JP2006512926A - マラリア・ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
マラリアは、世界の人口の40%に感染しており、毎年推定で1.5〜2.7百万人が死亡する(57)。このことは、甚大な人的被害と感染地域の進行を防ぐ負担を示している。マラリアは現在、アフリカ、アジア、及びラテンアメリカの熱帯の貧困地域にほぼ限られているが、以前に撲滅された地域にも再伝染している。マラリアは、世界の公衆衛生問題の大きな問題の一つである。
第一に、マラリア原虫に繰り返し晒されると、確かな臨床免疫、つまり、原虫と防御抗体が同時に存在する相関免疫状態を発達させるということは、立証された意見である。臨床的に免疫化された人は、通常低い原虫密度を有し、こうした免疫は、死亡率の低下にかなり有効である。
第二に、ヒト並びに動物モデルにおける実験により、免疫化が次回の原虫感染に対する免疫を誘導することができることが確かめられ、ワクチンがマラリアの制御の現実的なツールになりうることが示唆された。
GLULRPについて、ジエルモ(Dielmo)、セネガル(38)、ドゥドゥワ、ガーナ(11,50)、及びオード(OoDo)、ミャンマー(Soe Soe、未発表)において行われた3の独立した研究により、GLURP特異的IgG3及び/又はIgG1抗体のレベルとマラリア発症に対する感染防御とのあいだの統計的に有意な相関が示された。年齢と関連するP.ファルシパルムに対する暴露についての効果を混同する操作の後でさえも、この相関はかなり有意であった。これらの結果は、GLURPに対する天然IgG抗体が、ガンビアの子供における病気に対する防御と関連し、そしてリベリア及びブルキナファソの子供における高レベル原虫血症に対する防御と関連したという以前の研究を確かにした。
血清疫学的データーにおける同様の一貫性は、従来P.ファルシパルム・マラリアに対するワクチンとして有力な候補であったMSP1により例示される別のマラリア・ワクチン候補については一般的ではない。
改良されたワクチン誘導性抗体発現をもたらすマラリア・ワクチンが開示される。このワクチンは、プラスモジウム・ファルシパルム由来の少なくとも1の別のタンパク質、例えば、メロゾイト表面タンパク質3(MSP3)と遺伝子操作により結合されたプラスモジウム・ファルシパルムのグルタミン酸リッチ・タンパク質(GLURP)から生じた融合タンパク質、又はこの融合タンパク質をコードする対応のヌクレオチド配列を含む。
i) L.ラクチスは、特性を明らかにされ一般的に安全と認められた(GARS)工業微生物であり、発酵乳製品の生産における使用が最もよく知られている
ii) L.ラクチスは、規定の合成培地において成長できる
iii) 組換えタンパク質は、培養上清中に分泌され、そこから簡単に精製できる、及び
iv) L.ラクチスは毒性物質を作り出さない
という理由から発現宿主として選択された。
i) GLURP-MSP3ハイブリッド・タンパク質は、個々の分子のいずれの組み合わせよりも免疫原性が高く、
ii) GLURP-MSP3ハイブリッド・タンパク質は、GLURPとMSP3の両方に対して強い免疫応答を作り出し、
iii) GLURP-MSP3ハイブリッド・タンパク質は、1回の臨床試験において、GLURPとMSP3の両方を試験することを許容し、そして
iv) GLURPとMSP3との間の融合接続部において新たなエピトープを含まないことが、マウス及び非ヒト霊長類における前臨床試験により示されたので、GLURP-MSP3ハイブリッド・タンパク質は、個々の分子と同じくらい安全であると予想される。
融合タンパク質
組換え融合タンパク質は、1の遺伝子の異なる領域由来のヌクレオチド配列を遺伝子操作で結合すること、及び/又は2以上の別の遺伝子由来のヌクレオチド配列を結合することにより取得されるヌクレオチド配列によりコードされる。これらのヌクレオチド配列は、P.ファルシパルム由来であるが、該ヌクレオチド配列は、別の生物、クローニング手順に使用されるプラスミド、又は他のヌクレオチド配列由来でありうる。
免疫原性断片又はエピトープは、生物学的サンプルにおいて又は現在若しくは過去にマラリアなどの微生物に感染した人において、免疫応答を誘導するタンパク質の一部として定義される。
免疫応答は、以下の方法のうちの1の方法によってモニターされうる。
ホモロジーは、本発明の融合タンパク質のアナログ又はバリアントとして定義される。融合タンパク質は、特定のアミノ酸により特徴付けられ、そして特定の核酸配列によりコードされる。そうした配列が、組換え又は合成方法により産生されるアナログ及びバリアントを含むことが理解されるだろう。ここでそうしたポリペプチド配列は、組換えポリペプチド配列中の1以上のアミノ酸の置換、挿入、添加、又は欠失により改変され、そして本明細書中に記載されるいずれの生物学的アッセイにおいて免疫原性である。置換は好ましくは「保存的」である。置換は好ましくは、コドン使用における静的置換であり、該置換はアミノ酸配列に変化をもたらさないが、タンパク質発現を亢進するために導入されうる。置換は、以下の表にしたがって定義される。二列目の同じブロック、好ましくは三列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換されうる。三列目のアミノ酸は、1文字表記で表される。
