PT97150A

PT97150A - Novos metodos para o diagnostico da tuberculose

Info

Publication number: PT97150A
Application number: PT97150A
Authority: PT
Inventors: Chinnaswamy Jagannath; Meenakshi Balganesh; Bachally Ramasastry Srinivasa
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1990-03-27
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 1991-12-31
Also published as: ZA911855B; CN1060310A; BR9105237A; AU7564491A; IL97572A0; JO1671B1; EP0479971A1; SE9001105D0; WO1991014448A1

Description

NOVOS MÉTODOS PARA O DIAGNOSTICO DA TUBERCULOSE" 1. Resumo da invenção

Descrevem-se as propriedades imunoquímicas de um antigénio proteínico de 17 kDa fraccionado, purificado e sequenciado para os aminoácidos proveniente de microbacterium tuberculosis (South Indian isolado, SII 1) que causa a tuberculose humana disseminada mundialmente em 16 milhões de doentes. 0 antigénio de uma proteína com 17 kDa que tem um N-terminal deATTLPVQR (aa 1-8) tem pelo menos três epitopes de ligação de anticorpo específico localizados em péptidos lineares de sequências, * * 'frj RATYDKRYEVR (aa 91-101) eSEFAYG S F V R (aa 68-77) que foram utilizáveis num micro ELISA para o diagnóstico precoce de tuberculose humana através da detecção de anticorpos específicos. 0 antigénio da proteína 17 kDa que foi mitogénico para linfócitos de sangue periférico da tuberculose humana verificou-se transportar três epitopes de célula T previstos nos péptidos lineares com as sequências, SEFAYG SFVR (aa 68-77) e A E L PGVDP DCDV CITR (aa 107-122). O antigénio de 17 kDa de M. tuberculosis (SII 1) que apresenta reactividade de células T e B verificou-se conter 131 arainoácidos e ser potencialmente utilizável no diagnóstico imunológico, terapêutica imunológica e profilaxia imunológica da tuberculose humana. 2. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um novo antigénio proteínico de 17 KDadeMvcrobacterium tuberculosis (Isolado South Indian SII 1) e a certos fragmentos peptídicos derivados deste à utilização do antigénio referido e dos seus fragmentos peptídicos, no imunodiagnóstico, imunoterapêutica e imunoprofilaxia da tuberculose humana experimental. 2

ΰ *i A presente invenção também se refere à sequência de DNA que c£ difica para o referido antigénio de 17 KDa, as sequências de DNA que codificam para os fragmentos peptldicos referidos deri_ vados deste antigénio de 17 KDa e as sondas de DNA e RNA construídas com base na sequência proteínica do antigénio de 17 KDa incluindo as sequências dos fragmentos peptldicos deste an tigénio. 0 principal campo de aplicação é o uso do antigénio de 17 KDa e dos seus fragmentos peptldicos para o imunodiagnós_ tico da tuberculose. Um outro campo de utilização é na prepara ção de uma vacina contra a tuberculose que inclui o antigénio 17 KDa ou de subestruturas peptídicas derivadas deste. Um outro campo de aplicação é o uso do antigénio de 17 KDa ou dos seus péptidos subestruturais para a detecção em seres humanos de proliferação de células T através de testes cutâneos ou te£ tes in vitro. Este último campo de aplicação é importante no possível tratamento do cancro humano por desafio da imunidade celular. Um outro campo de aplicação é o do antigénio de 17 KDa ou dos seus péptidos subestruturais para a produção laboratorial de factores de desenvolvimento celular e de enzimas . 3 3. Antecedentes da invenção A tuberculose humana, provocada por M. tuberculosis. é uma doença debilitante crónica importante que está mundialmente disseminada que afecta i6 milhões de pessoas aproximadamente. Embora a sua prevalência principal seja nos países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, a recente epidemia de Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) nos países desenvolvidos pôs o problema de infecções secundárias por microbactéria incluindo M. tuberculosis. O diagnóstico exacto e confirmativo da tuberculose humana permite o tratamento precoce com antibióticos poderosos existentes embora l i, i em muito países se tenha iniciado um problema de resistência aos fármacos. No entanto, o diagnóstico precoce da tuberculose significa quimioterapêutica eficaz e portanto a eliminação da transmissão do bacilo vivo pelos doentes com tuberculose pulmonar. 0 diagnóstico convencional de tuberculose depende de achados clínicos e radiológicos, do exame microscópico, do espécime tuberculoso para detecção do bacilo e do isolamento da bactéria em cultura para M. tuberculosis. 0 controlo global da tuberculose não foi estabelecido ainda devido aos métodos inadequados presentemente disponíveis para diagnóstico.

