CN116023479A - 牛病毒性腹泻病毒纳米抗体及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，公开了一种抗BVDV‑重要功能蛋白纳米抗体及其制备方法和应用，主要通过构建BVDV‑NS5A表达载体，纯化NS5A蛋白；使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离羊驼外周血淋巴细胞，通过巢式PCR获得VHH基因，构纳米抗体噬菌体展示文库，目的基因插入率为90.8％，文库容量为1.02×10⁷CFU/mL，经M13K07噬菌体救援建立纳米抗体噬菌体展示文库容量为1.68×10¹⁶CFU/mL；以BVDV‑重要功能蛋白作为目标抗原，对扩繁得到的噬菌体展示文库进行三轮亲和筛选，从该文库筛选出与E0/E2/NS5A/NS3蛋白特异性结合纳米抗体，通过ELISA检测其反应原性，特异性良好的纳米抗体进行测序，分析序列，进而获得该特异性纳米抗体的基因，构建原核表达载体，对其进行原核表达、纯化和鉴定，得到所需纳米抗体Nb‑Y1、Nb‑Y2、Nb‑Y3，并通过Westernblot验证纳米抗体和BVDV重要功能蛋白的反应原性。

Description

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及抗BVDV重要功能蛋白蛋白纳米抗体的制备方法与应用，首先表达并纯化获得BVDV-NS5A蛋白，使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离淋巴细胞及血清，通过构纳米抗体噬菌体展示文库，使用BVDV-E0、E2、NS5A、NS3四种功能蛋白筛选特异性纳米抗体，ELISA检测其反应原性，并对特异性良好的纳米抗体进行表达和纯化，运用Wb验证纳米抗体的特异性。

背景技术

牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine Viral Diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的传染病。各种年龄的牛都易感染、以犊牛易感性最高。传染源主要是病畜的分泌物、排泄物、血液和脾脏等，传播方式为直接接触或间接接触方式两种。患牛表现为发病急，体温突然升高至40～42℃，食欲废绝，消化道粘膜损伤严重，最初常表现为水样腹泻，后期粪便中带血和粘膜，死亡率可高达90％。因此BVD-MD是养牛业中具有重大经济意义的疾病之一，也是进口检疫中应重点防范的疾病之一。据文献报道该病呈世界性分布，目前中国地区已有新疆、内蒙古、宁夏、山东、四川等20多个省市自治区不同程度的流行。

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属的单股正链RNA病毒，呈圆形有囊膜，与猪瘟病毒和羊边界病毒为同属病毒。BVDV主要有四个结构蛋白，衣壳蛋白(C)，囊膜蛋白(Erns，E1和E2)和7个非结构蛋白(P7，NS2/NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。

1993年，Hamers等在骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的抗体，称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体分子大小仅为15kDa、单链可变片段(30kDa)、Fab片段(60kDa)和完整抗体(150kDa)。尽管可以根据CDR2长度以及CDR1或framework-2中另一个半胱氨酸的位置在单峰骆驼中区分不同的亚家族，但所有纳米抗体都属于同一序列家族，与III族人类VH3的家族家族密切相关；并且这种抗体仅有重链的可变区，有水溶性好、耐高温、易在原核系统中表达、组织穿透性强、高稳定性、甚至可口服吸收而不被降解、抗原结合高亲合性等优势都说明纳米抗体是理想的研究工具，可用于开发复杂的纳米生物技术；本试验接种羊驼后，可以将VHH基因克隆到噬菌粒载体中，然后可以通过针对抗原的噬菌体展示选择抗原特异性VHH。由于其体积小、自然可溶的特性，以及独特的靶向替代表位的能力，使得纳米体在肿瘤靶向、诊断、甚至体内治疗等方面都非常有吸引力。

发明内容

本发明目的在于提供一种制备抗BVDV重要功能蛋白特异性纳米抗体的方法；

目前抗体获得方法有单克隆抗体，核糖体展示库，噬菌体展示库等，其中应用最广泛的技术是噬菌体展示库；

本技术筛选的纳米抗体较常规抗体具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性好、易表达和免疫原性低等特点，比常规抗体用途更广。

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种制备抗BVDV纳米抗体的方法及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

纳米抗体具有一些传统抗体所不具备的特性，高水溶性、稳定性强、抗原识别能力强、免疫原性低、穿透性强等诸多优点；纳米抗体目前一个研究热门就是其独特的抗原表位而这些是传统的抗体所不具备的。

