CN106226520A - 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽的应用 - Google Patents

结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽在制备结核病检测试剂、疫苗和药物中的应用，所述抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑5所示。本发明利用结核分枝杆菌Rv0865蛋白抗原及其B细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应，与以往采用完全抗原相比，能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。由所述Rv0865蛋白抗原及其表位肽制备的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域，Rv0865蛋白抗原及其表位肽制备的结核疫苗和抗结核药物可用于结核病的预防和治疗。

Description

结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽在制备结核病检测试剂、结核疫苗以及抗结核药物中的应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病，根据世界卫生组织统计，目前全球约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，其中约有10％有可能发展为活动性肺结核。我国结核病感染率为44.5％，是全球22个结核病流行严重的国家之一、结核病人总数位居第二，仅次于印度。2014年WHO报告显示2013年有900万新生病例和150万人死于结核病，其中36万属于HIV阳性病人，48万属于多重耐药结核病人(MDR-TB)，结核分枝杆菌合并人类免疫缺陷病毒感染以及多重耐药菌株的出现，使得结核病成为严重危害人类健康的公共卫生问题。
目前，结核病仍是我国传染病中危害最大的一种疾病，高特异性和高敏感性结核病早期检测技术及试剂，对于结核病的早期诊断，及时隔离和治疗，有效切断传染途径，降低结核病的发病率和死亡率至关重要。结核的诊断一般是依靠实验室诊断、影像学检查和临床诊断等，细菌学诊断中痰涂片染色镜检虽然简单易行，但对样本的浓度要求较高，通常要含菌量在5000～10000/ml才可检出阳性，故阳性率低，容易漏检，样本合格与否直接决定痰菌检出率的阳性与否。痰培养是结核病诊断的金标准，但周期长，培养成功率只有80％，不利于快速检测。临床上最常用的是皮肤结核菌素实验，但皮肤实验受卡介苗(BCG)接种和环境分枝杆菌感染的干扰导致假阳性的出现，使其灵敏度较低，并且需要患者二次就医。结核的影像学检查如常规的X线检查、CT检查、MRI检查、超声检查等价格昂贵，且对身体产生一定创伤性，特异性低，不适用于常规的检查诊断。结核病检测试剂盒逐渐应用于临床结核病的诊断，该方法具有操作简单、快速、成本较低、稳定性较好、便于推广等优点。结核病诊断试剂盒主要是应用了血清学诊断技术，其基本原理是抗原-抗体的特异性反应，因此筛选高特异性的B细胞表位及蛋白抗原有助于促进结核病的预防、诊断及治疗。
Rv0865(GI:15608005)是H37Rv基因组上的钼喋呤生物合成酶基因，基因全长483bp，编码含有160个氨基酸的蛋白，利用生物信息学软件对其进行抗原表位预测分析，发现Rv0865蛋白存在较多的B细胞表位，具有潜在的诊断效能。
结核的快速和早期诊断为结核病的早期治疗提供了有力保证，但要想在源头上遏制结核病还应从结核疫苗的制备方面入手。目前BCG疫苗是使用最广泛的并且是唯一批准使用的结核疫苗，BCG对婴幼儿脑膜炎有很好的保护效率，但是对成人结核保护率高低不一，目前对结核疫苗的改造主要分为两方面：一是新型亚单位疫苗作为加强免疫疫苗，以增强BCG引起的免疫应答。二是将BCG缺失的免疫优势抗原重新重组到BCG疫苗中通过过表达免疫优势抗原，从而增强BCG引起的保护性免疫应答。BCG疫苗已使用多年，其安全性已经得到大量接种人群的验证，因此以上两种疫苗改造策略均建立在BCG的基础上有很大的优势。目前已有抗原如Ag85、Rv3425、HspX等多种免疫优势抗原被鉴定并正在用于结核疫苗的研究中。由于结核分枝杆菌是胞内菌，在肺泡巨噬细胞中定植和增殖，细胞免疫应答在清除结核分枝杆菌中起到重要作用，研究也证实了体液免疫应答引起的抗体能改变结核分枝杆菌的病程发展，其中研究证实IgM、IgG1、IgG3和IgA等是保护性抗体，因此细胞免疫和体液免疫在结核感染中都至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865的应用。
本发明的另一目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865B细胞表位肽及其应用。
为了实现本发明目的，本发明提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv0865的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865B细胞表位肽，所述表位肽选自P207、P208、P209和P210，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示。
本发明还提供由所述B细胞表位肽衍生的表位肽或其类似物。
本发明还提供编码所述B细胞表位肽的DNA分子。
本发明还提供含有编码所述B细胞表位肽的DNA分子的表达盒及表达载体。
本发明还提供含有编码所述B细胞表位肽的DNA分子的转基因细胞系。
本发明还提供含有编码所述B细胞表位肽的DNA分子的重组菌及其表达纯化的重组蛋白。优选利用原核表达系统表达所述抗原蛋白Rv0865，优选的原核表达载体为pET-32a载体，优选的原核细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一个具体实施方案中，从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv0865的目的片段，目的片段胶回收后连接到T4载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中培养，提取质粒测序正确后，将质粒双酶切连接到pET-32a载体上转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，37℃，IPTG诱导后得到包涵体蛋白，经纯化复性后，得到有活性的Rv0865蛋白。
本发明还提供所述B细胞表位肽、编码所述表位肽的DNA分子、所述转基因细胞系或所述重组菌及其表达纯化的重组蛋白在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用。