Portanto, muitos dos aspectos clínicos da tuberculose não são específicos apenas da tuberculose e um estudo realizado na índia (proveniente do National Tuberculosis Institute, Bangalore, índia) revelou que apenas 30% dos suspeitos ao raios X desenvolvem eventualmente tuberculose, embora, em muitos países nos quais se inclui a índia, todos os suspeitos ao raios X sejam submetidos a quimioterapia anti-tuberculosa. A microscopia de espécime tuberculoso não é fácil sob as condições do campo e são necessários pelo menos 104 bacilos/ml para uma observação eficaz. Muitos espécimes tuberculosos, como o líquido cefalo-raquidiano proveniente de menigite tuberculosa, não contêm, frequentemente, bacilos. Além disso, a cultura bacteriológica, de um modo geral necessita seis a oito semanas e é dispendiosa como uma via de diagnóstico de rotina.

0 teste cutâneo de tubercolina largamente aplicado é pouco sensível e específico e leva cerca de três dias a sua realização total. Como a quimioterapia da tuberculose requer pelo menos seis meses, muitos doentes não mantêm um tratamento regular, desenvolvem resistência aos fármacos e transmitem os bacilos vivos. Finalmente, a vacinação tradicional por BCG verificou-se presentemente que estabelece níveis diversos de protecção que dependem das regiões geográficas.

Devido a estes factores, muitos investigadores, incluindo a Organização Mundial de Saúde, recomendam que o diagnóstico precoce da tuberculose deve ser considerado como uma área prioritária de investigação e desenvolvimento.

A microbactéria constitui para o homem e animais imunogénios poderosos como se demonstra pela sua aplicação em como imunoadjuvantes para provocar respostas imunológicas. Assim, foram reconhecidos muitos antigénios derivados de M, tuberculosis como indutores da formação de anticorpos específicos e de proliferação de linfócitos nos doentes com tubercolose (Ivangi et al., 1988)e em animais esperimentais. A detecção da resposta de anticorpo na tuberculose tem uma aplicação potencial no diagnóstico precoce. Identicamente, o estudo de linfócitos T 6

específicos de M. tuberculosis tem aplicação no diagnóstico precoce por testes cutâneos e no desenvolvimento de vacinas protectoras. Assim, em investigação foca-se nestes aspectos da tuberculose que se ligam com a identificação e.síntese de antigénios específicos de M. tubercolosis. 4. Técnica anterior

Muitos investigadores identificaram antigénios proteínicos de M-tuberculosis que têm potencial aplicação no imunodiagnóstico e na imunoprofi1axia. Poram publicadas as sequências de aminoácidos interna e N-terminal de muitos destes antigénios. Algumas das sequências de aminoácidos de N-terminal apresentam-se no Quadro I. 7

Quadro I

Antigénios proteínicos de M-tuberculosis identificados pelas sequências de arainoácidos N-terminal

Investigadores

Antigénios e N-terminal

Shinick et al . , 1987 65 kDa ; R G C R H P V Yamacruchi et al.. 1987 MPB 57 : M A K F N I K P L Pattorroyo et al.. 1987 13 kDa : A K V N I 18 kDa : G D L V G P G A E 23 kDa : A P K T Y 30 kDa : F S X P G L 68 kDa : W M T M T 77 kDa : G K X I A Y D G A A Matsu et al.. 1988 30 kDa : F S R P G L P Ashbridge et al., 1989 19 kDa : E H R V K R G L T V Baird et al.. 1989 10 kDa : A K V N I P K P Garcia et al. , 1989 70 kDa : F Q R I T R Q D L L Borremans et al.. 1989 32 kDa : F S R P G L P 8

Que se saiba,, nenhum destes antigénios foi introduzido como produtos de teste para imunodiagnóstico. Dois destes antigénios (antigénio de 10 kDa de Baird et al.. 1989e um antigénio homólogo de 65 kDa de Shinnick et al. 1987) foram testados para determinação da potência como vacina em animais de experiência e demonstraram fraca protecção contra M- tuberculosis (D.W. Smith, Universidade de Wisconsin, USA, comunicação pessoal).

Um conjunto ELISA para diagnósticos da tuberculose, utilizando o antigénio A60 presente em todas as microbactérias foi introduzido pelos diagnósticos ANDA (França). O teste, portanto, não é especifico apenas para a tuberculose humana.

Utilizando sondas de BNA, aplicado o método alternativo para o diagnóstico da tuberculose. O conjunto GEN PROBE (1988), comercializado, é utilizado para confirmar a identidade de membros do complexo de M-tuberculosi s isolados em cultura mas não tem sido directamente utilizado sobre espécimes clínicos. Um resultado positivo com este teste não admite outras microbactérias. A sonda de DNA idealizada por Enso Biochem (J. Clin. Microbiol., 1988 Dec.) usou sequências de DNA específicas com 1000 bases ou mais de comprimento e reinvidicou como sendo mais específica. Um obstáculo principal para todas as sondas com base em DNA é se se pode obter uma reacção verdadeiramente 9

% positiva com espécimes de doentes de modo a evitar a trabalhosa cultura do bacilo.

