mmol/L；2为IPTG的终浓度为0.4mmol/L；3为IPTG的终浓度为0.8mmol/L；4为IPTG的终浓度为1.2mmol/L。

图6为不同温度下IPTG浓度为0.4mmol/L时含有重组质粒pET32a-OmpH的宿主菌E.coli BL21(DE3)诱导表达4小时后表达鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白质Marker；1为诱导温度为25℃；2为诱导温度为30℃；3为诱导温度为37℃。

图7为37℃和IPTG浓度为0.4mmol/L时不同诱导时间下含有重组质粒pET32a-OmpH的宿主菌E.coli BL21(DE3)表达鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker；1为诱导0h；2为诱导9h；3为诱导7h；4为诱导5h。

图8为镍琼脂糖凝胶(Ni²⁺-NAT)亲和层析纯化后的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker；1为经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的OmpH重组蛋白；2为1mg/ml BSA。

图9为鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白Western-blot图。其中M为预染蛋白质Marker；1为OmpH重组蛋白的免疫印迹条带。

图10为鸭疫里默氏杆菌玻片凝集试验结果图。在1:2、1:4、1:8和阳性对照孔里分别有细沙状凝集颗粒；1:16孔内没有凝集颗粒。

图11为鸭疫里默氏杆菌微量凝集实验图片。在1:8、1:16、1:32和阳性对照孔里均可见凝集颗粒；1:64孔内无凝集颗粒。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸valV；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸phe F；组氨酸his H；脯氨酸proP；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cysC；精氨酸arg R；天冬氨酸Asp D。

下述稀释的方式是以体积比方式进行。

实施例1 鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的制备

1主要实验材料

质粒T-Vector pMD19(simple)，

Max DNA Polymerase，均购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET32a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5α、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和RA-CH-1菌株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

2实验方法

2.1 RA OmpH基因的克隆

2.1.1引物设计

根据GenBank上RA-CH-1 OmpH基因序列，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物。如SEQ ID NO:3所示的上游引物:5’-GGATCCATGAAAAAATTAAGCGTATTGTTTGC-3’(划线部分为BamHⅠ位点)；如SEQ ID NO:4所示的下游引物:5’-CTCGAGATTTTACATTATTGAGATGCCCTATTG-3’(划线部分为XhoⅠ位点)。引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

2.1.2 RA基因组DNA的提取

a、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株(RA)的培养：取冻干保存的菌种，用2mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)稀释，然后接种于血平板，CO₂条件下37℃恒温静置18～24h(菌落呈圆形，微凸起，边缘整齐，奶油状，菌落直径2mm；显微镜下观察菌体呈短粗型)。经过菌落观察和镜检，挑取单个菌落于胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB(含1％小牛血清)中培养。

b、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株(RA)的扩大培养：将培养过夜的鸭疫里默氏菌菌液按1:100接种到含1％小牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，37℃水浴振荡培养致细菌生长到对数生长期。

c、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株(RA)DNA的提取，具体步骤如下：(1)取生长到对数期的菌液1ml加到1ml离心管，12000rpm离心2min，弃上清。(2)加入567μl TE Buffer、30μl10％SDS和3μl蛋白酶K，37℃水浴1h，溶解沉淀。(3)加入等量的酚/氯仿抽提DNA，12000rpm离心5min，取上清。重复该步骤一次。(4)加入等量氯仿/异戊醇提DNA，12000rpm离心5min，取上清。(5)加入两倍体积的无水乙醇洗,10％体积的3mol/L的醋酸钠，冰浴30min，12000rpm离心15min，弃上清。(6)用70％的乙醇洗涤沉淀两次，弃上清。(7)室温下自然干燥沉淀DNA，加入适量TE(pH8.0)溶解沉淀DNA，-20℃保存备用。

2.1.3 PCR扩增鸭疫里默氏杆菌OmpH基因

PCR反应体系如表1所示：

表1 PCR反应体系

轻轻混匀，4000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃5min，然后进入94℃40s、55℃40s、72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取5μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度。