在该BVDV的结构蛋白中E0蛋白属于保守性很高的蛋白，且具备一定的免疫原性，在同属病毒的致病过程中所起的作用很重要；E2蛋白的C端含有疏水膜锚定区位于囊膜的表面，刺激机体产生免疫反应并产生病毒中和抗体；NS3蛋白不是病毒复制必须蛋白，且具体功能尚未知晓；NS5A蛋白具有亲水性。黄病毒科各成员中的NS5A的丝氨酸和苏氨酸残基均有磷酸化现象，这种现象助于病毒的繁殖并在病毒生命周期中发挥重要作用。

以BVDV NADL株基因组为模板，扩增目NS5A基因，克隆到原核表达载体pET-30a中，分别转化至大肠杆菌Top10克隆菌和BL21(DE3)表达菌中，经IPTG诱导表达、Ni-IDA亲和层析柱纯化，获得重组蛋白，通过WB检测反应原性。

纳米抗体按以下操作制备：使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离淋巴细胞及血清，通过构纳米抗体文库，对纳米抗体文库进行辅助噬菌体M13K07拯救和扩繁，获得纳米抗体噬菌体展示文库。进而以BVDV-重要功能蛋白作为目标抗原，扩增得到的噬菌体展示文库进行三轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选，随机挑取筛选得到的纳米抗体单克隆进行ELISA检测其反应原性并送至生物技术公司进行测序，分析序列，对特异性良好的纳米抗体通过构建原核表达载体pET30a-Nb-Y1、pET30a-Nb-Y2、pET30a-Nb-Y3表达纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3利用His标签镍柱纯化Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白。通过Western bloting来验证纯化纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3与重组蛋白BVVD-E0/E2/NS5A/NS3蛋白的结合能力。

本发明筛选到BVDV-重要功能蛋白特异性和亲和力的纳米抗体；为建立基于纳米抗体ELISA检测BVDV抗原的方法提供了基础，为纳米抗体生物制剂的研发提供了物质基础。

本发明属于生物技术检测领域，公开了一种BVDV-重要功能蛋白纳米抗体的制备方法和应用，主要通过构建BVDV-NS5A表达载体，纯化NS5A蛋白；使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离羊驼外周血淋巴细胞，通过巢式PCR获得VHH基因，构纳米抗体噬菌体展示文库，目的基因插入率为90.8％，文库容量为1.02×10⁷cfu/mL，经M13噬菌体救援建立纳米抗体噬菌体展示文库容量为1.68×10¹⁶CFU/mL；以BVDV-重要功能蛋白作为目标抗原，对扩繁得到的噬菌体展示文库进行三轮亲和筛选，从该文库筛选出与E0/E2/NS5A/NS3蛋白特异性结合纳米抗体，通过ELISA检测其反应原性，特异性良好的纳米抗体进行测序，分析序列，进而获得该特异性纳米抗体的基因，构建原核表达载体，对其进行原核表达、纯化和鉴定，得到所需纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3。

附图说明

图1是BVDV NS5A优势抗原表位预测，曲线表示氨基酸抗原表位阈值的变化趋势线。

图2是BVDV NADL标准株基因组为模板对NS5A目的基因片段进行PCR扩增电泳图，图中M为DNA Marker；泳道1-4为NS5A基因。

图3是pET-30a-NS5A重组表达质粒鉴定Nde I和Hind III双酶切电泳图，图中：泳道M为DL10000 Marker；泳道1为质粒对照；泳道2-5为Nde I和Hind III双酶切结果。

图4是pET-30a-NS5A表达产物的SDS-PAGE分析。图中：泳道M为SDS-PAGE Proteinmarker；泳道0为0h对照；泳道1为15℃诱导16h；泳道2为37℃诱导16h。

图5是NS5A蛋白的上清中亲和层析纯化。图中：泳道M为SDS-PAGE Proteinmarker；泳道1为NS5A表达菌破菌离心后上清；泳道2为上清通过Ni-IDA后的流出液；泳道3-4为50mM咪唑的洗脱组分；泳道5-7为100mM咪唑的洗脱组分；泳道8-10为500mM咪唑的洗脱组分。