Extirpes de M. tuberculosis isoladas no Sul da índia conhece-se a variação fenotípica na virulência (Nagamathan et al. . 1987), cuja base molecular ainda não foi estabelecida. Abou Zeid et ai. . (1988) descobriu que um antigénio proteínico com 13 kDa estava presente no fago de tipo II virulento de M. tuberculosis e ausente no fago de tipo I South Indian de M. tuberculosis de baixa virulência. Contudo, a relação entre este antigénio e a virulência ainda não foi investigada com pormenor. 5. A Invenção

Descobriu-se um antigénio proteínico de 17 kDa presente nos isolados de M. tuberculosis. Os aspectos imunoquímicos deste antigénio estão descritos nesta invenção. Deste modo a presente invenção refere-se a: 1. Antigénio proteínico de 17 kDa de M, tuberculosis (SII 1) como definido em seguida e a certas subestruturas do antigénio proteínico de 17 kDa como definidos posteriormente. 10

2. Uma sequência de DNA que codifica para o antigénio de 17 kDa de M. tuberculosis .(SII 1). 3. Uma sequência de DNA codificadora para subestruturas (péptidos) do antigénio de 17 kDa de M. tuberculosis (SII 1). 4. 0 uso da proteína 17 kDa citada ou de subestruturas citadas anteriormente (péptidos) para a preparação de antisoros policlonais ou monoclonais que reagem com o antigénio proteínico de 17 kDa, citado antes ou com as suas subestruturas. Estes anticorpos citados podem surgir em mamíferos (por exemplo em murganhos, coelhos e caprinos) para anticorpos policlonais. 5. 0 uso do antigénio proteínico de 17 kDa, citado antes, das subestruturas também citadas antes (péptidos) para a detecção de anticorpos entre espécimes humanas e animais para imunodiagnóstico. São conhecidos métodos de detecção cuja técnica utiliza métodos tal como ELISA radio-imuno-ensaio (RIA) e hemaglutinação passiva inversa (RPHA). 11 $ % 6. 0 uso do antigénio proteínico de 17 kDa ou suas subestruturas (péptidos) para o tratamento da tuberculose. 7. 0 uso do antigénio proteínico de 17 Kda ou suas subestruturas peptídicas para a preparação de uma vacina contra a tuberculose. 8. 0 uso do antigénio de 17 kDa ou de suas subestruturas peptídicas para a preparação de um reagente para a prova cutânea no imunodiagnóstico da tuberculose. 9. Son.das de DNA ou de RNA construídas com base na sequência de proteínas do antigénio de 17 kDa ou suas subestruturas para o diagnóstico da tuberculose. Estas sondas podem ser construídas por processos técnicos conhecidos. A mareagem destas sondas pode ser feita por métodos conhecidos, tal como uma incorporação de um radiosótopo, ou por mareagem com uma substância sem radioactividade, como por exemplo a biotina. 10. Um método de diagnóstico de tuberculose humana por interferência com os fluidos corporais tais como o soro, CSF, líquido pleural de um doente que se tem que diagnosticar com 12

anticorpo monoclonal para o antigénio de 17 kDa ou suas subestrturas (péptidos), como definido no parágrafo 3, anteriormente. 11. Um método para o diagnóstico da tuberculose humana por interacção com líquido corporal como, por exemplo, o soro do doente que se deve diagnosticar com uma proteína de 17 kDa como definida no parágrafo 5, anteriormente. 12. Um método de diagnóstico da tuberculose humana por interacção com fluidos corporais como por exemplo o espunto, o soro, o CSF e o líquido pleural de um doente que deve ser diagnosticado com uma sonda de DNA ou de RNA como definido no parágrafo 9, anteriormente. 13. Um método para a detecção in vitro da tuberculose humana que consiste em fazer contactar uma amostra de um líquido corporal, tal como fluido CSF líquido corporal ou soro de um doente, com um anticorpo monoclonal como definido no parágrafo 10, sob a forma marcada. 13

