JPH04501661A - マラリア抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリア抗原 発明の分野 本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｗ）抗原ＧＬｔｌ ＲＰから誘導された特徴あるアミノ酸配列からなるポリペプチド、前記特徴ある アミノ酸配列からなるポリペプチドに対して生じたか、あるいはそれと反応性の 抗体および／または自然ＧＬＵＲＰと反応性の抗体により認識されるポリペプチ ド、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、核酸分子を有する発現ベクター、 前記核酸分子を発現して前記ポリペプチドを産生ずる生物体、前記ペプチドを産 生および分離する方法、前記ペプチドの使用、前記ポリペプチドに対して向けら れたモノクローナル抗体、前記抗体またはポリペプチドからなる診断剤、および 診断および治療の目的のための前記抗体またはポリペプチドの使用に関する。

技術的背景 マラリアは、媒介動物の根絶および薬物の処理により、病気を抑制しそしてその 流行および連続する世界規模の広がりを減少する努力にかかわらず第３世界にお いて最も重大な寄生体の病気であり、そして毎年数位の人間はこの病気により影 響を受けている。増加する環境の変化および古典的抑制プログラムの失敗は、マ ラリアの抑制のワクチンの研究を刺激特表千４−５０１６６１　（５） した。当然、これらのアプローチの１つは免疫学であり、そして長い間、免疫学 はマラリアの有効なワクチンを提供するであろうことが希望されてきた。ヒトの マラリアは原生動物のプラスモディム属（Ｐｌａｓｓｏｄｉｕｍ）の４つの種に より引き起こされる。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）種は 最も危険な悪性のマラリアの寄生体であり、ことに若い子供および風土病に入る 移民において、しばしば致死的である、急性の激烈な感染を引き起こす。こうし て、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌ−ｃｉｐａｒｕａ＋）に対するワクチンは 開発されることが非常に望ましい。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒ ｕｍ）の生活環は異なる段階を包含する；第１段階の種虫の段階において、寄生 体は血流の中にアノフェレスカにより入る。種虫は血流中において肝臓へ運ばれ 、ここでそれらは肝細胞を侵し、そして５〜７日の過程においてメロゾイトに発 育する。感染した細胞から解放したメロゾイトは、赤血球を侵すことによって新 しいサイクルを開始する。赤血球において、寄生体は無性増殖を示し、この増殖 は異なる寄生体の段階を通る成熟、環、栄養体およびシゾント段階（核の分裂を 行う段階）を包含する。シゾントが感染した赤血球は破裂するとき、新しいメロ ゾイトは解放される。臨床的病気を生ずるのは赤血球の崩壊である。

しかしながら、あるメロゾイトは、寄生体の性の形態の配偶子母細胞（小配偶子 母細胞および大配偶子母細胞）に分化する。無性の感染した赤血球と反対に、こ れらの性の寄生体の段階は、感染した細胞、赤血球が力が血液を食べることによ って摂取されるとき、生活環を続けることができる。力の消化管の中で受精する ことによって、配偶子母細胞は運動性のオーキネートの段階に発育する。オーキ ネートは上皮を通過し、そして接合子嚢に成熟する。接合子嚢中で、新しい種虫 は発育する。これらの種虫は解放されそして唾液腺へ動き、次いで新しい宿主の 中に注入される状態である。寄生体は、受精後短時間で減数細胞分裂するとき、 生活環の大部分において半数体である。

アノフェレス蚊はマラリアの一次媒介動物であるが、病気は、また、輸血、汚染 された装置を使用する静脈内注射後、および感染した母から胎盤を通して新生児 へ伝達後に見られる。

一般に、ワクチン接種により寄生体の病気に対して十分な免疫性を得ることは、 困難であるか、あるいは不可能であることが証明された。なぜなら、多数の寄生 体は、侵入後、抗原の出現を変化させるか、あるいは寄生体それら自体以外の成 分に対する免疫応答を引き出す物質を産生じ、これによりワクチン接種により得 られた免疫性を寄生体の感染の発育を防除するために不十分とすることによって 、個体の免疫系を「逃れる」ことができる。マラリアの感染に対する免疫化は、 また、広範な種類の存在する異なるマラリアの寄生体のために困難でであった。

プラスモディム属（Ｐｌａｓｉｏｄｉｕｍ）種の寄生体、ことに熱帯熱マラリア 原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は最も集中的に研究されてきているマラリ アの寄生体である。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉ−ｐａｒｕｍ）からの ある数の可溶性の表面のタンパク質および抗原は、ことにシゾントの段階におい て、感染した個体からの血清の中に見いだされ（１，３，４，５，６，７）、そ してこれらの抗原を包含する血漿の分画はジェプセン（Ｊｅｐｓｅｎ）およびア クセルセン（Ａｘｅｌｓｅｎ）により分離されそして記載された。

典型的には、抗原はタンパク質および糖タンパク質の異種の群を構成する。可溶 性熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原（抗原１および抗原２ ）の混合物は生体外で増殖した熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕａ ＋）から分離された（２）、Ｌかしながら、参考文献１〜７に述べられている抗 原は別々に分離されそして精製され、そして抗原は分子量、グリコジル化および 抗原性、それらのアミノ酸組成ならびに抗原をエンコードするエピトープまたは 核酸分子の可能な含量を参照することによってはじめて特性決定された。

種々のプラスモディム属（Ｐ１ａｓｎ＋ｏｄｉｕｍ）種のポリペプチドをコード する核酸配列は分離および分析され（８，９，１０）が、これらの核酸配列のい ずれも特徴ある配列ＧＬｔｌＲＰを有するポリペプチドをコードし、そしてそれ らのすべては前記特徴あるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を分離するため に使用した方法と異なる方法に従い得られた。

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を包含する他の研究の例は 、次の特許刊行物に記載されている；ＷＯ３８／　００５９７　（ｋａｒａら） 　、ＷＯ８８１００５９５（Ｅｐｐｉｎｇら）　、ｈｏ８６１００６２０　（Ｋ ｏｅｎｅｎら）　、ＷＯ３５１０３７２４（Ｈｏｐｅら）　、ＷＯ３５１００９ ７５（Ｒｉｓｔｉｃら、ＷＯ３４／　０２９１７　（Ｋｅｍｐら）　、ＷＯ３４ １０２４７１（Ｄｕｂｉｓら）　、ＷＯ３４１０２４７２（Ｄｕｂｉｓら）、欧 州特許（ＢＰ）　０２５２５８８号（Ｓ＋ｓｉｔｈｋｌｔｎＢｅｃｌ’ａａｎ　 Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、欧州特許（ＢＰ）　０２０９６４３号（Ｅｎｉｒｉ −ｃｅｒｃｈｅ　Ｓ、ｐ、Ａ、）、欧州特許（ＥＰ）０１１１２７８４号（Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔ　’Ｐａ５−ｔｅｕｒ）　、英国特許第２１９９１４０号（Ｅｎｉ ｒｉｃｅｒｃｈｅ　Ｓ、ｐ、Ａ、）、米国特許第４，７３５．７９９号（Ｐａｃ ａｒｒｏｙｏ）　、米国特許第４．７０７．３５７号（Ｄａｍｅら）およびＷＯ ３５／　０３７２５　（Ｍａｃｈら）、欧州特許（ＥＰ）０１３６９３２号（Ｃ ｈｉｌｂｅｒｔ）および欧州特許（ＢＰ）　０１３６２１５号（Ｒｉｓｔｉｃら ）。

発明の簡単な開示 １つの面において、本発明は、次のアミノ酸配列：１８１　ＥＰＡＥＨＶＥＩＶ Ｓ　ＥＫＳＴＳＥＰＡＥＨＶＥＳＶＳＥＱＳＮＮ　ＥＰＳＨＫＫＤＧＰＶ　ＰＳ ＫＰＦＥＥＩＥＫ　ＶＤＶＱＰjＩＶＤＬ ２４１　ＱＩＩＥＰＮＦＶＤＳ　ＱＰＮＰＱＥＰＶＥＰ　５ＦＶＫＩＥＫＶＰＳ 　ＥＥＮＫＨＡＳＶＤＰ　ＥＶＫＥＫＥＮＶＳＥ　ＶＶＥＥjＱＮＳＱＥ ３０１５ＶＥＥＩＰＶＮＥＤ　ＥＦＥＤＶＨＴＥＱＬ　ＤＬＤＨＫＴＶＤＰＥ　 ＩＶＥＶＦ、ＥＩＰＳＥ　ＬＨＥＮＥＶＡＨＰＥ　ＩＶＥＩdＥＶＦＰＥ ３６１　ＰＮＱＮＮＥＦＱＥＩ　ＮＥＤＤＫＳＡＩ（ＩＱ　ＨＥＩＶＥＶＥＥＬ Ｌ　ＰＥＤＤＫＮＥＫＶＥ　ＨＥＩＶＥＶＥＥＩＬ　ＰＥＤjＮＥＫＧＱＨ ４２１ＥＩＶＥＶＥＥＩＬＰ　ＥＤＤＫＮＥＫＶＥＨＥＩＶＥＶＥＥＩＬＰ　Ｅ ＤＫＮＥＫＧＱＨＥ　ＩＶＥＶＥＥＩＬＰＥ　ＤＫＮＥＫＶhＪＩＥＩ ４８１　ＶＥＶＥＥＩＬＰＥＤ　ＫＮＥＫＧＱＨＥＩＶ　ＥＶＥＥＩＬＰＥＤＫ 　ＮＥＫＶＱＨＥＩＶＥ　ＶＥＥＩＬＰＥＤＫＮ　ＥＫＧＱgＥＩＶＥＶ ５４１　ＥＥＩＬＰＥＥＤＫＮ　ＥＫＧＱＨＥＩＶＥＶ　ＥＥＩＬＰＥＤＫＮＥ 　ＫＶＱＨＥＩＶＥＶＥ　ＥＩＬＰＥＤＫＮＥＫ　ＶＱＨＥhＶＥＶＥＥ ６０１１ＬＰＥＩＶＥＩＥＥ　ＶＰＳＱＴＮＮＮＥＮ　ＩＥＴＩＫＰＥＥＫＫ　 ＮＥＦＳＶＥＥＫＡＩ　ＰＱＥＰＷＰＴＬＮ　ＥＮＥＮＶＴoＫＰＳ ６６１　ＥＧＥＳＴＫＰＤＩＶ　ＱＩＫＩＶＱＥＮＫＰ　ＮＫＫＥＴＰＶＶＤＧ 　ＰＫＨＶＥＱＮＩＱＥ　ＤＤＮＤＥＥＤＤＤＤ　ＩＤＦＥfＬＳＲＫＤ ７２１　ＤＥＫＤＳＳＮＫＮＫ　ＫＫＳＳＦＩＴＹＩＳ　ＴＫＫＦＫＫＶＳＱＴ 　ＩＶＳＶＭＩＮＡＹＤ　ＧＶＩＱＷＳＴＩＫ　ＧＩＡＫＤhＶＩＦＦ ７８１　ＱＮＴ またはその類似体からなる、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰから誘導された特徴的なアミノ酸配列からなる ポリペプチドに関する。

ここでアミノ酸の略号は次の通りである二アミノ酸　３文字の略号　１文字の記 号アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ アスパラギンまたは アスパラギン酸　Ａｓｘ　Ｂ システィン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グルタミンまたは グルタミン酸　Ｇｌｘ　Ｚ グリシン　Ｇｌｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ イソロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ リジン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ スレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ アミノ酸　３文字の略号　１文字の記号トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ 本発明の文脈において、用語「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓ−ｍｏｄｔｕｍ　 ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋）抗原ＧＬＵＲＰから誘導された特徴的なアミノ酸配列 」は、ＧＬ［ＩＲＰ中の実質的に連続的なストレッチを構成するアミノ酸（線状 または空間的コンフォメーションにより）、またはＧＬＵＲＰ中の多少の非連続 的コンフォメーションで見いだされるアミノ酸（このアミノ酸は興味あるかつ有 用な性質を有する第２または第３のコンフォメーションを構成する）、例えば、 免疫原からなるアミノ酸配列、例えば、エピトープを意味することを意図する。

こうして、アミノ酸はＧＬＵＲＰ中で異なる位置に存在するが、例えば、化学的 または生理学的結合により、例えば、ジサルファイド架橋により一緒に保持され 、これにより興味ある第３立体配置を形成することは「特徴的なアミノ酸配列」 として理解すべきである。

特徴的なアミノ酸配列は、より大きいまたはより小さいのＧＬＵＲＰのアミノ酸 配列の連続的サブ配列またはこのようなサブ配列の２またはそれ以上の組み合わ せ（これらはＧＬＵＲＰに無関係の１または２以上のアミノ酸配列により分離さ れることができる）からなることができる。あるいは、特徴的なアミノ酸配列は 互いに直接結合することができる。

本発明の文脈において、用語「エピトープ」は、免疫能力細胞を刺激するか、あ るいはそれと相互作用することができる本発明のポリペプチドまたはその誘導体 または類似体、ことに診断、予防または処理に関して所望の性質を示す抗体をそ れに対してレイズすることができるエピトープ、の配列またはサブ配列を呼ぶ。

用語「類似体」は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｓ）抗原 ＧＬＵＲＰから誘導された特徴的なアミノ酸配列に類似するアミノ酸の組成また は配列のタンパク質またはポリペプチドを示すために本発明の文脈において使用 し、類似体の免疫原性に悪影響を及ぼさない小さい変化は可能である。類似のポ リペプチドまたはタンパク質は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉ−ｐａｒ ｕｍ）以外の他の種の微生物から誘導することができるか、あるいは部分的また は完全に合成由来であることができる。

この用語は、さらに、特徴的なアミノ酸配列の免疫原性サブ配列、機能的同等体 または誘導体を意味することを意図する。

用語「免疫原性サブ配列」は、マラリア−免疫の血清の中に見いだされる抗ＧＬ ＵＲＰ抗体と反応性の少なくとも１つのエピトープからなるおよび／または自然 ＧＬＵＲＰと反応性の抗体を引き出すアミノ酸配列を示すことを意図する。

用語「機能的同等体」は、同等体を含有するワクチンを投与した人間を包含する 動物において、ＧＬＵＲＰの特徴的なアミノ酸配列により引き出される免疫応答 に類似する（マラリア原虫の寄生体により引き起こされる免疫性を与える）、免 疫応答を引き出す能力をもつ、すべての免疫原的に活性な物質、例えば、抗イデ イオタイプの抗体を包含することを意図する。

機能的同等体は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）以外の他 の種の微生物から誘導することができるか、あるいは部分的または完全に合成由 来であることができる。ＧＬＵＲＰがらの特徴的なアミノ酸配列と機能的同等体 との間の類似性は、定量的であるよりむしろ定性的であり、機能的同等体の活性 のレベルよりむしろ性質に関する。

本発明は、また、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原Ｇ　 Ｌ、Ｕ　ＲＰを認識する抗体と反応性の少なくとも１つのエピトープからなる、 天然に産出するか、あるいは天然に産出しないポリペプチドに関する。このよう なポリペプチドにおいて、他の実施態様において、ポリペプチドおよびエピトー プは、ＧＬＵＲＰのアミノ酸配列と相同性であるが、それと同一でないアミノ酸 配列を有することができるが、ただし前記エピトープは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ 、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰを認識する抗体と反応性である。

本発明のポリペプチドの認識に使用される抗体は、上に概説するアミノ酸配列か らなるポリペプチドに対して特異的に生じたものであり、モノクローナル抗体ま たはポリクローナル抗体であることができる。本発明のポリペプチドの認識に有 用なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体ならびにそれらの産生方法を 下に記載する。あるいは、抗体はマラリア−免疫患者、例えば、デンマーク国コ ベン／’ｘ−））’　７．　ステイテンス・セルミンストリツートから入手可能 なマラリア−免疫血清のプールから得られる。抗原は血清から慣用方法により、 例えば、下の材料または方法に記載するようにして得られる。

用語「認識される」は、本発明のポリペプチドと抗体との間の反応が、観測が可 能な環境下に、前記ポリペプチドおよび抗体を反応させるとき、観測されること を意味する。この反応は沈澱の形であることができる。交差免疫電気泳動の原理 に基づく分析は、これに関して有用であることが発見された。交差免疫電気泳動 は、実質的に（１）に記載するようにおよび次の実施例において例示するように 、実施することができる。本発明のポリペプチドを差免疫電気泳動にかけたとき 得られる結果は、第１Ｂ図に示す。

他の面において、本発明は、前述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 からなる核酸分子に関する。核酸分子は、組換えＤＮＡ技術によりポリペプチド を調製する方法において、あるいは診断剤（すなわち、ＤＮＡプローブ）として 使用することができる０組換えポリペプチドの産生における本発明の核酸分子の 使用（例えば、断片を適当なベクターの中に挿入し、ベクターを適当な宿主微生 物の中に形質転換し、微生物を培養してポリペプチドを産生じ、引き続いてポリ ペプチドを微生物から回収することによって）は多数は利点を包含する。大量の ポリペプチドまたはその断片を提供することが可能であり、そして産生されたポ リペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の寄生体ま たは感染した個体からの血清に関する汚染物質を含有しない、実質的に遊離の形 態で分離することができる。本発明の核酸分子は、また、試料中の熱帯熱マラリ ア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の核酸分子を検出する診断剤中で使用する ことができ、この診断剤は前記ポリペプチドの少なくとも一部分の遺伝情報を指 定する核酸分子と実質的に相同性である、標識した核酸分子からなる。

なお他の面において、本発明は、マラリア原虫の寄生体により引き起こされる病 気に対して、人間を包含する動物を免疫化するためのワクチンに関し、このワク チンは、免疫学的に有効でありかつ生理学的に許容されうる量の上に定義したポ リペプチドおよび生理学的に許容されうる担体からなる。

ワクチンは免疫系の関連する部分の最適な刺激を可能とする、すなわち、認識、 吸収または刺激に必要な他の相互作用またはプロセスに関して最適な時間の間お よび形態で免疫原性ポリペプチドを提供すべきである。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの非炭水化物部分と反応性であるモノク ローナル抗体の調製において使用することができる。ポリペプチドまたは抗体は 、試料中に存在する前述のポリペプチドの少なくとも一部分の同定および／また は定量に使用することができ、こうしてプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ ｍ）種が誘発する病気の診断を可能とする。試料はプラスモディム属（Ｐｌａｓ ｍｏｄｉｕｍ）種の分子を含有する生きている有機体、例えば、ヒトまたは動物 の任意の部分であるか、あるいは前記生きている有機体から得られた検体である ことができる。試料は、ポリペプチドを含有する体液または組織の試料、例えば 、バイオプシー、例えば、肝臓のバイオプシー、骨髄組織の組織、血液の試料、 尿の試料、脳を椎流体の試料、血清、血漿または血液またはリンパから調製した 任意の産生物、分泌物またはプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分 子を含有するヒトまたは動物の腔から得られた任意の試料であることができる。

試料は、また、水、水道水、または食物、例えば、肉であるか、あるいはプラス モディム属（Ｐｌａｓ−ｍｏｄ　ｉｕｍ）種の分子の存在および／または量を決 定しようとするワクチンまたは診断剤であることができる。同定または定置すべ きプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子は、試料の中に存在する 細胞の上に存在するか、あるいはその一部分であるか、あるいは細胞内に存在す るプラスモディム属（Ｐｌａｓ−ｍｏｄｉｕｍ）種の分子であることができる。

用語「プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子」は、プラスモディ ム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の細胞表面の上に存在するか、あるいは細胞表 面の一部分である分子、例えば、ポリペプチドならびに細胞の中に、例えば、細 胞質の中にまたは核の中に存在する分子を表示する。さらに、プラスモディム属 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子は、ことに細胞表面から、そして細胞外の取 り巻きの中に、「分離した形態」またはプラスモディム属（Ｐ１ａｓ＋ｍｏｄｉ ｕｍ）種を含有する細胞「より分泌された」の分子を表示する。

本発明の種々の面は添付した請求の範囲から明らかである。

以下において、これらの面は請求の範囲を参照してより詳細に説明する。

発明の詳細な説明 本発明のポリペプチドは、前述したように、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＬＩＲＰに関する。上に概説したアミ゛ノ酸配列はＧ ＬＵＲＰを構成し、そしてライブラリーのクローンをヒトのマラリア−免疫の血 清およびマラリア−免疫の患者に見いだされる資源抗原１、熱帯熱マラリア原虫 （Ｐ、ｆａｌｃｉ−ｐａｒｕ＋ｗ）タンパク質で親和精製した抗体スクリーニン グすることによって分離した、核酸分子から推定する。

スクリーニングに使用した抗体は、交差免疫電気泳動において抗原１を表すホス ファターゼと相互作用であることが示され、したがって抗原１に対してモノ特異 的であると信じられた。したがって、これらの抗体と反応するライブラリー中の クローンは、抗原１またはその一部分をコードするＤＮＡインサートを含有する と推定された。

クローンの１つから精製した融合タンパク質は、融合タンパク質に対して特異性 のヒトの抗体の親和精製に使用した。

抗体源は、抗原を包含する熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｔｐａｒｕｍ）の 可溶性抗原いくつかに対する高い力価の抗体を有する、免疫のリベリア人の個体 である。融合タンパク質を使用して精製した抗体は交差免疫電気泳動において試 験した。それらは抗原１を表す沈澱のすべてと相互作用することが発見された。

精製した融合タンパク質を使用してウサギを免疫化したが、生ずるウサギの抗体 は抗原１を表す沈澱と相互作用しないが、抗原３、他の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ 、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原と強く相互作用した。融合タンパク質のカラムで 精製した抗体および交差免疫電気泳動におけるそれらの活性を詳しく分析するこ とによって、抗原は抗原１からの異なる沈澱と相互作用することが明らかにされ 、この沈澱をここで抗原３として同定された。。この他の沈澱が最初に観測され た理由は、この研究における沈澱の形態および局在化が抗原１の一部分に非常に 類似するという事実のためであると推定される。さらに、第２寸法電気泳動のた めに使用したマラリア−免疫の血清は、多分、それ自体で可視の沈澱を産生ずる ために十分な量のＧＬＵＲＰに対して向けられた抗体を含有せず、中間のゲル中 の親和精製した抗体の堆積はＧＬＵＲＰの沈澱を引き起こす。さらに、融合タン パク質のカラムからの溶離液中の抗原１に対して向けられた抗体の存在は多分非 特異的吸収により引き起こされた（参照、第１図）。

上に概説した実験により、融合タンパク質は抗原１と部分的に同一でなかった。

後に、融合タンパク質および抗原３の部分的同一性は、交差免疫電気泳動を使用 する実験により示された。はじめ入手可能であったより高度に精製された融合タ ンパク質（９００ｍｍの５４００１（Ｒゲル濾過カラムで３回発育した）を、第 一次元ゲルにおいて分離した熱帯熱マラリア原虫（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）培養物および第二次元カラムにおいて分離したヒト免疫 血清からの精製した抗原を使用する交差免疫電気泳動の中間ゲルに入れた。中間 ゲル中の等張生理的塩類溶液を使用する他の交差免疫電気泳動との比較は、抗原 ３と表示する沈澱が融合タンパク質を表し、そして融合タンパク質の沈澱のある 高さを生ずる第一次元における抗原３の前の位置に相当する沈澱の中に組み込ま れたことを示した。最後の実験は、抗原３およびクローンのＤＮＡインサートに よりコードされる融合タンパク質により共有されるエピトープの直接の指示であ る。本発明の１つの実施態様において、ポリペプチドは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ 、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の抗原３を認識する抗体と交差反応性である。

抗原１はマラリア−免疫の血清から分離および精製されず、そして本発明のポリ ペプチドをアミノ酸のレベル上の抗原１と比較するか、あるいは分離したポリペ プチドと分離した抗原１と比較することができなかった。

かなりの量の親水性アミノ酸配列および／または酸性アミノ酸からなる前述の型 のポリペプチドは、ことにそれらの免疫原性に関して、とくに興味あることが発 見された。アミノ酸の親水性および酸の性質は、コンフォメーシジンの構造、例 えば、三次構造の確立の原因となり、この構造は、ポリペプチドがポリペプチド の抗原決定基を含むとき、抗原決定基を暴露し、これによりポリペプチドを適当 な物質、例えば、抗体にに結合するとき有利である。かなりの量の親水性アミノ 酸および／またはアミノ酸は、また、ポリペプチドによる適当な物質、例えば、 抗体の認識において有利である。

好ましくは、本発明のポリペプチドは実質的に純粋である。

この文脈において、用語「実質的に純粋」は、問題のポリペプチドがポリペプチ ドの産生および／または回収から生ずるか、あるいはそうでなければポリペプチ ドと一緒に見いだされうる他の成分、例えば、他の免疫学的に活性な成分を実質 的に含まないことを意味する。他の免疫原性成分の存在から生ずる望まない悪い 免疫反応が回避されるので、本発明の高い純度のポリペプチドは、免疫化の目的 で、例えば、ワクチンの構成成分として使用すべきである。その高い純度のため に、実質的に純粋なポリペプチドはほとんどの目的で従来の低い純度のポリペプ チドより少ない量で使用することができる。さらに、所定の目的で、例えば、ワ クチンの形態で使用される、免疫原性の濃縮物および／または組成物（本発明の ポリペプチドから構成された）は、正確に決定することができる。本発明のポリ ペプチドの純度は、下により詳細に取り扱うウェスタン・プロット分析およびク ーマシ−（Ｃｏｏａ＋ａｓｉｅ）ブリリアントブルーによるポリペプチドの可視 化により決定することができる。

上に概説したＧＬＵＲＰの配列は、９０ｋＤの分子量に相当する、７８３アミノ 酸残基から構成されている。親水性アミノ酸ならびに酸性アミノ酸の量は多い。

しかしながら、アミノ酸グルタメートの高い含量はマラリアのタンパク質の独特 な特徴ではない。ｒＧＬＵＲＰ　Ｊはグルタメートに冨んだタンパク質のための 略号である。この文脈において、トビツクのＤＮＡおよびタンパク質の用語は次 の通りである：もとのλ−ファージークローンからのＤＮＡインサートはｇｌｕ ｒｐと呼び、そしてそのコードされたタンパク質をＧＬＵＲＰと呼ぶ。プラスミ ドｐＲＤ１５によりコードされ、λＣｒｏ−タンパク質のＮ末端部分、β−ガラ クトシダーゼのＮ末端部分およびＧＬＵＲＰから成る融合タンパク質をβ−ｇａ ｌ　：　：ＧＬＵＲＰと呼ぶ（参照、第２図）。そのＧＬＵＲＰがＣ末端部分で あると信じられるマラリア寄生体からのタンパク質を自然ＧＬＵＲＰと呼ぶ。

ＧＬＵＲＰは次のアミノ酸組成を有する数　アミノ酸の合計の数の％ Ｄ　４８　６．１ Ｅ　２０４　２６゜Ｏ Ｆ　１８　２．２ Ｇ　１８　２．２ Ｈ３０３，８ １６１７，７ Ｋ　６４　８．　Ｉ Ｌ　２４　３．Ｏ Ｍ　１　０．１ Ｎ　５５　７．Ｏ Ｐ　５１　６．５ Ｑ　３２　４．０ Ｖ　８９　１１．３ ｗ　ｏ　ｏ、　。

Ｙ　２　０．２ ＧＬＵＲＰのヒトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａ　ｔｈｅ）はカイト（Ｋｙｔｅ）お よびドールトル（Ｄｏｏｌｔｔｌｅ）の指数を使用して分析された（Ｋｙ　ｔｅ およびＤｏｏｌｔｔｌｅ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｆｏｌ、　１５７：　１０５−１３ ２．１９８２）。これが示すように、タンパク質は主要な主として親水性アミノ 酸末端部分（はぼ残基１−７３４）および小さい主として疎水性カルボキシ末端 部分（はぼ７３４−７８３）から成る。ヒトロバシーは第３図に示す。

ＧＬＵＲＰの５０アミノ酸のセグメントの正味の電荷は計算された。これが示す ように、残基７３２で出発するカルボキシ末端部分は正の電荷を有するが、タン パク質の残りの部分は正味の負の電荷を有する。タンパク質の正味の電荷を第４ 図に示す。予測される親水性は実験の結果と一致する。

ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）　（Ｈｏｐｐ、Ｔ、Ｐ、および に、Ｒ。

Ｗｏｏｄｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８　：　３ ８２４−３８２８　；　１９８１）の原理に基づ（ＧＬＵＲＰの抗原性の推定（ これは本質的にどの区域が水に実験されるという予測である）は、ＧＬＵＲＰの 主要な部分（アミノ酸１−７４０）のすぐれた抗原性の予測を与える。

抗原性は第５図に示されている。これはアフリカ人におけるＧＬＵＲＰに対する 抗原の頻繁な発見に従い（実施例４に記載されているように）そして第６図に示 す。

ＧＬＵＲＰは３つのユニーク反復および介在する非反復ＧＬＵＲＰから成るユニ ークな一次構造を有する。これは、また、ＧＬＵＲＰをコードするＤＮＡ配列か ら明らかであり、そのＤＮＡ配列は第７図に示されており、そしてさらに後述す る。

