JP2019526274A - 抗マラリアワクチンとしてのバイオ融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒトにおけるマラリアの原因となる寄生虫(特に、Plasmodium falciparumを含む)は、ヒト宿主において異なる形態を示し、感染宿主の生物におけるそれらの局在に応じて異なる抗原を発現する。ヒトにおけるそれらの生活環におけるこれらの寄生虫の形態的及び抗原的な差異により、少なくとも4つの区別可能な発達段階が可能になる。ヒトにおける寄生虫の非常に初期の発達段階は、寄生虫の昆虫ベクターの咬傷によって宿主の血中に導入されるスポロゾイト形態に対応する。第2の段階は、肝臓への寄生虫の通過及び肝細胞の感染に対応し、この段階では、寄生虫は発達して肝臓シゾントを形成し、これらは成熟すると(例えば、P. falciparumの場合にはスポロゾイトの浸透後6日目に)、破裂によって肝臓メロゾイトを放出する。第3の段階は、無性形態(血液期シゾント)の寄生虫が赤血球に感染し、それらが成熟すると、遊離メロゾイトが放出されることを特徴とする;この赤血球期の発達は、疾患の病原相に対応する。第4の段階は、生殖能力を有する形態(又は生殖母体)の形成に対応し、これは、蚊における細胞外生殖形態又は配偶子になるであろう。
定義
「ワクチン」は、疾患の予防及び/又は治療のために免疫を発生させるための組成物を意味すると理解すべきである。したがって、ワクチンは、抗原を含む医薬であり、ワクチン接種によって特定の防御及び保護物質を生成するために、ヒト又は動物において使用されることを目的とする。本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、マラリアに対する部分的又は完全な保護を誘発することができる免疫原性組成物を意味する。ワクチンは、感染に対して予防的であり得、及び/又は感染個体において治療的であり得る。
担体異種タンパク質配列は、有利には、ジフテリアトキソイドの交差反応物質(CRM)、ジフテリアトキソイド(D)、非毒性突然変異体リコンビナントPseudomonas aeruginosaエキソプロテインA(repA)、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体(OMPC)、破傷風トキソイド(T)、H. influenzaプロテインD(hiD)及びそれらの免疫原性フラグメントからなる群より選択され得る。
本発明の融合タンパク質構築物は、Plasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含む少なくとも1つの抗原性配列を含む。
特定の実施態様では、融合タンパク質は、担体配列としてのCRM197又はその免疫原性フラグメントに融合されたMSP3(好ましくは、MSP3−1)、LSA3、LSA5(PEBSとも称される)又はそのエピトープフラグメントを抗原性配列として含むか、又はそれからなる。
本発明の融合タンパク質は、任意のリコンビナント技術によって作製され得る。したがって、本発明の別の態様は、前記融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
融合タンパク質は、場合によりアジュバントと組み合わせて、生理学的に許容し得るビヒクルと併せて医薬組成物に製剤化される。
免疫原性組成物又はワクチンは、多成分/多抗原免疫原性組成物又はワクチンであり得る。
発現構築物の生成及びEscherichia coliにおけるバイオ融合タンパク質の産生
そのN末端及びC末端の両方においてマラリアペプチド抗原に共有結合的に連結された解毒化ジフテリア毒素CRM197から構成されるキメラ免疫原をコードする遺伝子配列(図1)を化学合成し(GenScript)、E. coliにおける産生のためにコドン最適化した。発現プラスミドpET−26a(Novagen)におけるクローニングのために、NcoI及びXhoIの制限部位を5’末端及び3’末端にそれぞれ付加した。配列決定によってシャトルプラスミドpUC57に挿入された配列をチェックし、迅速に凍結乾燥した(4μg)。
三角フラスコ中、小規模培養スケール(1L)で、リコンビナントタンパク質産生の持続期間、インデューサー(IPTG)の濃度及び温度などのパラメータを分析した。定常状態一晩培養物 5mlを1L(1:200)で希釈し、600nmの光学密度 0,7〜0,8まで30℃でさらに培養した。2つのIPTGインデューサー濃度 0.1及び1mMを用いて、3つの温度 22、30及び37℃で、リコンビナントタンパク質発現の誘導をアッセイした。22℃で一晩培養し、0.1mM IPTGによって誘導した後、最良のリコンビナント収量が得られた。