本発明は、本発明に従った融合タンパク質を含むワクチン組成物に関する。そうしたワクチン組成物の最適能力を保証するために、免疫学的に及び医薬として許容される担体、ワクチン、又はアジュバントを含むことが好ましい。
本発明の核酸断片は、抗原のin vivo発現を達成するために使用されうる。つまり、核酸断片は、Ulmer et al 1993において概説されるように、いわゆるDNAワクチンとして使用されうる。この文献は援用される。
ワクチンに対して細胞性免疫応答を効果的に活性化する一の可能性は、非病原性微生物ワクチン又はウイルスワクチンにおいて適切な抗原を発現することにより達成されうる。そうした微生物の周知の例は、マイコバクテリウム・ボビスBCG(Mycobacteriumu bovis BCG)、サルモネラ(Salmonella)、及びシュードモナ(Pseudomona)であり、そしてウイルスの例はワクシニア・ウイルス及びアデノウイルスである。
本発明は、D.Lowry(Lowry et al.,1999)により示された文献に記載される治療用ワクチンとして、本発明の融合タンパク質又は核酸を使用することに関する。治療性質を有する抗原は、ワクチンとして投与されたとき、実験動物においてマラリア感染の重篤度を低減する能力又は以前の感染の再活性化を妨げる能力に基いて同定されうる。治療ワクチンとして使用される組成物は、ワクチン用に上で記載される様に調製されうる。
細菌種、プラスミド、及び成長条件
指示されたプラスミドを含むE.コリDH10B(K12, F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ Δm15 ΔlacX74 deoRrecA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG)(Life Technologies)をエリスロマイシン(200μg/ml)を含むルリア・ブロス(LB)中で成長させた。指示されたプラスミドを含むL.ラクチスMG1363(17)を0.5%(wt/vol)グルコースを加えたM17ブロス(Difco Ltd.)又は3×SA・IV培地と名付けられる合成アミノ酸(SA)強化培地に1μg/mlのエリスロマイシンを加えた培地中で成長させた。固形LB又はM17培地に200又は1μg/mlのエリスロマイシンをそれぞれ加えた。ベクターであるpPSM1013(図1)は、pAMβ1レプリコンに基く多コピー数発現プラスミド(46)であり、最適分泌シグナル-ペプチド配列SP310mut2(Ravn, P., Arnau, J., Madsen, S.M., Vrang, A., 及びIsraelsen, H. 未発表)とのインフレーム融合体の構築を可能にする固有制限酵素部位を含む。ペプチドのmRNAは、プラスミドがコードする翻訳開始部位から翻訳され、そしてpH及び増殖段階誘導性のL.ラクチスプロモーター、P170から転写される(7,23,33)。pH7以上では、P170プロモーターからの転写は実質的にない。しかしながら、pH6.5以下の定常段階に移ると、転写が誘導される。プラスミドpAMJ328は、全てのlacZ制御配列を欠失して、lacプロモーターからの転写を避け、そしてシグナルペプチドを欠失する新たなクローニング領域を作ることにより、pPSM1013から派生させた(32)。
全てのプラスミドは、E.コリDH10B中で構築し、そして(22)で記されるように電気穿孔によりL.ラクチスMG1363に形質転換した。全てのプラスミドコンストラクトをDNAシーケンスにより確かめた。
pMST73. FVOglurpの非繰り返し領域をプライマー:5’-CCC AGA TCT ACA AGT GAG AAT AGA AAT AAA C [79から100のヌクレオチド] (M59706のATG開始コドンのAから数える)、及び5’-CCC AGA TCT TGC TTC ATG CTC GCT TTT TT CCG AT [1475から1500のヌクレオチド]で増幅し;BglIIで切断し、そして得られたDNA断片をBglIIで切断したpPSM1013中にクローニングした。
