CN111658770A - P14.7蛋白质及其作为疫苗佐剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了不使用常规佐剂(如铝盐佐剂，水包油乳剂佐剂，Toll样受体激动剂佐剂等)刺激针对抗原的免疫应答的组合物及该组合物的制作和使用方法。该组合物含有p14.7蛋白质和需要刺激的免疫反应的抗原。p14.7蛋白质起着佐剂作用，使得对包含p14.7的组合物刺激的抗原的免疫应答强于单独抗原刺激的免疫应答。该本发明提供了一种生产热稳定疫苗的方法和一种通过疫苗冻干处理来避免冷链维持的简单策略。
Description
发明领域
本发明涉及疫苗，更具体地说，涉及能增强该疫苗针对抗原免疫应答的疫苗佐剂。
背景技术
疫苗接种是现代医学中预防和控制疾病最经济，最有效的措施之一。自从1796年Edward Jenner第一次使用天花疫苗以来，疫苗便成为根除疾病不可或缺的手段之一(GaryJ.Nabel，2013)。疫苗被用来引发针对特定抗原的特异性免疫应答。例如，针对病毒或细菌的疫苗被用来预防或限制由相应病原体引起的感染(I.P.Nascimento等，2012)，针对肿瘤特异性抗原的疫苗被用来治疗肿瘤(Tagliamonte M等，2014)。然而，对于未受过刺激的免疫系统，靶抗原通常自身不能刺激强烈的免疫反应。特别当靶抗原是分离的或合成的肽化合物时，免疫系统常常不能产生强烈的免疫应答。为了克服这一点，商业疫苗制剂通常不仅包含靶抗原，而且还包含疫苗佐剂(Alberta Di Pasquale等，2015)。
疫苗佐剂是能增强机体对靶抗原特异性免疫反应的颗粒，固体或可溶性试剂。疫苗佐剂以各种方式增强机体对靶抗原的免疫应答。疫苗佐剂常被用来增强弱抗原的免疫原性和弱抗原的疫苗效力。疫苗佐剂也常被用来提高对强抗原的免疫反应速度，活力和持久性。疫苗佐剂还可在免疫系统不成熟，免疫抑制或衰老的个体中作为免疫增强剂使用。此外，疫苗佐剂可以有效地减少抗原剂量，有效地减少提供保护所需的疫苗注射次数(RobertL等，2010；Marciani DJ，2003)。
1926年Glenny及其同事观察到被铝盐沉淀的白喉类毒素能刺激出比可溶性白喉类毒素更强的免疫反应(A.P.C.Glenny等，1926)，从此抗原与含铝佐剂一直被混合着使用。在医药中使用最广泛的疫苗佐剂是含铝佐剂，它以铝盐的形式存在于人类和兽类的疫苗中。对于成分中含有铝盐佐剂的疫苗，疫苗的稳定性是一个需要考虑的问题。含有铝盐佐剂的疫苗在经历冻和融的过程后免疫功效会明显降低。冻和融的过程会导致含有铝盐佐剂的疫苗附聚和疫苗效力的丧失。此外，铝盐佐剂虽然能刺激对特定抗原的强烈免疫反应(Baylor NW等，2002)，但有多篇文献报道它可能会有一定程度的毒性作用(神经毒性，引发自身免疫等)(Kumar V等，2009；Shaw CA1等，2013)。铝盐作为疫苗佐剂的安全性问题仍然需要继续关注(Tomljenovic L.等，2011)。
由于与传统的铝盐佐剂相比，水包油型乳液佐剂引发免疫反应的质量大幅提高，水包油型乳液佐剂正越来越多地被用于疫苗中(G.Leroux-Roels，2010；F.R.Vogel等，2009)。然而，大多数水包油型乳液佐剂不能冷冻或冻干保存，并且当长期储存为液体共制剂时，水包油型乳液佐剂可能对蛋白质抗原的稳定性具有有害影响。通常，蛋白质抗原和水包油型乳液佐剂必须在施用前混合在一起才能获得最佳免疫效果(G.L.B.Gary Ott等，1995)。
Toll样受体(TLR)类别佐剂涵盖了极其广泛的病原体衍生化合物，包括核酸，脂肽，糖脂，及其类似物等(Petrovsky N等，2004)。所有的TLR激动剂可以通过TLR衔接蛋白，MYD88和TRIF来激活炎性转录因子NFkB(Verstak B等，2007)。NFkB活化的结果之一是产生热原和炎性细胞因子。有多篇文献报道NFkB的活化与慢性炎症和自身免疫疾病有关(Collins SE等al，2014；Akbar Mohammad Hosseini等，2015)。