第１反復の配列は、次のものを含んでなる：ＡＥＮＥＥＳＳＬＥｔ！ＧＨＨＥＢ ＩＶＰＥＱＮＮＥＥＳＧＥＳＫＬＶＤＮＤＥＧＧＦＥＥ＝　ａ：、第２反復の配 列は、次のものを含んでなる：５ＥＫＳＶＳＢＰＡＥＨＶＥ　ＩＶ　＝β、およ び第３反復は組成　ＥＥＩＬＰＥ（Ｅ／Ｄ／Ｉ　７ブテイ）　ＤＫＮＥＫ　（Ｖ 　／　Ｇ）（Ｑ／Ｅ）ＩＩＥＩＶＢＶ＝　ｒ’の１９または２０のアミノ酸配列 であり、ここで括弧をした記号は問題の位置において異なる可能性を表す。

非反復配列についての記号Ｙを使用すると、ＧＬＩＪＲＰの構造は次のように示 される： ♀α９α９βββ♀ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒ♀型Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの グリコジル化について４つの潜在的部位は、本発明者により発見された。それら はアミノ酸配列においてイリックおよび星印で示す：ＥＳＧＥＳＧＬＶＤＮＥＥ ＧＤＦＥＥ　ＰＮＩ（ＥＥＦＥＰＤＱＮ”ＤＳＥＬＳＥＮＥＬＶＥ　５ＥＫＳＶ ＳＥＰＡＥＨＶＥＩＶ　５ＩＪＳuＳ ＥＥ工ＬＰＥＥＤＫＮＥＫＧＱ　ＩＥＥ工ＶＥＶＥＥ工ＬＰＥＤｕＥＫＶＱ　１ （Ｅ工ＶＥＶＥＥＩＬＰＥＤＫＮＥＫＶＱ　ＨＥ工ＶＥＶＥd ＩＬＰＥ　ＩＶＥＩＥＥＶＰＳＱＴＮＮＮＥＮＩＥＴＩＰＥＥＸＩＣＮＥＦＳＶ ＥＥＫＡＩＰＱＥ　ＰＷＰＴＬ　ＮＥＮＥＪ／”ＶτＰＫＰr ＥＧＥＳＴ１’Ｊ’ＤＩＶＱＩＫＴＶＱＥＮＫＰＮＫＫＥＴＰＷＤＧＰＫＨＶＥ ＱＮＩＱＥＤＤＮＤＥＥＤＤＤＤＩＤＦＥＧＬＳＰ、ＫＤＤ）：ＫＤｓｓ謂冊オ ５ｎｒｒｘｓＴ葭耶５Ｑｒｘｖｓｖｓｘ　ＮＡＹＤＧ　ｖｘＱＶｖ　５ＴＩＫＧ ＩＡＫＤ　ｘｖＩＦｒＮＩ 上の配列において、イタリックの断片は親水性アミノ酸を示すが、肉太の断片は 反復を示す。

相同性のサーチは他のタンパク質と制限された類似性のみを明らかにした。これ まで、グリコフォリン結合タンパク質＝１３０と共通の６アミノ酸配列（Ｇｌｕ −Ｇｌｕ−＾ｓｎ　−Ｌｙｓ　−Ｈｉｓ−Ａｌａ）　（上の配列中で記号〈〉に より囲まれている）は本発明により発見された。このタンパク質において、６ア ミノ酸配列は赤血球の表面上のグリコフォリンと相互作用に関係すると推定され た１１の反復に対してアミノ末端である（Ｋｏｃｈａｎ　Ｊ。

Ｐｅｒｋｉｎｓ　Ｍ、およびＲａｖｅｔｃｈ　Ｊ　Ｖ　：　Ｃｅ１１．４４　： 　６８９−６９６　：　１９８６）。

本発明のポリペプチドの１つの実施態様において、アミノ酸のプロリンは実質的 に反復したサブ配列の位置３を占有しない。他の実施態様において、本発明のポ リペプチドは少な（とも２０％のグルタミン酸組成および最大１のメチオニン残 基および／またはシスティン残基を有することによって特徴づけられる。

本発明のポリペプチドは、好ましくは、Ｔ−リンパ球中の増殖の応答を誘発する ことができる。用語「増殖の応答」は、Ｔ−リンパ球が本発明のポリペプチド、 例えば、ポリペプチドにより表される抗原決定基に対して、免疫系のＢ−リンパ 球中で抗体の産生を誘発することができる物質、例えば、インターフェロンまた はインターリューキンを産生ずることによって応答する。増殖の応答は、暴露の とき産生されるインターフェロンおよびインターリューキンを検出しそして必要 に応じて定量するか、あるいはインターフェロンまたはインターリューキンを産 生させてＢ−リンパ球からの抗体の産生を引き出し、そして生ずる抗体の存在お よび／または量を決定することによって、決定することができる。後述するよう に、Ｔ−リンパ球における増殖の応答を引き出すポリペプチド（Ｔ細胞のエピト ープ）は、免疫化の目的でＢ−リンパ球により産生された抗体により認識される ポリペプチド（Ｂ細胞のエピトープ）と組み合わせて有利に使用することができ る。Ｂ細胞およびＴ細胞のエピトープはさらに下に説明する。

用語「Ｂ細胞のエピトープ」とは、免疫グロブリンの可変の部分と特異的に相互 作用するポリペプチドの構造を意味し、こうして、Ｂ細胞のエピトープはＢ細胞 により産生される抗体により認識される。Ｂ細胞のエピトープを構成するポリペ プチドの構造は、ポリペプチドの一次配列中のアミノ酸の伸長であるか、あるい は−次配列において隣接しない配列の一部分から、例えば、ポリペプチドの二次 または三次構造により、空間的に一緒にされたアミノ酸の群であることができる 。

通常、Ｂ細胞のエピトープはむしろ小さい数のアミノ酸を含有し、例えば、約３ 〜約２０のアミノ酸、より通常約４〜約１２のアミノ酸からなる。

用語「Ｔ細胞のエピトープ」は、は、抗原を表す細胞により表面されそしてＴ細 胞のレセプターと相互作用するポリペプチドにおける構造として理解すべきであ る。抗原を表す細胞（すなわち、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、互いにか み合う細胞およびランゲルハンス細胞）とＴ細胞のレセプターとの間の相互作用 は、次の方法で仲介されると推定される：抗原を表す細胞はエンドサイト−シス およびピノサイト−シスにより抗原を内部化し、引き続いて抗原のタンパク質分 解切断により小さい断片にプロセシングし、これらの断片は引き続いて細胞表面 に転移されそしてＴ細胞に表され、これにより抗原を表す細胞とＴ細胞のレセプ ターとの間の相互作用は確立される。プロセシングは、例えば、アンフィリック α−らせん構造を有する８〜２０アミノ酸の断片を産生ずる一次構造のタンパク 質分解切断を包含することが示された。

プロセシングの他の別の方法は、Ｔ細胞のエピトープがポリペプチドの一次構造 の非隣接アミノ酸から構成されうることか示されたので、明らかである。次いで 、アンソイリックα−らせんは主要な組織適合性複合体（クラスＩＩ）の分子に 関して外部の細胞表面上に表される。次いで、抗原からのアンフィリックα−ら せんのペプチドおよび組織適合性分子の複合体はこの抗原に対して特異性のＴ細 胞により認識され、そしてリンフ才力イン、増殖因子、分化因子および対応する レセプターのあるものの産生をトリガーする。これらの物質はＢ細胞を刺激して Ｔ細胞のエピトープに関するＢ細胞のエピトープに対する抗体をさせ、そしてナ チュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、キラー細胞、マクロファージおよび細胞障害 性Ｔ細胞を刺激して、抗原を表す標的をかみ合わせる。こうして、Ｔ細胞のエピ トープはそれら自体抗体を産生しないが、Ｂ細胞の抗体の産生の刺激に関係する インターフェロンおよびインターリューキンを産生ずることによって、なかでも Ｂ細胞からの抗体の産生を引き出す。こうして、Ｔ細胞のエピトープはＧＬＵＲ Ｐに対してレイズされた抗体により必ずしも認識されることはない。しかしなが ら、Ｔ細胞のエピトープの存在は、Ｔ細胞における増殖の応答を誘発する、すな わち、インターフェロンおよびインターリューキンの産生を誘発するそれらの能 力により例示することができる。

本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞のエピトープのみまたはＢ細胞のエピトープの みまたはこれらの組み合わせからなることができる。こうして、本発明のポリペ プチドの組成物は、それらの意図する用途、例えば、ワクチンの成分としてそれ らの用途に調整することができる。Ｂ細胞のエピトープは、抗体の産生を引き出 すために要求されるので、はとんどの応用のために有利である。Ｔ細胞のエピト ープは、免疫応答および抗体の産生を増強および加速するので、極めて有利であ る。さらに、　（ＮＢ　ｓｅ　ｇａｍｍｅｌｔ　ｋｏｎｃｅｐｔ）免疫系のメモ リーの機能はＴ細胞にある。免疫系のこの部分を刺激することによって、抗体産 生はほぼ５日後に有意である。メモリー機能は、例えば、非免疫化動物において 、参加しない場合、あるいは免疫化に使用される抗原がＴ細胞のエピトープを含 有しない場合、抗体産生が敗退後に有意であり、主に低い親和性のＩｇＭ抗原か ら成り、そして数カ月後高い親和性のＩｇＧ抗体から成る。

下に例示するアミノ酸配列は、ＧＬＵＲＰの適当なＴＷｌｌ胞のエピトープを構 成すると考えられる。配列は、実施例１０に記載するようにＡＭＰ旧−プログラ ム（Ｍａｒｇａｌｉｔ、■、　Ｓｐｏｕｇｅ、Ｊ　Ｌ＋Ｃｏｒｎｅｔｔｔｅ、Ｊ 　Ｌ、　Ｃｅａｓｅ、Ｋ　Ｂ、　Ｄｅｌｉｓｉ、ＣおよびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ＋ 　Ｊ＾ニー次次列列らの免疫優性ヘルパーＴ細胞の抗原性部位の予測（Ｐｒｅｄ ｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ　Ｃｅ １ｌ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓｉｔｅｓ　ｆｒｍ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　５ｅ ｑｕｅｎｃｅＬ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８　：　２２１３−２２３９　； 　１９８７）。ＡＭＰＨＩ−プログラムはアンソイリックα−らせん構造を有す る配列を予測する。いくつかの潜在的配列は発見された。これらのうちで、次の 配列はらせんホイールの手動的構成を使用して最も興味あると推定される：（１ ７９１８６）　Ｖａｔ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖ ａｌＢ（１６２１７１）　Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＶａｌＨ（１９４２１０）　Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ −Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｔｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ −Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ；（２２３−２３０）　Ｌｙｓ−Ｐ ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ；（３３３３４３）　 Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− Ｈｉｓ−ＧｌｕＨ（６００−６１３）　Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅ ｒ； （６９０６９６）　Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ 。

（７３９−７７４）　ＩＳＴＫＫＦＫＫＶＳＱＴＩＶＳＶＭＩＮＡＹＤＧＶＩＱ ＶＶＳＴＩＫＧＩＡＫ括弧内の数は、上に例示しそして第８図におけるポリペプ チド配列中の位置である。

本発明のポリペプチドは、ＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列がＧＬＵＲＰ から誘導されない第２アミノ酸配列に融合されている融合タンパク質であること ができる。ＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列が融合しているアミノ酸配列 は、有機体中で発現されるとき有機体によるタンパク質の発現を増加するか、あ るいはより容易なかつ経済的な回収により、例えば、配列に対して向けられた抗 体によるか、あるいは特異的化学または酵素反応により、例えば、容易に検出可 能であることによって、前記有機体からの融合タンパク質の精製および回収を促 進または改良ものであることができる。さらに、免疫原性を修飾する、例えば、 増加するアミノ酸配列は、ＧＬＵＲＰからの１または２以上の特徴的なアミノ酸 配列に有利にカップリングして、生ずる融合タンパク質をワクチン成分に適合さ せることができる。

融合タンパク質は、β−ガルクトシダーゼまたはその一部分、例えば、ｃｒｏ− β−ガルクトシダーゼからなることができる。ｃｒｏ−β−ガルクトシダーゼか らなる本発明による融合タンパク質の１つの例は、その融合タンパク質をエンコ ードするプラスミドｐＲＤ１５を収容するＥ、ｃｏｌｉ菌株ＰＯＰ２１３６によ り産生される融合タンパク質である。このＥ、ｃｏｌｉ菌株は、１９８８年９月 １５日にブダペスト条約の規定に従い、受は入れ番号ＤＳＭ４１８５で、ＤＳＭ 、トイチェ・サムルング・フォノ・ミクロオルガニシズメン（Ｄｅｕｓｃｈｅ　 ５ａａａａ＋１ｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ−ｓｍｅｎ）に受託さ れた。受託された菌株中に収容されるプラスミドの構成は第２図に示されている 。融合タンパク質の産生および特性決定は、下の実施例および図面に例示されて いる。

ある場合において、実質的にＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列のみからな る融合タンパク譬を切断することは有利であることがある。これらの場合におい て、ＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列は、好ましくは、切断剤、例えば、 化学的物質、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミンおよび２−二トロー５− チオシアノベンゾエート、または酵素、例えば、ペプチダーゼ、プロテアーゼま たはプロテアーゼ、例えば、トリプシン、クロストリバインおよびスタフィロコ ッカスプロテアーゼにより特異的に認識されるアミノ酸配列に融合される。

さらに、本発明のポリペプチドは、炭水化物または脂質部分、例えば、担体にカ ップリングするか、あるいは他の方法で変更する、例えば、アセチル化すること ができる。微生物、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中で産生ずるとき、本発明のポリペプ チドは、特別の手段を取らない場合、通常アセチル化されないであろう。アセチ ル化は、アセチル化したポリペプチドが細胞、血液または体の中でより安定であ ることがあるので、有利であろう。さらに、アセチル化は、自然熱帯熱マラリア 原虫（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰの構造およびコンフォメーションをまね る構造およびコンフォメーションを与えることができる。

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の抗原３の早期の研究は、 それが炭水化物の部分を含有すること（７）、および炭水化物の存在が抗原３の 反応性のために重要であることが明らかにされた。上で説明したように、本発明 のポリペプチドおよび抗原３は１または２以上のエピトープを共有すると推定さ れ、そして本発明のポリペプチドを炭水化物の部分にカップリングして、自然抗 原３を密接にまねることは有利であることがある。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原のいくつかは、ポリペプチド、炭水化物および脂質 の部分の複合体であると信じられる。こうして、本発明のポリペプチドに熱帯熱 マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原の自然の構造およびコンフォメ ーションを与えるために、脂質および炭水化物の部分をポリペプチドに付加する ことは望ましいことがある。

実施例１２において、本発明のポリペプチドは修飾しないで免疫系を刺激するこ とができる０本発明の好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは非グ リコジル化形態である。

当然、本発明のポリペプチドはプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏ−ｄｉｕｍ）種 、好ましくは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から誘導される 。好ましくは、ポリペプチドを誘導するプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ ｍ）種ばシゾントの段階である。

本発明のポリペプチドは、予防剤または治療剤、例えば、ワクチンとして、ある いは診断キットにおいて有用であると考えられ、そしてその調製において使用す ることができる。

これを下に説明する。

前述のように、本発明の１つの面は本発明のポリペプチドをエンコードする核酸 分子に関する。と（に、本発明は次のヌクレオチド配列から実質的になる： １２１　ＡＡＡＴＴＡＧＴＴＧ　ＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡ　ＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴ 　ＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡ　ＴＴＴＴＴbＡＴＣＴ １８１　ＧＡＡＧＴＡＡＧＴＡ　ＡＣＴＣＴＧＡＡＴＴ　ＡＡＡＴＧＡＡΔ八Ｔ 　ＧＡＡへＴＴＧＴＴＧ　ＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡ　ＡＡＧＴfＴＡＡＣＴ ２４１　ＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧ　ＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡ　ＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴ 　ＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡ　ＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧ`ＡＡＡＴ ６０１　ＧＴＡＧＡＡＡＧＴＧ　ＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡ　ＡＡＧＴＡＡＴＡＡＣ ＧＡＡＣＣＡＴＣＣＧ　へへへへＧＡＡＡＧＡ　ＴＧＧＡＣbＡＧＴＴ ６６１　ＣＣＴＴＣＡΔ八ＡＣＣへＴＴＴＧＡＡＧＡ　ＡＡＴＴＧＡＡ八Δ八　 ＧＴへＧへＴＧＴＴＣＡＡＣＣＴＡＡＡＡＴ　ＴＧＴＡＧＡbＣＴＴ ？２１　ＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧ　ＡＡＣＣＴＡＡＴＴＴ　ＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡ 　ＣＡＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＡ`ＣＣＡ ２１６１　ＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧ　ＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡ　ＴＡＡ八八へへＡＡ Ａ　ＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴ　ＣＴＴＴＴＡＴＡＡＣＡＴＡＴ`ＴＡＴＣＴ ２２２１　ＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴ　ＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴ　ＡＴＣＴＣＡＡＡＣ Ｔ　ＡＴＴＧＴＡＡＧＴＧ　ＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡ　ＴＧＣ`ＴＡＴＧＡＴ または本発明のポリペプチドの配列の遺伝情報を指定するそのサブ配列。

上の配列のヌクレオチドの各々は、一般的使用される略号により表される、すな わち、 Ａはアデニンであり、 Ｔはチミジンであり、 Ｇはグアニンであり、そして Ｃはシトシンである。

２３４９塩基対のオープンリーディングフレームがインサートの５′末端からｒ ＴＡＡ　Ｊ停止コドンに伸びる（上の表において矢印により示す）という事実の ために、このヌクレオチドは自然ＧＬＵＲＰのカルボキシ末端部分をエンコード すると考えられる。これはヌクレオチド配列の中に見いだされる、最も長いオー プンリーディングフレームである。出発または開始コドンがこのリーディングフ レームの中に存在しないことにより、上の配列が自然ＧＬＵＲＰのカルボキシ末 端をエンコードするＤＮＡ配列の３′末端であることが示される。上に示すＤＮ Ａ配列は次の実施例に記載するようにして確立された。

実施例２に記載するように、上のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク 質が得られる形態は、アミノ末端にβ−ガルクトシダーゼのペプチドの大部分を 含有する融合タンパク質として得られた。上のヌクレオチド配列において、ＧＬ ＵＲＰをコードする核酸配列は停止コドンが存在する位置２３４９において終わ ると推定される（矢印により示される）。

配列の残りの部分は非解読である。

上のヌクレオチド配列によりコードされる融合タンパク質は、実施例３および４ に記載するようにその抗原性に関して試験した。核酸配列の産生物とマラリア− 免疫の血清との反応性およびオランダ人のドナー（マラリア−免疫であると推定 されない）との非反応性は、ｐＥＸ２ベクターの１ａｃＺのそれと同期して存在 する制限断片が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉ−ｐａｒｕ…）により生体 内で使用されるものであることを強く示唆する。

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の異なる分離物を使用して実 施したサザンプロット（実施例１）は、核酸配列が広く分布していることを示す （参照、第１２図）。本発明において一般に制限断片の長さの多形性が観測され るが、タイ人およびビルマ人からの分離物について共通のパターンおよびいくつ かのアフリカ人について共通の他のパターンの観測により明らかのように、核酸 配列のある種の保存が存在するように思われる。相対的保存および広い幾何学的 分布は、核酸配列が寄生体にとって重要であることを示す。

核酸配列は、他のマラリアの核酸配列の特性のいくつかを表す：直列に反復した モチーフ、高いＡＴ含量（Ｈｙｄｅ、Ｊｏｈｎ　Ｅ。

および５１ｍ５．Ｐ、Ｆ、、　１９８７．　Ｇｅｎｅ（６１）　ｐｐ、１７７− １８７）およびこれらの塩基を含有するコドンの対応する優先、およびグルタメ ートのコドンの高い含量。

反復領域は、相同性のマトリックス、第９図、において、それ自体との配列の相 同性を表す対角線に対する平行に現れる点の線として示される。

図面は反復配列の３つの主要な領域を例示する：　ｂｐ３４からｂｐ１５６の１ つのモチーフはｂｐ２８９からｂｐ４１１に反復される；ｂｐ４７７からｂｐ５ ２１の他のモチーフはｂｐ５２２からｂＰ５６６およびｂｐ５６７からｂｐ６１ １までに２回直列に反復される。　ｂｐＨ７４からｂｐ１２３３の第３のモチー フは直列に１１回反復される。この最後の反復する領域は、アミノ酸アスパルテ ートの遺伝情報を指定する３塩基のＧＡＴにおいてのみ異なる３　ｘｓｏｂｐの 反復および８　Ｘ５７ｂｐの反復から成る。この領域は同義性６０ｂｐの反復の ５′末端に対してフランキングしている。

インサートのコード部分のＧＣ含量（第１０図に示されている）は、マラリアＤ ＮＡの前述の分析に従い、平均３０％であり、そして非コード３′末端のそれは １１％である。

ハイブリダイゼーションは、ＧＬＵＲＰの相同性を所定のＤＮＡ分子の配列と比 較するために有用な方法である。ＰＯＰ２１３６中のプラスミドｐＲＤ１５から のＧＬＵＲＰをコードする核酸配列からなる純粋なりＮＡは、マニアチス（Ｍａ ｎｉａｔｆｓ）ら、前掲ｐ、８６−９６に記載されている大規模の方法を使用し て調製される。

さらに詳しくは、プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによってｇｌｕ ｒｐをプラスミドから切断する。次いで、インサートをプラスミドＤＮＡからア ガロースゲルの電気泳動によりプラスミドＤＮＡから分離する。インサートを標 識の原理、例えば、ここに開示するものにより標識する。検査すべき外来ＤＮＡ をマトリックス、例えば、セルロースフィルターにカップリングする。フィルタ ーを使用するマトリックスの種類に適合する適当な処理にかけて、ニトロセルロ ースのフィルターの場合において、例えば、フィルターを８０°Ｃの温度におい て２時間ベーキングすることによってＤＮＡをマＩ・リックスにカップリングす る。膜を組成物の予備ハイブリダイゼーション溶液に、問題の膜に適合する推奨 される温度においておよび時間の間暴露する。次いで、膜をｐＲ０１５プラスミ ド（ｇｌｕｒｐ）から得られた標識し変性してＤＮＡプローブを含有するハイブ リダイゼーション溶液に入れる。ハイブリダイゼーションは好ましくは一夜適当 な温度において実施する。次いで、膜を洗浄し、そして５０ｍ１２　Ｘ５ＳＣの 体積６５”Ｃにおいて３０分間インキュベーションする。次いで、膜を０．１％ のＳＤＳを含有する１５＋ａｌの２ＸＳＳＣ中でインキュベーションする。イン キュベーションは６５°Ｃにおいて３０分間実施する。予備ハイブリダイゼーシ ョンおよび洗浄を包含するすべてのインキュベーションは、おだやかに撹拌しな がら実施する。フィルターを空気乾燥し、そして適当なプラスチックラップ（例 えば、サランラップ）の中に包み、次いでフィルターをＸ線フィルムに適用して 、オートラジオグラフィーの画像を得る。露出は好ましくは一７０°Ｃにおいて 増強スクリーンで、使用する陽性の対照により決定した期間の間実施する。ＤＮ Ａへのｇｌｕｒｐのハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の配列の類似性 、すなわち、ＤＮＡが本発明の核酸分子であることを示す。ＤＮＡ分子間の類似 性の他のアプローチは、普通のＤＮＡ配列決定分析によりｇｌｕｒｐまたはｇｌ ｕｒｐのサブ配列と比較すべきＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を決定し、そして ｇｌｕｒｐの選択したサブ配列との相同性の程度を比較することによる。同一の 方法で、所定のＤＮＡ配列のｇｌａｒｐの相補的ＤＮＡ配列に対する相同性を決 定することができる。

好ましくは、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約 ９５％の程度の相同性が得られる。

本発明の核酸配列は、融合ポリペプチド、例えば、前述したように、実施例に例 示する融合タンパク質を産生ずる目的で、特徴的なアミノ酸配列をコードする他 の核酸配列に融合した核酸配列からなる。組み換えＤＮＡ技術を使用するとき、 融合配列は適当なベクターの中に挿入され、このベクターは適当な宿主微生物の 中に形質転換される。あるいは、本発明の核酸分子はベクターの中にベクターが 有する核酸配列とインフレームで挿入することができ、この核酸配列は適当なポ リペプチドをコードする。宿主微生物は融合配列の発現を確実にする条件下に増 殖させ、その後融合ポリペプチドは培養物から物理化学的手順により回収するこ とができ、そして融合ポリペプチドはゲル濾過尾融合ポリペプチドの抗原性部分 に対して向けられた抗体を使用する親和クロマトグラフィーにかけることができ る。精製後、本発明のポリペプチドおよびそれと融合するポリペプチドを、例え ば、適当なタンパク質分解切断により、分子量することができ、そして本発明の ポリペプチドは、例えば、親和精製または他の適当な方法により、回収すること ができる。

他の実施態様において、本発明の核酸分子は第７図の核酸分子の少な（とも実質 的な部分に対して相補性である。

ＤＮＡ断片は、また、核酸分子の発現および複製を制御する適当なヌクレオチド 配列からなる。調節ヌクレオチド配列は、このようなベクターを使用するとき、 ポリペプチドの産生に使用する発現ベクターの一部分であることが便利である。

前述の本発明のポリペプチドの説明に類似して、本発明の核酸分子は、好ましく は、親水性アミノ酸および／または酸性アミノ酸に相当するコドン、例えば、ア ミノ酸のグルタミン酸およびアスパラギン酸に相当するコドンをかなりの数で含 有する。

前述の核酸分子は、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の寄生体から 、例えば、染色体またはゲノムのＤＮＡから、逆トランスクリブターゼ産生ＣＤ Ｎへにより得ることができる。染色体またはゲノムのＤＮＡから核酸分子を得る とき、それは好ましくは寄生体のゲノムから直接、例えば、ゲノムの配列につい てスクリーニングし、ｇｌｕｒｐの完全なまたは部分的核酸配列の基準にして調 製したＤＮＡプローブに対してハイブリダイゼーションすることによって誘導す ることが好ましい。

ＤＮＡが相補的ＤＮＡ　（ｃＯＮＡ）由来であるとき、それはＧＬＵＲＰまたは その一部分を産生ずる細胞からのｍＲＮＡの基準とするｃＤＮＡライブラリーを 調製することによって得ることができる。次いで、ハイブリダイゼーションの実 験はプローブとして合成オリゴヌクレオチドを使用して、ＧＬＵＲＰまたはその 一部分をコードするｃＤＮＡ配列を同定することができる。ｃＤＮＡはゲノムの Ｄ　Ｎ　Ａ異なり、例えば、それは解読ＤＮＡ配列内の非解読配列である、ある 種の転写制御要素およびイントロンを欠如する。これらの要素およびイントロン は常態でゲノムのＤＮＡの中に含有される。核酸分子は、また、合成由来である ことができ、すなわち、普通のＤＮＡ合成法により、例えば、ヌクレオチド合成 装置を使用することによって調製することができる。核酸分子は、また、これら の方法の組み合わせを使用することによって産生ずることができる。

他の面において、本発明は発現ベクターに関し、このベクターは宿主有機体の中 で複製することができ、そして前述したように核酸分子を有し、そして前述のポ リペプチドを発現することができる。この実施態様において、発現ベクターは宿 主有機体の中で複製しそしてその中でポリペプチドを発現することができ、この ポリペプチドは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰを認識する抗体と反応性の少なくとも１ つのエピトープ、例えば、ポリペプチドの実質的な部分と実質的に相同性の発現 されたポリペプチドからなり、そのアミノ酸配列は第８図に示されている。

このベクターは組み換えＤＮＡ手順に便利に付すことができる任意のベクターで あることができ、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば 依存する。こうしで、ベクターは自律的複製することができるもの、すなわち、 染色体外で複製することができるベクターであり、その複製が染色体の複製に対 して独立であるもの、例えば、プラスミドであるか、あるいは宿主の染色体とと もに複製するもの、例えば、バクテリオファージであることができる。

微生物または哺乳動物の細胞系を宿主生物として使用するとき、有用なベクター の例は次の通りであるニブラスミド、例えば、自然または合成のプラスミド、例 えば、ｐＢＲ３２２に関係するプラスミド、例えば、ｐＨＸ１−３　、　ｐＲＩ Ｔ族、ｐｕｃ族など、およびウィルス、例えば、アデノウィルス、ワタシニア、 レトロウィルス、バクロウィルス、ニブスティン−パルウィルス、Ｓν４０関係 ウィルスおよびウシ乳頭腫ウィルス。適当なバクテリオファージの例はＭ１３お よびラムダを包含する。

本発明は、また、上に定義した核酸分子を有しかつそれを発現することができ、 そしてその自然の形態で前記核酸分子を発現しない生物に関する。核酸分子は前 述したようにベクター上に存在するか、あるいは生物のゲノム中に組み込まれる ととができる。適当な生物の例は、次のものを包含する：微生物、例えば、バチ ルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ）　、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）　、例えば、Ｅ、ｃｏｌ ｉ、またはサルモネラ属（Ｓａｌ＋ｎｏｎｅｌｌａ）　；酵母菌、菌・かび、原 生動物、昆虫の細胞および高等真核生物の生物または植物および哺乳動物の細胞 。しかしながら、また、高等生物、例えば、動物、例えば、ヒツジ、ウシ、ヤシ 、ブタなどは、本発明のポリペプチドの産生に宿主生物として有用であると考え られる。