プラスミドpKBR8(GLURP)、pKBR10(MSP3)、又はpKBR11(GLURP-MSP3ハイブリッド)を含むL.ラクチスMG1363の発酵を2Lの発酵器中の、エリスロマイシン(1μg/ml)、酵母抽出物(0.5%)、及びグルコース(1.5%)を加えた3×SA・IV培地(1L)で、30℃で行った。培養液の開始pHを7.4に合わせた。L.ラクチスMG1363は、成長の間乳酸を産生するので、細胞密度が増加するにつれてpHは減少する。約3時間の成長の後に、pHは6に減少し、そして2MのKOHをpH制御様式で加えることにより、さらに8時間、細胞密度が約OD600=8となるまでこのレベルを維持した。50%グルコース溶液を塩基と平行して加えた。なぜならこの添加により細菌の収量を増大する傾向があるからである。Pellicon2 Duraporeフィルター(PVDF、0.22μm、0.1m2)(Millipore)で限外ろ過することにより細菌細胞を培養上清(外に出されたタンパク質を含む)から取り除いた。培養上清をすぐに使用するか、または-20℃で貯蔵した。
組換えGLURP、MSP3、及びハイブリッド分子について、組換え戦略を開発した。Pellicon XL Biomax 8フィルター(ポリプロピレン-膜、50000Da、50cm2)を備えるMillipore Labscale(商標)TFFシステムで無細胞培養上清を濃縮した。そしてSephadex G-25カラム(C26/40、170ml)上で濃縮液を20mMビス-Tris(pH6.4)にバッファー交換を行った。0〜1MのNaClの勾配を、1ml/分の流速でカラム緩衝液中に適用することにより、組換えタンパク質を最初に5mlHiTrapQ Sepharose High Performance(Phamacia Biotech)カラム上で精製した。所望の組換えタンパク質を含む分画(2ml)を貯めて、そして20mMビス-Tris(pH6.4)に対して透析し、そして5mlのHiTrap SP Sepharose High Performance(Phamacia Biotech)カラムに適用した。組換えタンパク質をカラム緩衝液中の0〜1MのNaCl勾配により溶出させた。GLURP及びMSP3を、単一ピークで溶出し、一方ハイブリッドを2ピークで溶出した。所望のピークを含む分画(2ml)貯め、そして1M(NH4)2SO4に調節し、そして流速1ml/分で20mMビス-トリス(pH6.4)中の1〜0Mの(NH4)2SO4の勾配を適用することにより、5mlのPhenyl Sepharose High Pherformance(Phamacia Biotech)でさらに精製した。全ての分画の分析を、SDS-PAGEにより行った。タンパク質濃度をBCA(商標)タンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, Illinois, USA)により計測した。
30匹のBALBc/CF1マウス(27)の雌マウス(7〜10週齢)をランダムに3群に割り当てた。2群を尻尾の付け根に皮下注射で20μgのGLURP27-500−MSP3212-380ハイブリッド(gr7)、又は15μgのGLURP25-512と5μgのMSP3212-380(gr8)の混合液でそれぞれ免疫化した。三番目の群(gr9)は、15μgのGLURP25-512を尻尾の付け根に注射され、そして5μgのMSP3212-380を肩に注射された。全ての免疫原をMontanide(商標)で乳化し、そして各マウスを2週間の間隔で3回注射し、そして0、14、28、及び35日目に採血した。群gr7、8、及び9の動物から35日目に採取した貯蔵血清サンプル及び貯蔵された0日目サンプルから全IgGを、(NH4)2SO4沈殿により精製し、そして続いてDEAEカラム上で精製した。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を以前に詳細に記載されるとおりに行った(54)。GLURP25-512、MSP3212-380、及びGLURP27-500-MSP3212-380の被膜濃度は、それぞれ0.5、1.0、及び0.5μg/mlであった。マラリアに臨床的に免疫化されたリベリア人成人からの血漿、又はマラリアに晒されたことのないデンマーク人ドナーの血漿(51)、及びマウスの血漿の段階希釈を、各抗原で被膜されたELISAプレート上で試験した。そして吸光度を血漿希釈度に対してプロットした。異なる血漿サンプルにおいて、抗ハイブリッド抗体応答と抗GLURP抗体及び抗MSP3抗体応答のそれぞれを比較するために、抗体タイターを曲線の平行部分においてA492=1000の吸光度をあたえる血漿希釈度として定義した。
組換えGLURP25-518及びMSP3212-380並びにそれら二つの抗原の混合体を、様々な濃度(3.2×10-5μg/ml〜100μg/ml)でPBS中の1.25%(w/v)ミルク粉末液に希釈されたGLURP-MSP3ハイブリッドで免疫化されたマウスの貯蔵血漿に加えた。使用される血漿希釈液を約2500の吸光度(A492)を与えるように調節した。抗原-抗体混合体を4℃で一晩インキュベーションし、そして続いてGLURP-MSP3ハイブリッドで被膜したELISAプレートに対する反応性を測定した。