実験室スケール(1〜2リットル)の生産を行って、マウス及び霊長類モデルにおいて前臨床免疫原性研究を行うために十分なPP21リコンビナントタンパク質を得た。
−遠心分離(4000g、30分間、4℃)によって、細菌細胞を回収した。
−細菌ペレットをバイオマス 1グラム当たり溶解バッファー(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM イミダゾール、pH8.0) 5mLに懸濁した。
−溶解物を1mg/mL リゾチームと共に氷上で30分間振盪した。
−冷却間隔を30秒間とし、150W、530秒間のバーストによって、細菌を溶解した。
−一式のプロテアーゼ阻害剤(Roche)を加えた5μg/mL DNAse I及び10μg/mL RNAse Aと共に、溶解物を氷上で30分間振盪した。
−10000g、4℃で30分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。
−溶解物を0,22μm篩でろ過し、4℃のロッキングトレイ上、容量 20mLで、NiNTA樹脂 200μLと共に一晩インキュベーションした。
−溶解バッファー 容量40mLで樹脂を十分に5回洗浄した。分析のために、第1段階の上清(樹脂インキュベーション後の溶解物)のアリコートを保存した。遠心分離工程は、200gで5分間以下であった。
−250mM イミダゾールを5倍含有する溶解バッファー 500μL中で樹脂をインキュベーションすることによって、リコンビナントタンパク質を回収した。
−溶出画分をプールし、30kDa篩による限外ろ過によってPBS pH7.3に対して透析した。
遠心分離(4000g、30分間、4℃)によって、細菌細胞を回収した。
細菌ペレットをバイオマス 1グラム当たり変性溶解バッファー(100mM NaH2PO4、10mM トリス−Cl、8M 尿素、NaOH pH8.0) 5mLに懸濁した。
溶解物を氷上で30分間振盪した。
冷却間隔を30秒間とし、150W、530秒間のバーストによって、細菌をさらに溶解した。
10000g、4℃で30分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。
溶解物を0,22μm篩でろ過し、4℃のロッキングトレイ上、容量 20mLで、NiNTA樹脂 200μLと共に一晩インキュベーションした。
変性溶解バッファー 容量40mLで樹脂を十分に5回洗浄した。分析のために、第1段階の上清(樹脂インキュベーション後の溶解物)のアリコートを保存した。遠心分離工程は、200gで5分間以下であった。
250mM イミダゾールを5倍含有する溶解バッファー 500μL中で樹脂をインキュベーションすることによって、リコンビナントタンパク質を回収した。
溶出画分をプールし、30kDa篩による限外ろ過によってPBS pH7.3に対して透析した。
ウエスタンブロッティングによって評価した貯蔵温度に応じたPP21の安定性は、図4に示されている。温度 6℃の冷蔵庫における21日間の貯蔵期間後、分解の兆候は観察されなかった。室温では、PP21は、同じ期間で分解の兆候を示し始めたのに対して、37℃では8日後に完全に分解された。しかしながら、それはGMP製造製品ではなく、微量のプロテアーゼを含有し得るので、この不安定性は推定内因性分子の不安定性に帰することはできない。
PP22;MSP3−2の配列(斜体下線)(PlasmodB ID:PF3D7_1035500)、残基178〜257(79aa)
PP23;MSP3−2の配列(CRM197の前の斜体下線)(PlasmodB ID:PF3D7_1035500)、残基178〜257(79aa)及びMSP3−3(CRM197の後の斜体)(PlasmodB acc.Nbr PF3D7_1035600)、残基246〜307(61aa)
PP25;LSA−3の配列(斜体下線)(PlasmodB ID:PF3D7_0220000)、残基176〜325(150aa)
LSA5−CRMタンパク質配列(配列番号:89)