2.1.4鸭疫里默氏杆菌OmpH基因PCR产物的回收

按OMEGA公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。

2.1.5纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH基因与pMD19-T的连接

连接反应体系如表2所示：

表2 连接反应体系

将上述试剂加入PCR反应管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

2.1.6 DH5α感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5α株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5α单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2)取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃200r/min振荡培养2.5～3h，使OD600＝0.4～0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃4000r/min离心10min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃4000r/min离心10min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油CaCl₂，混匀后分装为100μl/管，4℃冰箱中保存过夜以提高转化效率。

2.1.7转化感受态细胞

将10μl连接体系全部取出加到100μl DH5α感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入890μl LB培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μl涂于含Amp的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养18h后进行质粒抽提。

2.1.8质粒的抽提

按OMEGA公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。

2.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD19-OmpH，分别以BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化与XhoⅠ单酶切消化、BamHⅠ单酶切消化，酶切体系见表3所示，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

表3 单酶切和双酶切的体系

2.1.10鸭疫里默氏杆菌OmpH基因序列测定

将酶切鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

2.2原核表达质粒pET32a-OmpH的构建、诱导表达与表达条件的优化

2.2.1原核表达质粒pET32a-OmpH的构建与鉴定

a目的片段的酶切与连接：限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD19-OmpH质粒和原核表达载体pET32a(+)，酶切体系如表4所示：

表4 pMD19-OmpH质粒和原核表达载体pET32a(+)的酶切体系

37℃水浴4h，按OMEGA的DNA胶回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照表5连接体系16℃连接过夜。

表5 连接体系

b重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5α感受态细胞。之后，取连接液10μl加到含100μl感受态DH5α的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90s，然后迅速冰浴2min；加入不含Amp的LB液体培养基890μl，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μl培养物涂布于含Amp的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，同时设立空载体转化组(空载体10μl+感受态DH5α100μl)、无载体对照组(灭菌超纯水10μl+感受态DH5α100μl)。

c菌液的PCR鉴定：

以重组质粒菌液为模板，SEQ ID NO:3所示的上游引物:5’-_GGATCCATGAAAAAATTAAGCGTATTGTTTGC-3’(划线部分为BamHⅠ位点)；如SEQ ID NO:4所示的下游引物:5’-CTCGA GATTTTACATTATTGAGATGCCCTATTG-3’(划线部分为XhoⅠ位点)。进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测。

d重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用XhoⅠ单酶切、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如表6所示：

表6 酶切体系中各组分的含量

经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-OmpH。

2.2.2重组表达质粒pET32a-OmpH的诱导表达

a重组质粒pET32a-OmpH的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET32a-OmpH的DH5α菌种划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养10～16小时，离心收集菌液，按OMEGA质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

b重组质粒pET32a-OmpH转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并将重组质粒pET32a-OmpH转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中。

c重组质粒pET32a-OmpH的诱导表达：从上述LB固体培养基上挑取阳性克隆菌接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入含Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG诱导培养，收集1mL培养菌液，4℃13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入40μl超纯水和10μl 10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

d重组质粒pET32a-OmpH表达产物的可溶性分析：将于37℃和IPTG＝0.4mmol/L诱导表达过夜的重组质粒pET32a-OmpH表达菌液和空载体表达的菌液，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃，10000r/min离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL尿素液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用10mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入40μl超纯水和10μl 10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。

2.2.3重组质粒pET32a-OmpH表达条件的优化

a诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET32a-OmpH的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中4只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.2mmol/L 37℃诱导4h后，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

b温度条件优化：取含重组质粒pET32a-OmpH的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的5mL LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导4h，按上述常规方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

c诱导时间优化：取含重组质粒pET32a-OmpH的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，继续培养至OD600值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L,37℃分别诱导0、5、7、9h，吸取1mL培养液，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的大量制备与纯化

2.3.1鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的大量制备(上清处理)

将诱导表达的500mL菌液于4℃10000r/min离心10min，将菌体沉淀用40mL20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮；超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min离心10min。取上清，4℃保存备用。