许多疫苗具有热不稳定性的特征，这对有冷链管理困难的国家在疫苗的分发和储存方面提出了挑战(Brandau DT等，2003)。开发具有热稳定性的疫苗将有助于疫苗在这些冷链管理存在困难的地区分发。开发具有热稳定性的疫苗还将有助于减少由于各种原因导致疫苗储存温度超过或低于规定的储存温度而造成疫苗失效所产生的资源浪费。人们发现蛋白质产品进行冻干处理后可以保持一定的热稳定性。然而含有铝盐佐剂或水包油乳液佐剂的疫苗通常不能冻干处理。因而，开发能进行冻干处理的，具有热稳定性的疫苗就有非常大的意义。疫苗进行冻干处理有利于疫苗的分发和储存，特别是在冷链管理有困难的地区。另外，疫苗进行冻干处理后可提供更长的产品保质期。迄今为止，市场上的冻干疫苗不直接含佐剂，而是提供双瓶系统，在其使用前需要临时把双瓶系统中的成分混合在一起。这种双瓶系统疫苗会给具体使用过程造成很大的不方便。
世界卫生组织(WHO)指南和疫苗产品使用说明书建议除口服脊髓灰质炎疫苗外所有疫苗在国内分发过程中应储存在2-8℃温度之间。这会给在全球范围实施此类疫苗防疫计划带来重大的财政困难和技术障碍。此外，在自然灾害期间，电能供应不稳定情况下，冷链状态的维护常常是很困难的。开发不需要冷链维护的佐剂疫苗将大大降低在全球范围内实施疫苗防疫的成本以及解决重大技术障碍，特别是在资源匮乏的地区意义更加重大。
因此有必要开发出更安全和更方便使用的佐剂疫苗，有必要开发出具有热稳定性的佐剂疫苗，这种佐剂疫苗在一定的温度范围内具有更好的稳定性，并且能保持其引发针对疫苗抗原的免疫应答能力。如本文所公布的，本发明满足上述这些需求。
发明内容
本发明涉及具有佐剂活性的小分子量蛋白p14.7，本发明涉及包含小分子量蛋白p14.7的疫苗，本发明还涉及以小分子量蛋白p14.7作为佐剂用于预防或治疗疾病。
在一个实施方案中，免疫原性组合物(即疫苗)是所述p14.7蛋白和所述抗原，或免疫原性组合物是编码所述p14.7蛋白和所述抗原的的核酸。
在一个实施方案中，p14.7蛋白和抗原直接连接在一起，或编码所述p14.7蛋白的核酸和编码所述抗原的核酸直接连接在一起。
在一个实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物的用途，该免疫原性组合物用于制备诱导针对所述抗原的免疫应答药物，该免疫应答药物包含所述p14.7蛋白和所述抗原，或包含编码所述p14.7蛋白和编码所述抗原的的核酸。
在一个实施方案中，免疫原性组合物是以单链形式存在的p14.7-抗原融合蛋白。以单链形式存在的p14.7-抗原融合蛋白有利于该免疫原性组合物进行冻干处理。
通过阅读以下具体实施方案的非限制性描述，本发明的目的，优点和特征将变得更加明显和容易理解。以下所给参考附图仅作为示范。
附图说明
图1显示了用重组蛋白接种的小鼠的抗体应答。质粒pcDNA3-CH2CH3被用于转染HEK293细胞。CH2CH3蛋白稳定表达细胞系，命名为HEK293CH2CH3，是通过G418药物从pcDNA3-CH2CH3转染的HEK293细胞中筛选而得到。CH2CH3是人Ig G基因重链恒定区域2和区域3。不同的小鼠血清被用来染色HEK293CH2CH3细胞。图1A显示HEK293CH2CH3细胞用未接种重组蛋白的小鼠血清染色的实验结果；图1B显示HEK293CH2CH3细胞用CH2CH3重组蛋白接种的小鼠血清染色的实验结果；图1C显示HEK293CH2CH3细胞用p14.7-CH2CH3重组蛋白接种的小鼠血清染色的实验结果；图1D显示亲本HEK293细胞用p14.7-CH2CH3蛋白接种的小鼠血清染色的实验结果。
定义