IFAを以前に報告されるように行った(5)。簡潔に説明すると、P.ファルシパルムNF54のシゾント期を主に含む薄いRBCフイルムを、リン酸緩衝生理食塩水(PBSpH7.4)中に段階希釈された精製マウスIgGを30分間、37℃で湿箱中でインキュベーションした。PBSで洗浄した後に、PBS中に1:300希釈されたマウス抗体をALEXA・Fluor結合ヒツジ抗マウスIgG(Molecular probe,USA)に晒した。洗浄した後にスライドをUV光の元で試験した。指標タイターは、目に見える免疫蛍光を産生する抗体の最大希釈度であった。
タンパク質C4カラム(VYDAC(商標)、214TP54、USA)を使用して、HPLCシステム(Phamacia, Sweden)上でサンプルを分析した。分析をアセトニトリル:H2O:TFA緩衝液システム中で行った。精製されたサンプルを1:2のA-緩衝液(H2O+0.1%(w/v)TFA)中に希釈し、そしてカラムにアプライし、直線的勾配0〜80%のB緩衝液(80%アセトニトリル+0.1%(w/v)TFA)カラム体積の20倍を使用して、溶出を行った。溶出をUV-Abs.214mmによりモニターした。ピークを集め、そしてHetoVac(Heto,Denmark)で吸引して乾燥し、そして次の実験まで4℃に維持した。
ペプチド・マス・マッピング用のサンプルを、クマシー染色されたSDS-PAGEゲルから切り出した。基本的に記載(44)されたとおりに、バンドの半分(約1μgのタンパク質)を洗浄し、乾燥し、還元し、そしてヨードアセトアミドでアルキル化し、その後に改変トリプシン(Promega,USA)により一晩切断した。切断後の液の上清を、Poros20R2逆相物質(PerSeptive,USA)で一杯にしたGELoader Tips(Eppendorff, Germany)にアプライし、そして0.8μlのα-シアノヒドロキシケイ酸(70%アセトニトリル/30%水中20μg/μl)を直接MALDI標的に溶出した(28)。レフレクター・モードで行われるPerSeptive Voyager STR(PerSeptive, USA)上で分析を行ない、そして結果をGPMAW ver.5.02(Lighthouse data, Denmark)において分析した。
RP−HPLCからの分画(約20μgタンパク質)について無処理タンパク質熱スプレー質量分析を行った。サンプルを乾燥し、そして5%ギ酸に20pmol/μlの濃度に再溶解し、その後にナノスプレー源を使用してマイクロマスQTOF(Micromass,UK)で分析した。
glurp79-1500及びMSP3628-1140領域をコードするPCR断片は並べてクローン化し、それによりベクターによりコードされるシグナル・ペプチドとGLURP27-500-MSP3212-380融合タンパク質との間でインフレーム融合(pKBR11、図1)を作り出す。このハイブリッドは、これらのglurpとMSP3断片を結合することにより作られる2個の追加のアミノ酸残基を含む。比較のために、個々のglurp73-1542とMSP3628-1140断片はまたクローン化される(pKBR8及びpKBR10、図1)。プラスミドをL.ラクチスMG1363中に形質転換し、そして得られた株を材料と方法において記載されるように発酵器中で成長させた。成長培地のpHを6に維持して、P170プロモーターからの最適の転写を達成した(33)。全ての3の組換えタンパク質を、培養上清中に分泌し、ここでHiTrapQ及びSPセファロース・カラム上の連続的イオン交換により精製し、続いて、フェニルセファロース上の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。続いて、SDS-PAGEにより、プラスミドpKBR11(レーン1)、pKBR8(レーン2)、及びpKBR10(レーン3)が136、100、及び36kDaの主要生成物をそれぞれ産生することが示された(図2A)。さらなる低分子量バンドが、精製されたGLURP及びMSP3標品ひおいて観察された。免疫ブロッティングにより分析されるとき、レーン2及び3における小さい生成物は、全長生成物と同様に、GLURP及びMSP3に対する抗体により特異的に認識され、それらはmRNAの不完全な翻訳からもたらされるか、及び/又はもとのタンパク質生成物をプロテアーゼが分解することによりもたらされるということが示唆された。SDS-PAGEで精製されたレーン2のバンドをMALDI・MSトリプシン・ペプチドマッピングすることにより、この低分子量タンパク質が、GLURP25-514からもたらされたということが確認された(データ未掲載)。GLURP27-500-MSP3212-380及びGLURP25-514標本の純度を、材料と方法において記載されるHPLCにより評価した。GLURP27-500-MSP3212-380及びGLURP25-514は、単一主要ピークを与えた(図2B)。ESMSにより測定すると、GLURP27-500-MSP3212-380及びGLURP25-514の分子量は、それぞれ74950と56518Da(±20Da)であった。2個の組換えタンパク質は各々、ベクターがコードするN末端に結合するアミノ酸残基、A−E−R−Sを含む(図1)と仮定すると、これらの分子量は、推定値74939と56518とよく一致する。こうして、GLURP27-500-MSP3212-380、及びGLURP25-514の組換えタンパク質は、無傷であり、予測されたアミノ酸残基を含む。