本发明还提供一种结核诊断试剂，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865，或编码所述抗原蛋白Rv0865的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
所述B细胞表位肽、编码所述表位肽的DNA分子和/或所述重组蛋白。
本发明还提供含有上述诊断试剂的结核抗体ELISA检测试剂盒。所述试剂盒还包括以下材料或试剂：
①酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物的小鼠IgG单克隆抗体；
②96孔微孔反应板；
③其他抗体检测所需的试剂及耗材；
优选地，Rv0865或其表位肽固定在上述微孔反应板上。
本发明基于酶联免疫吸附原理，实验过程为：将Rv0865重组蛋白或其B细胞表位肽包被在96孔微孔板上，结核病人血清中的特异性抗体与Rv0865或其表位肽结合，酶标二抗与特异性抗体结合后，显色。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽在制备结核疫苗中的应用。
本发明还提供一种结核疫苗，其有效成分为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽，或编码所述抗原蛋白Rv0865和/或所述表位肽的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽在制备抗结核药物中的应用。
以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备多克隆抗体；或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备出识别结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽的人源化单克隆抗体。
本发明还提供一种抗结核药物，其有效成分是以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备的识别结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及其B细胞表位肽的人源化单克隆抗体。
本发明进一步提供所述抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽在检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应中的应用。其是将人或动物的淋巴细胞经抗原蛋白Rv0865或所述B细胞表位肽刺激后，检测T细胞或B细胞分泌的细胞因子。
其中，结核特异性T细胞分泌的细胞因子包括：Υ干扰素(IFN-Υ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。B细胞分泌的细胞因子包括抗体。
针对结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法包括酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验等。B细胞分泌的细胞因子的检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
所述淋巴细胞来自人或动物的外周血、静脉血、脑脊液、胸腔积液或胸水等。
本发明具有以下优点：
(一)本发明提供一种新的结核检测抗原，与以往采用单一抗原的检测手段相比，可减少因单一抗原造成的假阴性，从而提高检测灵敏度。
(二)本发明利用原核表达系统表达纯化蛋白Rv0865，适合大规模商业化生产，且成本较低。
(三)采用固相合成的方法合成表位肽，有利于质量控制，且成本较低，纯度高，适合大规模商业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中目的基因Rv0865的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M为DL1000 DNA Marker，1为目的基因。
图2为本发明实施例1中蛋白Rv0865的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白Marker，1为纯化的Rv0865蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1结核分枝杆菌抗原基因Rv0865的克隆及蛋白的表达纯化
1.引物设计：根据NCBI上结核分枝杆菌H37Rv的基因组序列，利用软件Primer5设计引物，上游引物：CGCGGATCCATGAGCACCCGGTCCGCTCGAA(含BamH1酶切位点)，下游引物：CCAAGCTTTCATCGCGGGTGATCTCCACC(含HindⅢ酶切位点)。
2.目的基因的扩增：利用CTAB法提取结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA，以DNA为模板，进行目的基因的扩增，PCR反应的体系如下：
PCR反应程序：95℃热启动5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃温育10min。
3.目的基因的鉴定：取7μl PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，用DL1000DNAMarker为分子量标准，用凝胶成像系统查看结果并拍照保存。
4.PCR产物的回收与纯化：
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，用消毒过的手术刀对目的条带进行切割，将含有目的片段的琼脂块置于2ml EP管中。
A(1)向100mg胶块中加入3倍体积的Buffer PG，50℃孵育10分钟，其间每隔2～3分钟温和地上下颠倒离心管，以确保胶块完全溶解。
A(2)加入1倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀。
A(3)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200μl Buffer PS，16200g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
A(4)将步骤(1)得到的溶液加入到已装收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，16200g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。
A(5)将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlBuffer EB，室温放置2分钟，16200g离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