图6是SDS-PAGE分析包涵体中NS5A蛋白的纯化结果。图中：泳道M为SDS-PAGEProtein marker；泳道1为NS5A蛋白包涵体溶解离心后上清；泳道2为NS5A蛋白包涵体上清通过Ni-IDA后的流出液；泳道3-8为50mM咪唑的洗脱组分；泳道9-11为300mM咪唑的洗脱组分。

图7是NS5A蛋白纯化检验。图中：泳道M为SDS-PAGE Marker；泳道1为BSA(1.5μg)；泳道2为NS5Aprotein(1.5μg)。

图8是纯化蛋白的Western Blot分析。图中：泳道M为Western Blot Marker；泳道1为NS5A蛋白约57kDa。

图9是羊驼血清中BVDV特异性抗体ELISA效价检测

图10是VHH目的基因PCR结果。图中：泳道M2为DL700 DNA Marker；泳道6-11为二轮PCR产物。

图11是pCANTAB 5E+VHH酶切鉴定。图中：泳道M为DL5000 DNA Marker；泳道1-5为pCANTAB 5E+VHH连接质粒。

图12是纳米抗体文库库容量鉴定滴度测定图。

图13是菌落PCR鉴定噬菌体抗体展示库插入率。图中：泳道M为DL700 DNA Marker；泳道1-12为二轮PCR产物。

图14是SDS-PAGE分析Nb-Y1蛋白于BL21(DE3)表达情况。图中：泳道M为SDS-PAGEProtein Marker；泳道0为对照(不加IPTG)；泳道1为37℃诱导16h；泳道2为全菌破菌后上清；泳道3为全菌破菌后沉淀。

图15是SDS-PAGE分析包涵体中Nb-Y1蛋白纯化结果。图为中：泳道1为包涵体溶解离心后上清；泳道2为上清同Ni-IDA孵育后流出液；泳道3-4为50mM Imidazole的洗脱组分；泳道5为300mM Imidazole的洗脱组分。

图16是Nb-Y1蛋白浓度测定。图中：泳道1为BSA(1.50μg)；泳道2为Nb-Y1、protein(2.00μg)；泳道M1为SDS-PAGE Marker。

图17是Nb-Y1蛋白WB检测。图中：泳道M2为Western Blot Marker；泳道1为BSA(1.50μg)；泳道2为Nb-Y1 protein(2.00μg)。

图18是SDS-PAGE分析Nb-Y2蛋白于BL21(DE3)表达情况。图中：泳道M为SDS-PAGEProtein Marker；泳道0为对照(不加IPTG)；泳道1为37℃诱导16h；泳道2为全菌破菌后上清；泳道3为全菌破菌后沉淀。

图19是SDS-PAGE分析包涵体中Nb-Y2蛋白纯化结果。图为中：泳道1为包涵体溶解离心后上清；泳道2为上清同Ni-IDA孵育后流出液；泳道3-4为50mM Imidazole的洗脱组分；泳道5为300mM Imidazole的洗脱组分。

图20是Nb-Y2蛋白浓度测定。图中：泳道1为BSA(1.50μg)；泳道2为Nb-Y2protein(2.00μg)；泳道M1为SDS-PAGE Marker。

图21是Nb-Y2蛋白WB检测。图中：泳道M2为Western Blot Marker；泳道1为BSA(1.50μg)；泳道2为Nb-Y2protein(2.00μg)。

图22是SDS-PAGE分析Nb-Y3蛋白于BL21(DE3)表达情况。图中：泳道M为SDS-PAGEProtein Marker；泳道0为对照(不加IPTG)；泳道1为37℃诱导16h；泳道2为全菌破菌后上清；泳道3为全菌破菌后沉淀。

图23是SDS-PAGE分析包涵体中Nb-Y3蛋白纯化结果。图为中：泳道1为包涵体溶解离心后上清；泳道2为上清同Ni-IDA孵育后流出液；泳道3-4为50mM Imidazole的洗脱组分；泳道5为300mM Imidazole的洗脱组分。

图24是Nb-Y3蛋白浓度测定。图中：泳道1为BSA(1.50μg)；泳道2为Nb-Y3protein(2.00μg)；泳道M1为SDS-PAGE Marker。

图25是Nb-Y3蛋白WB检测。图中：泳道M2为Western Blot Marker；泳道1为BSA(1.50μg)；泳道2为Nb-Y3 protein(2.00μg)。