Balb/c又はC57Bl/6マウス 4〜5匹の群は、リン酸緩衝生理食塩液pH7.2(PBS) 100μlで希釈してアジュバントMontanide ISA 720 100μlで乳化したMSP3−1−LSP 10μg又はPP21 1μgの2回又は3回の注射を受けた。皮下注射によって免疫化を実施し、15日間おいて1回又は2回反復した。2回目の注射の2週間後から開始して尾を出血させることによって、血液収集を実施し、初回抗原注射の160日後まで15日間隔で反復した。血清を分離し、使用まで−20℃で貯蔵した。並行して同時に処理した他の群は、PP21 1μg又は0.2μgのいずれかを投与した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって、マウス血清中のMSP3−LSP特異的抗体力価を決定した。PBSで希釈した2μg/ml MSP3−1−LSP又はMSP3−1−LSPペプチドa、b、c若しくはdの1つで平底マイクロタイトレーションプレート(Nunc-Thermo Scientific, USA)を4℃で一晩コーティングした。洗浄(PBS、pH7.2)及び飽和(PBS、3%脱脂乳)後、(PBS、3%脱脂乳、0.05%Tween20で希釈した)試験血清の系列希釈物を追加し、1時間インキュベーションした。ネガティブコントロールは、免疫前マウス血清からなる。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(H+L)(Invitrogen, USA)を1時間追加し、続いて、ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン(Amresco, USA)を追加することによって、特異的抗体を明らかにした。特異的抗体力価は、最後の陽性希釈の逆数に対応する。
ヒト脾臓は、レバノンのNational Organization for Organ & Tissues Donation & Transplantation (NOOTDT)との倫理的合意にしたがって、死亡した臓器移植ドナーから入手した。存命中に患者自身が、又はその死亡後に患者の両親が、移植又は科学研究のための臓器提供に関するインフォームドコンセントに署名した。
以前に記載されているように(Brams P, 1998)、外科的切除後24時間以内に、ヒト脾臓を加工した。簡潔に言えば、脾臓組織を解剖し、細胞懸濁液を調製した。ゲイ溶液を使用して、赤血球を25℃で5〜10分間溶解した。洗浄後、37%ウシ胎仔血清(FCS)(Sigma,USA)、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma,USA)及び53%RPMI1640(Sigma,USA)からなる培地に白血球を再懸濁し、次いで、使用まで液体窒素中で凍結保存した。各脾臓ドナーから単離した細胞の平均数は、100±40億個であった。
NOD.Cg−Prkdcscid−IL2rγtm1WjI/SzJ(NSG)マウスは、The Jackson Laboratories (USA)から入手し、無菌マイクロアイソレーター中で飼育した。食物、水、ケージ及び寝具は全て、使用前にオートクレーブ処理した。6〜8週齢のNSGマウスを実験に入れた。
ELISAによって、これらの決定を実施した。簡潔に言えば、マウス血清中の総ヒトIgGの検出のために、0.1M炭酸バッファー、pH9.5中の2.5μg/ml精製ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Invitrogen, USA)で平底マイクロタイトレーションプレート(Nunc-Thermo Scientific, USA)を4℃で一晩コーティングした。洗浄(PBS、pH7.2)及び飽和(PBS、3%脱脂乳)後、(PBS、3%脱脂乳、0.05%Tween20で希釈した)試験血清を追加し、1時間インキュベーションした。ネガティブコントロールは、同じ動物の免疫前マウス血清からなっていた。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Invitrogen, USA)を1時間追加し、続いて、ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン(Amresco, USA)を追加することによって、ヒトIgGを明らかにした。標準的なヒトIgG溶液(Zymed, USA)と比較して、Hu−SPL−NSGマウス血清中の総ヒトIgG濃度を計算した。PBS中2.5μg/ml MSP3−1−LSPでプレートをコーティングしたことを除いて、抗原特異的抗体の検出について同じ試験を実施した。