2.3.2鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的纯化

镍琼脂糖凝胶(Ni²⁺-NAT)亲和层析纯化鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白：根据融合蛋白的6-His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：

(1)装柱：镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；

(2)平衡：用平衡缓冲液约5个床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；

(3)上样：将0.45μm滤膜过滤的可溶性上清蛋白样品约50mL，加入层析柱中，流速为0.4mL/min；

(4)洗涤：用平衡缓冲液再洗2-5个床体积，流速为1mL/min；

(5)洗脱：分别用含20、200、250mmol咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

(6)清洗：用超纯水洗5个柱床体积，再用25％的乙醇洗3个柱床体积，流速为1mL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4℃中保存。

3实验结果

3.1鸭疫里默氏杆菌OmpH基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

3.1.1鸭疫里默氏杆菌OmpH基因的PCR扩增结果

以RA-CH-1基因组DNA为模板对OmpH基因进行PCR扩增，其产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约660bp的特异性DNA条带(图1)。

3.1.2鸭疫里默氏杆菌OmpH基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD19-T(simple)载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD19-OmpH。对pMD19-OmpH进行PCR、酶切(图2：重组质粒pMD19-OmpH用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到两个片段，小片段的分子量大小约为660bp)和测序鉴定，结果表明T克隆所获得的OmpH基因DNA序列(SEQ ID NO:2所示)同已知的鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1的OmpH基因DNA序列完全一致。

3.2原核表达质粒pET32a-OmpH的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET32a-OmpH的构建与酶切鉴定

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切T克隆质粒后回收目的片段，与经相同酶切的pET-32a表达载体进行连接并转化DH5α，得到重组表达质粒pET32a-OmpH,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到两条片段，XhoⅠ、BamHⅠ单酶切后得到一条片段，且大小与理论值相符，表明重组原核表达质粒构建成功(图3)。

3.2.2重组质粒pET32a-OmpH的诱导表达

诱导空载体pET-32a(+)转化菌株在约20kDa处出现一特异性蛋白条带，为载体本身标签蛋白大小；重组表达质粒pET32a-OmpH表达的重组融合蛋白在大约38kDa处，与理论值相符；另外，表达蛋白可溶性分析结果显示其主要存在于上清中，说明重组表达蛋白在菌体中以可溶的形式存在(图4)。

3.2.3重组质粒pET32a-OmpH表达条件的优化

a IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.2mmol/L诱导培养4h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，当IPTG＝1.2mmol/L时表达量最大(图5)。因此，选择1.2mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

b诱导温度条件的优化：IPTG终浓度为0.4mmol/L，分别于25℃、30℃、37℃诱导4h，结果显示，当温度在30℃和37℃时，诱导蛋白量较少，而当25℃时最高，因此，选择温度25℃作为最佳诱导温度(图6)。

c诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.4mmol/L，37℃条件下，分别诱导0h、5h、7h、9h，结果9h时即有大量的蛋白表达，而诱导0h-7h的重组蛋白表达量不大(图7)，因此，选择9h作为最佳诱导时间。

实施例2 鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的纯化

将实施例1制得的含有鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的表达产物经过收集菌体、超声波破碎、收集上清等一系列处理后，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组OmpH重组蛋白。蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为200mmol咪唑洗脱峰，峰3为250mmol咪唑洗脱峰。同时收集不同浓度咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验纯度及浓度，结果显示：在250mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的OmpH重组蛋白(图8)。将纯化的OmpH重组蛋白经超滤管浓缩后，用核酸蛋白仪测定蛋白的终浓度，分装后备用。

实施例3 鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的Western-blot(蛋白免疫印迹)

一、实验方法

将实施例1获得的含有鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的探针。

1 SDS-PAGE凝胶配制

1.1 12％分离胶的配制

去离子水1215ul，1.5M Tris-HCl(PH＝8.8)950ul，10％SDS 37.5ul，10％AP37.5ul，TEMED 1.5ul，30％丙烯酰胺1.5ml。