.% 14. Um método para detecção in vitro da tuberculose humana que consiste em se fazer contactar uma amostra de um líquido corporal, tal como espunto, CSF líquido pleural ou soro de um doente, com um anticorpo monoclonal como definido no parágrafo 10, sob a forma marcada. 15. Um método para a detecção in vitro da tuberculose humana que consiste em se fazer contactar uma amostra de um líquido corporal, tal como espunto, CSF líquido pleural ou soro de um doente, com um anticorpo monoclonal como definido no parágrafo 3, sob a forma marcada. 16. Um conjunto para se realizar o diganóstico iraunológico da tuberculose utilizando-se um anticorpo monoclonal para o antigénio de 17 kDa como descrito no parágrafo 3, anteriormente. 17. Ura conjunto para iraunodiagnóstico da tuberculose utilizando--se o antigénio de 17 kDa ou subestruturas peptídicas como descrito no parágrafo 5, anterior. 18. Um conjunto para o diagnóstico da tuberculose que utilize a sonda de DNA ou RNA como descrito no parágrafo 9, anteriormente. 14 19. Um microrganismo que exprime uma proteína de 17 kDa ou suas subestruturas como descrito no parágrafo 1, anteriormente. 20. Uma vacina contra a tuberculose desenvolvida com base num antigénio de 17 kDa ou suas subestruturas peptídicas como descrito no parágrafo 1, anterior. Esta vacina pode ser um produto de organismos provenientes de um processo de tecnologia genética tal como a salmonela, vírus da vacina, etc. A presente invenção é exemplificada mas não limitada ao diagnóstico terapêutico ou profilaxia de doentes, especialmente no diagnóstico da ínfecção M. tubérculosis. A sondagem epidemiológica, investigações forenses, determinações de contaminação de alimentos, inspecções da saúde pública, medicina preventiva, veterinária e aplicações na agricultura no que se refere ao diagnóstico de agentes infecciosos , podem ser abrangidos por esta memória descritiva. 15 5.1 Fraccionamento e purificação do anticrénio de 17 kDa 5.1.1 Antigénio sonicado não purificado. M.tuberculosis (SII 1) foi cultivado à temperatura de 37a C durante 2 semanas em meio de Kirschner e os bacilos recolhidos foram mortos com acetona arrefecida durante 18 horas à temperatura de 4o C. Lavaram-se os bacilos por três vezes com solução de cloreto de sódio e uma suspensão de 10 mg de bacilos em 5 ml de cloreto de sódio foi sonicada com uma frequência de 40 watts utilizando-se uma mini sonda dum sonicador de Branson. O produto sonicado foi centrifugado a 20.000 x g durante 30 minutos e determinado no sobrenadante o teor de proteína (método de Lowry) antes da conservação à temperatura de - 70°' C. 5.1.2 Fraccionamento e purificação

Fraccionaram-se 500 yug de produto não purificado sonicado em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio a 12,5% como descrito por Hunkapiller e Lujan (1986). Visualizaram-se as bandas de proteína por cloração rápida com azul brilhante de coomassie e electroeluiu-se o antigénio de 17 kDa contra carbonato de hidrogénio e amónio a 0,05 M com 0,1% de SDS seguido por electrodiálise 16

contra carbonato de hidrogénio e amónio a 0,01 M com SDS a 0,02%. A proteína eluída foi em seguida extraída com clorofórmio - metanol para se remover SDS e secou-se o precipitado. A pureza da proteína eluída foi analisada submetendo 5 jug deste precipitado a HPLC uti1izando-se uma coluna Lichrosorb RP 18 (LKB). Eluíu um único pico a B 45% e 26 m que se verificou conter o antigénio imunorreactivo. A Fig. 1 apresenta o perfil de HPLC do antigénio de 17 kDa. 5.2 Análise da sequência de aminoácidos do antigénio 17 kDa 5.2.1 Mapeação dos péptidos do antigénio 17 kDa

Mapa tríptico: Digeriram-se 30 jig de proteína de 17 kDa com TPCK, tripsina tratada com uma enzima para uma relação com o substrato de 1:50 em tampão de carbonato de hidrogénio e amónio 0,1 M, pH 7,8, à temperatura de 37° C 17

por ura período de 5 horas. 0 digesto tríptico foi fraccionado por HPLC numa coluna de 18 RP (0,46 x 25 cm) equilibrada com dissolvente A (TFA a 0,1% em água) e eluiram-se os péptidos com um gradiente de dissolvente B (acetonitrilo a 70% contendo TFA a 0,085%) de 0 a 65% em 60 m. Na Fig. 2 apresenta-se um mapa tríptico.

Mapa de protease V8: trataram-se 30 ^g do antigénio de 17 kDa com protease V8 de estafilococos durante 48 horas em amónia a 0,7% à temperatura de 37°· C. A relação molar da enzima para o substrato foi de 1:25. Purificaram-se os vários péptidos no digesto enzimático numa coluna de HPLC sob as condições como utilizadas para a mapeação tríptica. O perfil dos péptidos está apresentado na Fig. 3. 5.2.2 Análise de sequência do antigénio de 17 kDa A análise de sequência dos aminoácidos da proteína e dos péptidos foi realizada utilizando-se um modelo sequenciador de proteína 477A (Applied Biosystems Inc., USA)com um analisador de aminoácidos PTH acoplado. Solubilizou-se a 18 amostra com ácido fórmico a 10% e fixaram-se em um disco de fibra de vidro tratado com TFA (1 mg) revestido com polibreno e utilizou-se para a sequenciação.