本発明は、また、前述のポリペプチドを産生ずる方法に関する。適当には、ポリ ペプチドは組み換えＤＮＡ技術、例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｔｓ）ら、 前掲に開示されている方法を使用して調製する。さらに詳しくは、ポリペプチド は、ＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、例えば、 前述の核酸分子を有する生物を、前記核酸分子の発現に導く条件下に、培養およ び飼育し、引き続いてポリペプチドを生物体から回収することからなる方法によ り産生ずることができる。

前述したように、ポリペプチドの産生に使用する生物は高等生物、例えば、動物 、または下等生物、例えば、微生物であることができる。ポリペプチドの産生に 使用する生物の型に無関係に、ＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列をコード する核酸分子を生物の中に導入すべきである。便利には、核酸分子は発現ベクタ ー、例えば、上に定義したベクターの中に挿入し、引き続いてこのベクターを宿 主生物の中に導入する。

核酸分子は、また、宿主生物のゲノムの中に直接挿入することができる。ゲノム 中の核酸分子の挿入は、核酸分子を有しそして宿主生物のゲノム中の挿入を仲介 することができるウィルス、例えば、バクテリオファージを使用して達成するこ とができる。発現ベクターまたは宿主生物の遺伝子の中への核酸分子の挿入は、 例えば、次の参考文献に記載されているようにして達成することができる：　Ｇ ｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ　Ｐ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏ ！、、１５０　：　１−１４（１９８１）　：高等真核生物の細胞のための新し い優性ハイブリッド選択的マーカー（Ａ　ＮｅｗＤｏｍｉｎａｎｔ　Ｈｙｂｒｉ ｄ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　Ｈｉｇｈｅｒ、　Ｅｕｃａｒ ｙｏｔｉｃＣｅｌｌｓ）。

同様に、本発明のポリペプチドの産生に発現ベクターを使用するとき、核酸分子 は他のポリペプチドをエンコードする第２核酸分子とインフレームで挿入して、 融合タンパク質の発現を得ることガできる。

本発明のポリペプチドが１または２以上の明確な部分、例えば、融合タンパク質 からなり、これらが一方においてＧＬＵＲＰからの特徴的なアミノ酸配列および 他方においてＧＬＵＲＰに無関係のポリペプチドを構成するアミノ酸配列からな るとき、これらのポリペプチドの各々をエンコードする核酸分子はゲノムまたは 発現ベクターの中に別々に挿入することができるか、あるいは普通のＤＮＡ技術 、例えば、マニアチス（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ）ら、ｏｐ、ｃｉｔ、に記載されて いる技術によりゲノムまたは発現ベクターの中への挿入前にカップリングするこ とができる。

本発明のポリペプチドを産生ずる生物を培養または飼育する条件は、もちろん、 使用する生物に適合させるべきである。

普通の培養および飼育の技術を使用することができる。微生物の場合において、 培養は、例えば、発酵の目的で便利に使用される培地、例えば、ルリアブロス培 地中で、問題の微生物の型に適合するｐＨ１温度、通気などの条件下に、例えば 、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ｏｐ、ｃｉｔ、に記載されているように 実施する。

宿主生物中のポリペプチドの発現に引き続いて、ポリペプチドを生物から回収ま たは分離する。ポリペプチドは、培養物から、１または２以上の親和クロマトグ ラフィーおよび／または大きさクロマトグラフィーの工程からなる方法により、 そして必要に応じて前記ポリペプチドと反応性の抗体および／またはそれに対し てレイズされた抗体を使用する工程を用いて、分離または回収することができる 。ポリペプチドの回収に使用する手順は、宿主生物の型ならびに産生されるポリ ペプチドに依存する。

本発明のポリペプチドを宿主生物として微生物を使用して産生ずるとき、ポリペ プチドの回収および分離は、また、もちろん使用する微生物に依存する。適当に は、微生物からのポリペプチドの回収は、微生物を処理して、例えば、生物を破 壊して、すなわち、部分的または完全に、ポリペプチドを解放し、引き続いてポ リペプチドをよく知られている方法、例えば、沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロ マトグラフィー、またはＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーまたは免疫親和クロマ トグラフィーなどにより回収することからなる。

さらに詳しくは、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドを含有する生物学的材 料、例えば、ポリペプチドを産生ずる細胞の懸濁液から、生物学的材料をここに 記載する固定化したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体からなるマト リックスに吸着させ、ポリペプチドをマトリックスから溶離し、そしてポリペプ チドを溶離液から回収することからなる方法により分離することができる。ポリ ペプチドを分離する手順の例は、次の通りである： ａ）高い純度の分画、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌ−ｃｉｐａｒｕ ｍ）の分子を、とくにシゾントの段階で、含有する分画を含有するプラスモディ ム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕｏ＋）種に適当なプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄ ｔｕｍ）種の分子と反応性の抗体を使用する手順。この手順は特定の抗体、好ま しくはモノクローナル抗体をマトリックスに固定化し、前記マトリックスを解放 されたプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子を含有する調製物と 接触させ、洗浄し、そして最後にマトリックスに固定した抗原−抗体の複合体処 理して、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子を純粋な形態で解 放することによって実施することができる。好ましい方法は、プラスモディム属 （Ｐｌａｓｍｏｄｔｕｍ）種の分子をカラムのマトリックスに固定された抗体を 包含するカラム親和クロマトグラフィーにより分離することである。

ｂ）種々の形態の親和クロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ フィーまたは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を包含する手順。

Ｃ）調製用電気泳動の手順；例えば、次の手順：酵素処理し遠心した細胞または 細胞系の調製物からの上澄み液をゲル電気泳動、例えば、ドデシル硫酸ナトリウ ム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ）　（参照、Ｌａ ｅ＋ａ＋ｎｌｉ＋Ｕ、Ｋ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：　６８０−６８５：　１９７０．５ｕｐｒａ）にがけ る。引き続いて、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種と反応性の標識 した抗体、例えば、モノクローナル抗体を使用して、分離したプラスモディム属 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子により主として構成されたバンドを同定する 。例えば、抗体は任意の普通のイムノプロッティング技術において使用すること ができる。マーカーは関連する感受性フィルムにより検出可能なアイソトープま たは蛍光性標識であることができる。同定後、ゲルのプラスモディム属（Ｐｌａ ｓｍｏｄｉｕｍ）種を含有するバンドをゲルからプラスモディム属（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ）種の分子を解放する処理、例えば、ゲルをスライスしそして引き続 いてプラスモディム属（Ｐｌａｓ−ｍｏｄｉｕｍ）種の分子を溶離することを包 含する手順にかけることができる。必要に応じて、得られたプラスモディム属（ Ｐｌａｓｍｏｄｊｕｍ）種のタンパク質のアミノ酸配列を決定することができる 。

微生物の培養の前に、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、核酸分子 のベクター中への挿入の前後に、修飾することができる。産生されたポリペプチ ドは、また、修飾することができる。修飾は、それぞれ、核酸分子およびポリペ プチド中の１または２以上のヌクレオチドおよびアミノ酸の１または２以上の置 換、付加、挿入、欠失または転位、またはそれらの組み合わせからなることがで きる。用語「置換」は完全なアミノ酸またはヌクレオチド配列中の任意の１また は２以上のアミノ酸またはヌクレオチドを１または２以上の他のもと置換するこ とを意味することを意図し、「付加」は完全なアミノ酸またはヌクレオチド配列 のいずれかの末端に１または２以上のアミノ酸またはヌクレオチドを付加するこ とを意味すると理解され、「挿入」は完全なアミノ酸またはヌクレオチド配列内 の１または２以上のアミノ酸またはヌクレオチドの導入することを意味すること を意図し、そして「欠失」は１または２以上のアミノ酸またはヌクレオチドが完 全なアミノ酸またはヌクレオチド配列から、配列のいずれかの末端またはその内 部に適当な部位において、欠失されていることを示すことを意図する。「転位」 は、１または２以上のアミノ酸またはヌクレオチドが互いに交換されていること を示すことを意図する。しかしながら、核酸分子は、また、核酸分子を有する生 物を突然変異、好ましくは部位特異的突然変異させて修飾して、前記断片を突然 変異させる。生物が微生物であるとき、突然変異誘発は、普通の突然変異誘発手 段、例えば、紫外線照射、イオン化または化学的突然変異原、例えば、ミドマイ シンＣ１５−ブロモウラシル、メチルメタンスルホネート、窒素マスタードまた はニトロフランまたはこの分野において知られている突然変異原、例えば、次の 参考文献に記載されている型の突然変異原を使用して実施することができる：　 Ｍｉｌｌｅｒ＋Ｊ、Ｈ，＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｕｎｆ ｔ　ＩＩＩ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９７２゜Ｄ ＮＡ配列の適当な修飾の例は、次の通りである：タンパク質の他のアミノ酸配列 を生ずるが、例えば、配列を挿入する特定の有機体のコドンの使用に相当するヌ クレオチドの置換；異なるアミノ酸配列を生じ、したがって、可能ならば、ＤＮ Ａ配列によりコードされるポリペプチドの臨界的性質を障害しないで、異なるタ ンパク質構造を生ずるヌクレオチド置換；自然ＧＬｔｌＲＰの免疫原性を保持し たポリペプチドをコードする、上に示すＤＮＡ配列のサブ配列；または上に示す ＤＮＡ配列を基準にしてＤＮＡ分子の少な（とも一部分にハイブリダイゼーショ ンするＤ　Ｎ　Ａ分子、ただしそれは自然ＧＬ［ＩＲＰの生物学的的性質を有す るポリペプチドをコードする。

前述したように産生じたポリペプチドは、翻訳後の修飾、例えば、熱処理、化学 的性質、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたは適当なタンパク 質分解酵素、例えばペプチダーゼまたはプロテイナーゼ、例えば、トリプシンを 使用する処理、および置換、付加、挿入、欠失、またはポリペプチド中の１また は２以上のアミノ酸の転位にかける。

ポリペプチドの翻訳後の修飾は、ポリペプチドを特定の用途、例えば、ここに記 載するようなワクチンの成分として適合させるという目的に役立つことができる 。

組み換えＤＮＡ技術は、その自然環境において産生されるとき、ポリペプチドの プロセシング以外の他のポリペプチドのプロセシングに関連させることができる ことはよく知られている。こうして、バクテリア、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉを本発 明のポリペプチドの産生に使用するとき、ポリペプチドのアミノ酸残基はグリコ ジル化されず、これに対して他の微生物または有機体の中で産生されるとき、ポ リペプチドはグリコジル化される。Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＤＭＳ４８１５により産生 されるポリペプチドのグリコジル化の欠如は、β−ｇａｌ　：　：ＧＬＵＲＰの 免疫原性および抗原性に影響をいかなる実質的な方法においても与えないことが 発見された（参照、実施例３．４および１２）：ポリペプチドは特徴ある反応を 示し、例えば、それはマラリア−免疫の患者から得られた抗体と沈澱する。これ は次の実施例において例示されている。しかしながら、それは問題の宿主有機体 により引き起こされるプロセシング特性を除去または変更することは有利である ことがあり、そしてポリペプチドの翻訳後の修飾ならびにＤＮＡのそれはこの目 的役立つことがある。

また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの配列の個々のアミノ酸の連続的 カップリングまたはポリペプチドの配列の断片を形成する個々のアミノ酸のカッ プリングを利用する、液相または固相のペプチドの合成のよく知られている方法 により調製することができ、そして前記断片は引き続いてカップリングして、所 望のポリペプチドを産生ずる。固相のポリペプチドの合成は、例えば、次の参考 文献に記載するように実施することができる：　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ＋　Ｊ、Ａｎ＋、Ｃｈｅｌ＋＋。

Ｓｏｃ、　８５．１９６３．　ｐ、２１４９　、固相の合成において、アミノ酸 配列は最初のアミノ酸を固相にカップリングし、次いで他のアミノ酸配列を順次 にペプチドの結合により、所望の長さが得られるまで、連続的付加することによ って構成する。この実施態様において、固体の支持体は、また、後述するワクチ ン調製物中の本発明のポリペプチドのための担体として役立つことができる。ワ クチンとしてまたは診断の目的に使用する合成ペプチドの調製は、次の参考文献 に本質的に記載されているように実施することができる：　５ｈｉｎｎｉｃｋ、 　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃ−ｒｏｂｉｏｌ、　３７．１９８３＋　ｐｐ、４２５ 　４４６゜本発明は、また、人間を包含する動物をマラリア原虫の寄生体により 引き起こされる病気に対して免疫化するワクチンに関し、このワクチンは免疫学 的に有効なかつ生理学的に許容されうる量の前述の型のポリペプチドならびに生 理学的に許容されうる担体からなる。

用語「ワクチン」は、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｔｕｍ）種の感染の防 止、改善または処理のために、生きている有機体に投与するために適当なプラス モディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子の免疫学的に有効な部分を含有す る調製物からなる。好ましくは、マラリア原虫の寄生体は熱帯熱マラリア原虫（ Ｐ、ｆａｌ−ｃｉｐａｒｕａ＋）である。用語「免疫化」は、特定の免疫学的応 答を引き出すプロセスからなると理解され、ここでこれはプラスモディム属（Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｎ＋）種による感染に対する体液、および／または分泌、およ び／または細胞仲介免疫性を生ずるであろうことが期待され、すなわち、免疫性 は感染に対して抵抗するか、あるいはそれを克服するか、あるいは免疫化されて いない個体と比較して「より容易に」感染を克服するか、あるいは臨床的に影響 受けないで感染に耐えるか、あるいは転移をブロッキングする個体の能力からな ると理解すべきである。こうして、本発明による免疫化はプラスモディム属（Ｐ 　１ａｓｎ＋ｏｄ　＋　ｕｍ）種で感染する抵抗性を増加するプロセスである。

本発明のワクチンの調製における全体の面は、成分の生理学的な許容性およびワ クチンの全体の組成物のそれである。ワクチンの最終の配合物は、特定の免疫原 成分により誘発される免疫応答を支持および増強する混合物であるべきである。

本発明のワクチンは、適当には、種虫のワクチン、メロゾイトおよび／ま゛たは 配偶子のワクチンとして提供することができる。これらの用語は、前述のマラリ アの寄生体の生活環の種々の段階を呼ぶ。これらの段階はワクチンによる免疫学 的攻撃に対してターゲティングすることができる。

本発明の好ましい実施態様において、菌株非特異的であるワクチンが開発され、 すなわち、それはかなりの臨床的重要性の感染を引き起こすプラスモディム属（ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の実質的にすべての種に共通の保護のエピトープである エピトープからなる。この場合において、異なるプラスモディム属（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ）種の中に保存される本発明によるエピトープは有利である。

本発明の他の実施態様において、多価ワクチンを配合する、すなわち、いくつか の免疫学的に有効な成分を感染および／または伝播の減少において有効な単一の ワクチン−すべでの有効な保護免疫性を誘発するすべてにおいて−の中に混入す る。ワクチンは、ＧＬＵＲＰに無関係の１または２以上の追加の分子を含んで、 ワクチンの多価の性質を提供することができる。ことに興味ある追加の分子は、 プラスモディム属（Ｐｌａｓ−ａ＋ｏｄｉｕｍ）種の有機体以外の病原性有機体 から得られる。免疫学的に活性な分子であり、これら感染を減少するか、あるい はマラリア原虫の寄生体に加えてｌまたは２以上の病原性有機体の免疫性を提供 するとき有効なワクチンを生ずる。

種々のワクチンの型の調製において、クローニングしたＤＮＡ配列をタンパク質 およびペプチドの合成に使用することができるという事実を使用する。この方法 の主要な利点は、限定されない量の精製した産生物を産生ずることができる能力 および病原体により汚染の回避である。産生は前述したように、例えば、微生物 、例えば、バクテリアまたは酵母菌中で実施することができる。あるいは、液相 または固相を使用することができる。ワクチンの産生の日常の方法は、例えば、 望まない（または同定されない）汚染物質を含有するワクチンのために、望まな い副作用が得られるという危険を包含する。本発明によるワクチンの調製方法は 、特定の分子の同一性および免疫学的有効性が維持され、そして望まない微生物 の汚染が導入されないことを確実にするように設計される。

最終産生物は無菌の条件下に好ましくは無菌の容器の中に分配され、次いで容器 を密閉して外部の微生物を排除する。

ワクチンは、ワクチン調製物の免疫原性をを包含するためにアジュバントからな る。アジュバントは、非特異的方法で、免疫系の細胞からのサイトカインまたは リンフ才力インの産生を刺激することによって、ポリペプチドの刺激性質を増強 する目的に役立つ。アジュバントは、フロインド不完全アジュバント（参照、実 施例１２Ａおよび１２Ｃ）、水酸化アルミニウム（参照、実施例１２Ｂおよび１ ２Ｃ）、サポニン、ムラミルジペプチド、リボサツカリド、Ｔ細胞の免疫原、イ ンターリューキン−２、インターフェロン−ガンマ、油、例えば、植物性油、例 えば、落花生油、または鉱物油、例えば、シリコーンオイル、およびＢ、Ｃ，Ｇ 、から成る群より選択される。

他のワクチンの形態はワクチンの輸送および物理化学的提示を改良し、そして免 疫系の関連する部分のための提示時間を延長するので、有用であると考えられる 。このようなワクチンは種々の形態であることができる賦形剤からなる。ワクチ ンは、ミセルの中に組み込まれたポリペプチド（ミセル形成剤、例えば、洗浄剤 、好ましくは非イオン性洗浄剤または他の非変性ミセル形成剤、例えば、アンフ ィフィリックペプチド、グリコシド）、正しいサブユニットまたは球形の構造体 の部分から成る、開いた球形構造体からなり、その形成はポリペプチドの疎水性 ／親水性を利用する。またポリペプチドがいわゆるイスコム（ｉｓｃｏｍｓ）　 （免疫刺激複合体、例えば、欧州特許（ＢＰ）　１１０９９４２号に開示されて いる）。

本発明のポリペプチドは担体に有利にカップリングすることができ、この担体は ワクチンの調製において通常使用される任意の担体であることができる。担体は 高分子量の担体であることができ、例えば、ポリペプチドが共有結合または非共 有結合している多糖類またはポリペプチドからなる。担体は好ましくは無毒かつ 非アレルゲン性である。ポリペプチドはワクチン調製物の免疫原性を増加するの で、高分子量の担体に多価的にカップリングすることができる。これに関して、 ポリペプチドを担体にプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種以外から得 られた１または２以上の免疫学的に活性な分子と一緒にカップリングして、種々 の異なる免疫原の抗原決定基からなるワクチン、すなわち、混合ワクチンを得る ことは有利であることが証明され、このようなワクチンは種々の異なる有機体に より引き起こされる病気の免疫化に使用することができる。ポリペプチドを重合 する、すなわち、多価の形態でポリペプチドを提供するワクチンは、また、有利 であることが証明されることがある。

種々の免疫化のスゲジュールは、本発明のワクチンを使用するとき、用いること ができる：ある場合において、早い時期に活性な免疫化を提供することは適当で あることがある。

さらに１、反復した投与、例えば、規則的なまたは延長した間隔で一注射に関す る限り一種々の体の部位に、例えば、同時に用いることは望ましいことがある。

考えられるか、あるいは適当な免疫応答を生成することが示された免疫化のスケ ジー！５・−ルを、本発明の実施に従い使用することができる。

ワクチンは、免疫系の効率よい刺激を確実にする方法で投与すべきである。これ が意味するように、ワクチンは免疫原として機能することができるために十分な 時間の間および形態で細胞と接触させるべきである。いくつかの方法が可能であ る。これらのうちで、最も普通の方法は非経［コ的方法、すなわち、皮下、皮肉 、筋肉内または静脈内のルートである。

ワクチンを投与する他のより普通でない方法は、鼻内、経口的または直腸のルー トである。２つの最初に述べたルートの組み合わせは、気道を経て投与すべきワ クチンのエアゾール配合物により達成することができるであろう。ワクチンのこ の配合物は、次の理由で、より普通の配合物が不十分であるであろう特別の目的 に提案された：非常に遠い区域においてワクチン接種の必要性、ワクチンの輸送 および貯蔵に関連する問題、注射器の多数回の使用による感染の広がりに関連す る問題および多数の人口のワクチン接種の必要性。

エアゾールのワクチンは、たいていの場合において、鼻のルートを経て投与され る。ペプチドは無傷で鼻粘膜を通して輸送されて血液に到達することができるこ とが知られている。

気道をさらに下に輸送されるとき、抗原はスカベンジャーとして機能するマクロ ファージにより取り上げられ、そしてこのようにして潜在的に免疫系に提供され る。エアゾールとして投与される物質のあるものは多分腸に到達し、そして腸の 中に存在する免疫系を刺激することができ、そしてこの方法は体の免疫系を刺激 するか、あるいは腸により無傷の形態で吸収されそして血流の中に遊離すること ができ、ここでそれは免疫系のために提供されるであろう。

ワクチンは、また、鼻のルートを経て厳格に投与することができる。この方法は 投与を簡素化しそして注射器の多数回の使用による感染症の広がりに関連する問 題を回避する。

ワクチンを投与する経口的ルートは、ある種のタンパク質が腸粘膜により吸収さ れそして無傷の形態で血流の中に見いだされるという発見を利用する。このワク チンの投与する特別の方法は、胃または腸内の分解から免疫原性成分を保護する 製剤学的配合物の利点を有するであろう。経口的ルートを経てワクチンを投与す る効果は、また、腸および肝臓の中に存在する免疫系の部分を刺激するポリペプ チドから来ることができ、そしてこの方法は一般的免疫の刺激に導く。

ワクチンを投与する直腸のルートは、前述の方法と同一の利点を有するが、より 信頼性あることができ、こうして特別のグル・−プ、すなわち、子供において、 より大きい患者のコンプライアンスに導くことができる。

さらに興味ある面において、本発明は、マラリア原虫の寄生体により引き起こさ れる病気に対して、人間を包含する動物を免疫化するための生ワクチンとして使 用するための、本発明のポリペプチドの遺伝情報を指定する挿入されたヌクし・ オチド配列を有しそしてそれを発現することができる非病原性微生物に関する。

生ワクチンの使用は有利であることがある。なぜなら、生きている有機体に基づ くワクチンは、きわめてすぐれた免疫原性を示し、問題の病気に対する寿命の長 い免疫性を与えるという、いくつの指示が存在するからである。生ワクチンは、 また、精製工程を必要とせず、精製したタンパク質に基づくものより製造が安価 である傾向がある。

本発明のポリペプチドは、非病原性有機体の外側表面で有利に発現されることが できる。これは生ワクチンを投与した動物の免疫防御機構により認識されるポリ ペプチドの好適に提供し、こうして適当な免疫応答を誘発する。

組み換え生物、すなわち、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ）また はサルモネラ属（ＳａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａ）のようなバクテリアとじてワクチ ンの特定の配合物与えられると、このルートはバクテリアが腸および／または肝 臓の中に確立させ、こうして患者の免疫の刺激を延長することができるであろう 。

あるいは、抗原をコードする１または２以上のＤＮＡ配列はウィルスのゲノムの 中に、すなわち、レトロウィルス、ワクシニア、ニスパイン−バールウィルスの ゲノムの中に挿入して、多価のワクチンを生成することができる。プラスモディ ム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子および／またはその免疫学的同等物また は誘導体に関する特徴的なアミノ酸配列の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列は、ワ クシニアで組み換えして、プラスモディム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕｎ＋）種によ る感染に対して保護するためのワクチンを生成することができる。

本発明の他の面において、受動免疫化を使用する、すなわち、後述する型の、抗 体を含有する調製物、ことに高い含量の精製した抗体を使用する調製物を投与す る。本発明の好ましい実施態様において、２またはそれ以上の単一のワクチンの 混合物を使用する。

本発明の他の面は、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、例えば、熱 帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原または前述のポリペプチド に対して特異性のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、およびその調 製方法である。用語「抗体」は、本発明のポリペプチドへの暴露に対する応答と して免疫系に属する動物または動物の細胞により形成される物質を呼ぶ。

抗体の変異型のドメインは可変および一定の配列から構成される。ドメインの変 異型部分は抗体のイディオタイプと呼ぶ、抗体のこの部分は、抗原との相互作用 、抗原の結合の原因となる。

イディオタイプの構造は抗原性であり、こうしてイディオタイプの構造に対して 向けられた特異的抗体を生ずることができる。これはマウスにおいて実施された 。抗体はイディオタイプに対して生じ、抗イデイオタイプの抗体は由来の抗原の 構造をまね、したがって由来の抗原として機能して、由来の抗原と反応性の抗体 を生ずる。このアプローチの問題はタンパク質の重要な免疫原部分の特性決定お よび合成に関連する問題を排除するので、有利であることがある。これは、そう でなければ同定が困難である、コンフォメーションのエピトープの場合において 最も重要である。ある数の有機体について、保護の免疫性はこのようにして誘発 されうることか示された（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｄｒｕｚｅｉ、　 Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ。

Ｈｅｐａｔｔｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ、およびＰｌａｓｍｏｉｄｔｕｍ　ｋｎｏ ｗｌｅｓｉｉ）。

本発明の抗体は、免疫原の形態で本発明のポリペプチドの少なくとも一部分を投 与して、前記ポリペプチドと反応性の抗体を産生ずる細胞を獲得し、そして有機 体または細胞から抗体を含有する物質を分離することからなる方法により産生ず ることができる。本発明の抗体を産生ずる方法は、下にさらに説明する。

抗体は好ましくはモノ特異性である。モノ特異性の抗体は、適当な動物に本発明 のポリペプチドの実質的に純粋な調製物を注射し、次いで１または２以上の促進 注射を適当な間隔で（例えば、１または２週で口に）最初の採血の４または５陰 る前までに投与することによって調製することができる。確立された免疫化のス ケジュールを続け、そして動物を毎週約１回各追加免疫化後に採血し、そして抗 体を血清から適当な方法で分離する（参照、ＨｒｂｏｅおよびＩｎｇｉｌｄ、　 ５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｏ＋ｕｎ。

２（Ｓｕｐｐｌ、１）、　１９７３．　ｐｐ、１６１．−１６４）。

高いアッセイの特異性を必要としないという目的で、抗体はポリクローナル抗体 であることができる。ポリクローナル抗体は、例えば、ＨｒｂｏｅおよびＩｎｇ ｉｌｄ　（上を参照）に記載するように得ることができる。さらに詳しくは、ポ リクローナル抗体を得るとき、プラスモディム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕｎ＋）種 の分子の調製物は、好ましくは適当なアジュバント、例えば、フロインド不完全 アジュバントまたはフロイント完全アジュバントの添加後、動物に注射する。免 疫原がヒトのプラスモディム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｔｕａ＋）種の分子であるとき 、動物はウサギであることができる。動物は規則的に、例えば、１週の間隔で採 血し、そして得られる血液を抗体を含有する分画に分離し、そして必要に応じて 前記分画を抗体の精製するそれ以上の手順、および／または精製したプラスモデ ィム属（Ｐ１ａｓ＋ｍｏｄｉｕｍ）種の分子の使用を包含する手順に付す。

他の好ましい実施態様において、モノクローナル抗体が得られる。モノクローナ ル抗体はプラスモディム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕｏ＋）種の分子の必須成分、す なわち、エピトープに対してレイズするか、あるいは実質的に直接それに対して 向けることができる。モノクローナル抗体は普通の技術（例えば、Ｋ５ｔ＋１ｅ ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６．１９７５．　ｐ、４９５ ）により、例えば、ハイブリドーマの細胞系の使用によるか、あるいはクローン またはそのサブクローンによるか、あるいは前記モノクローナル抗体の遺伝情報 を指定するハイブリドーマの細胞系からの遺伝情報を有する細胞により産生ずる ことができる。モノクローナル抗体はモノクローナル抗体を産生ずる細胞を適当 な細胞系の細胞と融合し、そして前記モノクローナル抗体を産生ずる生ずるハイ ブリドーマの細胞を選択およびクローニングすることによって産生ずることがで きる。あるいは、モノクローナル抗体は前記モノクローナル抗体を産生ずる非融 合細胞系を免疫化し、引き続いて適当な培地中で細胞を増殖し、そしてモノクロ ーナル抗体を増殖培地から収穫することによって産生ずることができる。

本発明の抗体の調製に使用する免疫化された動物は、好ましくは、ウサギ、サル 、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ、ウマおよびモルモットから成る群より 選択される。本発明の抗体を産生ずる細胞は、牌細胞またはリンパ球、例えば、 末梢リンパ球であることができる。

ハイブリドーマの細胞を本発明の抗体の産生において使用するとき、これらは生 体外中でか、あるいは動物の体腔中で増殖することができる。抗体を産生ずる細 胞を動物、例えば、マウスに注射し、腹水の腫瘍を形成し、この腫瘍は動物の腹 水の中に高い濃度の抗体を解放する。動物は、また、正常の抗体を産生ずるであ ろうが、これらはモノクローナル抗体の小さい百分率のみであるが、モノクロー ナル抗体は腹水から標準の精製手順、例えば、遠心、濾過、沈澱、クロマトグラ フィーまたはそれらの組み合わせにより精製することができる。