1.2 5％浓缩胶的配制

去离子水700ul，1.0M Tris-HCl(PH＝6.8)125ul，10％SDS 10.0ul，10％AP10.0ul，TEMED 1.0ul，30％丙烯酰胺165ul。

2蛋白样品的处理

在蛋白样品中加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(0.5M Tris-HCl(PH＝6.81.2ml)，甘油1ml，去离子水4.8ml，10％SDS 2.0ml，0.1％BPB 0.5ml)。100℃煮沸10min后10000r/min 10min。

3电泳

待胶冷却到室温后，把蛋白样直接上到SDS-PAGE孔内，100v电泳90min。

4转膜

按照电转三明治的安装顺序安装，70v 90min。

5封闭

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，漂洗2min。

6一抗的孵育

一抗为兔抗鸭疫里默氏杆菌高免血清按1:200稀释，4℃孵育过夜，然后用PBS洗涤3次。

7二抗的孵育

二抗为KPL公司HRP标记的羊抗兔IGg按照说明书1:3000稀释，4℃孵育1h，PBS洗涤3次。

8底物显色

加入酶底物显色液，用去离子水终止反应，膜自然晾干，保存于暗处。

二、实验结论

通过Western-blot蛋白免疫印迹实验，鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白能够与鸭疫里默氏杆菌的阳性血清产生良好的反应原性(如图9)，可作为检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的探针或捕获剂。

实施例4 鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的间接ELISA试剂盒

鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的应用主要通过间接ELISA试剂盒进行说明。

固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中固相载体的材料很多，如聚苯乙烯，其必须满足具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，可制成各种形式。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于ELISA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。

抗体捕获剂：由于鸭疫里默氏杆菌的培养环境及营养要求较高，不利于培养，易被污染。所以，本发明中采用的抗体捕获剂为实施例2纯化后的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白。

酶标二抗：本发明中采用的酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)，也可采用其他非鸭动物的抗鸭IgG-HRP(如兔抗鸭IgG-HRP)，除了以辣根过氧化酶标记，也可以采用其他酶标记，如磷酸酯酶。

底物：底物可选用四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)及其他HRP有色结合物作为底物。当采用其他酶标记时，可采用与其有色结合物作为底物。由于本发明的酶标二抗采用的是羊抗鸭IgG-HRP，所以其底物为TMB。

封闭液：封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白、小牛血清或明胶作为封闭剂的，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂。

终止液：本发明采用的是2mol/L H₂SO₄。

一实验方法

1间接ELISA步骤

①将纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白用包被液稀释至终浓度为8.0ug/ml，依次加入酶标板中，l00μl/孔，4℃包被过夜；

②洗涤三次，弃液体，于每孔中加入300μl封闭液，37℃封闭30min；

③洗涤三次，弃液体，将各待检血清稀释后并上样，l00μl/孔，37℃孵育30min；

④洗涤三次，弃液体，于每孔加入稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，l00μl/孔，37℃孵育30min；

⑤洗涤三次，弃液体，于每孔加入TMB 100μl，避光显色20min，然后加入终止液50μl/孔，轻拍混匀，用酶标仪测OD450nm值。

2抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数的确定

将鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白用包被液倍比稀释并包被酶标板，l00μl/孔；将RA阳性和阴性血清分别用抗体稀释液体积倍比稀释后加入酶标板中，l00μl/孔。以方阵法进行试验，选择P/N(阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值)最大时的OmpH重组蛋白包被浓度和血清稀释倍数作为最佳抗原包被浓度和最适抗体稀释倍数。

3抗原包被时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被浓度分别4℃包被过夜、37℃孵育1h后4℃包被过夜和37℃孵育2h后4℃包被过夜，然后进行间接ELISA试验，每个样本重复检测3次，选择最优的抗原包被时间。

4不同封闭液的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，分别用1％BSA、5％BSA、10％BSA和5％的脱脂奶粉进行封闭，然后进行间接ELISA试验，每个样本重复检测3次，选择最优的封闭液。

5一抗和二抗结合时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，一抗和二抗分别反应120min、90min、60min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的反应时间。