图26是pET-30a-Nb-Y1重组表达质粒鉴定Nde I和Hind III双酶切电泳图，图中：泳道M为DL4500 Marker；泳道1为质粒对照；泳道2为Nde I和Hind III双酶切结果。

图27是pET-30a-Nb-Y2重组表达质粒鉴定Nde I和Hind III双酶切电泳图，图中：泳道M为DL4500 Marker；泳道1为质粒对照；泳道2为Nde I和Hind III双酶切结果。

图28是pET-30a-Nb-Y3重组表达质粒鉴定Nde I和Hind III双酶切电泳图，图中：泳道M为DL4500 Marker；泳道1为质粒对照；泳道2为Nde I和Hind III双酶切结果。

图29是WB验证纳米抗体Nb-Y1的特异性。图中：泳道M为100KDa Western BlotMarker。

图30是WB验证纳米抗体Nb-Y2的特异性。图中：泳道M为100KDa Western BlotMarker。

图31是WB验证纳米抗体Nb-Y3的特异性。图中：泳道M为100KDa Western BlotMarker。

具体实施方式

1.优势抗原表位预测

根据BVDV NADL标准株(NC_001461)，运用在线软件Predicting Anti-genicPeptides服务器预测NADL株目的蛋白NS5A的优势抗原表位。(图1)

2.NS5A蛋白的基因扩增及原核表达载体的构建

以BVDV NADL标准株基因组为模板，扩增NS5A目的基因片段。(图2)使用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对NS5A蛋白氨基酸序列进行优化，通过限制性酶切位点Nde I/Hind III将NS5A基因插入到表达载体pET-30a中，通过酶切和测序确认最终表达载体的准确性，得到原核表达质粒pET-30a-NS5A(图3)。

表1双酶切反应体系

Table1-5 Reaction system of double enzyme digestion

2.表达载体转化及诱导表达

将构建好的含有BVDV NS5A基因的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600nm为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mM IPTG，之后置于在15℃、37℃诱导表达0h、16h。(图4)

3.NS5A蛋白的上清中亲和层析纯化

表达菌诱导后，经超声破碎，离心分离上清与沉淀。吸取上清加入Buffer A平衡过的Ni-IDA柱内，使用不同咪唑浓度的Buffer B洗脱蛋白，收集各浓度下洗脱组分，SDS-PAGE分析蛋白表达形式。表达菌破碎离心后的上清中无目的蛋白表达。(图5)

4.NS5A蛋白包涵体的亲和层析纯化

包涵体采用50mM Tris(pH8.5)、150mM NaCl含1％Triton X-100、5mM EDTA、2mMDTT洗涤后，以50mM Tris(pH8.5),150mM NaCl,8M Urea缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测(图6)，将蛋白稀释至0.1mg/mL，4℃环境下，透析到缓冲液[50mM Tris(pH 8.5)，150mM NaCl，2mM EDTA，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M Arginine，]中复性，复性过程中蛋白少量析出，复性后Nb2合成蛋白最终透析于储存液50mM Tris(pH 8.5)，150mM NaCl，10％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，浓缩提高浓度，用0.22um滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

5.NS5A蛋白的纯化与浓度测定

蛋白经纯化后，Bradford法检测其浓度，蛋白浓度为0.331mg/mL。SDS-PAGE检测分析，使用BSA作为对照，SDS-PAGE分析。图1-7可见，目的蛋白与预期大小相符，表明NS5A蛋白均纯化成功。(图7)

6.NS5A蛋白Western Blot分析

NS5A复性后进行Western-blot分析其抗原性，NS5A蛋白在预期大小处均可见明显条带(57KDa)，结果表明纯化后的重组蛋白NS5A具有良好的抗原性(图8)

7.羊驼的免疫

使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分别在第0d、21d、49d、以及70d使用抗凝管(EDTA)采集全血，分离外周血淋巴细胞及血清。测得抗体效价，结果显示羊驼血清抗体效价可达1:51200。(图9)

8.VHH基因的获得

提取外周血淋巴细胞的RNA，反转录成cDNA，通过参考文献合成巢式引物进行巢式PCR扩增纳米抗体目的基因，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，目的片段在400bp左右。(图10)