モノクローナル抗体を産生ずることができる適当な方法の例は、免疫化したマウ ス（例えば、Ｂａ１ｂ／ｃマウス）からの牌細胞を骨髄腫細胞と普通の技術によ り融合することである〔例えば、Ｒ，Ｄａｌｃｈａｕ、　Ｊ、Ｋｉｒｋｌｅｙ、 　Ｊ、１１．Ｆａｂｒｅ、　ｒラットの白血球共通（Ｌ−Ｃ）抗原に対して多分 相同性のヒトの白血球特異的膜の糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｍ ｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｂｏｄｙ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　１ｅｕｋｃｙｔｅ −ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｎｂｒａｎｅ　ｇｌｙ−ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏ ｂａｂｌｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｅｕｋｃｙｔｅ−ｃｏｍ ｍｏｎ（Ｌ−Ｃ）　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｒａｔ）　」、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１０＋　１９８（Ｌ　ｐｐ−７３７−７４４）。得られる融合物 は、普通の技術、例えば、前述の方法により得られたプラスモディム属（Ｐ１ａ ｓａ＋ｏｄｉｕｍ）種の分子を使用する結合アッセイによりスクリーニングする 。

ことに興味ある抗体は、本発明の核酸分子によりコードされそして受け入れ番号 ＤＭＳ４８１５で受託された微生物から発現されるポリペプチドの少な（とも一 部分と反応性のモノクローナル抗体である。

それ以上の面において、本発明は上に定義した抗体、好ましくはモノクローナル 抗体からなる診断剤に関する。あるいは、診断剤は、容器内に、第８図に示すよ うな配列の特徴的なアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる試験キットの形 態であることができる（参照、実施例６）。診断剤は、例えば、シゾントの段階 において、ことに熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）種の寄生体 により、マラリア原虫の感染の診断において、使用することができる。診断剤は マラリア原虫の寄生体の存在またはここに定義する試料中のそれに関係する分子 の存在を検出するために使用することができる。

診断剤は、抗体をカップリングする固体の粒子が試験する試料中に本発明のポリ ペプチドの存在下に凝集する、凝集アッセイにおける使用に適当である（参照、 実施例７）、この型の試験において、抗体の標識は不必要である。しかしながら 、はとんどの使用のために、抗体に結合した抗体の検出のための標識を付けるこ とが好ましいか、あるいは（例えば、二重抗体のアッセイにおいて）、標識した 抗体および標識しない抗体の組み合わせを使用することができる。標識として使 用する物質は、それ自体検出可能であるか、あるいは他の物質と反応して検出可 能な産生物を産生ずる物質から選択することができる。こ・）して、標識は放射 性アイソトープ、酵素１０発色性物質１、蛍光性物質または化学発光性物質、お よび複合化剤から選択することができる。

標識として有用な酵素の例は、β−ガクトシダーゼ、ウレアーゼ、。グルコース オキシダーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、ベルオキシダービ（例えば、セイヨウワサ ビペルオキシダーゼ）、ホスフ・７ラーゼ（例えば、アルカリ性ホスファターゼ または酸性ホスファターゼ）、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ およびリボヌクレアーゼである。

酵素はそれら自体検出可能ではないが、その最終産生物が検出可能である、反応 を触媒する基質と組み合わせなくてはならない。こうして、基質を反応混合物に 添加して、着色した、蛍光性または化学発光性の産生物または色の変化または色 、蛍光または化学発光の変化を生成することができる。本発明の方法において前 述した酵素のための基質として有用な基質の例は、ＨｚＯｚ　＊　Ｐ−ニトロフ ェニルホスフェート、ラクトース、尿素、β−Ｄ−グルコース、ｃｏｔ、ＲＮＡ 、澱粉、またはマレートである。基質は、例えば、ドナーまたはアクセプターで ある発色性物質と組み合わせることができる。

本発明に従い使用するとき成分の検出のための標識として使用することができる 蛍光性物質は、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート、４−メチルウンベ リフェリルＤ−ガラクトピラノシド、および３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プ ロピオン酸である。これらの物質は蛍光分光光度計により検出することができる 。化学発光性物質は、ペルオキシダーゼ／エオシン／ＥＤＴＡ、イソルミノール ／　ＥＤＴＡ　／　）ｂｏｘおよびそのための基質であることができる。

発色性物質は０−フェニレンジアミンまたは同様な化合物であることができる。

これらの物質は分光光度計により検出することができる。放射性アイソトープは 検出可能なかつ実験室において許容されうるアイソトープ、例えば＋ｚｓｌ。

！３１１，３Ｈ，３Ｓｐ、３ｓＳまたは１４Ｃであルコとができる。放射能はγ −カウンターまたはシンチレーションカウンターで、あるいはラジオオートグラ フィーおよび引き続くデンシトメトリーにより測定することができる。

複合化剤はプロティンＡ１プロテインＧ（これは免疫グロブリンと複合体を形成 する）、ビオチン（これはアビジンおよびストレプトアビジンと複合体を形成す る）、およびレクチン（これは炭水化物の決定基、例えば、レセプターと複合体 を形成する）であることができる。この場合において、複合体はそれ自体検出可 能でなく、複合化剤が複合体を形成する物質の標識付けを必要とする。このマー キングは前述の標識物質のいずれを使用することによっても実施することができ る。

本発明の実施態様において、本発明の抗体はポリペプチドは固体の支持体にカッ プリングした架橋分子にカップリングすることができる。固体の支持体および抗 体に連鎖するように設計した架橋分子は、プロティンＡ、グルタルアルデヒド、 カーポジイミドまたはリジンを加水分解することができる。

使用する固体の支持体は、例えば、ポリマーであるか、あるいはポリマーで被覆 したマトリックスであることができる。

マトリックスは任意の適当な固体の物質、例えば、ガラス、祇またはプラスチッ クから作られることができる。ポリマーはプラスチック、セルロース、例えば、 特別に処理した紙、ニトロセルロース紙または臭化シアン活性化紙であることが できる。適当なプラスチックの例は、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ ル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニルおよび適当なそれらの コポリマーである。シリコーンポリマーの例はシロキサンを包含する。

固体の支持体は、トレー、プレート、例えば、マイクロタイターグレート、例え ば、薄い層であるか、あるいは好ましくはストリップ、フィルム、糸、固体の粒 子、例えば、ビーズであり、プロティンＡ被覆したバクテリア、または紙を包含 することができる。

本発明のポリペプチドおよび抗体は、試料の中に存在する前記ポリペプチドの形 態および／または・一部分の同定および／または定量のアッセイにおいて使用す ることができる。本発明に従い使用することによって実施する同定および／また は定量は、プラスモデイム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子またはある形態 のプラスモデイム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子を包含する同定および／ または定量であることができる。こうして、同定および／または定量は、科学的 、臨床的および工業的の目的で実施することができる。さらに後述するように、 プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子を同定または定量するため に臨床的ルーチンにおいてことに重要である。

試料は生きている有機体、例えば、ヒトまたは動物、あるいは環境の検体、例え ば、水から得られる検体であることができる。検体は血液、例えば、赤血球に富 んだ分画、または組織の試料、例えば、肝臓細胞からなる試料であることができ る。本発明の非常に興味ある実施態様において、検体は尿である。

同定および／または定量は、有機体、例えば、動物または人間におけるプラスモ デイム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種による感染を診断する目的に役立つことが できる。診断は好ましくは有機体からの検体または試料、例えば、前述した型の 検体または試料ある。同定および／または定量は、本発明のポリペプチドまたは 抗体を使用するアッセイの使用により実施することができる。ポリペプチドまた は抗体は、その意図する使用に適する組成物のアッセイキットの一部分であるこ とができる。

このようなアッセイキットは、ｌまたはいくつかの層からなり、そしてここに記 載する方法のいずれかにより調製されたプラスモディム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕ ａ＋）種の分子を含有する。これはさらに下に詳細に説明する。

臨床的試料を使用してマラリアを診断する既知の方法のいくつかの次点は、既知 の試験が、体液、主として全血の試料について実施するとき、正確な診断に要求 される特異性および感受性を示さず、そして１つの特定の試験、すなわち、感染 した個体から得られた末梢血液のスミア中の寄生体の検出が特別に訓練された人 員を必要とする、すなわち、ルーチンの分析として実施することができないこと である。また、それは多数の患者のスクリーニングのためのスクリーニング分析 として不適当である。

本発明によるプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子の同定および ／または定量は、容易に入手可能な試料、とくに全血、血漿、血清または尿を使 用することができるので、例えば、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ） 種の最近獲得した感染の正確な検出において有利であることがある。

マラリアの感染は、試料、例えば、血液または尿の試料をプラスモディム属（Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子に対する抗体、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ）種の分子の存在、および／またはプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｕｍ）種の分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ断片の存在について検査する ことによって診断することができる。また、例えば、ここに記載する型の、ワク チン中のプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子の存在および量を この方法において決定することができる。前述したように、新規でありかつ非常 に興味あるものであＡと考えられる本発明の１つの面は、尿の試料について実施 したマラリアの感染の診断である。マラリアの診断における尿の試料の使用は、 血液または血清の試料の使用に比較して診断の容易かつ便利なアプローチである 。

１つの本発明の好ましい実施態様において、本発明の方法において使用する抗体 はモノクローナル抗体である。なぜなら、これは一般にアッセイの高い正確さお よび精度を提供する同時に実施に要する時間が少ないからである。さらに、２ま たはそれ以上の異なる抗体の混合物を使用することができる。なぜなら、これは 試験の検出の限界および感受性を増加することができるからである。モノクロー ナル抗体は後述する方法により得ることができる。高い結合活性を有する抗体は 、捕獲技術のために選択することができる。

本発明の方法において使用する抗体は、本発明のアッセイの正確さおよび／また は精度を改良するために、好ましくは実質的に純粋な形態（適当な技術に従いま たは本発明の方法により精製した、下を参照）である。

本発明のポリペプチドまたは抗体をプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ） 種の分子の同定および／または定量に使用するとき、ポリペプチドまたは抗体に 検出可能なマーカーまたは標識をつけることは有利であることがある。検出可能 はマーカーは、普通の技術および装置により容易に同定することができるマーカ ー、例えば、放射線標識したマーカー、例えば、アイソトープ、例えば”’Ｉ　 （Ｇ、Ｄｏｒｉｎｇ、　Ｈ，Ｊ、０ｂｅｒｎｅｓｓｅｒおよびに、Ｂｏｔｚｅｎ ｈａｒｔ、　ｒシュードモナス・アエルギノサの細胞外毒素。アルカリ性ホスフ ァターゼの検出についてラジオイムノアッセイ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　 ｔｘｉｎｓ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉ−ｎｏｓａ、Ｒａｄ ｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｒ　ｏｆ　ａｌｋａｌ ｉｎｅ　ｐｒｏｔｅ−ａｓｅ）」、　Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ、Ｂａｋｅｔｒｉｏｌ 、Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ、Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎｓｋｒ。

Ｈｙｇ、Ａｂｔ、１０ｒｉｇ、２５２．１９８２．　ｐｐ、２３１　１４７　） 　、または酵素標識したマーカー（ＤＪ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｔ、　Ｔ、Ａ、Ｗ ａｌｔｍａｎｎ、　Ｍ、Ｃ，Ｗｉｌｉ−ｎｇｈａｍおよび１．Ｐａ５ｔａｎ、ｒ ヒトＴ細胞増殖因子レセプターを発現する細胞に対して活性なシュードモナス・ エキトキシン抗ＴＡＣ細胞特異的イムノトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ　 ｅｘｏｔｏｘｉｎ−Ａｎｔｉ−ＴＡＣｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｍａ＋ｕ ｎｏｔｏｘｉｎ　ａｃｔｉｖｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｎ ｇ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃ ｅｐｔｏｒ）　Ｊ　＋Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７４．１９８４．　ｐｐ、 ９６６　９７１　）またはフルオレセインで標識したマーカー（Ｊ、Ａ、Ｈｏｘ ｉｃ、　Ｊ、Ｄ、Ａｌｐｅｒｓ、　Ｊ、Ｌ、Ｒａｃ−ｋｏｗｓｋｉ、　Ｋ、Ｈｕ ｅｂｎｅｒ＋　Ｂ、Ｓ、Ｈａｇｇａｒｔｙ、　Ａ、Ｊ、Ｃｅｄａｒｂａｕｍおよ びＪ。

Ｃ，Ｒｅｄｄ、ｒ　ＨＩ　Ｖで感染した細胞におけるＴ４（プラスモディム属の 種）タンパク質およびｎ＋ＲＮＡの合成において変更（Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　 ｉｎ　Ｔ４（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　５ｐｅｃｉｅｓ）ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ 　ｍＲＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔ ｈ　ＨＩＶ）　Ｊ　Ｉ　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４＋ｐｐ、１１２３−１１２７） である。また、複合化剤、例えば、ビオチンは有用なマーカーであることがある 。

本発明のポリペプチドと反応性でありそして試料、例えば、上に定義した試料の 中に存在する抗体の決定は、試料を本発明のポリペプチドと接触させ、そして前 記接触から生ずる結合した抗体の存在を検出し、そして結果を参照値と相関関係 づけることからなる方法により実施することができる。

１つの実施態様において、本発明の方法はよく知られているＥＬＩＳＡの原理の あるもの、例えば、直接（参照、実施例４）、捕獲（参照、実施例５）、能力（ 参照、実施例６）および二重酵素結合免疫吸収を使用する。例えば、阻害アッセ イにおいて、本発明の精製したポリペプチドを固体の支持体（例えば、ポリスチ レンのマイクロタイタートレー（Ｎｕｎｃ））に取り付ける；測定すべき試験溶 液を特定の参照抗体、例えば、本発明の抗体と混合し、そしてこの混合物を前述 したようにポリペプチドの調製物を有する固体の支持体とともにインキュベーシ ョンする。十分に洗浄した後、酵素標識した抗ＩｇＧ抗体を添加し、そして最後 に酵素の基質を適用する、参照、実施例６゜ＥＬＩＳＡ技術において使用する原 理のそれ以上の詳細な情報については、例えば、次の参考文献を参照：　Ｖｏｌ ｌｅｒ＋ＬＩ　ＢｘｄｗｅＨ＋Ｄ−Ｅ、およびＢａｒｔｌｅｔｔ、Ａ、　（１９ ７９）　：酵素結合免疫吸収アッセイ（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　 Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）（ＥＬＩＳＡ）　Ｄｙｎａｔｅｃｈ 　Ｅｕｒｏｐｅ＋　Ｂｏｒｏｕｇｈ　Ｈｏｕｓｅ　Ｇｕｅｒｎｓｅｙ）。

ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡの方法はよく確立されており、そして現存する実験室の 装置を使用して実施することができそして、また、自動化することができる。し たがって、本発明の方法は診断の目的でおよびワクチン接種の手順の結果を監視 するために、およびワクチンの生成において使用すべき免疫原のアッセイとして 製剤工業において広い応用を有する。

プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子またはプラスモディム属（ Ｐｌａｓｓｎｏｄｉｕｍ）種の分子様物質の存在は、陰性的および陽性的の両者 で決定することができる。本発明の方法は、プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｕｍ）種の分子の定性（参照、実施例７）および定量の両者のために使用する ことができる（参照、実施例５および６）。定量のために、試験において結合し た抗体の量はこの分野においてよく知られている方法において試料の系統的希釈 により決定することができる。

本発明のポリペプチドは試料の中のプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ） 種の分子の存在を決定するアッセイにおいて使用するとき、それは診断試薬また は診断剤の形態であることができる。当業者とって明らかなように、いくつかの 技術をこのような診断剤に関して適用することができる。

本発明に従い、前記ポリペプチドの一部分を固体の支持体にカップリングすると き、成分に対する抗体を次いで添加することができる（参照、実施例４および６ ）。あるいは、抗体を固体の支持体にカップリングする（参照、実施例５および ６）、。

それ以上の別法として、試料の中に存在するプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｕｍ）種の分子を固体の支持体にカップリングする。次いで、それはポリペプ チドの成分を固体の支持体に添加し、次いで検出可能なマーカーで標識した抗体 を添加することによってポリペプチドの成分とともにインキュベーションするこ とができる。

前述したように、生物の中のプラスモディム属（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕ＋ｍ）種の 分子により感染または試料の中おその存在は、本発明のＤＮＡ配列を使用してプ ラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子に関係するＤＮＡ配列の存在 を決定することによって検出することができる。この検出は試料中のＤＮＡ配列 と本発明のＤＮＡ配列との間の相同性に基づき、そして本発明のポリペプチドの 少なくとも一部分をエンコードする配列と相同性の標識したＤＮＡ配列からなる 診断剤の使用により実施することができる。ＤＮＡ配列は適当な標識、例えば、 放射性アイソトープ、酵素、化学的修飾剤、例えば、スルホニル導入化合物およ び複合化剤、例えば、ビオチンから選択される標識で標識することができる。

試料中のプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子に関係するＤＮＡ 配列の存在の検出のための核酸分子の使用は、有利には、次の参考文献に記載さ れているポリメラーゼ連鎖反応の原理を使用して実施することができる：　Ｒａ ｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、＋５ｃｔｅｎｃｅ＋　１９８５＋　２３０　：　１３ ５０−１３５４＋　Ｒａｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ。

１９８８、２３９：　４８７−４９１　、および５ｔｏｆｌｅｔ　ｅｔ　ａｌ、 、　５ｔｏｆｌｅｔ。

１９８８、２３９：　４９１−４９４　、、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は 、試料の中に存在するＤＮＡの増幅に使用する手順である（参照、実施例７およ び９）。この手順は、増幅すべき核酸分子をフランキングする２つのオリゴヌク レオチドのプライマーの使用を包含する。オリゴヌクレオチドのプライマーは、 例えば、１０〜４５マーであり、そしてｇｌｕｒｐのフランキングからなるか、 あるいはｇｌｕｒｐの一部分であることができる。オリゴヌクレオチドのプライ マーは、１つのプライマーの標的ＤＮＡのプラス鎖５′へのハイブリダイゼーシ ョンおよび他のプライマーの標的ＤＮＡのマイナス鎖５′へのハイブリダイゼー ションを可能とするように、構成する。２つのプライマーの間の距離は診断の目 的のために１００〜２０００塩基対以上であるが、より大きい距離は調製の目的 に受け入れられうるであろう。

プライマーを増幅すべき反対ＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションし、そしてＤＮ Ａポリメラーゼ、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩまたは他の有用 なりＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を 使用することによって伸長して、プライマーをアニーリングするＤＮＡ配列に対 して相補的なりＮＡ配列を合成する。これらの相補的配列の合成後、合成したＤ ＮＡを、例えば、加熱により、「親のＤＮＡストリング」から変性し、そして親 のストリングならびに新しく合成したＤＮＡストリングを新しいＰＣＲ増幅サイ クルにかける。このようにして、試料の中に存在する特異的ＤＮＡ配列を実質的 に増幅することができる。ＰＣＢ増幅法を使用することによって、試料の中に存 在する本来非常に少ない、検出不可能な量のＤＮＡ配列を増幅しそしてその存在 を検出し、これにより、例えば、マラリアの感染を同定することができる。

図面および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。

図面の説明 第１図。抗融合タンパク質抗体の特異性の交差免疫電気泳動。生体外熱帯熱マラ リア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）培養物の上澄み液からの２０μｌの親和 精製した抗原を第１次元において分離し、そして４００μｌの免疫血清に対して 第２次元において展開した。Ａは中間ゲル（ｉｇ）中で親和精製した非免疫血清 を使用する電気泳動であり、Ｂは中間ゲルにおいて親和精製した免疫血清を使用 する。ＧＬｔｌＲＰを表す沈澱は矢印および名称により示す；二重の矢印は抗原 １を示す。ＧＬｔｌＲＰはプレートＡ上で沈澱しない。その理由は多分第２次元 において使用した血清中の抗ＧＬＵＲＰ抗体の含量が低いことにある。プレート Ｂ上でＧＬＵＲＰを表す沈澱の局在化は、溶離液中の抗ＧＬＵＲＰ抗体の力価が 非常に高いことを示す。交差免疫電気泳動の第２次元は、矢印１．Ｄおよび２． Ｄにより示す。

第２図は、そのＥｃｏＲＩ制限酵素の切断部位にΦ１５インサートを含有するプ ラスミドｐＥＸ２から構成されたプラスミドｐＲＤ１５の地図である。独特制限 酵素の切断部位および最も重要な非独特制限酵素の切断部位が示されている（Ｂ ａｍＨｌ、　Ｂｇｌｌ。

ＥｃｏＲｌ、　ＫｐｎＩ＋　Ｐｖｕｌ＋　Ｐｓｔｌ、　５ａｌＩ、　５Ｌｌｌａ ｐ）。

略号の意味は次の通りである： Ｐｒはλ−ファージの右方向のプロモーターあり、矢印はこのプロモーターの転 写の方向を示す。

Ｃｒｏ　’はλ−ファージｃｒｏ−遺伝子の５′部分である。

１ａｃＺ’　ｈａβ−ガタトシダーゼ酵素のＮ末端部分をコードするＩａｃＺ− 遺伝子の５′部分である。

Ｏｒｉは複製のＭＢＩ−由来であり、矢印は複製の方向を示す。

ｂｌａは宿主有機体のアンピシリン抵抗性を与える酵素のβ−ラクタマーゼをコ ードする遺伝子である。

波状の線はＣｒｏ　’−遺伝子および１ａｃＺ　’−遺伝子を表し、二重線（＝ ）はＧ　Ｌ　ＩＩ　ＲＰをコードするマラリア誘導ＤＮＡ断片を表す。

プラスミドｐＲ０１５はＣｒｏ−タンパク質のＮ末端、β−ガタトシダーゼ酵素 のＮ末端およびＧＬＵＲＰから成る融合タンパク質をコードする。プラスミドｐ ＲＤ１５の大きさは８８５７塩基対である。

第３図は、カイテ（Ｋｙｔｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）の指数 の使用により決定した、ＧＬＵＲＰタンパク質のヒトロバシーを示す。

第４図は、５０アミノ酸のセグメントについて推定した、ＧＬＵＲＰタンパク質 の正味の電荷を示す。

第５図は、ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）に従うＧＬＵＲＰタ ンパク質の抗原性を示す。

第６図は、マラリア−免疫の患者ならびにトキソプラズマ症および住血吸虫症と 診断された患者からの１：２００に希釈した血清の試料および対照群からの試料 について、実施例３に記載するように、抗体検出ＥＬＩＳＡにより測定した光学 密度を表す点線線図である。

第７図は、ＧＬＵＲＰをコードするＤＮＡ配列ｇｌｕｒｐのヌクレオチド配列を 示す。ヌクレオチド配列は実施例１に記載するように決定した。矢印は停止コド ンを示す。

第８図は、ＧＬＵＲＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列から推定された アミノ酸配列を示す。

第９図は、Ｘ軸およびＹ軸に沿って表したＧＬＵＲＰをコードする遺伝子の配列 と相同性のマトリックスを示す。Ｘ軸から最初の３０塩基のブロックをＹ軸上の 最初の３０塩基と比較し、そして点は少なくとも２４塩基が同一である（８０％ の相同性）である位置にプリントされている。次いで、ブロックをＹ軸上の１つ の塩基を塩基１−３１に動かし、そして比較を反復し、これを配列の末端まで続 ける。この手順はＸ軸から塩基２−３２で反復し、そして全体の配列が比較され るまで続ける。

第１０図は、ｇｌｕｒｐのＤＮＡ配列のＣＧ含量を示す。

第１１図は、７．５％のＳＯ３−ＰＡＧＥ上で分離した、λ−ｇｔｌｌリソゲン （レーン１）およびΦ１５リソゲン（レーン２）のレゼイトを示す。タンパク質 をクーマツシー（Ｃｏｏｎ＋ａｓｓｉｅ）ブリリアントブルーで染色することに よって可視化し、そして同一タンパク質をニトロセルロース膜にブロッティング する（レーン３および５：λ−ｇｔｌｌリソゲンおよびレーン４および６：Φ１ ５リソゲン）、レーン３および４は配位子として抗原１との親和精製した抗体の 反応を示し、そしてレーン５および６はオランダ人のドナーからの血清のプール の反応を示す。使用した分子量のマーカーは、フェリチン（還元せず、沸騰せず ）４４０ｋ　、２２０ｋ　；ミオシン２００　ｋ　、β−ガタトシダーゼ１１６ ｋ　；ホスホリラーゼ８９２．５ｋ　；ウシ血清アルブミン６６ｋ（すべてのｋ はｋＤを示す）。

第１２図は、実施例１に示すようにＢｃｌｌで消化した熱帯熱マラリア原虫（Ｐ 、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の地理学的に異なる分離物のサザンプロットを示す。

ＢｉｎｄｌＩＩで消化したλ−ＤＮＡを分子量の大きさのマーカーとして使用し た。ゲノムのＤＮＡはＢｃｌＩで消化し、１％のアガロースゲルの電気泳動によ り分離し、そしてニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌ ｌ）にプロッティングし、そしてニック翻訳した（ニック翻訳キット、Ａｍｅｒ −ｓｈａｍ）　Φ１５−インサート　（α−３２ｐ−ｄＡＴＰで標識した）でプ ロービングした。最後の洗浄は０．　Ｉ　ＸＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｐ、４ ４７）。

６５°Ｃにおいて１０分間実施した。

第１３図、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ２Ｏ ２高分解能のカラム（寸法９００Ｘ２６ｍｍ）上のゲル濾過の間に溶離液を連続 的に紫外線監視することによって得られたクロマトグラムを示す。

Ａ）分離から生ずるクロマトグラム、ここでプロセシングしないリゼイトの塩酸 グアンジジウム中の可溶性の分画をカラムに適用した。これは広いプラトーを与 え、ボイド体積直後に溶離された融合タンパク質の悪い分離を表す。

Ｂ）分離から生ずるクロマトグラム、ここでカラムに適用した物質は封入体とし てプロセシングされていた。この図面上の線に相当する溶離された物質をプール し、そして実施例２に記載するように濃縮した。融合タンパク質調製物中の不純 物は、最初のピーク中に不規則性として見られ、そして第２ピークが存在した。

Ｃ）分離から生ずるクロマトグラム、ここで前述のプールしそして濃縮した物質 を追加のカラム長さについて展開した。

曲線はさらに平滑であるが、なお小さいピークがより感受性の第２チヤンネル上 で検出された。図面上の線に相当する溶離された物質をプールし、そして実施例 ２に記載するように濃縮した。

Ｄ）分離から生ずるクロマトグラム、ここで前述のプールしそして濃縮した物質 を追加のカラム長さについて展開した。

融合タンパク質を表す以外のピークは観測されなかった。このピークの物質を第 １４図、レーン６．７および８に示す。

第１４図は、還元性条件下の７．５％のＳＤＳ　−ＰＡＧＥの展開を示す。

レーン１．２および１０： バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）高分子量および低分子量マーカーレーン３： ファーマシアのフェリチン分子量マーカー。分子量（ｋＤ）は矢印に相当する（ 上から下）　：　４４０．２２０．１１６．９２．６６、４５゜レーン４，５お よび９： ｐＲＤ１５からの部分的に精製した封入体（それぞれ、２０　、３０および１０ μｌ）。タンパク質の極端な負荷は分離ゲルの上部から４５ｋＤのマーカーの範 囲において観測された。

レーン６．７および８： ５４００ＨＲ−カラムの２７００ｍｍのゲル濾過後の封入体、ゲルに適用した体 積、それぞれ、１０，５および２０μ１．ゲル濾過クロマトグラフィーの効果は 明らかであった。相対的分子量３００ｋＤの１つのバンドが見られた。レーン８ における２０μｌの融合タンパク質の適用は、過度の負荷およびスミアの生成を 生じた。この図面を第１３図Ｂ、ＣおよびＤと組み合わせると、タンパク質の実 質的な純度を実証する。

第１５図は、吸収（・）について使用したＧＬＵＲＰの希釈の関数として自然Ｇ ＬＵＲＰとのヒト免疫血清の反応性の阻害の半対数プロットである。ＧＬＵＲＰ は反応性の９２％を阻害することができた。これは組み換えタンパク質が自然タ ンパク質とほとんど同一であることを示す。対照として、同様な量のβ−ガタト シダーゼを同様な手順についてＧＬＵＲＰ代わりに使用した（×）。阻害は観測 されなかった。希釈はＰＢＳ中の１■のＧＬＵＲＰ／ｍｌの溶液から行った。

第１６図は、顕微鏡検査により決定して異なる寄生中症をもつ生体外の熱帯熱マ ラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｎ）培養物（ヘマトクリット６％）から の上澄み液について使用したＧＬＵＲＰ検出ＥＬＩＳＡを示す、半対数プロット である。検体の希釈は１：１００であり、捕獲抗体は４■／ｍｌのストックから １：３２０に希釈した、精製したウサギ抗融合タンパク質抗体であった。

検出抗体は血清から１：５００に希釈したマウス抗融合タンパク質抗体であった 。接合したウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ　Ｐ２６０）を １　：　１０００に希釈した。

第１７図。エピトープのマツピング、ＧＬＵＲＰの主要な反復領域を含有する、 部分的に精製したタンパク質をＴ細胞のエピトープについて試験した。図面は（ Ａ）ガンピア人からの１６人のマラリア−免疫のドナー、および（Ｂ）８人の非 免疫のヨーロッパ人のドナーの増殖応答を示す。１６人・のマラリア−免疫のド ナーのうちで１３人からのＴ細胞は２．５Å以上の増殖指数で応答したが、非免 疫ドナーの１人のみは、マラリア回復期であり、有意に応答した。刺激指数は３ 回の測定の幾何学的平均を３回の対照の幾何学的平均で割って計算した。