6酶标抗体最佳工作浓度测定

根据已确定的抗原最佳包被浓度和抗体最适稀释倍数，将羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG，购自美国KPL公司)作不同体积倍数(1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600,1:3200，1:6400)稀释并进行间接ELISA试验，每个稀释度重复4次，求出平均P值和N值，从而确定羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗的最佳工作浓度。

7TMB显色时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，TMB的底物显色时间分别为10min、20min、30min，每个样本重复检测3次，选择最优的显色时间。

8阴阳性临界值判定标准的确定

取20份RA阴性鸭血清，按照上述建立的间接ELISA方法进行检测。将20份阴性样品的OD450nm值的平均值(X)和3倍标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限，即待检样品的OD450nm值＞阴性样品OD450nm值的临界值(X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性。

9特异性试验

用已建立的间接ELISA方法分别检测鸭病毒性肝炎病毒(DHV)阳性血清、禽流感病毒(AIV)阳性血清、鸭沙门氏菌(Salmonella bacillus，SB)阳性血清、鸭大肠杆菌(E.coli)阳性血清、鸭肿头症病毒阳性血清、鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC 11845株和RA-CH-2株阳性血清，以检测其特异性，每份血清样本重复检测3次。

10稳定试验

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白包被constar酶标板，按照建立的间接ELISA方法检测5份待检血清，每份血清样品重复5孔，判定批内重复性。再用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白包被5个不同批次的constar酶标板检测5份待检血清，判定批间重复性。

11敏感性试验

将RA阳性血清进行体积倍比稀释，用已建立的间接ELISA试验进行检测，同时用琼扩试验、玻片凝集试验、微量凝集试验以及破碎的RA-CH-1的全菌ELISA进行检测，所有检测试验重复操作3次，取平均值，比较其敏感性。

二实验结论

1抗原(抗体捕获剂)包被浓度和血清稀释度的确定

通过方阵滴定试验，鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1阳性血清和阴性血清的检测结果分别如表7和表8所示，当抗体捕获剂的包被浓度为8ug/mL，血清稀释体积倍数为1:100时，阳性血清OD450nm值为0.417，相应的阴性血清OD450nm值为0.044，如表9所示P/N值最大(9.477)。因此，抗体捕获剂最佳包被浓度为8ug/mL，血清最适体积稀释倍数为1:100。

表7 阳性血清检测结果

表8 阴性血清检测结果

表9 P/N值

2抗原包被时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被浓度分别于4℃包被过夜、37℃孵育1h后放4℃包被过夜和37℃孵育2h后放4℃包被过夜，然后进行间接ELISA试验，每个样本检测3次，结果如表10所示。直接放4℃包被过夜后检测出的阳性值最高，且测定的数值比较稳定，故选择该条件作为本方法的最佳抗原包被条件。

表10 抗原包被条件的优化

3不同封闭液的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，分别用1％BSA、5％BSA、10％BSA和5％的脱脂奶粉封闭，然后进行间接ELISA试验，每个样本重复检测3次，选择最优的封闭液，结果如表11所示。1％BSA封闭液封闭后检测出的阳性值最高，故选择该浓度的封闭液作为本方法的最佳封闭液。

表11 封闭液的优化

4一抗和二抗结合时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件封闭，然后进行间接ELISA试验，一抗和二抗分别反应120min、90min、60min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的反应时间，结果如表12和表13所示。OD450nm值均随着一抗和二抗反应时间的增多而升高，故一抗和二抗的作用时间均选择120min。

表12 一抗结合时间的优化

表13 二抗结合时间的优化

5酶标抗体最适浓度的确定

结果见表14，当酶标羊抗鸭抗体IgG作1:400体积稀释时，P/N值最大为30.17647，因此确定最佳酶标抗体体积稀释倍数为1:400。

表14 酶标抗体最佳工作浓度的确定

6 TMB显色时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件封闭，然后进行间接ELISA试验，TMB的底物显色时间分别为10min、20min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优显色时间。结果如表15所示，TMB在37℃反应10min效果最优，故本方法的最优底物显色时间为10min。