Determinaram-se os primeiros 18 aminoácidos do N-terminal utilizando-se a proteína completa. Com base nas sequências de aminoácidos dos péptidos trípticos, escolheu-se a protease V8 para gerar os péptidos que podiam fornecer sobre camadas para os péptidos trípticos. O alinhamento dos péptidos trípticos e de protease V8 forneceu a sequência completa para o antigénio 17 kDa. Os pormenores das sobre camadas são apresentadas na Fig. 4. 5.2.3 Composição de aminoácidos do antigénio kDa A proteína tem, A9, C3, Dll, E10, F9, G8, H2, 17, K4, LU, M2, P9, Q2, Rl2, S8, T9, Vil e Y4. É significativo não haver triptofano e asparagina. A proteína é de natureza ácida uma vez que existem 5 aminoácidos ácidos (D+E=21) mais que o número total de aminoácidos básicos (R+K=16). A proteína tem 131 aminoácidos que contribuem para um peso molecular de 14.762. 19

5.3. Imunorreactividade de um antigénio de 17 kDa 5.3.1 Demonstração do carácter imunodominante do antigénio de 17 kDa nas estirpes de N.Tuberculosis.

Cultivaram-se M. Tuberculosis (SII 1), M. tuberculosis ATCC 27294, M.ntilei. M. smeamatis, M. Kanasasii. M. avium. intracelular e M. scrofulacium. em meio de Kirschner durante 2 semanas e recolheram-se os bacilos que se mataram com acetona fria. Prepararam-se os antigénios sonicados a partir de cada uma destas espécies como descrito na Secção 5.1.1. a análise de SDS PAGE destes antigénios que se realizou em seguida em gel a 12,5%. Os geles corados com azul de Coomassie evidenciaram que estava presente o antigénio de 17 kDa somente nas estirpes de M.tuberculosis. Utilizou-se também antissoro de coelho formado contra M.tuberculosis SII 1 para sondar estes sonicados em manchas Wistern. A banda de 17 kDa dominante foi encontrada em a mancha Western (Western blot). 5.3.2 Demonstração da formação de anticorpos provocados por 17 kDa em animais de experiência. 20

0 antigénio de 17 kDa electrodiluído (10 jig numa solução de 100 ml de cloreto de sódio) foi emulsificado com igual volume de adjuvante incompleto de Freund (FICA) e utilizado para a imunização intraperitoneal de 10 murganhos BALB/c. O soro recolhido destes murganhos, 30 dias após imunização, reconheceu uma banda de 17 kDa no antigénio sonicado de M. tuberculosis SII 1.

Portanto, esta experiência confirma que um anticorpo policlonal ou monoclonal que reconhece a estrutura da proteína do antigénio de 17 kDa ou suas subestruturas pode ser produzido no murganho. Estes anticorpos, em particular os anticorpos monoclonais, podem ser utilizados num método de detecção de antigénio como a sanduíche ELISA para a detecção de o antigénio de 17 kDa ou de suas subestruturas em espécimes de tuberculose humana no imunodiagnóstico da tuberculose. 5.3.3 Demonstração de que um antigénio de 17 kDa reage com soro de doente de tuberculose humana

Soros derivados de 24 indivíduos saudáveis e de 20 doentes com tuberculose humana comprovados por cultura foram 21

titulados frente ao antigénio de 17 kDa do seguinte modo: revestiram-se placas de PVC Dynatech com 1 jig/ml de PBS de antigénio de 17 kDa electroeluído durante 24 horas à temperatura de 22° C. As placas, bloqueadas com PBS-BSA forandepois tituladas contra diluições duplicadas (a 1/200) de soros que se incubaram à temperatura de 22°' C durante 2 horas e 30 minutos. Placas lavadas receberam conjugado de IgG anti humanos HRP durante 1 hora e 30 minutos. As placas lavadas foram depois analisadas com substrato de 0-fenileno diamina e lidas a 492 nm. 0 Quadro II demonstra que o antigénio de 17 kDa tinha uma sensibilidade de 70% e especificidade de 85%. 22

Quadro II

Micro ELISA com antigénio de 17 kDa em soros de doentes com TB e controlos

Grupos de soro n ELISA+ ELISA- Sensibilidade Especificidade Rpulação Eãuâavel 24 4 20 ---- 85% Doaites flfecculoscs 20 14 6 70% ---

Sensibilidade : Positividade apresentada nos doentes de TB

Especificidade : Negatividade apresentada nos controlos saudáveis. ELISA+ : DO 492 >=0,3 na diluição a 1/200 (=média + 2 x 2REP de DO 492 nm para controlos saudá -veis, n=24).