第１８図は、実施例１２Ａに記載するように融合タンパク質で免疫化したウサギ の血清の中に存在する抗体の抗体検出ＥＬＩＳＡにおいて得られた結果を示す、 半対数プロットである。

第１９図は、能力アッセイを示す半対数プロットである：ウサギ抗融合タンパク 質抗体をヒトマラリア−免疫の血清と融合タンパク質のコーティングについて能 力させた。ウサギの抗体は、実施例１２Ａに記載するように、ヒトの抗体の反応 性を区別することができた。

第２０図。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ０融合タンパク質で免疫化した４匹のサルから得 られたサルの血清の滴定。血清は免疫化の日間して第一１３２（・）、第０日（ Ｘ）、第１４日（○）、第２４日（Ｘ）に集めた。分析は、０．１２５ｇの融合 タンパク質／ウェルでコーティングした実施例３に記載する抗体検出ＥＬＩＳＡ で実施した。サル抗融合タンパク質抗体の結合は、１：１０００に希釈したウサ ギ抗サル血清の抗体により検出し、ウサギの抗体の結合は１　：　１０００に希 釈したブタ抗ウサギ抗体で検出した。

ＡはサルＮｏ、８６４についてのタイトレージョン曲線を表す。

ＢはサルＮｏ、８６５についてのタイトレージョン曲線を表す。

ＣはサルＮｏ、８６６についてのタイトレージョン曲線を表す。

ＤはサルＮｏ、８６７についてのタイトレージョン曲線を表す。

すべてのサルは、使用したアジュバントに無関係に、融合タンパク質に対する有 意の力価を発生した。

材料および方法 ゲノムのライブラリーの構成に使用したマチリアの分離物はタンザニア人の分離 物Ｆ３２であった。サザンブロッテイングに使用した分離物は、次の通りであっ た：タンザニア（Ｆ３２　、　Ｄ２５）　、ビルマ（Ｄ５１）　、セネガル（Ｄ ２Ｂ）　、インド人（Ｄ４１）　、リベリア（Ｌｌ）、ケニアまたはタンザニア （Ｄ　５０）およびケニア（Ｋ１）。すべての分離物は由来として示した国を旅 行した患者からのものである。分離物Ｄ５０はケニアおよびタンザニアを旅行し た患者からのものである。

すべてのマラリアの分離物はデンマーク国コペンハーゲンのステイテンス・サー ムミンスチツツ（Ｓｔａｔｅｎｓ　：Ｓ・ｅｒＩＩｌｉｎｓｔｆｔｕｔ）から入 手可能である。

ゲノムのライブラリーのスクリーニングおよびタンパク質の特性決定に使用した ヒトの血清は、アフリカおよびインドネシアからのものであった。抗原１を主と して認識する抗体は、アフリカのマラリア−免疫の血清から、配位子として抗原 １を使用するクロマトグラフィーの親和精・製により精製する。次のベクター使 用した：　Ｍ１３　、　ｐＵｃ９　、λ−ｇｔｌｌ　、　ｐＥＸ２゜次のＥ、ｃ ｏｌｉ細胞系（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに下に示す受け 入れ番号で受託された）を使用した：Ｙ１０９０（ＡＴＣＣＮｏ、３７１９７） 、Ｙ１０８９（八ＴＣＣＮｏ、３７１９６）、Ｙ１０８８（ＡＴＣＣＮｏ、３７ １９５）、およびＰＯＰ２１３６　Ｃゲンスプレジスニングスグルッベン（Ｇｅ ｎｓｐｌｅｊｓｎｉｎｇｓｇｒｕｐｐｅｎ）　＋　デンマーク国リングビー、か ら〕。

β−ガタトシダーゼの検出のＥＬＩＳＡ抗体： ダコバッツ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）から入手したセイヨウワサビペルオキシダー ゼに接合したウサギ抗マウスＩｇＧ　、コードＰ２６０　ｉセイヨウワサビペル オキシダーゼに接合したヒトＩｇＧ　。

ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ、コードＰ２１４゜マウスのモノクローナル抗β−ガタトシ ダーゼ、（Ｍｇａ１８）　、デンマーク国のステイテンス・サームミンスチツツ （Ｓｔａｔｅｎｓ　Ｓｅｒｍｔｎｓｔｉｔｕｔ）、ハイブリドーマ研究所から入 手した。

化学物質： 過酸化水素３０％、過酸化水素、物品Ｎｏ、７２１０　Ｍｅｒｃｋ　、　１．２ オルトーフエニレンジアミンージハイドロクロライド（ＯＰＤ）、デンマーク国 コペンハーゲンのケンエンチク（ＫｅｍＥｎＴｅｃ）から入手した。

ＥＬＩＳＡ装置 マイクロタイターＨＬＩＳＡプレート、ｎｏ４　３９４５．　ＮＩＪＮＣから入 手した。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｉｍｍｎｏｒｅａｄｅｒ＋　ＮＪ２０００＋　Ｔ ＥＣＨＮＵＮＣ）。

イムノウオッシャ−１２，ＮＵＮＣから入手した。

緩衝液： 炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６（１，５９ｇのＮａ、ＣＯ，、２，９３ｇのＮａＨＣＯ ｓ、蒸留水で１０１００Ｏとする）。

洗浄緩衝液（２９，２ｇのＮａＣ１，０，２ｇのＭＣＩ、　０．２　ｇのＫＨ， ＰＯ，。

１１５ｇのＮａｚＨＰＯａ　・２ＨｚＯ，１０ｍ１のトリスフＸ−１００，蒸留 水で１ΩＯＯｍ　１とする）。

希釈緩衝液ｐ’Ｈ７，２（１０ｇのウシアルブミン、２１１のフエノルレッド０ ．５％、洗浄緩衝液で１０１００Ｏにする、水酸化ナトリウムでｐＨ７，２に調 節する。

保存緩衝液（２９，２ｇのＮａＣ１，０，２ｇのＭＣＩ、０．２８のＫ）ＩｇＰ Ｏ，。

１．１５ｇのＮａＪＰＯ４’　２ＨｚＯ，１，７ｇのアジ化ナトリウム、５ｇの ウシアルブミン、蒸留水で１０００＋ａｌとする）。

着色緩衝液ｐＨ５，０（？。３ｇのクエン酸・Ｈ，Ｏ，ｘｌ、８６ｇのＮａｔＨ ＰＯａ　・２ＨｚＯ１蒸留水で１０００ｓ＋１とする）。

着色基質溶液（４０■のＯＰＤを４０μｍ過酸化水素を補充した１’００ｍ１の 着色緩衝液の中に熔解する）。この溶液の容器をスズ箔で包装して光への暴露を 回避する。この溶液は４°Ｃにおいて１へ・２日間貯蔵して使用することができ た。

免疫吸収技術に使用した装置 ポンプ：　バリオペルペックス（Ｖａｒｉｏｐｅｒｐｅｘ）　１゜ＬＫＢ　、ス ウェーデン国ストックホルム。

レコーダー：ＬＫＢ、スウェーデン国ストックホルム、２２１０型。

紫外線モニター二ファーマシア・ファイン・ケミカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、スウェーデン国つップサラ、ＬＩＶ−１型、 ２８０ｎｍ。

濃縮セル：　アミコン・セル（Ａｍｉｃｏｎ　ｃｅｌｌ）、２０２型、ウルトラ フィルターＰＭＩＯ（アミコン・コーポレーション、米国マサチュセッツ州レキ シントン）。

フィルター：　０．２２／／Ｉｌｌ、シュレイヘル・アンド・シュネル。

分画コレクター：レジラフ（Ｒｅｄｉｒａｃ）ＩＪＢ、スウェーデン国ストック ホルム。

自然抗原１に対する抗体の産生 ＩｇＧを既知のマラリア−免疫のアフリカ人の大人のＥＤＴＡ　−血漿から、次 の文献に詳細に記載されているように塩析およびイオン交換により分離した：例 えば、Ｈａｒｂｅ、ＮおよびＩｎｇｉｌｄ、Ａ　：免疫化、免疫グロブリンの分 離および抗体力価の推定（Ｉｍｍｎｉｚａｔｉｏｎ、　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｉ＋ｎｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｔｎｓ　ａｎｄｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ）、　５ｃａｎｄ、Ｊ、１ｍ＋１ｕｎｏ１．２＋ ５ｕｐｐ１．　］　：　１６Ｌ　１９７３　、交差免疫電気泳動（ＣＩＢ）によ り、血漿は（１）に記載されているように抗原１および抗原２に対する抗体を含 有することが示された。交差免疫電気泳動はジェブセン、Ｓ、およびアクセルセ ン、ＮＨ（１）に本質的に記載されているようにして実施した。１４０■のＪｇ Ｇ抗体をファーマシア・ファイン・ケミカルスからの１５ｇのＣＮＢｒ活性化セ ファロース４Ｂにカップリングした。製造業者の手順に従った。マラリア培養物 （熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕａｉ）、Ｆ３２〕の上澄み液か らの抗原を、ジェプセン、Ｓおよびアンダーソン、ＢＪ（２）に記載されている ようにして精製した。

免疫１ｇＧカラムで精製した抗原のプールを、製造業者の指示に従いＣＮＢｒ活 性化セファロース４Ｂにカップリングした。

前述したように交差免疫電気泳動によりこのカップリングの通過を分析すること によって、次の事実が偶然に観測された。

それは、使用したかたまりのＣＮＢｒセファロースに適用した過剰物質のために 、および／またはＣＮＢｒ活性化セファロースに対する抗原１のクローニングの 効率がプール中の他の抗原のそれより低いために、抗原１をもっばら含有した。

通過した液体を濃縮し、そして製造業者の手順に従いＣＮＢｒセファロース４Ｂ の２．３ｇ（乾燥重量）にカップリングした。題目：ＧＬＵＲＰに対して向けら れたヒト抗体の親和精製のための融合タンパク質使用二の下に述べた手順および 試薬を使用して、Ｇ　Ｌ　ＩＩ　ＲＰに対して特異性の抗体を精製した。抗体の 特異性をＣＩＥの中間ゲル中で試験した。

ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＯＳ　−ＰＡ ＧＥ） ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡ ＧＥ）によりタンパク質の分析は、バイオラドのプロティン２または３％の積み 重ねゲルおよび７．５％の分離ゲルを使用する不連続のゲル系によるミニ−プロ チアン（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ）　２で実施した。ゲル電気泳動のためのす べての試薬はバイオラドから入手した。典型的には、分析のための５０μｌの体 積の各試料を１／３体積の負荷緩衝液（４％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）　、０．４モルのジチオトレイトール、０．０８モルのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ ７，８、１０％のグリセロール）と混合し、５分間沸騰させ、そして前述のゲル 系の電気泳動により分離した（参考文献：　Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ　Ｋ、　Ｎａｔ ｕｒｅ＋　２２７　：　６８０−６８５；１９７０）。タンパク質をクーマツジ −ブリリアントブルーで可視化した。

ウェスタン・プロット分析 ウェスタン・プロット分析のために、タンパク質を前述のＳＯＳ　−ＰＡＧＥで 最初に分離し、次いでゲルから０．２２ｊｒｍのニトロセルロースのフィルター （シュレイヘル・アンド・シュエル）に電気泳動的に移した。プロッティングは ５　Ｖ　／　ｃｍの場の強さで５時間４°Ｃにおいて実施し、そしてゲルおよび 膜を転移緩衝液の中に沈めた。プロッティング後、ニトロセルロースのフィルタ ーを０．５％のツイーン２０を含有する洗浄緩衝液でブロッキングし、そしてプ ロットを洗浄緩衝液中で適当に希釈した抗原１に対する血清または精製した抗体 とともに１時間インキュベーションした。よく洗浄した（ロキングテーブル上で 洗浄緩衝液とともに１５分間のインキュベーションを３回）後、可視化をｉ：１ ｏｏｏに希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳから入 手したＰ２１４）ブタ抗ヒトＴｇＧを使用して実施し、次いで前述したように洗 浄し、そして次の参考文献に従いペルオキシダーゼで染色した：　Ｈｅｅｇａａ ｄ、Ｎ　ＨＨｅｔ　ａｌ、、イムノプロッティング、一般的の原理および手順、 タンパク質のイムノブロッティングのハンドブック（Ｉｍｍｕｎｏ−ｂｌｏｔｔ ｉｎｇ、Ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｓ、　Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ）＋　ＣＲＣＰｒｅｓｓ＋　フロリダ州ポカ・レイトン、１９８７゜ 交差免疫電気泳動（ＣＩＥ） ＣＩＥはガラス＋Ｉｉ　７　Ｘ　５　ｃｍ＋上でトリスーパルビトールｐＨ８， ６イオン強度０．０２中の１％のアガロースゲル〔リテツクス（Ｌｉｔｅｘ）デ ンマーク国グロストルブ、Ｈ３Ａ型〕中で、１Ｏ−１５Ｖ／ｃｍの第１次元ゲル 中で親和精製した可溶性抗原の２０μｍを、平行のブルーのアルブミンが２．６ 　ｃｒｎ移動してしまうまで、展開することによって実施した。第２次元の電気 泳動は、第１次元のゲルに対して垂直に２Ｖ／ｃｍにおいて１８時間、１２μｍ ／ｃ１ｉの上に定義したリベリアの免疫血清を含有するゲルの中に展開した。プ レートを洗浄し、そして３回プレスし、そしてクーマツジ−ブリリアントブルー Ｒ２５０で染色した。

サポニン処理した寄生体の抗原 寄生体の培養物を２４００Ｘｇにおいて５分間遠心する。細胞の沈澱を５体積の 無菌の０．９％のＮａＣ１中で洗浄し、２４００Ｘ　ｇにおいて５分間遠心し、 そして５体積の無菌の水中の０．０１％のサポニン溶液で室温において１０分間 インキュベーションした。４５００Ｘｇにおいて１０分間遠心した後、サポニン 処理を反復し、そして沈澱を最後に５体積の無菌の等張ＮａＣ１で洗浄し、そし て８００Ｘｇで１０分間遠心した。細胞の沈澱を廃棄し、そして上澄み液をＳＯ Ｓ　−ＰＡＧＥのために使用した。

リンパ球の増殖アッセイ ヘパリン処理した静脈血液をガンビアの丁子−から集めた。

非免疫（対照）試料は、マラリア−免疫ではないことが期待されるユヨーロッパ 人から得た。

リンパ球の増殖アッセイは、従来記載された方法で実施した（Ｒｉｌｅｙ、ＥＭ 　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８８）　ｏ簡単に述べると、単核細胞（ＭＮＣ）を密度 遠心により分離し、そしてツベルクリンの精製したタンパク質誘導体（ＰＰＤ） またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはβ−ガタトシダーゼを含有する対 照緩衝液で刺激した。アッセイを丸底のマイクロタイタープレートで３回実施し 、そして培養物を３日（ＰＨＡ）または７月（ＰＰＤおよび抗原）の間３７°Ｃ において５％のＣＯ２中でインキュベーションした。増殖は３Ｈ−チミジンの組 み込みにより決定した。

〉２．５の刺激指数は陽性の応答を指示すると考えた。

使用した組み換えバクテリアの培養のための材料ＬＢ培地：１０ｇ（７）ＮＺ７ ミ７．５ｇ（７）酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）、５ｇの塩化ナトリウム、２ｇの硫 酸マンガン・７８２０．　ｐＨ７，５に調節し、蒸留水で１リツトルにした。成 分を１２０″Ｃにおいて０．５時間オートクレーブ処理し、次いで無菌のびん中 で４°Ｃにおいて貯蔵した。

寒天を有するＬＢプレート：１０ｇのＮＺアミン、５ｇの酵母エキス（Ｄｉｒｃ ｏ）　、５　ｇの塩化ナトリウム、１５ｇの寒天（Ｄｉｒｃｏ）　、体積を蒸留 水で１０１００Ｏに調節し、そして全体の組成物を１２０°Ｃにおいて０．５時 間オートクレーブ処理し、そしてペトリ皿の中に分配し、プレートに必要に応じ て５０■／１のアンピシリン（ＤＡＫから入手したアンピシリン）をを補充した 。

Ｙ１０９０中のλｇｔｌｌのために使用したＬＢ上部にアガロース：５ｇのＮＺ アミン、２．５ｇの酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　、２．５　ｇの塩化ナトリウム 、蒸留水で５００ｍ１に調節し、各１００ｍ１のびん中の０．３５　ｇのアガロ ース。５０ｍ　ｌの上の溶液を各１０ｍ１のびんの中に注ぎ入れ、そして全体を １２０°Ｃにおいて２０分間オートクレーブ処理した。

ＳＯＳ　−ＰＡＧＥに使用した緩衝液 電極緩衝液：　０．０２５モルのトリス・グリシンｐＨ８，３、０，１％のＳＤ Ｓ。

転移緩衝液：　０．０２５モルのトリス・グリシンｐＨ８，３、２０％のメタノ ール。

ウェスタン・プロットの洗浄緩衝液二０．１モルのトリス・塩化水素ｐＨ７，４ ，０，５％のツイーン２０　、０．５モルの塩化ナトリウム。

免疫吸収カラムに使用した緩衝液 カラムの緩衝液：　０．０２モルのトリス・バルビタールｐＨ８，６゜０．５モ ルの塩化ナトリウム、１５ミリモルのＮａＴｏ。

溶離緩衝液：３モルのチオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）およびトリス・バルビ タール、０．０２モルｐＨ８，５，５，５，ジエチルバルビッル酸（Ｍｅｒｃｋ 、物品２７６）　）リス、トリス（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、Ｔ１２７８）、チオシア ン酸カリウム（Ｍｅｒｃｋ、物品５１２５）　、、トリズマ塩基（Ｓｉｇｍａ　 Ｎｏ、Ｔ１５０３）、ゲル濾過緩衝液：　ＰＢＳ　、ｐ、Ｈ７，４、アジ化ナト リウム＝　ＰＢＳ八。

ス財ｌ汁Ｌ ＧＬｔｌＲＰをコードする゛　云　のクローニング熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆ ａｌｃｉｐａｒｕｍ）の培養は、次の参考文献に記載されているようにして実施 した：Ｊ・ｅｐｓｅｎ、ＳおよびＢＪ　Ａｎｄｅｒｓｓｅｎ（２）およびＴｒａ ｇｅｒ、　ＷおよびＪ　Ｂ　Ｊｅｎｓｅｎ、連続的培養におけるヒトマラリア寄 生体（Ｈｕｍａｎ　１Ｉｌａｌａｒｉａ　ｐａｒａｓｔｔｅｉｎｃｏｎｔｉｎｕ ｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ）、　５ｃｉｅｎｃｅ＋　１９３：　６’７３　６７５ ；　１９７６゜ＤＮＡは、次の手順に従い、赤血球の中に存在するシゾント段階 の寄生体から抽出した： １、赤血球を重力により沈降させた。

２、赤血球を撹拌しないように注意して培地の２／３を除去した。

３、懸濁液を２０００　ｇ　ａｖにおいて５分間遠心し、そして上澄み液を除去 した。

４、細胞の沈澱を沈澱のそれのほぼ５倍の体積の等張生理的塩類溶液中で洗浄し 、そして２０００　ｇ　、ｖにおいて５分間遠心した。

５、沈澱を等張生理的塩類溶液中の０．０１％のサポニンの中に再懸濁し、そし て室温において１０分間インキュベーションした。

６、　３０００ｇ□において１０分間遠心した。

７、沈澱を沈澱のそれのほぼ５倍の体積の等張生理的塩類溶液中の０．０１％の サポニンの中に再懸濁し、そして室温において５分間インキュベーションし、次 いで３０００　ｇ　ｍｖにおいて１０分間遠心した。

８、沈澱を沈澱のそれのほぼ５倍の体積の等張生理的塩類゛溶液中で洗浄し、そ して３０００　ｇ　ｍＶにおいて１０分間遠心した。

９、沈澱を沈澱のそれのほぼ５倍の体積のＤＮＡ緩衝液（１００ミリモルのトリ ス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１％のＳＯＳ　、　５０ミリモルのＥＤＴＡ、　０． ２モルのＮａＣ１）の中に懸濁させた。

１０、　１０分間沸騰させたＲＮアーゼを５０ｇ／ｍｌに添加し、そして懸濁液 を３７℃において１時間インキュベーションした。

１１、プロイテイナーゼＫを１００■／ｍｌに添加し、そして懸濁液を５０℃に おいて１時間インキュベーションした。

１２、フェノールの抽出およびエタノール沈澱を次の参考文献に従い実施した： 　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ　ＦおよびＳａｒａｂ−ｒｏｏ ’に、Ｊ：分子クローニング：実験室のマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ ｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド・スプリ ング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９８２．　ｐｐ、４５８−４５９ および４６１−４６２゜１３、沈澱を適当な体積の１０ミリモルのトリス−ＨＣ ｌ　ｐＨ７，５。

１ミリモルのＥＤＴＡの中に再溶解した。

１４、ＤＮＡの濃度を、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ｏｐ　ｃｉｔ、。

ｐ、４６８に従い、ＯＤよ、。およびＯＤ！、。の測定により推定した。

５ｍｌの１００４のＤＮＡ／ａｌｌの溶液を、２５Ｇｘ１のカニユーレで注射器 の中に入れ、すべては氷上に１時間貯蔵した。ＤＮＡの溶液を注射器の中から外 に急速に押し出してＤＮＡを剪断した。これは、ゲル電気泳動により測定して、 ２０ｋｂｐの平均大きさのＤＮＡ分子を形成させた。フェノールの抽出を前述し たように実施し、そしてＥＤＴＡを２５ミリモルの濃度に添加した。イソプロパ ツールの沈澱を、次の参考文献に従い実施した：　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ ｔｓｃｈ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−。

コールド−ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）、１９８２゜ｐｐ、４６１−４６２　、　ＤＮＡ断片を、マニアチス（ Ｍａｎｉａｔｉ３）ら、ｏｐｃｉｔ、、　ｐ、１１７　１２１に記載されている ように、４つの型のデオキシヌクレオチドの存在下に７４　ＤＮＡポリメラーゼ でフィリリングアウトすることによって平滑末端とした。二ニー・イングランド ・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）がらのＨｃｏＲＩ リンカ−を、マニアチス（ｌｌａｎｉａｔｉｓ）ら、ｏｐ　ｃｉｔ、、　ｐ。

２４３−２４６に記載されているように、ＤＮＡ断片の結合した。

ＥｃｏＲＩリンカ−をもつ生ずるＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ　（ベーリンガー・マ ンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉａ＋）　）で消化し、そして ラムダｇｔｌｌアーム〔プロメガ・バイオラプス（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｌｏ−１ ａｂｓ）　）に結合した。結合はＴ４　ＤＮＡリガーゼ（アマ−ジャム）を使用 して実施した。組み換えラムダのゲノムをパッケージングミックス（プロメガ・ バイオラプス）で製造業者の指示に従いパッケージングした。次いで、ライブラ リーを使用してＹ１０９０を感染し、そして寒天を有するＬＢ培地上で平板培養 した。１００，０００のプラークのニトロセルロースのプロット（ＢＡ８５膜、 シュレイヘル・アンド・シュエル）をマラリアの抗体でスクリーニングして、マ ラリアのタンパク質を発現するクローンを検出しくＹｏｕｎｇ　ＲＡおよびＲＷ 　Ｄａｖｉｓ　：酵母菌ＲＮＡポリメラーゼＴＩ遺伝子：抗体のプローブを使用 する分離（Ｙｅａｓｔ　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｈｇｅｎｅｓ　：　ｌ ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＡｎｔｆｂｏｄｙＰｒｏｂｅｓ）、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２２２：　７７８−７８２：　１９８３　）　、可視化をセイヨウワサ ビペルオキシダーゼに接合したブタ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ　Ｐ ２１４）で実施し、次いでペルオキシダーゼの染色を実施した（　Ｈｅｅｇａａ ｄ、Ｎ　ＨＨおよびＯＪ　Ｂｊｅｒｒｕｍ　：イムノブロッティング、一般原理 および手順、タンパク質のイムノブロッティングのハンドブック（Ｉｍｍｕｎｏ ｂｌｏｔｔｉｎｇ、Ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｒｉｎ−ｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏ ｃｅｄｕｒｅｓ、　：　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｉ＋＋ｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉ ｎｇ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ）、　ＯＪ　ＢｊｅｒｒｕｍおよびＮ　ＨＨＨｅｅ ｇａａｄｌｉ、（：ＲＣＰｒｅｓ５＋フロリダ州ポカレイトン、１９８７　）配 列決定 制限断片の長さのマツピングを実施し、そして便利な光および局在化の断片を、 それぞれ、Ｍ２Ｓ　（Ｍ２Ｓのクローニングおよび配列決定のハンドブック（Ｍ ］、３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ）、 　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ、　１９８４　）　 ＋　ｐ［Ｉ（：９（Ｖｉｅｒａ　ＪおよびＪ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　１ ９　：　２５９−　；　１９８２）およびラムダｇｔｌｌ　（Ｈｕｙｎｈ　Ｔ　 Ｖ、　ＲＡ　ＹｏｕｎｇおよびＲＷ　Ｄａｖｉｓ　ニラムダｇｔｌｏおよびラム ダｇｔｌｌ中のｃＤＮＡライブラリーの構成およびスクリーニング（Ｃｏｎｓｔ ｒｕｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａ−ｒｉｅ ｓ　ｉｎ　ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌＯａｎｄ　ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ）　：　Ｄ 　ＮＡのクローニング：実際のアプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　 ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏ−ａｃｈ）、　Ｖｏｌ、　１　、　Ｄ　Ｍ　Ｇ ｌｏｖｅｒｌｉ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　オックスフォード、１９８５　）から の−末鎖（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ　：　Ｄ　Ｎ　Ａ中のヌクレオチド配列の決定（Ｄ ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　 １ｎＤＮＡ）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４　：　１２０５−１２１０　；　１ ９８１）および二本鎖〔ユナイテッド・ステイソ・バイオケミカルス（Ｕｎｉｔ ｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ）、　Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ　Ｃｏｍ ｍｅｎｔ）＋　１４　：　５　；　１９８８）のＤＮＡを使用して、サンガーの ジデオキシ停止配列決定技術にかけた。インサートの消化をエンドヌクレアーゼ ＩＩＩ　（プロメガからのイレーズ・ア・ベース（Ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ） 、米国〕で実施して、高度に反復性の領域である遺伝子の３′領域の配列決定に 適する長さの断片を産生じた。製造業者の手順は、次の通りであった： リソゲン化 価値があると推定されたプラークをパスツールピペットで取り上げ、３Ｍ培地の 中に入れ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｏｐ　ｃｆｔ、＋ｐ７０）そし て室温において２時間震盪し、次いでファージを培地に遊離した。

リソゲン化に選択したファージのクローン（Φ１５と呼ぶ）を、次の参考文献に 記載されているように、最初に増幅した：Ｈｕｙｎｈ　Ｈｅｔ　ａｌ、、ラムダ ｇｔｌＯおよびラムダｇｔｌｌ中のｃＤＮＡライブラリーの構成およびスクリー ニング（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃＤＮＡ　Ｌ ｉｂｒａｒｉｅｓ　ｉｎ　ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌＯａｎｄ　ｌａｍｂｄａｇｔｌ ｌ）　：　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニング：実際のアプローチ（ＤＮＡ　ＣＣ１ｏ− ｎ１ｎ　：＾ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）、　Ｖｏｌ、１．　Ｄ　 Ｍ　Ｇｌｏｖｅｒｍ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、　１９８５　。＞１０”プラーク形成 単位／ｍｌの力価を有する、増幅したファージのストックをＬｃｏｌｔ　Ｙ１０ ９Ｂの感染に使用して、バクテリアのリソゲンとしてΦ１５を確立した。参考文 献に記載されているようにして調製したＹ１０９８．１０”細胞／ｍｌの１００ μｍの懸濁液を１００μｍ前述のファージのストックと混合し、これを使用して 通常推奨されるより１０３大きい１０’の多重度を得た。上の参考文献のｐ、７ ６における手順をそれ以外は実施した。次いで、１０μｍのこの混合物をＬＢ培 地中でｌ：１０００に希釈し、そして１．１０および１００μｌのこの希釈物を 寒天を有するＬＢ培地に広げた。広げた体積は常に少なくとも１００μｍであっ た。平板を一夜３０°Ｃにおいてインキュベーションした。

平板上のコロニーを温度感受性について２つのＬＢ培地の同一にマークした場所 上に各コロニーからバクテリアを広げることによって試験し、引き続いて平板を 、それぞれ、３０゛Ｃおよ゛び４２°Ｃにおいて配置した。４２°Ｃではなり３ ０°Ｃにおいて増殖するコロニーはリソゲンであると仮定した。

Φ１５リソゲンを使用する融合タンパク質の産生温度感受性のコーティングを、 ５０■／ｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地を含むエルレンマイヤーフラスコ の接種に使用し、そしてこれを−夜３０°Ｃにおいてインキュベーションした。

生ずる培養物をタンパク質の産生の出発培養物として使用した。−夜の培養物を ５０■／ｌのアンピシリンを補充した新鮮なＬＢ培地中で１　／１００に希釈し た。培養物を３０°Ｃにおいて軌道震盪器中で、０．５のＣＤ６゜。に到達する まで、インキュベーションし、そのとき温度は４２°Ｃに突然上昇し、そしてそ の温度に２０分間維持した。次いで、ＩＰＴＧ　（イソプロピルβ−Ｄ−チオガ ラクトビラニシド、シグマ・バイオケミカル・カンパニー（Ｓｔｇｍａ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎいから入手した〕を培養物に１０ミリモルの最 終濃度に添加し、そして増殖を経験により決定して細胞が溶解する瞬間まで（Φ １５について約１時間であった）続けた。