この場合、ネガティブコントロールは、Plasmodiumに感染したことがない個体の血清からなっており、ポジティブコントロールは、過免疫アフリカ人成人由来の血清のプールからなっていた。両方の場合において、抗体力価を決定するために、各血清の系列希釈物を試験した。特異的抗体力価決定のために、カットオフ(ネガティブコントロールOD×2)を超える吸光度が得られた場合、試験を陽性とみなした。ヒトIgGサブクラスに特異的な二次マウスモノクローナル抗体(それぞれ最終希釈 1/4,000、1/10,000、1/10,000及び1/60,000でクローンNL16[IgG1;Skybio, UK]、HP6002[IgG2;Sigma-Aldrich, Germany]並びにZg4及びGB7B[それぞれIgG3及びIgG4;Skybio, UK)を使用した)、続いて、PBSで1/4000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Invitrogen)を使用して、IgGサブクラスの検出を実施した。
完全RPMI1640培地中、免疫化抗原での刺激あり又はなしで、免疫化及び非免疫化マウスの脾臓細胞を細胞 2×106個/mlで培養した。24時間の培養後、RNeasy Mini Kit (Quiagen, Germany)を使用して、全細胞RNAを抽出した。反応混合物 20μl中で、RevertAid M-MuLV enzyme (RevertAid kit First Strand Synthesis kit, Thermo Scientific Fermentas)を使用して、逆転写を行った。簡潔に言えば、オリゴdT18プライマー 1μlを全RNA 約400ngに追加し、混合し、65℃で5分間インキュベーションした。製造業者が推奨するように、チューブを氷上に数分間置き、短時間遠心分離してから、5×反応バッファー、Ribolock Rnase阻害剤(20u/μl)、dNTP(10mM)及び逆転写酵素(200u/μl)を追加した。反応混合物を42℃で60分間インキュベーションした。70℃で5分間加熱することによって、酵素を不活性化した。定量的PCRを使用して、Th1又はTreg細胞に特徴的であると考えられる異なるヒトサイトカイン、ケモカイン及び転写因子の相対的発現を測定した。製造業者が推奨するように、LightCycler 480 SYBR Green Master, La Rocheを使用して、PCR混合を実施した。PCR増幅をLightCycler 480 machine (La Roche)において95℃で5分間(1サイクル)実施し、続いて、95℃で10秒間及び55〜57℃で10秒間のインキュベーションを45サイクル行った。各サンプルを3回反復でランした。内部標準として使用したハウスキーピング遺伝子は、ベータアクチン(βアクチン)及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT1)(geNorm analysis)であった。作成したPCR曲線に基づいて、サイクル閾値(Ct)を計算した。2ΔΔCt法によって、相対的発現量を計算した。
主にP. falciparum(3D7)の成熟シゾントを含有する赤血球培養物由来の風乾したアセトン固定薄層塗抹標本を使用して、免疫蛍光アッセイを実施した。PBS−1%ウシ血清アルブミンで希釈したHu−SPL−NSG血清を加湿チャンバー中、37℃で1時間インキュベーションした。PBSで洗浄した後、エバンスブルー対比染色(1/200)と共にPBSで1/400希釈したAlexaFluorコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Molecular Probes及びInvitrogen)を使用することによって、抗体を検出した。
実施例1:PP21(CRMP97−MS3融合構築物)の免疫原性
以下の動物モデル:
・BALB−Cマウス
・C57BLマウス
・Saimiri sciureusサル
・ヒト免疫原性マウスモデル(HIMM)
において、PP21によって誘導された免疫応答を評価した(免疫不全NSGマウスに移植したヒト脾臓組織由来の細胞をin vivoで免疫化し、免疫化動物由来の血清及び細胞を免疫アッセイに使用する)。
使用した全てのモデルにおいて、PP21は、ベンチマーク抗原MSP3−LSPよりも高い血清学的応答のターゲット細胞親和性サブクラスを誘導する。