5.质粒的扩增：
将空质粒pET-32a转入到大肠杆菌DH5α中，在含氨苄霉素的LB固体平皿上37℃过夜后，挑取单个菌落，置于氨苄抗性的液体LB中过夜培养，次日用试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司生产的无内毒素质粒中提试剂盒)提取质粒，步骤如下：
B(1)取5～15ml过夜培养菌液，加入离心管中，＞6200g离心3分钟收集细菌，尽量弃去全部上清。
B(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl Buffer P1，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。
B(3)向离心管中加入500μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6～8次，使菌体充分裂解，室温放置3～5分钟，向离心管中加入500μl Buffer E3，立即上下颠倒混匀6～8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟，16200g离心10分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱中，16200g离心1分钟过滤，将收集管中的滤液转移到离心管中。向滤液中加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀。
B(4)柱平衡：向已装入收集管的吸附柱中加入200μl Buffer PS，16200g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
B(5)将步骤B(3)中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。16200g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
B(6)向吸附柱中加入750μl Buffer PW，16200g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱重新放回到收集管中，16200g离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5分钟。
B(7)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入100～300μlEndo-Free Buffer EB，室温放置2～5分钟，16200g离心2分钟，-20℃保存质粒。
6.将得到的DNA产物和质粒分别进行双酶切。
DNA产物的酶切反应体系为：
质粒的酶切反应体系为：
分别37℃孵育1小时后，用DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)对酶切产物进行回收，步骤如下：
C(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
C(2)向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。将所得溶液加入一个吸附柱CB2中，室温放置2min，12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
C(3)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
C(4)重复操作上述步骤。
C(5)将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱CB2于室温放置数分钟，彻底晾干。
C(6)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30～50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
7.重组质粒和重组菌的获得：
连接：将酶切后纯化得到的DNA和pET-32a质粒用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：
16℃过夜连接。
转化：将连接的质粒转化到大肠杆菌DN5α中，将5μl质粒加入到装有50μl感受态细胞的离心管中，用枪吹打均匀，冰浴30min，42℃水浴90sec，冰浴2min，加400μl 37℃预热的不含抗生素的LB培养基，37℃摇床中培养45min，150r/min,使细胞恢复抗药性，4000r离心2min。弃去400μl上清，余下55μl混匀，涂LB平皿。置于室温4～5min后，倒置平皿于37℃培养12～16小时。
测序：挑取单个菌落，进行菌液PCR，验证阳性的单克隆置于液体LB培养基中培养12小时后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。目的基因Rv0865(SEQ ID NO:6)的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。
将测序正确菌种再次扩大培养后提取质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中(步骤同上)。对转化后的BL21(DE3)进行菌落PCR验证阳性后，一部分用甘油存放于-70℃作为菌种，一部分扩大培养获得蛋白。
8.结核分枝杆菌抗原在大肠杆菌中的诱导表达：
将1ml新鲜菌液加到300ml含氨苄抗性的LB培养基中于37℃摇床过夜培养后，次日再加入300ml LB培养基扩大培养3个小时后，测定OD值在0.6～0.8时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)使其终浓度为1mmol/ml，37℃诱导3小时后，12000rpm离心5分钟收集菌体，用含1％Triton X-100的PBS重悬菌体，混匀后，用功率300W超声仪，工作5s，停止5s，超声30min。12000rpm离心5min，将上清保留，沉淀用PBS重悬后，进行SDS-PAGE电泳，结果见图2。确定蛋白以包涵体的形式表达在菌体沉淀中。
9.Rv0865蛋白的纯化与复性：收集培养液，8000转/分钟离心10分钟，收集沉淀的菌体，每100ml菌液中加入4ml破碎缓冲液(pH8.550mM Tris-HCL，2mM EDTA，100Mm NaCl，0.5％Triton X-100，1mg/ml溶菌酶)，冰上混合45分钟，混合菌体在冰水中用300W超声仪工作5s，停止5s，超声10分钟，然后12000g离心10分钟，弃去沉淀，用pH7.4的50mM磷酸缓冲液(含0.5M NaCl，8M尿素，10mM咪唑)重悬沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤，避免堵柱。具体操作如下：