組換えタンパク質の抗原性は、マラリアに対し臨床的に免疫化されたリベリア人の71成人からの血漿に対して評価された(図3)。血漿サンプルの段階希釈は、各組換えタンパク質でコートされた分離されているプレート上で試験され、そして抗原-特異的タイターを、1000の吸光度を与える希釈度として定義した。予想されたように、異なる血漿は、異なる量のGLURP及びMSP3特異的IgG抗体を含んだ(図3A)。一般的に、ハイブリッド-特異的抗体タイターは、GLURP25-514及びMSP3抗原各々で記録された抗体タイターを超えており(図3B及びC)、ハイブリッド分子がGLURP及びMSP3抗原決定因子をそれぞれ適切に提示するということを示している。
GLURP-MSP3ハイブリッド分子が、GLURP25-514とMSP3212-380の個々の混合体と比較して、優れた免疫原であるかを決定するために、BALBc/CF1マウスの群をモンタニド中のハイブリッド分子で皮下的に免疫化するか、或いはGLURP25-514とMSP3212-380を1のシリンジ内で混合して免疫化するか若しくは2の異なる部位において別々に注射することにより免疫化した。三回目の注射の後に、35日目の血清をGLURP及びMSP3それぞれに対するIgG抗体反応性について試験した。GLURP-ELISAタイターの平均が、ハイブリッド群において、他の2つの群に比べてわずかに高かった一方、MSP3-ELISAタイターの平均は、ハイブリッドを受けた群において、MSP3212-380とGLURP25-514を二つの異なる部位で受けた群と比較(図4Aの群7と群9との比較)して、4.3倍高かった(Kruskal Wallis検定、P<0.004)。個々のレベルでは、ハイブリッドで免疫化されたマウスは、GLURPとMSP3ドメインの両方に強く反応する一方で、二つの分子を組み合わせて免疫化されたマウスは、GLURP又はMSP3のいずれかに対する優勢な抗体応答を高める傾向がある。抗−ハイブリッドIgG抗体は、ヒト抗体の周知のエピトープを含むP3、P4、P11、及びS3ペプチドに主に向けられているが(51)、そうしたエピトープを含まないペプチドP5とP9もまた認識される(図4B)。GLURP及びMSP3特異的IgGサブクラスの特性が、全てのワクチン製剤に類似している(図4C)一方で、GLURP特異的IgG抗体は、カッパー軽鎖を使用する傾向があり、そしてMSP3特異的IgG抗体は、ラムダ軽鎖を使用する傾向がある。この軽鎖の違いは、ハイブリッドで生じていようと個々の分子の混合体に対して生じていようと、全てのGLURP又はMSP−3特異的抗体について見つかっている。
ハイブリッドに対するマウス抗体の特異性は、競合−ELISAにより分析された(図5)。ハイブリッドに対する抗体は、純粋にGLURP及びMSP3に特異的であるようだ。なぜなら、溶解性のGLURP25-514とMSP3212-380の混合体が、完全に抗−ハイブリッド抗体の、固定GLURP27-500−MSP3212-380に対する結合を完全に阻害できるからである。こうして、GLURP−MSP3ハイブリッド分子のコンストラクトは、重なり合っている部位において新しいB細胞エピトープを作らなかった。
組換えGLURP及びMSP3の免疫原性は、原虫誘導タンパク質を3種の組換えタンパク質、つまりハイブリッド、GLURP25-514、及びMSP3212-380それぞれで免疫化されたマウスからの血清で免疫ブロッティングすることにより、調べられた。図6において示されるように、GLURP25-514、MSP3212-380、及びハイブリッドで免疫化されたマウス由来の血漿は、約220000Da(レーン1)、48000Da(レーン2)、及びその両方(レーン3)のポリペプチドをそれぞれ認識した。
20匹のBALBc雌マウス(7〜10週齢)を、ランダムに4の群に割り当て、そしてMSP3とGLURPの異なる組み合わせで皮下注射することにより免疫化した。
1. 群110を5μgのLR55で免疫化した。
2. 群111を5μgのLR67で免疫化した。
3. 尻尾の付け根に皮下注射することにより、群112を5μgのLR55と5μgのLR67の混合体で免疫化した。
4. 群113に尻尾の付け根で5μgのLR55を与え、そして5μgのLR67を肩に注射した。
全ての免疫原をモンタニドISA720中に乳濁化し、そして各々のマウスは、3回の注射を2週間の間隔で受けて、そして0、14、28、及び35日で採血された。