表2目的基因扩增所需引物

Table1 The primers for target gene PCR amplification

9.重组载体pCANTAB5E+VHH的构建

取琼脂糖凝胶电泳后回收纯化的目的片段和冻存的质粒pCANTAB5E，用限制性内切酶Sfi I和Not I进行酶切。将酶切后的VHH目的片段与pCANTAB5E在200μL的无菌EP管中进行连接。配制好的连接体系放置在低温连接仪内，16℃低温连接16h。将重组载体pCANTAB5E+VHH进行酶切鉴定。(图11)

10.连接产物的转化及文库鉴定

连接好的重组载体pCANTAB5E+VHH转入到TG1感受态细胞中，将转化后的菌涂布于LB-AMP固体培养基，放入培养箱37℃过夜培养。次日分别向平板中加入1mL LB-AMP液体培养基，用无菌的细胞刮刀收集菌落，取20μL接种于20mL 2×YT/AMP培养基中，放入摇床37℃，200rpm/min，培养至对数生长期，OD600nm值在0.8-1.0。加入100μL M13K07辅助噬菌体，轻轻混匀，37℃静置30min。2800g室温离心10min，弃上清，菌体用200mL 2×YT/AMP培养基重悬，放入摇床37℃，200rpm/min培养12h。放入离心机，4℃，12000g离心15min，收集上清，加入0.1mL预冷的PEG/NaCl，上下颠倒混匀，冰上静置2h。放入离心机，4℃，10000g离心10min，弃上清，用1mL PBS重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体充分溶解。

取保存的救援噬菌体用2×YT按照10-1、10-2、10-3、10-4……10-16梯度稀释，以1:1的比例加入对数生长期的TG1，室温孵育5-10min。吸取孵育后的混合液100μL，用平板涂布法均匀涂布于LB-AMP固体培养基上。37℃过夜培养。次日对板上单克隆计数，并计算救援噬菌体滴度。从转化后的培养板上随机挑取96个单克隆菌落做菌液PCR，并且对PCR产物进行鉴定目的片段插入的阳性率，并计算文库库容。最终得到库容为1.02×10⁷CFU/mL的VHH文库(图12)。90.8％的克隆含有目的基因的插入。(图13)

11.特异性纳米抗体淘选

以E0、E2、NS5A、NS3四个蛋白为包被抗原进行特异性纳米抗体淘选。将蛋白E0、E2、NS5A、NS3用包被液稀释至100μg/mL，每个蛋白包被16个孔(阴性对照用PBS代替抗原蛋白)；弃去包被液，加入200μL浓度为5％的脱脂奶粉，放入温箱，37℃封闭2h。用PBS’T洗涤4次，取救援后的噬菌体溶液，用2％的脱脂奶粉稀释10⁵倍，每孔加入100μL，37℃孵育2h；弃去噬菌体样品，用PBS’T和PBS各洗涤5次，每孔加入100μL新鲜配制的0.1M的三乙胺，室温孵育10min，迅速用等体积PH为7.4的1M Tris-HCl中和。洗脱噬菌体浓度测定，取400μL洗脱液，感染4mL对数生长期的TG1，轻轻混匀后，37℃孵育30min，加入16mL 2×YT-AMP液体培养基，放于摇床37℃，200rpm/min培养至对数生长期，D_600nm值在0.6-0.8之间；向到达对数生长期的培养液中加入20μL M13K07辅助噬菌体，轻轻混匀后，放于37℃孵育1h，2800g离心10min，弃上清。菌体用2×YT-AMP液体培养基重悬菌体，放入摇床37℃，220rpm/min培养14h。后进行噬菌体粒子浓缩纯化。重复三次完成三轮淘选。

12.重组纳米抗体的诱导表达及粗提物获取

分别取E0、E2、NS5A、NS3第三轮筛选后洗脱得到的噬菌体，用2×YT稀释度为108的样品，分别取100μL加入等体积对数生长期的TG1，混匀，37℃静置15min；将感染后的TG1涂布于LB-AMP固体培养基，放入温箱，37℃培养8h；每个蛋白随机挑取96个单克隆菌落，接种于200μL LB-AMP液体培养基中，培养10h；将菌液与TB培养基以1:100的比例混匀，对应编号，放入摇床37℃，200rpm/min培养至对数生长期；加入IPTG使其终浓度为0.1mM，诱导过夜；4℃，3200g离心10min，弃上清，将菌体沉淀放入-20℃冰箱冷冻30min。置于室温至融化，每管加入500μL无菌PBS，放入摇床37℃，225rpm/min培养30min。4℃，3500g离心15min，收集上清即为可溶性重组纳米抗体粗提物。