(1)取1ml镍NTA琼脂糖凝胶预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，破碎上清以0.5ml/min上样，然后2ml/管分装。
(2)用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1～2ml/min，2ml/管收集。
(3)用5ml洗涤缓冲液(含0.5M NaCl，8M尿素，25mM咪唑)洗去未吸附的样品，流速1～2ml/min，2ml/管收集。
(4)用5ml洗涤缓冲液(含0.5M NaCl，8M尿素，40mM咪唑)洗去吸附的杂蛋白，流速1～2ml/min，2ml/管收集。
(5)用5ml洗涤缓冲液(含0.5M NaCl，8M尿素，60mM咪唑)洗去目的蛋白，流速1～2ml/min，2ml/管收集。
(6)用5ml洗脱缓冲液(含0.5M NaCl，8M尿素，300mM咪唑)洗去目的蛋白，流速1～2ml/min，2ml/管收集。
(7)用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％乙醇，封闭。
将收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(图2)后，SDS-PAGE结果显示Rv0865大小在35kDa左右，将目的蛋白用蛋白复性试剂盒进行复性，并用BCA蛋白定量试剂盒对复性的蛋白Rv0865进行定量。蛋白Rv0865的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
实施例2结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865表位肽的合成
利用生物信息学软件TE predict和IEDB对Rv0865编码基因上B细胞抗原表位进行预测，利用固态合成法合成B细胞表位肽，再通过ELISA对结核病人、健康人血清中特异性抗体进行检测，从而评价该抗原用于结核检测的灵敏度和特异性。
本实施例提供的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865 B细胞表位肽选自P207、P208、P209和P210，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示。
实施例3结核ELISA检测试剂盒的制备
所述试剂盒基本组成如下：
①实施例1制备的蛋白抗原Rv0865或其B细胞表位肽。
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物小鼠IgG单克隆抗体。
③培养板：96孔微孔反应板。
④其他ELISA检测所需的试剂及耗材。
将Rv0865抗原或其表位肽固定在上述微孔反应板上。
该试剂盒是基于间接酶联免疫吸附实验原理设计的，采用Rv0865或其表位肽检测血清中的特异性抗体，实验过程为：Rv0865或其B细胞表位肽包被96孔微孔板，加入血清后，能与血清中抗原或表位肽特异性抗体结合后，然后加入鼠抗人的酶标二抗结合，显色，从而检测样品中特异性抗体的存在。
实施例4抗原蛋白Rv0865用于结核感染的临床检测
1.血清的分离、收集
1.1受试对象
结核病志愿者的筛选标准：
临床表现症状、体征及胸部影像学检查诊断为肺结核的，且痰培养为阳性的肺结核患者。
健康志愿者的筛选标准：
无结核临床症状、无结核病人密切接触史、无其他疾病或感染。
入选的结核病患者和志愿者从到结核病室就诊的连续时间样本中随机选取。共采集了104例结核病志愿者、104例健康志愿者血液样本，采血时使用无内毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周静脉血，每名志愿者采血约5ml。将新鲜血液3000rpm/转，离心10分钟后，取上层血清，-80℃保存备用。
1)将Rv0865蛋白抗原用包被液稀释成终浓度为2μg/ml，P207、P208、P209、P210多肽用包被液稀释成终浓度为3μg/ml，100μl/孔加到96孔微孔板中，4℃包被过夜。
2)次日，弃去孔内液体，用PBST洗涤96孔板5遍。
3)将104份结核病志愿者血清和104份健康志愿者的血清分别用PBS 100倍稀释后分别加入用Rv0865、P207、P208、P209、p210包被的96孔板，100μl/孔，37℃孵育1小时。
4)弃去血清，用PBST洗涤96孔板5遍。
5)加入1:7500倍稀释的酶标二抗，37℃孵育1小时。
6)弃去酶标二抗，用PBST洗涤96孔板7遍。
7)加入TMB显色液，100μl/孔，37℃孵育10～30分钟显色。
8)加入2M的H2SO4，50μl/孔，终止显色。
9)用酶标仪测定OD450nm的吸光值，用SPSS软件分析实验结果。
10)结果如表1所示：
表1Rv0865及其四条B细胞表位肽ELISA检测结果
蛋白 Youden指数 cut-off值 灵敏度(％) 特异度(％) AUC
Rv0865 0.734 0.289 89.42 83.96 0.901
P207 0.528 0.122 78.85 74.04 0.832
P208 0.625 0.180 73.08 89.42 0.872
P209 0.711 0.143 88.46 88.69 0.934
P210 0.654 0.132 79.81 85.58 0.896
Youden指数是评价筛查试验真实性的方法，Youden指数越大，说明筛选试验的效果越好，真实性越大，从表1结果可知，Rv0865蛋白及其B细胞表位肽的Youden指数、灵敏度和特异度均较高，均能很好在人群中检测出结核病人，是很好的结核免疫检测抗原或表位肽。另外，Rv0865蛋白在Youden指数、灵敏度和特异度上均高于四条多肽，证实Rv0865蛋白在作为抗原检测结核病时，检测效果更优于另外四条表位肽。同时也可得知Rv0865抗原上存在更多的B细胞表位肽，人群筛选实验证实Rv0865蛋白是一种能够被结核病人识别的免疫优势抗原，具有良好的免疫原性，能够引起机体产生强烈的体液免疫应答，可以用于结核疫苗的构建和制备。
综上所述，Rv0865抗原蛋白及其B细胞表位肽可以作为一种诊断试剂用于结核病的诊断检测，且抗原蛋白Rv0865能引起强烈体液免疫应答，是一种免疫优势抗原，可以用于结核疫苗的构建和制备。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865在制备结核病检测试剂、疫苗和药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv0865的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