35日目の血漿サンプルの段階希釈液を、それぞれ0.5μg/mlのLR55又はLR67でコーとしたELISAプレート上で試験し、そして吸光度を、血漿希釈度に対してプロットした。抗体タイターを曲線の平行部においてA492=1.00の吸光度をあたえる血漿希釈度として定義した。
合成ペプチドに従って作られたMSP3とGLURPの混合体に対するバランスのとれた免疫応答を得るために適しているかどうかを確かめるために、BALBcマウスの4群を、それぞれ皮下注射で1)LR55(gr110)、2)LR67(gr111)、3)LR55とLR67を1のシリンジ内で混ぜ合わせたもの(gr112)、或いは4)LR55とLR67を離れた二つの部位に注射する(gr113)。血清を最初の注射から35日後に集め、GLURPとMSP3それぞれに対する抗体応答性を試験した。LR55又はLR67のみで免疫化されたマウスはそれぞれ、LR55又はLR67のいずれかに強く反応した(図7(a)及び7(b))。同様に、異なる部位に注射されて二つの分子で免疫化されたマウスは、GLURPとMSP3ドメインの両方に強く反応した(図7(d))、一方、1のシリンジ中の2個の分子の組合せで免疫化されたマウスは、LR55に対してのみ反応した(図7(c)。
この結果は、GLURP及びMSP3の個々の生成物の混合体が、GLURPとMSP3との間の抗原競合を起こすことなく、一のワクチン製剤において投与することができないということを強く支持する。
Claims (12)
- プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)由来の少なくとも1の別のタンパク質と遺伝子操作により結合されたプラスモジウム・ファルシパルム・グルタミン酸リッチ・タンパク質(GLURP)に由来する融合タンパク質、又は該融合タンパク質のホモログを含む、抗原に基く抗マラリア・ワクチン。
- GLURPに遺伝子操作により結合された前記タンパク質が、プラスモジウム・ファルシパルムのメロゾイト表面タンパク質3(MSP3)に由来する、請求項1に記載の抗原に基く抗マラリア・ワクチン。
- 配列番号1を含む、請求項2に記載のワクチン。
- プラスモジウム・ファルシパルム由来のタンパク質の免疫原性断片をさらに含む、請求項2又は3に記載のワクチン。
- 配列番号1を含む融合タンパク質又はそのホモログ。
- プラスモジウム・ファルシパルム由来の1以上のタンパク質の1以上の免疫原性断片をさらに含む、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 前記免疫原性断片が、CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA−175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pfl6、又はPf28から選ばれる、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 組換えラクトコッカスsp(Lactococcus sp)から請求項5〜7に記載の融合タンパク質を製造する方法。
- 配列番号2を含む核酸又はそのホモログ。
- 請求項6又は7に記載される融合タンパク質をコードする核酸。
- ワクチンの製造のための、請求項9又は10に記載される核酸の使用。
- 請求項9又は10に記載の核酸配列を発現する組換えBCGを含むワクチン。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019526274A (ja) * | 2016-07-21 | 2019-09-19 | ヴァック4オール・ピーティーイー・リミテッドVac4All Pte. Ltd. | 抗マラリアワクチンとしてのバイオ融合タンパク質 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2697022B1 (fr) * | 1992-10-19 | 1994-12-16 | Pasteur Institut | Antigènes de Plasmodium falciparum capables d'induire des anticorps protecteurs à large spectre - Application à la vaccination. |
US20030161840A1 (en) * | 1992-10-19 | 2003-08-28 | Institut Pasteur | Plasmodium falciparum antigens inducing protective antibodies |
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WO2013082394A1 (en) * | 2011-11-30 | 2013-06-06 | The Regents Of The University Of California | Immunogenic plasmodium falciparum antigen compositions and uses thereof |