表15TMB底物显色时间的优化

7阴阳性临界值判定标准的确定

用上述优化的各ELISA条件对20份RA阴性血清样品进行检测，所得结果如表16所示。X值为0.23535，SD值为0.045833，确定阴阳性临界点为X+3SD＝0.23535+3×0.045833＝0.37。

表16 RA阴性血清检测结果

因此，鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的间接ELISA方法为：用8ug/mL鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白4℃包被过夜，1％BSA于37℃封闭30min，1:100稀释的待检血清37℃作用120min，1:400稀释的酶标二抗37℃作用120min，TMB显色10min，若待测样品的OD450nm值大于0.37时判定为阳性，小于或等于0.37时则判定为阴性。

8特异性试验

按已建立的间接ELISA方法对包括鸭疫里默氏杆菌血清在内的7种病原阳性血清分别进行测定，结果如表17所示，除鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC 11845株阳性血清和RA-CH-2阳性血清以外，其余5种阳性血清的OD450nm值均小于0.37，表明除鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC11845株和RA-CH-2株阳性血清以外，该抗原不与上述其它5种病原阳性血清发生交叉反应，由此说明建立的以鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原检测RA抗体的ELISA方法具有较好的特异性，且该重组蛋白能够作为RA-CH-1、RA-ATCC 11845和RA-CH-2不同血清型RA抗体检测的通用抗原。

表17 特异性实验结果

9稳定试验

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白包被constar酶标板，按照建立的间接ELISA方法检测5份待检血清，每份血清样品重复5孔；再用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白包被5个不同批次的constar酶标板检测5份待检血清。通过所得每份血清的OD450nm值计算出平均OD450nm值及标准方差(SD)，再计算出每份血清的批内及批间变异系数(CV)，结果如表18和表19所示，批内重复试验5组血清变异系数均值为1.9098％，且每组变异系数低于10％，批间重复试验5组血清的变异系数平均值为3.0066％，且每组变异系数均低于10％，由此说明本研究建立的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的间接ELISA方法具有较好的稳定性。

表18 批内重复试验

表19 批间重复试验

10敏感性试验

同一份血清样本分别进行琼扩试验、玻片凝集试验、微量凝集实验和破碎RA-CH-1全菌的ELISA检测并与本方法比较。琼扩试验不能出现沉淀线，故无法判定抗体效价。玻片凝集实验的效价为1:8(如图10)。微量凝集实验的效价为1:32(如图11)。破碎后的全菌ELISA效价为1：6400。利用本实验方法的结果如表20所示，随着RA-CH-1阳性血清稀释度的增加OD450nm值下降，当稀释倍数为1:41600时，血清检测结果低于阴性值，因此，用本研究制备的纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白作为抗原最低可检测到的阳性血清稀释倍数为1:20800。

表20 敏感性实验结果

上述实施例为本发明优化后的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，

所述抗体捕获剂为鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示，所述重组蛋白的制备方法如下：取含重组质粒pET32a-OmpH 的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp 的LB 液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日按1：50 转接种于含Amp 的LB液体培养基中，37℃培养至OD600 值为0.4 时，取其中4只试管，分别加入IPTG 至终浓度为1.2mmol/L 25℃诱导9h 后，将含有鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白的表达产物经过收集菌体、超声波破碎、收集上清，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组OmpH 重组蛋白；

所述重组质粒pET32a-OmpH由以下方法构建：限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ分别双酶切pMD19-OmpH质粒和原核表达载体pET32a(+)，16℃连接过夜即可，pMD19-OmpH质粒由纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH 基因与pMD19-T连接，所述鸭疫里默氏杆菌OmpH 基因由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列为引物，鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1 株基因组DNA为模板，经扩增而得；

所述抗体捕获剂为浓度≥8.0μg/mL 的鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白；所述酶标二抗为作400 倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。

2.根据权利要求1所述的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH 重组蛋白的ELISA 试剂盒，其特征在于：封闭液为1％ BSA。

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