Portanto, esta experiência confirma que o antigénio de 17 kDa proveniente de estirpes de M- tuberculosis pode ser utilizado em um sistema micro ELISA para imunodiagnóstico da tuberculose no homem. 23 5.3.4 Demonstração de que o antigénio da proteína 17 kDa tem epitopes de anticorpo definidos.

Os fragmentos peptídicos derivados da digestão tríptica do antigénio de 17 kDa (secção 5.2.1, Fig. 2) foram titulados individualmente contra soros de indivíduos saudáveis e de doentes com tuberculose como descrito na secção 5.3.3. Dos 14 péptidos testados, os péptidos com as sequências RATYDK, YEVR, LEDEMK, LMR, DFDGR e SEFAYGSFVR mostraram actividade de ligação com o anticorpo com níveis de sensibilidade entre 17 e 36%. Para se determinar se estes péptidos formavam epitopes de anticorpo lineares ou conformacionais, realizou-se uma inibição de ELISA em que cada um dos péptidos foi analisado contra outros cinco, utilizando-se antissoro de murganho para o anticorpo de 17 kDa. Os péptidos YEVR e ATYDK foram inibidos mutuamente indicando deste modo que eram uma parte de um epitope de anticorpo completo, o que se confirmou também pela determinação da estrutura completa do antigénio 17 kDa, como na secção 5.2.2., Fig. 4. Os outros quatro péptidos eram lineares e provavelmente conformacionais na apresentação do epitope do anticorpo. Dos seis péptidos contendo epitope de anticorpo, citados antes, os péptidos com as sequências de aminoácidos seguintes, foram sintetizados pelo método de fase sólida de Merrifield e 24 verificou-se conterem actividades de ligação com o anticorpo sensíveis e específicas: RATYDKRYEVR : Sensibilidade 65%; Especificidade 95%. SEFAYGSFVR: Sensibilidade 66%; Especificidade 95%. A mapeação do epitope do anticorpo, como descrito, indicou portanto que subestruturas ou péptidos definidos de o antigénio de 17 kDa podem ser sintetizados e utilizados para o imunodiagnóstico da tuberculose humana em micro ELISA. 0 péptido com a sequência RATYDKRYEVRDFDGRAEL foi sintetizado e verificou-se que apresentava sensibilidade de 86,6% e especificidade de 100% quando testado em amostras de CSF de cultura de doentes de M.TB e controlos. Este péptido é portanto particularmente apropriado para se utilizar em substituição do antigénio de 17 kDa no teste de ELISA. 5.3.5 Demonstração de que um antigénio de 17 kDa é linfoproliferativo. 25

Fraccionaram-se linfócitos de sangue periférico (PBL) de dadores saudáveis e de doentes tuberculosos e cultivaram-se 2 x 10 células com ou sem (controlo) 1 jjg de antigénio - de 17 kDa durante 3 dias em meio RPM1 1640 com soro autólogo a 10%. Nas 24 horas antes da recolha das culturas, estas foram pulsadas com 1 jici de 3H timidina. O Quadro III mostra que o antigénio de 17 kDa foi linfoproliferativo para os linfócitos dos doentes tuberculosos (dados apresentados de apenas 2 indivíduos).

Quadro III

Ensaio de linfoproliferaçõo com antigénio de 17 kDa

Origem (PBL) incorporação 3H timidina (cpm, media de culturas em triplicado) Saudável controlo : 90 Antigénio : 121 Doentes TB controlo : 110 Antigénio : 650 26

Além âa propriedade da proliferação dos linfócitos do antigénio de 17 kDa, utilizou-se o método de previsão de epitopes simuladores de células T para mapear os sítios prováveis na estrutura do antigénio de 17 kDa. Estes epitopes de células T foram localizados nos péptidos com as sequências seguintes:

SEFAYGSFVR

AELPGVDPDCDVCITR

Portanto, esta experiência indica que o antigénio de 17 kDa ou subestruturas (péptidos) podem ser utilizados para estimular os linfócitos de sangue periférico humano. Como os linfócitos estimulados elaboram crescimento celular e factores de diferenciação diversos que contribuem para o efeito da vacina do antigénio de 17 kDa ou de suas subestruturas, pode-se utilizar este antigénio na primeira instância de uma vacina contra a tuberculose e também para desafio de imunidade celular não específica. A Fig. 6 apresenta a estrutura primária de um antigénio de 17 kDa de M. tuberculosis contendo as regiões com actividade biológica, embora não se possa excluir actividade idêntica nas regiões não marcadas. 27 \ 6. Comentário e resumo dos resultados do teste. A presente invenção descreve as propriedades imunoquímicas de um novo antigénio proteínico de 17 kDa de M. tuberculosis da estirpe SII 1. A M. tuberculosis causa a tuberculose em todo o mundo entre 16 milhões de pessoas. Devido a processos de diagnóstico pouco adequados disponíveis presentemente, a doença ainda não foi erradicada. 0 foco da investigação nos anos recentes tem sido o desenvolvimento de métodos de imunodiagnóstico para a detecção da tuberculose no estádio precoce, assim como a identificação de candidatos apropriados para a vacinação, uma vez que a vacina BCG tradicional tem dado apenas uma protecção parcial contra a tuberculose. Os estudos descritos na presente invenção mostram que o novo antigénio de 17 kDa derivado de M. tuberculosis apresenta actividade antigénica. Investigou-se a natureza química antigénica e a química. As proteínas com actividade biológica do antigénio proteínico foram mapeadas e desenvolvidos métodos de imunodiagnóstico para a detecção precoce da tuberculose.