CN102533677B (zh) * | 2012-01-10 | 2013-07-24 | 特菲(天津)生物医药科技有限公司 | 一种疟疾疫苗及其制备方法 |
CN104321316B (zh) | 2012-01-19 | 2018-01-19 | 不列颠哥伦比亚大学 | 3’平伏氟取代的神经氨酸酶抑制剂化合物、组合物及其用作抗病毒剂的方法 |
CN105652009B (zh) * | 2014-11-11 | 2018-04-24 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 可用于辅助诊断疟疾的试剂盒 |
CN105628928A (zh) * | 2014-11-11 | 2016-06-01 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | 可用于辅助诊断疟疾的试剂盒 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04501661A (ja) * | 1988-09-16 | 1992-03-26 | スターテンス セルミンスティチュト | マラリア抗原 |
JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びH.influenzaeのプロテインD由来の担体を含む免疫原 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5231168A (en) * | 1988-09-16 | 1993-07-27 | Statens Seruminstitut | Malaria antigen |
EP0434751A1 (en) * | 1988-09-16 | 1991-07-03 | Statens Seruminstitut | A malaria antigen |
FR2697022B1 (fr) * | 1992-10-19 | 1994-12-16 | Pasteur Institut | Antigènes de Plasmodium falciparum capables d'induire des anticorps protecteurs à large spectre - Application à la vaccination. |
WO2002092628A2 (fr) * | 2001-05-16 | 2002-11-21 | Institut Pasteur | Antigenes de plasmodium falciparum et leurs applications vaccinales et diagnostiques |
DK200201741A (da) * | 2002-11-12 | 2003-09-16 | Statens Seruminstitut | Vaccine comprising chimeric malaria proteins derived from Plasmodium falciparum |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04501661A (ja) * | 1988-09-16 | 1992-03-26 | スターテンス セルミンスティチュト | マラリア抗原 |
JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びH.influenzaeのプロテインD由来の担体を含む免疫原 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6009042381, Scand.J.Immunol.,Vol.56,No.4(2002.Oct.)p.327−343 * |
JPN6009042382, Infect.Immun.,Vol.68,No.5(2000)p.2617−2620 * |
JPN6009042384, Blood,Vol.84,No.5(1994)p.1594−1602 * |
JPN6009042385, Memorias do Instituto Oswaldo Cruz,Vol.94,Suppl.2(1999)p.216 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019526274A (ja) * | 2016-07-21 | 2019-09-19 | ヴァック4オール・ピーティーイー・リミテッドVac4All Pte. Ltd. | 抗マラリアワクチンとしてのバイオ融合タンパク質 |
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