2.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865B细胞表位肽，其特征在于，所述表位肽选自如SEQ IDNO:1-4所示的氨基酸序列中的一种。
3.权利要求1和权利要求2所述抗原及表位肽在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用。
4.一种结核诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865，或编码所述抗原蛋白Rv0865的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
权利要求2所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
5.含有权利要求4所述诊断试剂的结核ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
①酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物的小鼠IgG单克隆抗体；
②96孔微孔反应板；
③其他抗体检测所需的试剂及耗材；
优选地，Rv0865或其表位肽固定在上述微孔反应板上。
6.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或权利要求2所述表位肽在制备结核疫苗中的应用。
7.一种结核疫苗，其特征在于，其有效成分为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865，或编码所述抗原蛋白Rv0865的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
权利要求2所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
8.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或权利要求2所述表位肽在制备抗结核药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备多克隆抗体；或者，
以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备出识别结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及权利要求2所述表位肽抗原的人源化单克隆抗体。
10.一种抗结核药物，其特征在于，其有效成分是以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865和/或其B细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备的识别结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0865及权利要求2所述表位肽抗原的人源化单克隆抗体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109975543A (zh) * 2019-03-01 2019-07-05 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 分枝杆菌Ku蛋白的应用
CN113278633A (zh) * 2020-02-20 2021-08-20 北京蛋白质组研究中心 结核分枝杆菌H37Rv新基因及编码蛋白和其应用
CN113403327A (zh) * 2020-03-17 2021-09-17 北京蛋白质组研究中心 结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2706及其编码蛋白和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060182685A1 (en) * 2004-09-04 2006-08-17 Bishai William R Hollow fiber technique for in vivo study of cell populations
CN104685054A (zh) * 2012-09-27 2015-06-03 成都永安制药有限公司 Lsr2活性降低或敲除的改良BCG菌株及包含该菌株的药物组合物
CN105675863A (zh) * 2016-02-17 2016-06-15 遵义医学院附属医院 一组耐多药结核病诊断标志物及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060182685A1 (en) * 2004-09-04 2006-08-17 Bishai William R Hollow fiber technique for in vivo study of cell populations
CN104685054A (zh) * 2012-09-27 2015-06-03 成都永安制药有限公司 Lsr2活性降低或敲除的改良BCG菌株及包含该菌株的药物组合物
CN105675863A (zh) * 2016-02-17 2016-06-15 遵义医学院附属医院 一组耐多药结核病诊断标志物及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEBNATH PAL AND DAVID EISENBERG: "Inference of Protein Function from Protein Structure", 《STRUCTURE》 *
NCBI: "WO_003404549.1", 《NCBI》 *
WWW.UNIPROT.OGR/BLAST/: "R4M6B5", 《UNIPROT》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109975543A (zh) * 2019-03-01 2019-07-05 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 分枝杆菌Ku蛋白的应用
CN113278633A (zh) * 2020-02-20 2021-08-20 北京蛋白质组研究中心 结核分枝杆菌H37Rv新基因及编码蛋白和其应用
CN113278633B (zh) * 2020-02-20 2022-10-28 北京蛋白质组研究中心 结核分枝杆菌H37Rv基因及编码蛋白和其应用
CN113403327A (zh) * 2020-03-17 2021-09-17 北京蛋白质组研究中心 结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2706及其编码蛋白和应用

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