Deste modo, o antigénio proteínico de 17 kDa que comporta 131 aminoácidos verificou-se conter dois péptidos com as sequências RATYDKRYEVR e SEFAYGSFVR que comportam epitopes de ligação com o anticorpo para o diganóstico da tuberculose. Além disso, este contém dois péptidos que transportam regiões de estimulação de células T previstas nas seuqências 28

Sr SEFAYGSFVR e AELPGVDPDCDVCITR. Este último dos dois péptidos contribui presumivelmente para a propriedade estimuladora de células T de um antigénio de 17 kDa total descrito nesta invenção. A propriedade estimuladora de células T do antigénio de 17 kDa e. os seus péptidos subestruturais significa que podem ser utilizados na terapêutica e vacinação da tuberculose. 7. Legendas das figuras

Fig. 1. Análise HPLC de um antigénio da proteína com 17 kDa electroeluído de M. tuberculosis. SII 1.

Condições de HPLC: coluna 18 RP (LKB; poro de 10 μιτι) , A: TFA a 0,1% em água, B: TFA a 0,85% em aceto nitrilo a 70%, Gradiente: 0 a 65% de B em 40 m, Sensibilidade: 0,08, 220 nm.

Fig. 2. Péptidos trípticos do antigénio de proteína de 17 kDa de M. tuberculosis (SII 1) fraccionados por HPLC em RP 18 (LKB, 10 jjm de poro) .

Fraccionamento: A: TFA a 0,1% em água, B: TFA a 0,085% em aceto nitrilo a 70%, Gradiente: 0 a 65% de B em 60 minutos, Sensibilidade: 0,08,220 nm. 29 aeada >r

Sequências de aminoácidos: A sequência determinada foi del contra cada péptido.

Fig. 3. Piptidos de protease V8 do antigénio de proteína de 17 KDa de M. tubérculosis SII 1 fraccionados por HPLC em RP 18 (LKB, com poro de 10 ^im).

Fraccionamento: A: TFA a 0,1% em água; B: TFA a 0,85% em aceto nitrilo a 70%, Gradiente: 0 a 65% em 60 minutos, Sensibilidade: 0,82,220 nm.

Fig. 4. A estrutura primária do antigénio de 17 KDa de M-tuberculosis SII 1 mostrando o alinhamento dos péptidos. TRp: Tripsina, V8 Protease, V8 Staphilococcus aureus; as setas inscritas superiormente indicam a sequência de aminoácidos obtida com a proteína completa. (Código de letra única utilizado para os aminoácidos).

Fig. 5. A estrutura primária de um antigénio de 17 KDa de M. tuberculosis SII 1 que mostra as regiões com actividade biológica. 30

AA 68 a 77:Anticorpo θ epitopes de célula T presentes. AA 91 a 101 epitope de um anticorpo presente. AA 107 a 122: presentes dois epitopes de células T. 31

Claims

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REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de uma proteína com a seguinte estrutura: 1 40 AITIPVQHSSBSLEPEFSZEFaaPPSrAGLSPTEDTIELa 80 RS IQ ITIRLZD rmrgiyl? varegzirsefayg sfvrtvs 131 LPVGADEDDIRATYDRRYRVRDFDGRAZLPGTDPDCDVCITRGILTVSVCV caracterizado pelo facto (a) de se desenvolver um organismo hos^ pedeira que contém um vector com uma sequência de ADN que codi-fica a proteína; e (b) de se isolar a proteína. 2.- es trutura: Processo para a preparação de um péptido com a RATYDKRYZVRDFDGSAEL ou AHLPGVDPDCDVCrTR e fragmentos da proteína de acordo com a reivindicação 1, os quais incluem uma ou mais destas sequências peptídicas, caracterizado pelo facto de (a) se desenvolver um organismo hospedeiro que contém um vector com uma sequência de ADN que codifi