LSA3は、多くの魅力的な特徴を有する前赤血球期抗原であり、保護志願者と非保護志願者のディファレンシャルな応答の対比によって発見され、系統間で保存されており、高等霊長類及びチンパンジーを含む広範囲の動物において非常に抗原性かつ免疫原性であり、後者の場合には、スポロゾイト期のヒト寄生虫Plasmodium falciparumによる大規模チャレンジに対して保護的な免疫応答を誘導する。保護は、抗原特異的インターフェロンガンマ応答に関連する。コンジュゲートもいかなる融合も伴わないLSA3(DG729)を使用したコントロール構築物とPP25の免疫原性を比較した。免疫化及び免疫分析の条件は、PP21に関する上記のものと同一である。
MSP3−1とCRM及びLSA3との融合に依拠するPP21を用いて得られた結果は、CRMを有する構築物(PP23と称される)において、赤血球期由来の他の抗原、例えばMSP3−2及びMSP3−3を使用して再現可能であることが証明された。実際、HIMMモデルに移植したヒトリンパ球では、構築物PP23(MSP3−2−CRMP97−MSP3−3)によって、強いB細胞応答及びT細胞応答が誘発され(図27)、力価は、Montanide中MSP3−2 CTのみで免疫化したマウスよりも平均10倍高い。抗体サブクラスは、ADCI機構において単球と協調して作用することができる主要な細胞親和性クラスであるIgG1クラスが優位であった。MSP3−2又はMSP3−3のいずれかによってin vitroで再刺激したPP23免疫化ヒトリンパ球によるIFN−γ分泌によって測定したところ同様に強いT細胞応答が誘導された。
PEBS(前赤血球期及び血液期抗原)としても公知の肝臓期抗原−5(LSA−5)又はSR 11.1(11.1 P.falciparum遺伝子のサブ領域)は、単一分子中にMSP3及びLSA3の両方の特徴を併せ持つ。それは、メガ遺伝子Pf 11.1の残りとそれとを区別するユニークな配列を含有し、系統間で完全に保存されている。それは、前赤血球期及び無性血液期の両方に対する保護を誘導するので、放射線弱毒化スポロゾイトで免疫化した志願者由来の血清によってそれが認識されたことはユニークである。それは、前赤血球期及び血液期の両方において発現される。前赤血球期に対するLSA5の保護的役割は、収束in vitro侵入阻害研究、抗LSA5抗体の受動伝達によるin vivo保護によって、及びリコンビナントLSA5のワクチン接種によるチャレンジから保護された霊長類における概念実証研究によって裏付けられている。血液期に対して、天然に存在するヒト抗Pf LSA5抗体及び人工的に誘導された動物抗Pf LSA5抗体は両方とも、寄生虫殺傷ADCI媒介性効果を発揮する。流行地域の個体では、抗原性が高く、相関免疫(すなわち、曝露によって誘導される保護)を有する個体では、IgG3抗体が優位である。多数の疫学的研究により、臨床的マラリア発作に対する保護と、薬物処置脳マラリアの予後の改善との強い関連性が見出された。最後に、LSA5は高度に免疫原性であり、マウスにおいて顕著に高い力価を達成し、MSP3免疫化マウス由来の血清よりも高いADCI活性を達成する。
Claims (17)
- 担体異種タンパク質配列のN末端及び/又はC末端に融合された少なくとも1つの抗原性アミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、該抗原性配列がPlasmodiumタンパク質のエピトープ配列を含み、該担体異種タンパク質配列がヒトにおいて免疫原性の配列である、融合タンパク質。
- 担体異種タンパク質配列が、ジフテリアトキソイドの交差反応物質(CRM)、ジフテリアトキソイド(D)、非毒性突然変異体リコンビナントPseudomonas aeruginosaエキソプロテインA(repA)、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体(OMPC)、破傷風トキソイド(T)、H. influenzaプロテインD(hiD)及びそれらの免疫原性フラグメントからなる群より選択され、担体異種タンパク質配列が、好ましくは、CRM197又はその免疫原性フラグメントであり、このフラグメントが、好ましくは、フラグメントA、膜貫通ドメインT、CRM197のレセプター結合ドメインR、CRM197のアミノ酸配列1〜190及びCRM197のアミノ酸配列1〜389からなる群より選択される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 抗原性配列が、赤血球期においてPlasmodiumによって発現される抗原性タンパク質又はそのエピトープフラグメントである、請求項1又は2のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 