培養物を２７°Ｃにおいて２０００ｇ、ｖｄｅ　ｉｏ分間遠心し、沈澱をＰＢＳ 　（培養物の体積の１　／１０）の中に再懸濁し、３×２０秒間最大の出力（１ ５０ワットＭＳＥウルトラソニック崩壊装置）で超音波処理し、そして−８０° Ｃにおいて凍結した。

リゼイトのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＯＳ 　−ＰＡＧＥ）およびウェスタン・プロッティングによる分析は、材料および方 法に記載するようにしてパイロラド・プロチアン２系により、１：８００に希釈 した非免疫のドナーからの血清および１：２００に希釈した抗原１に対する親和 精製した抗体を使用して実施した、参照第１１図。

異なるマレ−シアの分離物からのＤＮＡの間の比較上に説明した方法においてビ ルマ、タイ、パプアニューギニア、インド、リベリア、セネガル、およびタンザ ニアからのマラリアの分離物から得られたＤＮＡをＢｃｌＩで消化し、そしてサ ザンプロットを実施した。すべての分離物はΦ１５からインサートとハイブリダ イゼーシヨンした。少なくとも２つのバンドが期待された。なぜなら、Φ１５− インサートは内部のＢｃｌＩ部位を含有するからである。４つの場合において、 約１、７　ｋｋｂにおいて第３のバンドが観測され、これは部分的消化のためで あろう。サザンプロットを第１２図に示す。

２旌五久 一ガクトシ゛−ゼの　およびＥＸ２ベクター　のΦ１５インサートのサブクロー ニング Φ１５リソゲンＹ１０９０　Ｅ、ｃｏｌｉからのＤＮＡをマニアチス（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ）ら、（ｐｐ、７９−９４）に記載されている標準の手順に従い調製し た。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から 由来するΦ１５インサートを切除するために、ＤＮＡをアマ−ジャムからの制限 酵素ＥｃｏＲＩで１０単位／ｎ　ＤＮＡを使用して３７゛Ｃにおいて１時間消化 した。１００ミリモルのトリス−ｔｔｃｔｐＨ７，５、５０ミリモルの塩化ナト リウムおよび１０ミリモルの塩化マグネシウムから成る緩衝液を使用した。ＥＭ ＢＯＪ、Ｖｏｌ、３゜１９８４、ｐｐ、１４２９　１４３４．　Ｃ，Ｓ、５ｔａ ｎｌｅｙおよびＪ、Ｐ、Ｌｚｉｏに開示されておりそしてベーリンガーーマンハ イムから購入した発現ベクターｐＥＸ２を、前述したようにＥｃｏＲｌで消化し た。消化したｐＥＸ２を、１５ミリモルのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５、１０ミ リモル２−メルカプトエタノールおよび０．０５％のウシ血清アルブミンから成 る緩衝液中のバクテリアのアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し、そして２ ５°Ｃにおいてインキュベーションした。切除したΦ１５インサートおよび脱リ ン酸化し直線化したｐＥＸ２を混合し、そして４°Ｃにおいてアマ−ジャムから のＴ４ＤＮＡリガーゼと一夜結合した。この構成の本質的特徴は第２図に図解さ れている。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＰＯＰ２１３６中の組み換えｐＥχ２の形質転換組み換えｐＥＸ ２はＥ、ｃｏｌｉ　ＰＯＰ２１３６ニ形質転換した。ＰＯＰ２１３６は次の方法 で構成したλファージの誘導体である：まずＣｌ８５７アルレおよびＰｍプロモ ーターを有するλファージの２．３ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を、下に示すようなポ リリンカーのＢａｍＨＩ部位の中にクローニングした： 陣Ｒ１陰Ｈ１陣ＲＩ 次いで、このようにして得られたＥｃｏＲＩ断片をｐＯＭ４１のＥｃｏＲ１部位 の中にクローニングし、そしてＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００菌株の染色体上に転移し た（Ｍａｌ−Ｔｅｔ”　、　３０℃において選択した；Ｇｅｎｅ、　２９．　ｐ ｐ、２３１　２４１）。最後に、近位のマーカーａｒｏＢとＰｌの同時形質導入 により、この構造体をＭＭ２９４のバックグラウンドＣＰ−ｅｎｄＡ　ｔｈｉ　 ｈｓｄＲ）の中に導入した。

ＰＯＰ２１３６　：向きｍａｌＴ、Ｐ　＊　＋　Ｃｌ８５７＋　ｍａｉＰＱ生ず るＰＯＰ２１３６は、３０°Ｃおよび４０℃の両者の温度において、Ｍａｌ−で あり、そしてλ免疫である。

能力Ｅ、ｃｏｌｆ細胞を調製するために、ハナハン（ｌａｎｎａｈａｎ）方法を 使用した（Ｈａｎｎａｈａｎ＋　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニングの形質転換のための 技術（Ｔｅｃｈｎｉｃｓ　ｆｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ、 ｃｏｌｉ　１ｎＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ）、　Ｖｏｌ、　１、実際のアプローチ （Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｂ）　、第６章、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅ ｒＷ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５　）。

形質転換された細胞をアンピシリンを含むＬＢ平板上で選択し、そしてマニアチ ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、第１章、に記載されているようにプラスミドＤＮＡ の小規模の分離を使用してスクリーニングした。分離したプラスミドを５ｃａＩ 　（アマ−ジャムから）およびＢａｍＨＩ（ベーリンガーーマンハイム）を１時 間消化した。Ｓｃａ　Ｉに使用した緩衝液二６ミリモルのトリス−ＨＣｌ。

１５０ミリモルの塩化ナトリウム、６ミリモルの塩化マグネシウム、６ミリモル の２−メルカプトエタノールのウシ血清アルブミン、１００Ｉ！ｇ／ｍｌ　、　 ｐＨ７，５、３７°Ｃにおいて。ＢａｍＨＩに使用した緩衝液：１０ミリモルの トリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０，７ミリモルの塩化マグネシウム、１００ミリ モルの塩化ナトリウム、２ミリモルの２−メルカプトエタノール、０．０１％の ウシ血清アルブミン、３７°Ｃにおいて。消化物を１％のアガロースゲル上で、 ４時間の分離時間、１００ボルトにおいて分析した。本質的に直線化した組み換 えｐＥＸ２を生じたクローン（ＳｃａｌとＢａｏ＋ＨＩとの間の距離は数百塩基 である）をそれ以上の特性決定めために選択した。３００ｋＤの分子量をもつタ ンパク質を高いレベルで与えそしてウェスタン・プロットにおいてマラリア−免 疫の血清と反応したクローンを、融合タンパク質のそれ以上の発現のために選択 した。

このクローンを１９８８年９月１５日にトイチェ・サムバッグ・フォノ・ミクロ オルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋ−ｒｏ ｏｒｇａｎ′１ｓｍｅｎ）に受け入れ番号４８１５で受託された。

Ｅ、ｃｏｌｔ中のβ−ガタトシダーゼ：：　ＧＬＵＲＰの発現それ以上の発現の ために選択したクローン（０Ｍ５４８１５）を、アンピシリンを補充したＬＢ平 板上で維持し、そして４°Ｃにおいて貯蔵した。より長い期間の貯蔵は、２０％ のグリセロールを補充した一夜の培養物の一８０°Ｃの貯蔵により保証された。

２８℃において増殖しそしてアンピシリンを５０■／ｌに補充した一夜の培養物 を、アンピシリンを５０■／１に補充したＬＢ培地中で１００倍に希釈した。組 み換えバクテリアを２８“Ｃにおいて軌道震’Ｊｌ器上のプレゲル（Ｐｒｅｇｌ ）フラスコ内部、ＯＤ、。０が１．０となるまで、増殖した。温度を４２°Ｃ１ 時間上げ、そしてＯＤ６゜。がほぼ５．０となるまで１．４時間以内の間培養を 続けた。

封入体の精製 次いで、Ｂ、ｃｏｌｉ細胞をソーパル（Ｓｏｒｖａｌ）超速度の遠心機内でＧＳ −ヘッドを５００Ｏｒｐｍ　（２０００ｇ　、ｖ）で室温において使用して１０ 分間遠心することによって収穫した。次いで、沈澱をＴＥＮ（５０ミリモルのト リス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５，０，５ミリモルのＥＤＴＡ　、　１５０ミリモ ルの塩化ナトリウム）中で再懸濁した。

沈澱を１　／１００の体積のＴＥＮの由来の培養物の中に再懸濁し、そして細胞 をフレンチプレス〔アメリカン・インスルメント・カンパニー（Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｌ１ｌｐａｎｙ）、米国マリイランド州〕を １８０００ｐｓ　ｉ圧力において崩壊させた。この材料を４０００ｇ、、、　４ °Ｃにおいて１０分間遠心し、そして上澄み液を廃棄した。沈澱をもとの培養物 の体積の１　／１００に等しい体積のＴＥＮ中で洗浄した。この懸濁液を再び１ ０００　ｇ□、４°Ｃにおいて１０分間遠心した。この手順をさらに２回実施し た。

封入体から成る生ずる沈澱を、５モルのグアニジニウム−ＨＣｌ　、　５０ミリ モルのトリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０，１ミリモルのジチオスレイトール、１ ミリモルのＥＤＴＡから成る変性緩衝液をもとの培養物の体積１　／１００の体 積の中に再懸濁した。この物質を４°Ｃにおいて一夜穏やかに震盪した。可溶性 物質を不溶性物質から遠心：　３６００Ｘ　ｇ　、　１時間により分離した。次 いで、上澄み液をファーマシアから入手したセファクリルＳ３００（９００ｍｍ 　Ｘ　２６ｍｍ０カラム）に通過させた。ゲル濾過を４℃において実施した。セ ファクリル８３００カラムを、１床体積の前述の変性緩衝液と平衡化した。流速 は４０ｍ１／時間のＰＢＳ−緩衝液、ｐＨ７，４であった。分画を集め、そして ５０倍の体積のＰＢＳに対して４　”Ｃにおいて分析について透析した。産生の ために、次のりフォルディングの手順を使用した：実質的な量の融合タンパク質 を含有する分画をプールし、そして５モルの尿素、５０ミリモルのトリス−ＨＣ ｌ　、　ｐＨ７，５および１ミリモルのＤＴＴに対して室温において３時間透析 した。次いで、尿素の濃度を徐々にゼロにほぼ１０時間にわたって低下し、ＤＴ Ｔの濃度を１ミリモルに維持した。ゼロモルの尿素において、ＤＴＴの濃度をゼ ロに低下させ、透析は、例えば、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７， ５に対して、室温においてほぼ２時間であった。この手順の目的は融合タンパク 質を可溶化して保持することであった。この手順は次のことを可能とした：１） タンパク質はその正常の構造にフォルディングする、および２）その内部のジサ ルファイド架橋を再び獲得した。高過ぎる速度の沈澱が観測される場合、この手 順を５モルの尿素、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　、　ｐｕ’７．５および１ ミリモルのＤＴＴ中に溶解したタンパク質を使用して反復した。

ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧ Ｅ）により分画の分析は、バイオラドのミニ−プロチアン２系を使用して材料お よび方法に記載するようにして実施した。合理的な量の融合タンパク質を含有す ることが示された分画をプールした。ウェスタン・プロット分析は、このプール を使用して、材料および方法に記載するようにして実施した。プロットを１：８ ００に希釈したリベリアからの免疫血清とともにインキュベーションした。

ＧＬ（ＪＲＰ：：β−ガタトシダーゼ融合タンパク質のそれ以上の精製は、次の 手順により実施した： 分画コレクターから得られた分画の一部分を、融合タンパク質およびＥ、ｃｏｌ ｉのタンパク質に関してそれらの組成について分析した。主として融合タンパク 質を含有する分画をプールし、そして濃縮した。濃縮の手順は、透析膜のバッグ の内側の融合タンパク質を含有する溶液とそのバッグの外側に付着したＰＥＧ２ ００００との間に浸透勾配を確立することによって実施した。この方法を使用す ると、融合タンパク質は塩酸グアニジニウム、ＤＴＴおよび要求される濃度のｐ Ｈ維持緩衝液から成る緩衝液の中に止まった。こうして、プールの分画の体積は ゲル濾過のカラムへの適用に最適な体積、例えば、１０〜１５ｍ１に減少した。

この手順をさらに１回反復して、融合タンパク質および２７００ｍｍのゲル濾過 に相当するＥ、ｃｏｌｉタンパク質を完全に分離した。ゲル濾過の精製のこの延 長は、ファーマシア−ＬＫＢから入手した５４００ＨＲゲル濾過°マトリツクス で実施した。この型のマトリックスは、前に述べた５３００よりすぐれた分離の 特性を与えそしてよりすぐれた流れの性質を有した（参照、第１３図および第１ ４図）６種々の分画中の融合タンパク質の含量の定量のために、ウサギ抗融合タ ンパク質抗体で融合タンパク質を捕獲する原理に基づ＜ＥＬＩＳＡ（酵素結合免 疫吸収アッセイ）を使用し、そしてマウス抗融合タンパク質またはモノクローナ ルマウス抗β−ガタトシダーゼ抗体またはヒト血清を使用する検出を使用した。

融合タンパク、質（上に概説したようにリフオルディングした）のそれ以上の精 製は、次のようにして実施した：ファーマシアから入手したＣＮＢｒセファロー ス４Ｂにカップリングしたマウスモノクローナル抗β−ガタトシダーゼ抗体のカ ラムを使用する。使用した抗体は、ハイブリドーマの上澄み液から、プロティン Ａおよび／または融合タンパク質のカラムを使用して精製し、そして製造業者の 手順に従い臭化シアン活性化゛セファロースにカップリングする。ゲル濾過から プールした分画をカラムに適用する：融合タンパク質の物質はカラムの合計の結 合容量を越えない。これは抗β−ガタトシダーゼ抗体を利用するＥＬＩＳＡで通 過を検査することによって監視する。

次いで、カラムを３床体積のカラムの緩衝液で洗浄し、そしてＮａＣ１を含まな いカラムの緩衝液中の３モルのチオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）を使用して溶 離する。集めた分画をＰＢＳに対して透析し、そしてβ−ガクトシダーゼの検出 のためにＥＬＩＳＡを使用して分析する。はぼ２■／ｍｌの濃度は、アミコンの ダイアフローコンセントレイターの細胞中で実施した。

Ｅ、ｃｏｌｉからのりボサッカリドを除去するために、この物質をポリミキシン Ｂカラムを通過させ、そしてリムルス・アメボサイト（ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏ ｅｂｏｃｙｔ）　リゼイトのアッセイの使用によりエンドトキシン活性について 検査する。

融合タンパク質の調製物の純度の推定に使用した方法精製の間に、次の技術を融 合タンパク質の調製物の純度の監視に使用した：クロマトグラフィーの手順の連 続的紫外線の監視、溶離液の選択した分画のＳＯ５−ＰＡＧＥ、および検査の目 的に適当な抗体、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ−タンパク質に関する純度の推定するた めの抗Ｅ、ｃｏｌｉ抗体と反応した分離したタンパク質のイムノブロッティング 。

前述の精製手順の開発の間に、収穫した細胞の異なる調製物からの溶離液により 産生された紫外線吸収プロフィルに関して、かなりの経験が得られた。フレンチ プレス中でプロセシングされる全細胞の可溶性分画をゲル濾過カラムに適用する と、むしろ広い延長し吸収が生じた、参照、第１３図Ａ、前述の封入体の原理に 従いプロセシングされるプロセシングされた細胞の調製物を適用するとき、明瞭 な差が観測された。

封入体を使用するとき、ボイド体積の直後、ピークが現れた、第１３図Ｂ、この ピークを集め、濃縮しそして再循環すると、紫外線吸収のプロフィルのそれ以上 の鋭敏化は認められた、第１３図Ｃ０これは第２の再循環後なおいっそう顕著で あった（合計２７００ｍｍのゲル濾過）、第１３図Ｃ０ピークの純度は５ＯＳ− ＰＡＧＥにより連続的に監視した。これを引き続いてクーマツシーブルーにより 染色した。この染色方法はゲルの中に存在するタンパク質の定量的着色を与えた 、第１４図。クーマツシーブルーにより染色したゲルを読む偏見のない方法は、 ゲルのデンシトメトリーの走査および引き続くゲルの合計の染色に融合タンパク 質を表すバンドの染色を関係づけることであろう、ゲルの定量的評価のために、 銀染色を適用することができる。

ゲルが無傷の融合タンパク質の分子量と異なる分子量のタンパク質を示す場合で さえ、これは調製物の純度を無効にしないであろう。なぜなら、これらのバンド は無傷のタンパク質から由来する分解産生物を表しうるからである。これは、例 えば、免疫血清またはウサギ抗タンパク質抗体と反応したイムノプロッティング において分析することができる。分解は６力月以上の間のタンパク質調製物、こ とに希釈した調製物の貯蔵の間に観測される。

前述の方法により、融合タンパク質の実質的な純度が実証された。

災癒拠主 人タンパク　およびマラリア寄生　からの　然タンパク夏Ｕ但比ｑ分捉 Ｅ、ｃｏｌｉから産生された融合タンパク質、Ｇｌ、ＵＲＰと熱帯熱マラリア原 虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの自然ＧＬＵＲＰとの類似性を推定する ために、競合アッセイを実施した。このアッセイは２つの相で実施した： １）ヒトマラリア−免疫の血清がＥＬＩＳＡのウェルにおいて融合タンパク質の コーティングと反応した、吸収相、２）抗融合タンパク質抗体が欠乏した、第１ 相からの液体の相をＥＬＩＳＡのウェルに移し、ここで培養物の上澄み液からの 自然タンパク質をウサギ抗融合タンパク質の抗体上の残留抗体に提示した。

２つの対照をこの研究に含めた： 第１は液相のウェルへの移送であり、ここでウサギ抗融合タンパク質抗体のコー ティングは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌ−ｃｉｐａｒｕｍ）の生体外培養物 からの上澄み液に暴露しないが、生体外培養のために使用した培地に暴露した。

それは、それが熱帯熱マラリア原虫（ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原を含有す るという事実を除外して上澄み液と同一の組成をもつ物質である。この対照は、 はとんどすべてのヒト血清の試料における抗つサギＩｇＧ抗体の含量のために、 非常に高いバックグラウンドを確立する。

他方の対照は、ベーリンガーーマンハイムから入手したβ−ガタトシダーゼの第 １相の吸収ＥＬＩＳＡウェルのコーティングであった。β−ガタトシダーゼは融 合タンパク質の非マラリア部分である。この対照は、抗体および融合タンパク質 の非マラリア部分の非特異的相互作用の可能性、あるいはＥＬＩＳＡのウェル中 のタンパク質および血清中の抗体の非特異的相互作用の可能性を除外する。

抗融合タンパク質抗体の吸収のために使用したｆＥＬＩｓＡプレートをコーティ ングするために、１■／ｍｌのタンパク質濃度をもつ融合タンパク質の調製物を 使用した。ウェルへの通用した融合タンパク質の量は、６．２５Ａｒ〜７００ｐ ｇの範囲であった。

すべての実験は二重反復試験において実施した。融合タンパク質でコーティング しないが、ブロッキング緩衝液でブロッキングしたウェルを、融合タンパク質の 無制限希釈の試料として使用した。希釈は炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中で実施し、 そしてコーティングおよびブロッキングは標準の手順に従い実施した。希釈緩衝 液中で１：２０００に希釈したヒトマラリア−免疫の血清（ＩＳ１４９）の吸収 は、震盪テーブル上で室温において２時間実施した。１１０μｌの体積の免疫血 清を各ウェルに適用した。吸収後、ウサギ抗融合タンパク質抗体へ提示された自 然マラリア抗原を含有するウェルに、１００μｌの体積をピペットで入れた。こ れらのウェルは、抗原検出ＥＬＩＳＡを記載する節において正確に記載されるよ うにして調製した。吸収したヒト血清は天然タンパク質を１時間で反応した。ヒ ト抗体の存在は、１：１０００に希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧ　（ＤＡＫＯＦＡ ＴＴＳＰ２’１４）で検出した。可視化は標準の手順に従い着色基質を使用して 実施した。光学密度を４９０ニトロセルロース膜において測定した。所定量の融 合タンパク質により発揮される阻害％は、ウサギ抗ＧＬＵＲＰ抗体上に提示され た培養物のコーティングについて得られた光学密度を、同−抗体上に提示された 培養物の上澄み液のコーティングについて得られた光学密度から減じ、そして前 述の抗体上に提示された培養物の上澄み液のコーティングと反応する前述の希釈 の非吸収のヒト免疫血清を使用して得られた最大光学密度値とウサギ抗ＧＬＵＲ Ｐ抗体上に提示された培地のコーティングおよび非吸収のヒト免疫血清の反応に より得られた光学密度値との間の差で割ることによって計算した。すなわち、所 定の吸収（Ｚ）による阻害％（Ｐ）は、下に示すように計算される。

Ｐ＝［光学密度（Ｚ、培養物の上澄み液）−光学密度（Ｚ、培地）］／〔光学密 度（非吸収、培養物の上澄み液）−光学密度（非吸収、培地）〕 この実験が示すように、吸収ウェルのコーティングのために使用した融合タンパ ク質が高い希釈であってさえ、ヒトマラリア−免疫の血清と自然タンパク質との 反応について明瞭な阻害作用が認められた。使用した融合タンパク質の量に相当 する量のβ−ガタトシダーゼでコーティングした吸収ウェルは、自然タンパク質 へのヒト抗体の結合にまったく影響を与えなかった。自然抗原へのヒト抗体の結 合の最大の阻害はほぼ９２％であった。この結果が示すように、Ｅ、ｃｏｌｉ中 で産生されそして前述したように復元されたタンパク質、熱帯熱マラリア原虫（ Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）により産生された自然タンパク質が有するエピト ープの９２％を含有する、第１５図。

実施■土 熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対して向けられた抗体を 検出するためのＥＬＩＳＡにおける抗原として融合タンパク質を使用すること ＰＢＳ　、　ｐＨ７，４の中に２■／＋＋＋１を含有する溶液からの融合タンパ ク質を、ＥＬＩＳＡプレートのコーティングのために、０．１６ｎ／ウエルの量 で１００μｌの体積の炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中で使用した。プレートを加湿 したチャンバー内で４°Ｃにおいて一夜放置した。（ＥＬＩＳＡプレートのコー ティングあ、別法で、加湿チャンバー内で室温において軌道震盪器上で２時間イ ンキュベーションすることによって実施することができる。）洗浄はテクヌンク ・イムノウオッシャ−（Ｔｅｃｈｎｕｎｃ　ｆｎ＋ｕｎｏ−ｗａｓｈｅｒ）　１ ２で洗浄緩衝液を使用して実施した。各ウェルは緩衝液で４回フラッディングし た。洗浄後、プレートを空にし、そして１００μｌ保存緩衝液を各ウェルに適用 した。ここでＥＬＩＳＡプレートを少なくとも２力月間４°Ｃにおいて貯蔵する ことができる。１）オランダ人のドナーの対照群（多分マラリアに決して暴露さ れていない）、２）リベリア人のドナー（多分マラリア暴露された）、３））キ ンプラズマ症と診断されたオランダ人の患者、および４）住血吸虫症（＝ビルハ ルツ住血吸虫症）と診断されたオランダ人の患者からの試験すべき試料を、希釈 緩衝液中で１：２００に希釈し、そして１００μｌを各ウェルに適用した。各試 料を２つのウェル中で試験した。次いで、プレートを室温において軌道震盪器上 に１時間配置した。洗浄を前述したように実施し、そしてＥＬＩＳＡプレート中 のすべての流体を除去した。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合し たウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤａｋｏｐａｔｔｓＰ２１４希釈１　：　１０，０００ ）を、ウェルに１００μｍの体積で適用した。（ヒト以外の種における抗体の検 出のために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗体を問題の種のＩｇＧに対 して向ける。）プレートを室温において１時間軌道震盪器上でインキュベーショ ンし、次いで洗浄し、そして前述したように空にした。着色緩衝液をウェルから 除去し、そして１００μｌの着色基質を各ウェルに適用し、次いで２０〜３０分 間インキュベーションした。各ウェルに１５０μｌの１モルの硫酸を適用するこ とによって、着色のプロセスを停止した。４９０ナノメートルにおける光学密度 をタイターチクＥＬＩＳへリーダーで測定し、そして結果を第６図に示す。正の 読みと負の読みとの間の比は約１５であり、これは非常に満足すべきものである 。

９３人のオランダ人のドナーの平均はほぼ０．０６７吸収単位であり、標準偏差 は０．０５７であった。マラリア−免疫の患者についての典型的な値は１．５以 上であった。アフリカ人のドナーから得られたマイナスの結果は交差免疫電気泳 動の使用による血清の分析により評価した。こうして、９５％以下の値を与える リベリア人の群はＣＩＨにおいてＧＬＵＲＰと解釈される沈澱をもたなかった。

これらの患者は、製剤学的予防またはマラリアの伝播がない生存場所、すなわち 、リベリアの首部のために、マラリアをもたなかった。

融合タンパク質に対する抗体の検出は、時には、その種が抗体をもたない抗体に 対する種において実施しなくてはならない。これは、例えば、実施例１２Ｃに述 べたサルにおいて実施した免疫化実験の場合であった。この障害は最初に競合Ｅ ＬＩＳＡの原理を使用して回避された。後に、ウサギ抗サル血清抗体を利用する ことができた。このアッセイにおいて、通常の量で融合タンパク質でコーティン グしたＢＬＩＳＡプレートを使用した。１：５〜１：６４０の変化する希釈でサ ルの抗体を、前述のＥＬＩＳＡプレートのウェルの中に５０μｌ／ウエルの体積 で入れた。サルの抗体をウェル中で１５〜３０分間単独でインキュベーションし 、次いで５０μｌのヒト免疫血清を適用した。ヒト免疫血清の希釈は、力価の曲 線の直線部分上でヒト抗体が乗るように選択して、融合タンパク質のコーティン グに結合した抗体の量の変動を最大にした。ヒト血清の添加後、インキュベーシ ョンを１時間延長した。ヒト免疫グロブリンの結合は、１　：　１０００に希釈 したウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体（Ｐ２１４）により検出した。可視化は上 のようにして実施した。

ＧＬＵＲＰの定量 ヒトまたは動物の血清または分泌物、ことに尿中のＧＬＬＩＲＰの測定は、ＥＬ ＩＳＡ技術を使用するか、あるいは競合ＥＬＩＳＡ　ｎ。

原理を使用することによって実施することができる。可能ならば１工程の手順で 血清または尿について実施される、競合ＥＬＩＳＡの原理に基づく診断道具は、 本発明の価値ある実施態様である。ＧＬＵＲＰの定量は実施例５〜７において例 示する。

ス】１１足 ＧＬＵＲＰ　’片１３ＥＬＩＳＡ マラリア抗原は、ＥＬＩＳＡの次の構成を使用して熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　 ｆａｌｃｉｐａｒｕｓ＋）の生体外培養物からの培養上澄み液中で検出した。ウ サギ抗融合タンパク質抗体を、実施例１２Ａに記載するように免疫化したウサギ から精製した。抗体の精製は、次の参考文献の手順に従った：　Ｈａｒｂｅ＋Ｎ −およびＩｎｇｉｌｄ。

Ａ、、免疫化、免疫グロブリンの分離および抗力価の推定（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔ ｉｏｎ＋　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｏ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　ａ ｎｄ　ｅｓｔｉｍａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｒｅ）、　５ ｃａｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２．５ｕｐｐ１．１　：　１６１゜１９７３゜抗 体の感受性および消費の間の合理的妥協として、各ウェルへの１．２　ｔｒｇの ＩｇＧの適用に相当する１：３２０の抗体ストックの希釈を使用した。抗体は炭 酸塩緩衝液ｐＨ９，６中で希釈したウェルに適用した。コーティングは室温にお いて２時間実施するか、あるいは４°Ｃにおいて一夜実施した。プレートを４回 洗浄し、空にし、そして１００μｌのブロッキング緩衝液を添加し、そして室温 において少なくとも１時間インキュベーションした。ＧＬＵＲＰについて分析す べき検体を希釈緩衝液中で希釈し、そして１００μｌの体積でウェルに適用した 。

すべての測定は二重反復試験において実施した。試験物質として、１：５〜１： ２８１６に希釈した生体外のマラリアの培養からの上澄み液を使用した。熱帯熱 マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉ−ｐａｒｕｍ）の生体外培養のために培地は陰性 の対照として働いた。

抗原をウェル中で少なくとも２時間、好ましくは一夜インキユベーションした。

ウェルの底にコーティングしたウサギ抗体へのＧＬｔｌＲＰの結合の検出は、ヒ ト抗熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗体を使用するか、ある いはマウス抗融合タンパク質抗体を使用することによって実施した（参照、実施 例１２Ｂ）。ヒト抗体は１：２００〜１：２０００の希釈で使用した。

この目的で適用した抗体は、震盪テーブル上で室温において１時間インキュベー ションした。マウス抗融合タンパク質の希釈は１：５００〜１：１０００であっ た。ＧＬＵＲＰへのヒト抗体の結合は、１：１０００に希釈したウサギ抗ヒトＩ ｇＧ　（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳＰ２１４）で検出した。マウス抗体の結合は、ペル オキシダーゼに接合したウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ　Ｐ２６０ ）を使用して検出した。