ca o péptido; e (b) se isolar o péptido.
3. - Anticorpo, caracterizado pelo facto de actuar com uma proteína ou com um péptido como definidos nas reivindicações 1 ou 2.
4. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de ser um anticorpo policlonal ou mo-noclonal eventualmente marcado.
5. - Método para o diagnostico da tuberculose humana, caracterizado pelo facto (a) de se fazerem inter-reagir fluidos corporais, tais como-o soro de um doente, com uma prcí teína ou um péptido obtidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2j e (b) de se detectar a interacção. o
6. - Método para o diagnóstico da tuberculose humana, caracterizado pelo facto (a) de se fazerem inter-reagir fluidos corporais, tal como sputum, CSF, líquido pleura! ou soro proveniente de um doente, com um anticorpo monoclonal para uma proteína ou péptido obtidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e (b) de se detectar a interacção.
7. - Método para o diagnóstico da tuberculose humana, caracterizado pelo"facto (a) de se fazer inter-reagir fluidos corporais, tal como sputum, CSF, liquido pleural ou so ro de um doente, com urna sonda de ADN, construída com base na proteína ou péptido obtidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e (b) de se detectar a interacção.
8. - Método para a detecção da tuberculose humana "in vitro", caracterizado pelo facto (a) de se fazer inter-rea gir uma amostra de um fluido corporal, tal como sputum, CSF, líquido pleural ou soro de um doente, com um anticorpo policl£ nal para uma proteína ou péptido obtidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e (b) de se detectar á interacção.
9. - Método para a detecção da tuberculose humana *'in vitro", caracterizado pelo facto (a) de se fazer contactar uma amostra de um líquido corporal tal como sputum, CSF, fluido pleural ou soro provenientes de um doente, com um anticorpo monoclonal para uma proteína ou péptido obtidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e (b) de se detectar a interacção. O Ag ente Oficio! da Propriedade Industrial 40 40
15.- Método para o diagnóstico da tuberculose humana, caracterizado pelo facto de se fazer inter-reagir fluidos corpo rais, tal como sputum, CSF, líquido pleural ou soro de um doen te com uma sonda de ADN marcada, de acordo com a reivindicação 5.
16. - Método para a detecção da tuberculose humana in vitro, caracterizado pelo facto de se fazer contactar uma amostra de um fluido corporal, tal como sputum, CSF, líquido pleural ou soro de um doente, com um anticorpo policlonal marcado, de acordo com a reivindicação 7.
17. - Método para a detecção da tuberculose humana in vitro, caracterizado pelo facto de se fazer contactar uma amostra de um líquido corporal tal como sputum, CSF, fluido pleural r*- ou soro provenientes de um doente, com um anticorpo monoclonal sob a forma marcada, de acordo com a reivindicação 7.
18. - Proteína ou péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para aplicação em um método de tratamento de um ser humano ou de um animal, em imunodiagnõstico, terapêutica ou vacinação, caracterizado pelo facto de se relacionarem com a tuberculose humana.
19.- Proteína ou péptido de acordo com a reivindica- 41

sé ção 1 ou 2, para a utilização num método de tratamento de um ser humano ou de um animal, caracterizado pelo facto de produzir anticorpos policlonais de mamífero ou anticorpos mono-clonais de murganho, para aplicação no método de imunodiagnÓ£ tico tal como o ensaio ELISA, e de detectar a proteína de acor do com a reivindicação 1, entre espécimes da tuberculose humana .
20. - Proteína ou péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para aplicação num método de tratamento de um ser humano ou de um animal, caracterizado pelo facto de detectar anticorpos em espécimes tuberculosas, por métodos serolégicos ou por detecção precoce da tuberculose.
21. - Proteína ou péptido de acordo com a reivindica-ção 1 ou 2, para utilização num método de tratamento de um ser humano ou de um animal, caracterizado pelo facto de detectar a proliferação de células T em um espécime tuberculoso, e de obter o imunodiagnóstico num teste cutâneo ou de detectar um can didato para vacina contra a tuberculose.
22. - Utilização de uma proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para imunodiagnóstico, terapêutica ou vacina ção, caracterizado pelo facto de se relacionar com tuberculose humana. 42 l
23. - Uso de uma proteína ou de um péptido de acordo com a reivindicaçãp 1 ou 2, caracterizado pelo facto de desen volver um reagente para terapêutica da inflamação tuberculosa devida a proliferação de células T.
24. - Uso de uma proteína ou de um péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de permi tir a produção de factores de crescimento e de diferenciação mediante a utilização de um ensaio de proliferação de células T.
25. - Uso de sondas de ADN ou de ARN de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de detectar ADN de M. Tuberculosis entre espécimes de tuberculose humana para a detecção precoce da tuberculose. Cr
26. - Uso de sondas de ADN ou de ARN de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de identificarem ADN microbacteriano, por exemplo entre isolados de culturas ou para investigação laboratorial. O Agente Oficial da Propriedade Industrial