13.可溶性重组纳米抗体的ELISA检测

分别将E0、E2、NS5A、NS3四个蛋白用包被液稀释至10μg/mL，取96孔酶标板，每孔加入100μL(每个蛋白包被2板)，4℃包被过夜。空白孔不需包被蛋白使用PBS作为无抗原对照。弃去包被液，拍干，每孔加入200μL 5％的脱脂奶粉，放入37℃温箱，封闭2h。用PBS’T洗涤3次，取可溶性重组纳米抗体粗提物，用5％的脱脂奶粉1:1稀释后，每孔加入100μL，放入37℃温箱，孵育45min。用PBS’T洗涤3次，同种蛋白，不同板，分别加入1:2000倍稀释的HRP标记的酶标E-tag、HRP鼠抗M13，放入37℃温箱，孵育45min。用PBS’T洗涤3次，加入ELISA显色液，放入37℃温箱，显色15min。每孔加入50μL ELISA终止液，使用酶标仪测定D_450nm值，分析OD数值大于PBS对照3倍以上的为阳性。

14.特异性纳米抗体测序分析

选取两组ELISA均为阳性，且OD值较高的阳性克隆保存液转接于新鲜的20mL 2×YT-Amp液体培养基中过夜培养。次日，用引物VHH-F、VHH-R进行菌液PCR，将PCR产物送至华大基因(北京)股份有限公司进行测序，经Blast比对后，应用DNAMAN软件分析对比氨基酸序列同源性。结果得到7条不同氨基酸序列的纳米抗体。

15.纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3基因的合成及原核表达载体的构建

采用密码子优化软件MaxCodon TM Optimization Program(V13)对提供的Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3基因插入到表达载体pET30a中，得到原核表达质粒pET30a-Nb-Y1、pET30a-Nb-Y2、pET30a-Nb-Y3并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到Top10克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中。(pET30a-Nb-Y1图26)(pET30a-Nb-Y2图27)(pET30a-Nb-Y3图28)

16.表达载体转化及诱导表达

将构建好的含有Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3基因的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至D_600nm为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.5mM IPTG，之后置于37℃诱导表达。扩大培养，生长至D_600nm＝0.8时，加终浓度0.5mM IPTG，37℃诱导16h后收集菌体。

17.纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3 SDS-PAGE分析鉴定表达结果

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。全菌采用20mMTris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测。(E2-1图14)(E2-3图18)(NS2-3图22)

18.包涵体通过亲和层析纯化纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白

包涵体采用20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA，5mMDTT洗涤后，以20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。(Nb-Y1图15)(Nb-Y2图19)(Nb-Y3图23)

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的Lane 3-5，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea，5％Glycerol]中复性，复性后Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，5％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

19.纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白浓度测定

测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。(Nb-Y1图16)(Nb-Y2图20(Nb-Y3图24)

20.纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白WB检测

WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著。(Nb-Y1图17)(Nb-Y2图21)(Nb-Y3图25)

21.纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白结合辣根过氧化物酶(HRP)

22.WB验证纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3的特异性

将80μL BVVD-E0/E2/NS5A/NS3蛋白分别与20μL的蛋白上样液混匀，加热煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳。目的蛋白所在的位置切下，入膜转移液中备用，将滤纸、胶和PVDF膜分别放入半湿转膜仪上(顺序为3层滤纸、胶、PVDF膜和3层滤纸)，大约移50min即可。之后转移至平皿中用5％脱脂奶粉室温封闭2h，再用孵育盒孵育结合辣根过氧化物酶(HRP)纳米抗体Nb-Y1、Nb-Y2、Nb-Y3蛋白，稀释为1：5000，摇床室温孵育1h。TBST清洗3次之后，将将化学发光液均匀的滴加在PVDF膜表面，放入化学曝光仪器中进行曝光。结果显示Nb-Y1、Nb-Y2能够与E0发生特异性结合，Nb-Y3能够与E2发生特异性结合。(图29)、(图30)、(图31)。

Claims (1)

1.一种抗BVDV E0的纳米抗体，其特征在于：氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

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