ＧＬＵＲＰ　ＥＬＩＳＡの感受性を試験しかつＧＬＵＲＰを定量するその能力を 推定するために、既知の寄生窒息症を使用する生体外熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、 　ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｎ）　（Ｆ”）培養からの培養上澄み液を検体として使 用した。寄生窒息症は４％〜２０％の範囲であった。ヘマトクリットは絶えず６ ％であった、参照、第１６図。

前述の実験の結論は次の通りであった：　ＧＬＵＲＰとヒト抗体との結合は、検 体中のヒトＩｇＧの含量が低いか、あるいはゼロであるとき、満足すべきもので あるが、バックグラウンドは、試験する検体が、例えば、ヒト免疫血清であると き、より高いレベルに上昇する。マウス抗融合タンパク質抗体は、試験する検体 がヒト血清である場合でさえ、満足に機能する。

これはマラリア抗原を含有しないことが推定されたオランダ人のドナーの血清を 使用して試験した。これらの検体は０．１〜０．２の光学密度の読みを有した。

Ｆ３２タンザニア人の分離物からの培養と澄み液で実証した実験において、１： ２８１６の希釈においてさえ、はぼ４のシグナル対ノイズ比が存在することが示 された。この検出法はブラジル人およびホンジュラス人の分離物について有用で あり、そして抗体はインドシナ人、インド人およびリベリア人からの分離物から のタンパク質を認識する。したがって、抗原の存在を診断するこの方法は地理学 的制限がないと推定される。

前述のＥＬＩＳＡは、融合タンパク質の種々のバッチの中のタンパク質の含量と β−ガタトシダーゼの標準の含量との比較に使用した。これは異なるバッチの含 量を推定するために実施した。この目的で、検出する抗体はモノクローナル抗β −ガクトシダーゼ抗体〔ハイブリドーマ・ラボラトリ−（）ｌｙｂｒｉ−ｄｏｍ ａ　Ｌｉｂｒａｔｏｒｙ）　ＳＳＩ＋　Ｍｇａ１８）であった。

血液、血清または尿の中のＧＬＵＲＰの検出に使用したＧＬＵＲＰ検出ＥＬＩＳ Ａの感度は、捕捉層および検出層の両者において親和精製した抗体の使用により さらに増加することができる。

これらの層の一方または双方はモノクローナル抗体から成ることができる。さら に、これらの層はＦａｂ断片に酵素的にプロセシングされた抗体から構成するこ とができる。さらに、検出抗体はのために原理に直接認識することができる、す なわち、ビオチル化し、ペルオキシダーゼに接合し、アルカリ性ホスファターゼ に接合し、ユウロピウムなどに接合することができる。

実ＩＬ団 並金銭ＩＳＡ　Ｌで　、の゛、ｌ テクヌンク（Ｔｅｃｈｎｕｎｃ）からのＥＬＩＳＡプレートＮｏ、　４−３９４ ５のウェルの各々を、炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６で１賄〜１ｎｇ／＋＋１に希釈し た１００μｍの融合タンパク質でコーティングした。プレートを加湿したチャン バー内で４°Ｃにおいて一夜放置した。

ＥＬＩＳＡプレートのコーティングは、別法で、加湿チャンバー内で軌道震盪器 上で室温において２時間インキュベーションすることによって実施することがで きる。

生体外の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｔ＋１１１）からの５０ μｍの上澄み液を、１：１６００〜１　：　１２８００の希釈でウサギ抗融合抗 体を含有する等しい体積の希釈緩衝液と混合した。この混合物をウェルの中に入 れ、そして軌道震盪器上で室温において１時間インキュベーションした。陰性の 試験検体として、生体外の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）培 養に使用した培地は培養上澄み液の希釈に相当する希釈で使用した。あるいは、 抗体および検体の混合物をウェルへの適用前に１５〜６０分間インキュベーショ ンする。これは通常感度を１０倍増加する。洗浄は上のようにして実施した。ペ ルオキシダーゼに接合したブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ　Ｐ２１７） を１：１０００の希釈で使用し、ロッキングプラットフォーム上で室温において １時間インキュベーションした。プレートを前述したように洗浄した。１００μ ｌの着色緩衝液を各ウェルに１分間適用し、次いで除去し、そして１００μｍ０ 着色基質をウェルに適用した。着色反応を２０〜３０分間続けさせ、次いで１５ ０μｌの１モルの硫酸で停止した。４９０ナノメートルにおける光学密度をＥＬ ＩＳＡリーダーで測定した。

競合原理の主要な利点は、それを実施することができる速度である。一般に、培 養上澄み液中のＧＬＵＲＰの存在についての検出限界は１：１０〜１：１００の 希釈であった。一般に、ある程度までのウサギの低い濃度は、固相における融合 タンパク質の低い量と同様に怒度を増加した。

競合ＥＬＩＳＡの別の設計は、前述したように、抗体（融合タンパク質を使用す る免疫化によりいずれかの種または細胞系から得られた）でＥＬＩＳＡプレート をコーティングすることである。炭酸塩緩衝液中の０．００４ｇ／ｍｌ〜４００ ｇ／ｌｌ１ｌの抗体濃度を使用する。５０μｌの試料を５０μｍの希釈緩衝液中 の融合タンパク質の希釈物と混合する。１系列の連続的希釈物を使用し、希釈は 希釈緩衝液中の１■／ｍｌ〜ｌｐｇ／ｍｌの範囲であるか、あるいは試料の型を 考慮して適当であることが発見された他の希釈の範囲である。

ウェル中の抗体に結合した融合タンパク質の可視化は、ここに記載するように、 蛍光性分子または基質ハイブリダイゼーションすることができる酵素で標識した 融合タンパク質を使用し、これにより所定の波長または他の原理で基質の吸収を 変化させるすることによって実施することができる。あるいは、融合タンパク質 のβ−ガクトシダーゼ部分に対して向けられた抗体は、それ自体標識されたβ− ガクトシダーゼ抗体を使用するか、あるいは次の層中の標識成分に接合したβ− ガクトシダーゼ抗体に対して特異性の他の抗体を使用するとによって、融合タン パク質の存在を検出するために使用することができる。

災施拠旦 尿の　査による　の　の　マラリア、　（Ｐ、ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍ）■牟在皇 検良 臨床的観察が示すように、タンパク質および他の物質の血流から尿への排出の増 加はマラリアに悩む患者において非常に共通の現象である。これにより、尿はマ ラリア寄生体から誘導されかつそれに対して特異性の成分、すなわち、タンパク 質、ＤＮＡ、　ＲＮＡ、脂質などの有用な源である。

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋）に対して特異性の調製の検 出は、実施例５および６に記載するようにして実施することができる。好ましく は、検出はＧＬＵＲＰに対する抗体でコーティングした膜に尿の試料を通過させ 、これによりＧＬＵＲＰを捕捉し、引き続いて可視化因子、すなわち、アルカリ 性ホスファターゼに接合した抗体により適当な基質を使用してＧＬＵＲＰの存在 を検出することによって簡素化することができる。

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｆｐａｒｕｍ）に対して特異性のＤＮＡの検 出は、実施例９に記載するようにして実施することができる。

これらの方法の診断の能力の評価は、現在、ガンビアにおいてＭＲＣリサーチ・ ステーションと共同して実施されている。急性マラリアに悩まされる個体からの 尿を集め、アジ化ナトリウムで保存し、そしてわれわれの実験室への輸送前に一 ２０°Ｃにおいて凍結された。

尿中のＧＬＵＲＰの存在を検出するアッセイの別の設計は、粒子、例えば、ラテ ックス粒子をＧＬＵＲＰに対する抗体（融合タンパク質を使用する免疫化により 任意の種または細胞系から得られた）でコーティングすることである。次いで、 これらの粒子を、必要に応じて緩衝液中の、ある体積の尿試料の中に懸濁する。

Ｘ廉佐工 ＥＬＩＳＡプレートのコーティングのために使用すう抗原の量の決定 ＥＬＩＳＡプレートのコーティングのために使用すう抗原の量の決定目的で研究 を実施した。２■／ｍｌの濃度の融合タンパク質の水溶液の１０ｎｇ／ウェル（ ０，５μｍ／ウェルに相当する）で出発するタンパク質の減少する量で、ＥＬＴ ＳＡプレートをコーティングした。抗原を炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中で希釈した 。

連続的２倍希釈物をＥＬＩＳＡプレートに適用した。５つの血清をこの実験に使 用した。リベリア人からの免疫血清、前に高い光学密度を与える免疫血清のプー ル、非常に低い光学密度を与えることが知られているドナーからの３つの血清お よび中程度の光学密度の反応を与える２つ、しかしそれらはマラリア抗原に対す る既知の暴露をもたなかった。これらの２つの血清は、すべての血清学の試験に おいて発生ずることが知られている血清を表した、偽性の陽性。実験において、 真の陽性の血清についての光学密度は抗原の量１２．５ｎｇ　（０，０６２５μ ｌ）で最大に増加したが、陰性の対照および既知の暴露をもたない偽性の陽性の ドナーは使用した抗原の量のすべての希釈で光学密度測定において減少した。実 験の結論は、非特異的バックグラウンドを陽性の反応を変化させないで少なくと も２倍に減少できるということである。

尖施拠主 ＤＮＡのハイブリダイゼーション技術を使用して熱帯熱マラリア原虫（Ｐ１ａｓ ｍｏｄｉｕｏ＋　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の感染の診断１〜５ｍｌの血液試料を 検査すべき個体または動物から得る。

血液細胞を沈降さセ、そして細胞を溶解した。

参考文献に記載されているように（Ｓａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０゜ ｐｐ、１３５０−１３５４．１９８５または米国特許第４．６８３，２０２号） ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅を実施するために、次の物質を使用した ：　ＧＬＵＲＰをエンコードするＤＮＡの５−プライム領域に対する相補的な１ ヌクレオチドのプローブ（例えば、２０〜４５マー）または他のＤＮＡ鎖上の第 １の述べたプローブに対して３−プライムのほぼ１５００塩基の領域に対して相 補的な他のヌクレオチドのプローブ（例えば、２０〜４５マー）、増幅はＴａｑ ポリメラーゼを使用して２０〜６０サイクルで実施する。

第１実験において、プライマーの組ＡＣ、ＡＤおよびＢＤを試験し、ここで： Ａ　＝　５　’　−ＡＡＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡ八−３′ Ｂ−５′　〜−＾ＴＡＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴ−３’ Ｃ＝　５　’　−ＴＧＡＴＧＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴ ＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴ　−３’Ｄ　＝　５　’　−ＣＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＣ ＣＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＴＴＡＣＡＡＣ−３’５×１０−１７モルの精製した 染色体Ｆ３□−ＤＮＡを使用して３つのテライマーの組による増幅は、はぼ期待 する大きさの断片を産生した：へＣ＝１１７２ｂｐ　、　ＡＤ＝１６５６ｂｐ　 、　ＢＤ＝１０８ｂｐ　、使用した同腹サイクルは９４℃において１分間でＤＮ Ａを変性し、６５°Ｃにおいて２分間でプライマーをアニーリングし、そして７ ２℃において８分間でポリメラーゼ反応を進行させ、３５回反復した。増幅の産 生物はアガロースゲルの電気泳動後ＤＮＡの大きさを計算することによってチェ ックし、ＫｐｎＩによる増幅の制限酵素の消化後の断片の大きさを計算すること によってＡＤ産生物をチェックした。

増幅物はＤＮＡをドツトプロットまたはサザンプロットのようにニトロセルロー ス膜に移し、そしてｇｌｕｒｐから誘導した適当な産生物を使用してハイブリダ イゼーションを実施した。ハイブリダイゼーションの発生を視的に検出するため に、放射線標識したプローブ、蛍光性分子で標識したプローブあるいは基質を加 水分解することができる酵素（ここで前記基質の加水分解は所定の波長の輻射に ついて吸収の変化により明らかとなる）、例えば、セイヨウワサビペルオキシダ ーゼにカップリングしたプローブを使用することができる。可視化は中間の工程 を使用して増幅することができ、ここで中間の工程は、例えば、次のプローブを 包含する：酵素または蛍光性分子と接合したアビジンまたはストレプトアビジン と反応するビオチニル化プローブ；あるいは３．酵素または蛍光性分子と接合し た化学的修飾に対して直接向けられた抗体と反応する化学的に修飾したプローブ 。次いで、可視化は適当な系、すなわち、ペルオキシダーゼの染色および吸収の 測定、光の放射の測定などで実施する。

療法的応用 実籏■測。

ＧＬＵＲＰのエピトープの゛ ここに記載するように、ＧＬＵＲＰのアミノ酸配列から誘導されたペプチドまた はタンパク質は免疫化の目的で使用することができると考えられる。これらのペ プチドまたはタンパク質は、次のもの中の産生されたアミノ酸配列の断片または 転位体であることができる：熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆ　ａ　１　ｃ　ｔｐ ａｒｕｍ）中で、あるいは酵母菌、哺乳動物の細胞培養物中で、あるいは他の有 機体、例えば、融合タンパク質としてＥ、ｃｏｌｉ中で、遺伝子産生物としてＥ 、ｃｏｌｉまたは他の生物中で、例えば、ベクター（ＮｇａｉおよびＴｈｏｇｅ ｒｓｅ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ。

１５３、第２９章、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｉｎｃ、、　１９８７） を使用するか、あるいは免疫化すべき動物への遺伝子の転移に有用でありそして 転移後、動物にマラリアの寄生体に対する免疫性を与えるような方法で遺伝子産 生物を発現することができる、ベクター、例えば、ワタシニアの中に挿入された 任意の配置において遺伝子または遺伝子の成分を使用する。さらに詳しくは、分 子のほとんどの免疫原性領域を使用することが考えられ、ここでこの領域は互い にまたはワクチンの別の成分としてよ（特徴づけられていて、Ｂ−リンパ球およ びＴ−リンパ球の両者との反応性を確実にし、これにより動物を免疫化し、そし てマラリアの寄生体に対する免疫系の既往反応の応答を保証する。

ａ）Ｂ−リンパ球のエピトープ ＧＬＵＲＰの分子中のＢ−リンパ球のエピトープを局在化するために、次の４つ のアプローチが考えられる：（１）ホップおよびウッズの分析、レウイットの分 析またはサーフアセプロット（Ｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔｏ）（Ｓｙｒｒｔｈｅｔ ｉｃ　ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）のようなコンピュータープ ログラムを使用して、ＧＬＵＩ？Ｐの配列の抗原性を評価すること、（２）エラ ーゼーアーベイス系を使用して欠失突然変異を産生ずること、 （３）遺伝子を不規則的に剪断しそして発現ベクター中で断片をクローニングす ることによって、遺伝子のライブラリーを産生ずること、 （４）予測したエピトープの合成ペプチド、例えば、ここに記載するようにして 、産生ずること。

アプローチ（２）および（３）はコンフォメーションのエピトープのあるものを 保存することができるが、あるものは破壊が避けられないであろう。これらのク ローンからの遺伝子産生物をＥＬＩＳＡにおいて免疫血清に対して試験して、Ｇ ＬＵＲＰのどの領域が抗原−抗体の認識のために最も重要であるかを決定する。

免疫学的に重要な領域をエンコードする遺伝子断片を配列決定して、それらをヌ クレオチド配列に関係付け、これによりアミノ酸配列に関係付ける。

ｂ）Ｔ−リンパ球のエピトープ １、　コンピューターのアルゴリズムにより予測Ｔ−リンパ球のエピトープを決 定するために、ＧＬＵＲＰをエンコードする遺伝子をＡ？ＩＰ旧プログラムで分 析した（Ｍａｒｇａｌｉｔｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８．　ｐ ｐ、２２１３−２２３９．１９８７）　、この分析に従い、潜在的ヘルパーＴ細 胞のエピトープはつぎ配列（これらはまた上に示した）であった、アミノ酸残基 は括弧内である： （１７９−１８６）　Ｖａｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｈｉ ｓ−Ｖａｌ　；（１６２１７１）　Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ；（１９４２１０）　Ｔｈｒ−３ｅｒ −Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−旧５−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ− ３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ；（２２３−２３０）　Ｌｙ ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ；（３３３３４ ３）　Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌ ｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ；（６００−６１３）　Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ｇｉｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ −Ｓｅｒ； （６９０６９６）　Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−１、ｙｓ−Ｈｔｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｉ ｎ；（７３９−７７４）　ＩＳＴＫＫＦＫＫＶＳＱＴＩＶＳＶＭＩＮＡＹＤＧＶ ＩＱＶＶＳＴＩＫＧｉＡＫ。

これらの配列のすべては、アンフィバティックアルファらせんの二次構造を有す るための可能性を有する。

２、　リンパ球の増殖の研究 ガンビアのマラリア風土病の地域に生活する合計２０２人の個体を、融合タンパ ク質によるリンパ球の増殖の誘発について試験した。

これまで、試験した個体の年令および刺激指数の対数のみを利用することができ た。増殖アッセイの評価に関係する研究の個体に関する他の変数を集めたが、分 析値はなお最終的に分析されない。予備的結論は、タンパク質がマラリア風土病 の地域におけるある個体を事実刺激するということである。

この研究のより詳細な解釈は後に可能となるであろう。

タンパク質をより詳細に分析するために、次の実験を実施した。

エピトープを主要な領域においてｇｌｕｒｐの下位断片のクローニングおよび発 現を使用してサーチした。塩基９８１−１９３５からなる５ａｕ３ＡＩ−Ｋｐｎ ｌ断片をｐＵｃ１９−ベクターの中にクローニングした。生ずるプラスミドをｐ ＭＢ８９８と表示したここの翻訳産生物は、β−ガタトシダーゼの一部分と融合 して、主要な反復の全長＋他の４５アミノ酸を含有する。融合タンパク質は、Ｆ ′−プラスミド上のβ−ガタトシダーゼのω−相補的部分をコードする遺伝子を 有するＪＭ１０９−　Ｅ、ｃｏｌ　ｉ菌株中で発現するとき、酵素的に活性であ る。

ｐＭＢ８９８を有するバクテリアをＬＢ培地中で０．５のＯＤ、。。

に増殖させ、発現はＩＰＴＧの添加により１ミリモルの合計濃度に誘発され、そ して−夜増殖させた。次いで、細胞を遠心により収穫し、そして２０ｍ１の１０ ミリモルのビス−トリスｐＨ６の中に再懸濁し、そしてフレンチプレスを通過さ せて破砕した。

細胞の破片を１時間の遠心Ｇ　２０．０００により除去し、そして８ｍｌの上澄 み液を１００ｍ１のＤＥＡＥ急速流れセファロースマトリックス（ファーマシア ーＬＫＢ、スウェーデン国）。カラムにおいてＦＰＬＣでビス−トリスｐＨ６中 のＮａＣ１の濃度を増加し、そして５ｍｌの分画を集めた。

β−ガタトシダーゼ活性を使用して融合タンパク質を含有する分画を認識する分 画を選択し、この融合タンパク質をほぼ０６モルのＮａＣｌ　ｆＡ度において溶 離した。分画をプールし、ＰＢＳＡに対して透析し、そして固体ＰＥＧ　２０， ０００に対して透析することによって１０ｍ１に濃縮した。

マラリア−免疫のドナーからのＴ細胞中の増殖的応答を誘発する能力を試験した 。１６のドナーのうちで１３からのＴ細胞は応答したが、８の非免疫ドナーのう ちで１からのＴ細胞のみが応答した（第１７図）。応答する非免疫ドナーはマラ リアの攻撃から４週早く回復した。

これらの結果が示すように、ｌまたは２以上のＴ細胞のエピトープは反復領域内 の位置するか、あるいはその領域をフランキングする。配列内の２つのドメイン は、ＡＭＰ旧プログラムにより、潜在的なＴ細胞のエピトープを含有することが 発見された（ａａ３３３３−３４３　、およびａａ６００−５１３　、上）。こ れらのエピトープを合成ペプチドでさらに研究は準備されている。

非免疫の回復からのＴ細胞が反応したという事実が示すように、単一のマラリア の攻撃は応答の促進に十分であり、そしてマラリアに対するサブユニットのワク チンの成分として、ＧＬＵＲＰからのこのような高度に効力のあるＴ細胞のエピ トープの使用が提案される。

３、　エピトープの保存 コンピューターより予測されそして実験室の分析により見いだされるエピトープ のうちで、地理学的に異なる分離物のうちで最も保存されるものは最も興味ある 。これらは次のようにして決定される二 あるいは、異なる分離物からのＧＬＵＲＰ遺伝子の部分をＰＣＲを使用して増幅 し、ｐＵＶベクター中にクローニングし、そして配列決定する。

最も保存されたエピトープを合成ペプチドとして産生され、そしてＴ−リンパ球 の増殖刺激性質および／またはリンホカインの分泌について試験する。

次いで、こうして特徴づけられた最も効率よいＢ−リンパ球およびＴ−リンパ球 のエピトープを有機体中の産生ずべきヌクレオチドのレベルで一緒にするか、あ るいは合成ペプチド中のアミノ酸として一緒にする。エピトープの組み合わせを 別々のエピトープの性質の保存について試験すべきである。

すなわち、別々のエピトープの免疫刺激性質は、アミノ酸の間の相互作用のため に、それらを密接に一緒にすることによって壊滅させることができる。

組み合わせた直列に接続したユニットを使用することができる。これを達成する １つの方法は、次の参考文献に記載されているようにペプチドの間のＳＳ架橋に よりエピトープのサブニー’−７トを接続することである：　Ｐａｔａｒｒｏｙ ｏ　Ｍ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ、。

熱帯熱マラリア原虫の無性血液段階を使用して対抗に対してヒトを合成ワクチン は保護する（Ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｐｒｏｔｅ細胞質ゾル ｈｕｍａｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｗｉｔｈ　ａｓｅｘｕａ ｌ　ｂｌｏｏｄｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒ ｕｍ）、　Ｎａｔｕｒｅ＋　３３２：１５８−１６１；１９８８、これを実施す る他の方法はサブユニットをヌクレオチドレベルでカップリングし、そして新規 なタンパク質またはエピトープの多数の反復を含有するペプチドを発現する。

久ｌバク屓迎且月 プールした分画のタンパク質含量をバイオ−ラド法で決定し［Ｂｒａｄｆｏｒｄ 、　Ｍ　Ｍ　；タンパク質色素結合の原理を使用してタンパク質のマイクログラ ム量の定量の急速および感受性方法（Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉ ｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎ。

ｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｒｉ−ｄｙｅ−ｂｉｎｄｎｇ）、　Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２：２４８−２５４゜１９７６）　２■／ｍｌの濃度を示し た。はぼ７５■の融合タンパク質ヲ１５ｇ　（乾燥重量）のＣＮＢｒ活性化セフ ブロース（ファーマシア・ファイン・ケミカルス、スウェーデン国つプサラ）に カップリングした。製造業者により与えられたカップリングのすべての手順に従 った。リベリア人の３ｍｌのヒトマラリア−免疫の血清をカラム緩衝液で１：１ ０に希釈した。この物質を濾過し、次いでポンプを使用して２０ｎ＋　ｌ　７時 間の流速でカラムに適用した。洗浄は３床体積のカラム緩衝液で実施した。溶離 はＮａＣ１を含まないカラム緩衝液中の３モルのチオシアン酸カリウムで実施し た。溶離緩衝液のそれより上の紫外線吸収を示すカラムから溶離した分画をプー ルし、そしてＮａＣ１を含まないカラム緩衝液に対して透析した。アミコンのダ イアフローの濃縮セルにより血清のもとの体積の１／３に濃縮した。

溶離した抗体の特異性は、交差免疫電気泳動：ＣＩＥ）中で中間ゲルの中に溶離 した物質を適用することによって実証さレタ〔参考文献：　Ａｘｅｌｓｅｎ、　 Ｎ　Ｈ＋交差および融合したロケットの免疫電気泳動における中間ゲル（Ｉｎｔ ｅｒ＋ｍｅｄａｔｅ　ｇｅｌ　１ｎｃｒｏｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｉｎ　ｆｕｓｅ　 ｒｏｃｋｅｔ　ｉｍｏ＋ｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）。

５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２．５ｐｐ１．１　：　７１　７７、１９７ ３）。

天然ＧＬＵＲＰは、溶離液中の抗天然ＧＬＵＲＰ抗体の非常に高い含量を示す中 間ゲルに入った直後に、沈澱した。さらに、抗原１に対する抗体は、これらの沈 澱の低下により示されるように、より制限された量で溶離液の中に存在した。

カラムの結合容量の利用を最適化するために、展開の監視のために融合タンパク 質でコーティングしたＥＬＩＳＡを使用することができる。展開する物質は融合 タンパク質に対する抗体を主要な量で含有すべきではない。

実施ｆｆｉ人。

３匹のウサギを、実施例２に記載するようにして産生したＰＢＳ中の２■／１の 融合タンパク質の１体積、および１：ｌの体積比のフロインド不完全アジュバン トの１体積から構成されたワクチンで免疫化した。各ウサギに０．１ｍｌの皮下 注射を１週の間隔で３回行った。第３回の投与後１週で、ウサギから採血した。

採血後２週で、ウサギに新しい投与量を与え、１週後採血し、これを続けた。下 に記載するすべての分析は、採血Ｎｏ、７を使用して実施した。

免疫化はイムノプロッティング、抗原として融合タンパク質を使用するＥＬＩＳ Ａおよび融合タンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用す る競合ＥＬＩＳＡにおいて分析した。

イムノブロッティング 生体外の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ　、　ｆ　ａ　１　ｃ　ｉｐａｒｕｍ）培養か らの寄生体を収穫し、超音波処理により崩壊し、そしてＳＯＳ　−ＰＡＧＥにお いてプロチアン２装置を使用して分離し、そして材料および方法に記載するよう にニトロセルロース膜上で電気転移させた。ウサギの血清を１：１００の希釈で 使用した。免疫化前に得られたウサギ血清を対照として使用した。予備分析にお いて、血清はほぼ１１０−１３０ｋＤの間隔の分子量および５５−６３ｋＤの間 隔のバンドの寄生体タンパク質を反応することが示された。

免疫蛍光 寄生体化赤血球を単層として１２ウエルをもつスライド上にコーティングした。

これは、ＥＬＩＳＡのコーティングについて述べたように、炭酸塩緩衝液でスラ イドを予備コーティングした。１滴の寄生体の懸濁液をスライドの各ウェルの上 に３０分間配置した。スライドを洗浄した。寄生体はウェルをアセトンで覆い、 次いで空気乾燥することによって固定した。ウサギ抗融合タンパク質抗体の希釈 物をウェル上に３０分間配置した。ウェルを４回洗浄し、そして１：４０に希釈 した蛍光接合したブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ　Ｆ２０５）を各ウェ ルに適用し、そして３０分間インキュベーションし、次いでスライドを４回洗浄 した。次いで、スライドを１０■／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、そしてカバ ーを取り付けた。スライドをオリンパスＢＨ蛍光顕微鏡で検査した。

スライドの予備検査により、蛍光は好気のシゾントのメロゾイトに位置するこが 示され、自然ＧＬＵＲＰは寄生体サイクルのこの段階に関係することが示唆され た。同様な研究を１％のグルタルアルデヒドで固定した寄生体で実施した。この 固定はアセトンを使用する固定と対照的に赤血球の膜を抗体に対して不透過性と した。蛍光はグルタルアルデヒドで固定した単層上に見られなかった。

ＥＬＩＳＡ ２つの型のＥＬＩＳＡを使用した： ａ）実施例５に記載するように、各ウェルを０．１２５１ｒｇの融合タンパク質 でコーティングし、ウサギ血清を融合タンパク質と直接反応させ、引き続いてウ サギ抗体とペルオキシダーゼに接合したブタ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（ＤＡ ＫＯＰＡＴＴＳＰ２１７）　との結合を実証する。

これは血清の滴定のために使用した。光学密度値が最大光学密度値の５０％を構 成する血清の希釈物として定義される力価は、それぞれ、１　／６００　、　１ 　／８５００および１　／８５００に対して測定された。結果を第１８図に示す 。

ｂ）競合ＥＬＩＳＡ　、１　：　２．５〜１：５１２０に希釈した５０μｌの体 積のウサギ抗融合タンパク質抗体（すべての３匹のウサギから由来するウサギ抗 血清の４■／ｍｌのプールから精製した）を、０．１５■の融合タンパク質／ウ ェルでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。１５分後、５ ０μｍの体積のヒト免疫血清（ＩＳ　１４１／８７　、１　：　４００に希釈し た）を添加し、核酸プレートをロッキングプラットホーム上で室温において１時 間インキュベーションした。ヒト免疫グロブリンの結合を、実施例６に記載する ように、１　：　１００００に希釈したペルオキシダーゼに接合したウサギ抗ヒ トＩｇＧにより検出した。このウサギ抗血清のプールは融合タンパク質上のエピ トープを満たして、希釈したウサギ血清（１：５１２０に希釈した）の添加と比 較したとき、ヒト免疫グロブリンの結合を９７％減少することができた。このプ ロットは第１９図に示されている。