抗原性配列が、MSP3、LSA5(PEBS又は11−1のサブ領域とも称される)、Glurp R0及びR2、SERP、P27及びP27A、P45、P90及びP77、P14、P181、MSP1−Block 2、MSP2、GBP130、タンパク質332、タンパク質11−1、MSP4又はそれらの任意のエピトープフラグメントからなる群より選択され、抗原性配列が、好ましくは、MSP3又はそのエピトープフラグメントであり、このフラグメントが、好ましくは、MSP3−1、MSP3−2、MSP3−3、MSP3−4、MSP3−7及びMSP3−8の中から選択されるPlasmodium MSP3タンパク質、好ましくはMSP3−1のC末端領域のモチーフa、b、c、d、e及び/又はfを包含する、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 抗原性配列が、前赤血球期においてPlasmodiumによって発現される抗原性タンパク質又はそのエピトープフラグメントである、請求項1又は2のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 抗原性配列が、LSA3、LSA5(PEBS又は11−1のサブ領域と称される)、CS、Trap及びSalsa並びにそれらの任意のエピトープフラグメントからなる群より選択される、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 抗原性配列が、Pf25、Pf45/48、Rh5、AMA1、MSP1−19、MSP1−42、MSP2、MSP4−5、Var CSA及びそれらの任意のエピトープフラグメントからなる群より選択される、請求項1又は2のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 担体配列としてのCRM197又はその免疫原性フラグメントに融合されたMSP3、好ましくはMSP3−1、LSA3、LSA5又はそのエピトープフラグメントを抗原性配列として含む、請求項1〜6のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 担体タンパク質配列のC末端及びN末端にそれぞれ位置するか、又は同じ末端に両方とも位置する2つの抗原性配列を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つのアミノ酸配列が、ペプチドリンカーによって担体異種タンパク質配列のN末端及び/又はC末端に連結されており、該ペプチドリンカーが、好ましくは、1〜35アミノ酸、好ましくは5〜20アミノ酸の配列である、請求項1〜8のいずれかに記載の融合タンパク質。
- ペプチドリンカーが、(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)n、(Gly)n又は(EAAAK)n(nは、1〜4、好ましくは1〜3である)である、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜11のいずれかで定義される融合タンパク質をコードする、核酸構築物。
- 発現カセットにおいて請求項12に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
- 請求項13に記載のベクターが挿入されている、宿主細胞。
- 請求項1〜11のいずれかで定義される融合タンパク質を調製するためのin vitro方法であって、請求項12で定義される核酸構築物の発現を誘導する条件下で請求項14に記載の宿主細胞の複製を可能にすること、及びこのようにして発現された該融合タンパク質を収集することを含む、in vitro方法。
- ワクチンであって、生理学的に許容し得るビヒクルと共に、請求項1〜11のいずれかで定義される融合タンパク質、又は少なくとも2つの異なる抗原性アミノ酸配列をそれぞれ含む少なくとも2つの請求項1〜11のいずれかで定義される融合タンパク質の組み合わせ、又は請求項12で定義される前記融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む、ワクチン。
- マラリアに対するヒト被験体のワクチン接種において使用するための、請求項16に記載のワクチン。
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