実施例１２Ｂ マウスの免疫化 融合タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生ずる目的で、各４匹のＢＡＬ Ｂ／　Ｃマウスの２つの群を融合タンパク質および水酸化アルミニウムゲルおよ び等張生理的塩類溶液を含有するワクチンで免疫化した（１０ｍｌのワクチンに ついて、次を使用した：　２００Ｉｔｇの融合タンパク質、２．８４ｎ＋１の水 酸化アルミニウムゲルの６．９■／ｍｌの溶液および等張生理的塩類溶液で１０ ｍ１にした）。９００ｍｍのゲル濾過を使用して精製した融合タンパク質の調製 物を１つの群の動物に使用し、そして２７００ｍｍのゲル濾過を第２群に使用し た。動物に１ｍｌのワクチンを２週毎に腹腔内に与えた。マウスは第３回の投与 後２週に試験した。９００■のゲル濾過で精製した融合タンパク質で免疫化した 群１の平均の力価は１：６０００であり、そして２７００■のゲル濾過で精製し た融合タンパク質で免疫化した群２の平均の力価は１　：　１６８２５であり、 高度に精製した融合タンパク質を使用することによって得られた２、８の平均力 価の増加にに相当した。マウスを融合５日前に促進した。ハイブリド二マからの 培養上澄み液を、融合タンパク質に対する抗体の検出のためにＥＬＩＳＡにおい てスクリーニングした。３回の融合を実施して、融合タンパク質に対する非常に 低い力価をもつわずかのクローンのみが検出された。したがって、第４回の融合 を実施した。培養上澄み液をウサギ抗融合タンパク質抗体に提示された自然ＧＬ ＵＲＰについて試験する。同一抗体に提示された生体外の熱帯熱マラリア原虫（ Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋）培養のための培地を陰性の対照とする。ハイブ リドーマの培養上澄み液の希釈は１：４であり、セイヨウワサビペルオキシダー ゼに接合した抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ　Ｐ２６０）を検出する。

マウスからの抗体をイムノブロッティングにおいて試験して、ウサギ抗融合タン パク質抗体により認識されるバンドに類似する分子量のバンドとの反応性をした 。さらに、マウスからの抗体は抗原検出ＥＬＩＳＡにおいて検出抗体として使用 して、検体として添加される変化する量の培養上澄み液を認識することができた 。

この研究の目的は、融合タンパク質が霊長類における免疫原として水酸化アルミ ニウムゲルをアジュバントとして使用して有効であることを示すことであった。

ガイアナからの４匹のサル、サイミリ・シウレウス（Ｓａｉｍｔｒｉ　５ｃｉｕ ｒｅｕｓ）を使用した。２週毎に、４匹のサルのうちで２匹（サルＮｏ、８６４ およびサルＮｏ、８６５）を、６０硝の融合タンパク質、２，０■の水酸化アル ミニウムゲル、０．４７ｍ１の等張生理的塩類溶液、１％のチオメルサラトソジ ウムを含有する１ｍｌのワクチンで免疫化した。他方の２匹のサル（サルＮｏ、 ８６６およびサルＮｏ、８６７）を６゜ｎの融合タンパク質、２．０■の水酸化 アルミニウムゲル、０．５３ｍ１のフロインド不完全アジュバント、１％のチオ メルサラトソジウムを含有する１ｍｌのワクチンで２週毎に免疫化した。フロイ ンド不完全アジュバントを補充したワクチンでサルの２匹を免疫化する目的は、 これらの２匹のサルを免疫系の最適な刺激に暴露し、これにより陽性の対照とす ることであった。

ワクチンは胸の中央に相当する後部のわきのした線で皮下に与えた。ワクチンは 免疫化の実験の第０日、第１４日および第２８日に与えた。採血は免疫化の開始 前の１３２日、免疫化の実験の第０日、第１４日、第２８日に実施し、そして第 ４２日に実施するであろう。

血液の試料を０．１２５■／ウエルから成るコーティングをもつＥＬＩＳＡを使 用して分析した。各サルからの第４採血は１：５０〜１：６４００の希釈で分析 した。コーティング上のサルの抗体の存在は１：１０００に希釈したウサギ抗サ ル血清抗体により検出し、引き続いてこれを１　：　１０００に希釈したセイヨ ウワサビペルオキシダーゼに接合したブタ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（ＤＡＫ ＯＰＡＴＴＳ　Ｐ２１７）を使用して可視化した。色の発生はＯＰＤを基質とし て使用して実施した。

前述のＥＬＩＳＡにおける検体の光学密度の読みを第１０図に示す。

１：２００に希釈したサルＮｏ、６８７および８６５からの血清をイムノブロッ ティングにおいて試験した。それらはウサギと同一の寄生体タンパク質のバンド に対する抗体を有する。

この実験の結論は、融合タンパク質に対する抗体が水酸化アルミニウムゲルをア ジュバントとして使用して有効に誘発されるということである。有意のレベルの 抗体は、ワクチンの単一の投与にってさえ誘発される。

参考文献のリスト （１）　Ｓ、ＪｅｐｓｅｎおよびＮ、Ｈ，八ｘｅｌｅｓｅｎ＋　１９８０＋　’ 免疫電気泳動法により研究した熱帯熱マラリア原虫のマラリアにおける抗原およ び抗体（Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｍａｌａｒｉａ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｂｙ　Ｉ ｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＭｔｈｏｄｓ）　Ｊ　、　Ａｃｔａ 、Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５ｃａｎｄ、５ｅｃｔ、Ｃ＋　８８＋　ｐ、 ２６３−２７０゜ （２）　Ｓ、ＪｅｐｓｅｎおよびＢ、Ｊｙｄｉｎｇ　Ａｎｄｅｒｓｅｎ、　ｒ生 体外培養した熱帯熱マラリア原虫の培地からの抗原の免疫吸着分離（Ｉｍｍｕｎ ｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　Ｆｒｏ ｍ　ｔｈｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔ ｉｖａｔｅｄ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　Ｊ　＋Ａｃｔ ａ、Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、５ｅｃｔ、Ｃ＋　８！Ｌ　ｐ 、９９−１０３゜（３）　Ｐ、Ｈ，Ｊａｋｏｂｓｅｎ、　Ｊ、Ｂａｅｋ　＆　Ｓ 、Ｊｅｐｓｅｎ、　１９８ＥＬ　’リムルス・アメボサイテ・リゼイトおよびポ リミキシンＢと反応性の可溶性熱帯熱マラリア原虫抗原の実証ＣＤｅｍｏｎｓｔ ｒａｔｉｏｎ　ｏｆｓｏｌｕｂｌｅ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒ ｕｍ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗｉｔｈ　Ｌｉｍｕｌｕｓａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙ ｓａｔｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ）　Ｊ　、　Ｐａｒａｓｉｔｅ　Ｉ ｍｍｕｎｏ−１ｎｇｙ、　１０．　ｐ、５９３−６０６゜（４）　１．Ｃ，Ｂｙ ｇｂｊｅｒｇ、Ｓ、Ｊｅｐｓｅｎ、Ｔ、Ｇ、Ｔｈｅａｎｄｅｒ　＆　Ｎ、Φｄｖ ＋ａ＋。

１９８５、ｒ生体外培養において熱帯熱マラリア原虫からの精製した可溶性抗原 に対するおよびマラリア患者の血清からの抗原に対するヒトリンパ球の特異的増 殖（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａ−ｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏ ｆ　ｈｔ＋ｍａｎ　１ｙｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｔｏ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｓｏｌｕ ｂｌｅａｎｔｉｇｅｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒ ｕｍ　ｔｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｓａｎｄ　ｔｏ　ａｎｔｔｇｅｒ＋ｓ 　ｆｒｏｍ　ｍａｌａｒｉａ　ｐａｔｉｅｎｔｓ’　５ｅｒａ）」、　Ｃｌ１ｎ 。

ｅｓｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、。５９．　ｐ、４２１−４２６゜（５）　Ｓ、Ｊ ｅｐｓｅｎ＋　１９８３．　’精製した抗マラリアヒト　ＩｇＧ抗体による熱帯 熱マラリア原虫の生体外増殖の阻害、培養上澄み液からの標的抗原の分離（Ｉｎ ｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ｇｒｏｗｔｈｏｆ　Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ｂ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｉｍａｌａｒ ｉａｌ　ＨｕｍａｎＩｇＧ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｔａｒｇｅｔ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｆｒｏ＋ａ　Ｃｕ１−ｔｕｒｅ　５ｕｐ ｅｒｎａｔａｎｔｓ）」Ｉ　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１８．ｐ、 ５６７　５７１゜（６）　Ｐ、Ｈ，Ｊａｋｏｂｓｅｎ＋　Ｓ、Ｊｅｐｓｅｎ　＆ 　Ｒ，八ｇｇｅｒ、　１９８７．　ｒ可溶性熱帯熱マラリア患者の抗原に対する 阻害性モノクローナル抗体（Ｉｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　５ｏｌｕｂｌｅ　Ｐｌａｓｍｏ−ｄｉｕｍ　ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）　Ｊ　Ｉ　０ａｒａＳｉｔｏｌ　Ｒｅｓ＋＋ 　７３＋　ｐ、５１８５２３゜ （７）　Ｐ、Ｈ，Ｊａｋｏｂｓｅｎ、　Ｔ、Ｇ、Ｔｈｅａｎｄｅｒ、　Ｊ、Ｂｊ ｅｎｓｅｎ＋　Ｋ、Ｍφ１ｂａｋ　＆　Ｓ、Ｊｅｐｓｅｎ＋　１９８’Ｌ　’可 溶性熱帯熱マラリア患者の抗原は免疫反応性に重要な炭水化物部分を含有する（ Ｓｏｉｕｂｉｅ　Ｐｌａ−ｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ａｎｔｉｇ ｅｎｓ　Ｃｏｎｔａｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏ１ｅ−ｔｉｅｓ　Ｉ ｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）　Ｊ　、Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、 ２５＋　Ｎｏ、１１．　ｐ、２０７５−２０７９゜（”８　）　Ａ、Ｓｃｈｅｒ ｇ、　Ｃ，Ｈｉｌｂｉｃｈ、　Ｋ、Ｓｉｅｇ、　Ｄ、Ｍａｔｔｅｉ＋　０．Ｍｒ ｃｅ−ｒｅａｕ−Ｐｕｉｊａｌｏｎ　＆　Ｂ　Ｍｔｌｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌｔ　１ ９８１１　’明確な急速に発生する反復の遺伝情報を指定する熱帯熱マラリア原 虫の１１−１遺伝子（Ｔｈｅ　１１−１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ ｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ｃｏｄｅｆｏｒ　ｆａｓｔ　ｅｖｏｌｖｉｎｇ　ｒ ｅｐｅｔｓ）　Ｊ　、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　Ｖｏｌ、７゜Ｎｏ 、４．　ｐ、１１２９−１１３７゜（９）　Ｔ、Ｔｒｉｇｌｔａ、　Ｈ，５ｔａ ｈ１．　Ｐ、Ｅ、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ、Ａ、５ｉｌｖａ、　Ｒ，Ｆ。

Ａｎｄｅｒｓ　＆　Ｄ、Ｊ、Ｋｅｍｐ、　１９８８＋　’グルタミン酸に冨んだ タンパク質（ＧＡＲＰ）をエンコードする熱帯熱マラリア原虫の遺伝子の構造（ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ−ｒｉ ｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｊ　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ＋　３Ｌ　ｐ、１９９−２０２゜（１０）　 Ｆ、Ｂ、Ｐｅｒｌｅｒ＋　Ａ、Ｍ、Ｍｏｏｎ、　Ｂ、Ｑｉｎ　Ｑｉａｎｇ、　Ｍ 、Ｍｅｄａ＋　Ｍ。

Ｄａｌｔｏｎ＋　Ｃ，Ｃａｒｄ、　Ｒ，Ｓｃｈｍｉｔ−Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ｄ、 Ｗａ１１ａｃｔ＋＋　Ｊ、Ｌｙｎｃｈ　＆Ｊ、Ｅ、Ｄｏｎｅｌｓｏｎ＋　１９８ ７＋　’ガイビア人の血清と交差反応する豊富なブラシンジウム・ノウレジのク ローニングおよび特性決定（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｂｕｎｄａｎｔ　Ｐｌａｓｍｏ−ｄｉｕｍ　ｋｎｏ ｗｌｅｓｉ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｓ　ｗｉｔ ｈ　Ｇａｍｂｉａｎｓｅｒａ）　Ｊ　Ｉ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ＋　２５＋ｐ、　１８５−１９３゜ 浄書（内容に変更なし） 抗原性　（ＨＯＰＰ　ＡＮＤ　ＷＯＯＤＳ）翻訳された　１−２３４９ 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、６：　融合タンパク質ＥＬＩＳＡ抗原ｆ４０．１６μｇ／ウエル 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　１０ 停書（内容に変更なし） 浄＠（内容に７！！更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） か 浄書（内容に変更なしン 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ０Ｄ４９０　Ｆｉｇ、２Ｑ　（続き） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８９１００２１８ 平成１年特許願第５１０２８６号 ２、発明の名称 マラリア抗原 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　スターテンス　セルミンスティチュト４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）図面の翻訳文 （４）委任状 （５）法人証明書 ７、補正の内容 （１）（４）（５）　別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （３）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）図面の翻訳文　１通 （４）委任状及びその翻訳文　各１通 （５）法人証明書及びその翻訳文　各１通国際調査報告 Ｉｎｌ＊ｍ５ｍ５ａｌ＾−−に鴫雪１＊＊Ｎ・ｐｃ丁／ＤＫ８９１００２１８ｈ ＋＋ｅ＋ｖｎｌｔｅｌＩａｌ　Ａｅ両ｓ神ｓ　Ｎ＠、ＰＣＴ／Ｄに８９１００２ １８国際調査報告

Claims (90)

【特許請求の範囲】
1. １．次のアミノ酸配列： 【配列があります】 またはその類似体からなる、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰから誘導された特徴的なアミノ酸配列からなる ポリペプチド。
2. ２．熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰを認識す る抗体と反応性の少なくとも１つのエピトープからなるポリペプチド。
3. ３．前記エピトープは上記第１項に示すアミノ酸配列のサプ配列である、上記第 ２項記載のポリペプチド。
4. ４．上記第１項に示すアミノ酸配列と実質的に相同性であるが、それと同一では ないアミノ酸配列を有するとしてさらに特徴づけられる、上記第２または３項記 載のポリペプチド。
5. ５．ＧＬＵＲＰのα，βおよびＦから成る群より選択される独特リピートと実質 的に相同性である実質的に反復したサプ配列からなる、上記第１〜４項のいずれ かに記載のポリペプチド。
6. ６．アミノ酸のプロリンは実質的に反復したサプ配列の位置３を占有しない、上 記第５項記載のポリペプチド。
7. ７．少なくとも２０％のグルタミン酸組成および最大１のメチオニン残基および ／または０のシステイン残基を有するとして特徴づけられる、上記第１〜６項の いずれかに記載のポリペプチド。
8. ８．Ｔ−リンパ球中で増殖の応答を誘発することができるとしてさらに特徴づけ られる、上記第１〜７項のいずれかに記載のポリペプチド。
9. ９．次のアミノ酸配列： 【配列があります】 【配列があります】 の少なくとも１つを包含するとしてさらに特徴づけられる、上記第１〜８項のい ずれかに記載のポリペプチド。
10. １０．ＧＬＵＲＰから誘導されない第２アミノ酸配列からなるとしてさらに特徴 づけられる、上記第１〜９項のいずれかに記載のポリペプチド。
11. １１．第２アミノ酸配列はβ−ガクトシダーゼに実質的に相当する、上記第１０ 項記載のポリペプチド。
12. １２．第１および第２の配列は特異的に切断可能なアミノ酸配列により接続され ている、上記第１０項記載のポリペプチド。
13. １３．グリコシル化されていない形態である、上記第１〜１２項のいずれかに記 載のポリペプチド。
14. １４．熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の抗原３と交差反応性 である、上記第１〜１３項のいずれかに記載のポリペプチド。
15. １５．プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、好ましくは熱帯熱マラリ ア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から誘導された、上記第１〜１４項のいず れかに記載のポリペプチド。
16. １６．プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種はシゾント段階である、上 記第１５項記載のポリペプチド。
17. １７．実質的に純粋な形態である、上記第１〜１６項のいずれかに記載のポリペ プチド。
18. １８．炭水化物または脂質の部分であるか、あるいは他の方法で修飾されている 、例えば、アセチル化されている、上記第１〜１２または１４〜１７項のいずれ かに記載のポリペプチド。
19. １９．予防剤または治療剤として使用する上記第１〜１８項のいずれかに記載の ポリペプチド。
20. ２０．上記１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドからなる組成物。
21. ２１．上記第１〜１８項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列からなる核酸分子。
22. ２２．次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 またはそのサプ配列から実質的になる核酸分子。
23. ２３．上記第２１〜２２項のいずれかに記載の核酸分子の少なくとも実質的な部 分に対して実質的に相補的である、核酸分子。
24. ２４．第７図に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と６５℃のハイブリダ イゼーション温度において２×ＳＳＣハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブ リダイゼーションする、上記第２１〜２３項のいずれかに記載の核酸分子。
25. ２５．第７図に示す配列の等しい長さのサブ配列、または前記配列に対する相補 性のＤＮＡ配列と少なくとも７０％相同性である、上記第２４項記載の核酸分子 。
26. ２６．反復した配列をＧＬＵＲＰのＦ反復の中に翻訳される、上記第２５記載の 核酸分子。
27. ２７．上記第２１〜２６項のいずれかに記載の核酸分子を有し、そして宿主有機 体中で反復することができかつ熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）抗原ＧＬＵＲＰを認識する抗体と反応性の少なくとも１つのエピトープからな るポリペプチドをその中で発現することができる、発現ベクター。
28. ２８．発現されたペプチドは、そのアミノ酸配列が第８図に示されているポリペ プチドの実質的な部分と実質的に相同性である、上記第２７項記載の発現ベクタ ー。
29. ２９．プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種でなく、上記第２１〜２６ 項のいずれかに記載の核酸分子を有し、そして前記核酸分子によりエンコードさ れるポリペプチドを発現することができる有機体。
30. ３０．上記第２７または２８項記載の発現ベクターを収容する、上記第２９項記 載の有機体。
31. ３１．微生物、好ましくはバクテリア、酵母菌、菌・かび類、原生動物、昆虫の 細胞、植物の細胞、哺乳動物の細胞または細胞系である、上記第２９または３０ 項記載の有機体。
32. ３２．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ ｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサルモネラ属（Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ）のバクテリア である、上記第３１項記載の微生物。
33. ３３．プラスミドｐＲＤ１５を収容しかつ受け入れ番号ＤＭＳ４８１５で受託さ れた微生物。
34. ３４．マラリア原虫の寄生体により引き起こされる病気に対して、入間を包含す る動物を免疫化するためのワクチンであって、免疫学的に有効でありかつ生理学 的に許容されうる量の上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドからな るワクチン。
35. ３５．マラリア原虫の寄生体は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉ−ｐａｒｕ ｍ）である、上記第３４項記載のワクチン。
36. ３６．プラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種以外の病原性有機体から得 られた１種または２種以上の免疫学的に活性の分子をさらに含む、上記第３４ま たは３５項記載のワクチン。
37. ３７．さらにアジュバントを含む、上記第３４〜３６項のいずれかに記載のワク チン。
38. ３８．アジュバントは、フロインド不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、 サポニン、ムラミルジペプチド、油、例えば、植物性油、例えば、落花生油、ま たは鉱物油、例えば、シリコーンオイル、およびカルメットーゲラン杆菌（Ｂａ ｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔ　Ｇｕｅｒｉｎ）（Ｂ．Ｃ．Ｇ．）から成る群より選択 される、上記第３７項記載のワクチン。
39. ３９．ポリペプチドをミセルまたはイスコムス（ｉｓｃｏｍｓ）の中に組み込ま れている、上記第３４〜３８項のいずれかに記載のワクチン。
40. ４０．担体は高分子量の担体である、上記第３４〜３９項のいずれかに記載のワ クチン。
41. ４１．高分子量の担体は多糖類またはポリペプチドである、上記第４０項記載の ワクチン。
42. ４２．ポリペプチドは高分子量の担体に多価的にカップリングされている、上記 第４０または４１項記載のワクチン。
43. ４３．ポリペプチドは重合されている、上記第３４〜４２項のいずれかに記載の ワクチン。
44. ４４．非経口的投与、例えば、皮下的、皮内的または筋肉内的投与に適する形態 である、上記第３４〜４３項のいずれかに記載のワクチン。
45. ４５．経口的、鼻内的または直腸の投与に適する形態である、上記第３４〜４３ 項のいずれかに記載のワクチン。
46. ４６．マラリア原虫の寄生体により引き起こされる病気に対して、人間を包含す る動物を免疫化するためのワクチンとして使用するために適当であり、前記微生 物は上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドの免疫学的に活性な部分 の遺伝情報を指定する挿入されたヌクレオチド配列を有するおよび／または発現 することができる、非病原性微生物からなるワクチン。
47. ４７．マラリア原虫の寄生体により引き起こされる病気に対して、人間を包含す る動物を免疫化するための生ワクチンの調製のための、上記第１〜１９項のいず れかに記載のポリペプチドの免疫学的に活性な部分の遺伝情報を指定する挿入さ れたヌクレオチド配列を有し、そしてそれを発現することができる非病原性微生 物の使用。
48. ４８．上記第３４〜４６項のいずれかに記載のワクチンの免疫学的に有効量を動 物に投与することからなる、マラリア原虫の寄生体により引き起こされる病気に 対する保護免疫を、人間を包含する動物において、得る方法。
49. ４９．上記第２９〜３３項のいずれかに記載の有機体を上記第１〜１９項のいず れかに記載のポリペプチドの発現に導く条件下に培養し、そしてポリペプチドを 有機体から回収することからなる、上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペ プチドを産生する方法。
50. ５０．ポリペプチドは天然に産出するものではない、上記第４９項記載の方法。
51. ５１．ポリペプチドを実質的に純粋な形態に精製することをさらに含む、上記第 ４９または５０項記載の方法。
52. ５２．ポリペプチドの回収は、上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチ ドに対してレイズされたか、あるいはそれと反応性である抗体の使用を包含する 、上記第４９〜５１項のいずれかに記載の方法。
53. ５３．産生すべきポリペプチドの遺伝情報を指定する核酸分子を、断片中の１ま たは２以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入、欠失または転位により修飾する 、上記第４９〜５２項のいずれかに記載の方法。
54. ５４．有機体は突然変異させる、上記第４９〜５２項のいずれかに記載の方法。
55. ５５．ポリペプチドを、熱処理、化学物質により処理、酵素処理、およびポリペ プチド中の１または２以上のアミノ酸の置換、付加、挿入、欠失または転位から 成る群より選択される翻訳後の修飾に付す、上記第４９〜５２項のいずれかに記 載の方法。
56. ５６．ポリペプチドを培養物から分離し、前記分離の方法は１または２以上の親 和クロマトグラフィーおよび／または大きさのクロマトグラフィーの工程からな り、そして必要に応じて前記ポリペプチドと反応性の抗体を使用する工程を使用 する、上記第４９〜５０項のいずれかに記載の方法。
57. ５７．順次に成分のアミノ酸を連鎖してポリペプチドを形成することからなる、 上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドを産生する方法。
58. ５８．熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰまたは 上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドに対して特異性の精製された 抗体。
59. ５９．モノクローナル抗体である、上記第５８項記載の抗体。
60. ６０．ハイプリドーマの細胞系によるか、あるいはクローンまたはそのサブクロ ーンによるか、あるいは前記モノクローナル抗体の遺伝情報を指定するハイブリ ドーマの細胞系からの遺伝情報を有する細胞により産生される、上記第５９項記 載のモノクローナル抗体。
61. ６１．動物を上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドで免疫化して、 前記ポリペプチドまたは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原 ＧＬＵＲＰに対して特異性の抗体を産生する細胞を獲得し、そして前記抗体を動 物または細胞から分離することからなる、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）抗原ＧＬＵＲＰまたは上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペ プチドに対して特異性の抗体を産生する方法。
62. ６２．さらに、 モノクローナル抗体を産生する細胞を適当な細胞系の細胞と融合し、そしてモノ クローナル抗体を産生する生ずるハイプリドーマ細胞を選択およびクローニング するか、あるいはモノクローナル抗体を産生する融合しない細胞系を永久分裂化 し、適当な培地中で細胞を増殖させて前記抗体を産生させ、そしてモノクローナ ル抗体を増殖培地から収穫する、ことを含む、上記第６１項記載の方法。
63. ６３．免疫化した動物は、ウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ 、ウマおよびモルモットから成る群より選択される、上記第６１または６２項記 載の方法。
64. ６４．抗体を産生する細胞は脾臓またはリンパの細胞である、上記第６１〜６３ 項のいずれかに記載の方法。
65. ６５．ハイプリドーマの細胞を生体外で増殖させるか、あるいは動物、例えば、 マウスの体腔の中で増殖させる、上記第６１〜６４項のいずれかに記載の方法。
66. ６６．上記第５８〜６０項記載の抗体または上記第６１〜６５項記載の方法によ り産生された抗体からなる、マラリア原虫の寄生体により引き起こされる病気に 対して、人間を包含する動物を受動免疫化するための組成物。
67. ６７．有効免疫化量の上記第６６項記載の組成物を投与することからなる、マラ リア原虫の寄生体により引き起こされる病気に対して、人間を包含する動物を受 動免疫化する方法。
68. ６８．上記第５８〜６０項記載の抗体からなる、上記第１〜１９項のいずれかに 記載のポリペプチドを検出するための診断剤。
69. ６９．抗体は標識を含む、上記第６８項記載の診断剤。
70. ７０．標識は、アイソトープ、酵素、化学的修飾剤、例えば、スルホニル導入化 合物、蛍光剤および錯化剤から選択される、上記第６９項記載の診断剤。
71. ７１．標識を含む、上記第２１〜２６項のいずれかに記載の核酸分子を検出する ための診断剤。
72. ７２．標識は、アイソトープ、酵素、化学的修飾剤、例えば、スルホニル導入化 合物、蛍光剤および錯化剤から選択される、上記第７１項記載の診断剤。
73. ７３．試料を上記第２０項記載の組成物とともにインキュベーションすることか らなる、試料中のマラリア原虫の抗原またはこのような抗原に対する抗体をイム ノアッセイにより同定および／または定量する方法。
74. ７４．試料を上記第５８〜６０項のいずれかに記載の抗体とともにインキュベー ションすることからなる、試料中のマラリア原虫の抗原またはこのような抗原に 対する抗体をイムノアッセイにより同定および／または定量する方法。
75. ７５．試料は生きている有機体、例えば、ヒトまたは動物からの検体であるか、 あるいは環境の検体、例えば、水である、上記第７３〜７４項のいずれかに記載 の方法。
76. ７６．検体は血液、例えば、赤血球に富んだ分画、または組織の試料、例えば、 肝臓の細胞からなる試料である、上記第７５項記載の方法。
77. ７７．検体は尿である、上記第７５項記載の方法。
78. ７８．有機体から得られた尿の試料を上記第２０項記載の組成物とともにインキ ュベーションすることからなる、有機体におけるプラスモディム属（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ）種による感染を診断する方法。
79. ７９．さらに上記第５８〜６０項のいずれかに記載の抗体を使用することを含む 、上記第７３〜７８項のいずれかに記載の方法。
80. ８０．組成物またはポリペプチドまたは部分または抗体は検出可能なマーカーを 有する、上記第７３〜７９項のいずれかに記載の方法。
81. ８１．標識は、アイソトープ、酵素、蛍光体および錯化剤から成る群より選択さ れる、上記第８０項記載の方法。
82. ８２．組成物のポリペプチドまたは抗体は固体の支持体とアソシエーションして いる、上記第７３〜８１項のいずれかに記載の方法。
83. ８３．支持体は、板、ストップ、ビーズ、粒子、フィルムおよび紙から選択され る、上記第８２項記載のポリペプチドまたは抗体。
84. ８４．固体の支持体は、ポリマー、例えば、プラスチック、例えば、ラテックス 、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ナイロンまたはポリビニリ デンジクロライド、シリコーンおよびシリカから成る群より選択される支持体か らなる、上記第８３項記載のポリペプチドまたは抗体。
85. ８５．試料を上記第５８〜６０項のいずれかに記載の抗体とともにインキュベー ションする、試料中のプラスモディム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の分子の存 在を決定する方法。
86. ８６．抗体を天然に産出しないポリペプチドに対してレイズさせた、上記第８５ 項記載の方法。
87. ８７．抗体は固体の支持体とアソシエーションするおよび／または標識を有する 、上記第８５または８６項記載の方法。
88. ８８．上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドを含有する生物学的物 質を上記第５８〜６０項のいずれかに記載の固定化した抗体からなるマトリック スに吸着させ、前記ポリペプチドを前記マトリックスから溶離し、そして前記ポ リペプチドを溶離液から回収することからなる、上記第１〜１９項のいずれかに 記載のポリペプチドを精製する方法。
89. ８９．試料を上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドと接触させ、前 記接触から生ずる結合した抗体の存在を検出し、そして結果を参照値と相関関係 づけることからなる、試料中の上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチ ドと反応性の抗体の存在を決定する方法。
90. ９０．上記第７３〜７４項のいずれかに記載のアッセイを使用することからなる 、ワクチン中の上記第１〜１９項のいずれかに記載のポリペプチドの量を監視す る方法。