本发明所用的术语“疫苗”是指提高对特定疾病的免疫力的生物制剂。疫苗通常含有类似致病微生物的成分，并且常常由减弱或灭活的微生物制成，或者由微生物毒素或其表面蛋白质之一制成。
本发明所用的术语“抗原”是指一种分子，当它被用来接种宿主时能够刺激宿主的免疫系统产生细胞特异性免疫应答和/或体液特异性免疫应答。类似地，在体内表达免疫原性蛋白质或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸也包括在抗原的定义中。
本发明所用的术语“佐剂”是指该成分添加或连接到免疫原性物如抗原时，能增强或加强宿主对免疫原性物的免疫应答。本发明所用的术语“佐剂活性”是指当佐剂和抗原一起使用时对抗原的的免疫应答/反应强于抗原单独使用的免疫应答/反应。
本发明所用的术语“变体”是指5型腺病毒E3，p14.7蛋白，或其同源物，或其直向同源物，或其旁向同源物的其中一种或多种氨基酸已被修饰或修改，但保留了佐剂活性。修饰或修改可以是：从p14.7蛋白序列删除一个或多个连续或非连续氨基酸；p14.7蛋白序列的一个或多个氨基酸的被取代；p14.7蛋白序列的一个，两个，三个或更多个氨基酸的延伸。
同源物：某一基因与另一相关的基因来自共同的祖先基因。术语“同源物”可适用于通过物种分离形成的基因(参见直向同源物)或通过基因复制产生的基因(参见旁向同源物)。由相关基因编码的蛋白质也可以被命名为同源物。
直向同源物：直向同源物是不同物种中的基因，它们从共同的祖先基因进化而来。直向同源物通常在进化过程中保留相同的功能。直向同源物可能会丢失或获得某种功能。由相关基因编码的蛋白质可以也被命名为直向同源物。
旁向同源物：旁向同源物是同一基因组内由基因重复复制而形成的相关基因。直向同源物在进化过程中保留相同的功能，而旁向同源物进化出新的功能。由相关基因编码的蛋白质也可以命名为旁向同源物。
具体实施方式
本发明使用的遗传学，分子生物学，生物化学和核酸的术语和符号遵循该领域公认的标准，如KornbergandBaker，DNA Replication，New York(W.H.Freeman，纽约，1992年)；Lehninger，Biochemistry，Second Edition(Worth Publishers，New York，1975)；Strachan and Read，Human Molecular Genetics，Second Edition(Wiley-Liss，NewYork，1999)这些书中所使用的术语和符号。所有术语都应该被理解为在相关领域中所确立的典型含义。
本发明是基于对5型腺病毒E3区域编码的小分子量p14.7蛋白的一个意外发现：当E3区域p14.7蛋白与其他抗原连接时，可以起到佐剂作用。本发明提供了一种用于增强个体对抗原免疫应答的免疫成分，该免疫成分包含p14.7蛋白和抗原。p14.7蛋白质包含128个氨基酸，这128个氨基酸具有佐剂活性。p14.7蛋白氨基酸序列显示在本发明的SEQ ID NO：1。
在一个实施方案中，p14.7是NCBI参考文献AP_000224.1中所示的氨基酸序列。腺病毒E3，p14.7蛋白在腺病毒的生命周期早期表达，抑制由TNF-α和FasL受体介导的细胞死亡；腺病毒E3，p14.7蛋白是高度寡聚化蛋白；腺病毒E3，p14.7蛋白在溶液中以稳定的高级低聚态(九聚体)存在；腺病毒E3，p14.7蛋白含有抗蛋白水解的C末端结构域(Kim HJ1等，2002)。
在一个实施方案中，将p14.7蛋白与抗原一起组成免疫物。在一个实施方案中，编码p14.7蛋白的核酸与编码抗原的核酸一起组成免疫物。在一个实施方案中，本发明使用p14.7蛋白质或编码所述p14.7蛋白的核酸作为疫苗(免疫原性组合物)的佐剂。在一个实施例方案中，本发明提供了p14.7蛋白或编码所述p14.7蛋白的核酸作为佐剂在制备疫苗中的应用。在一个实施方案中，疫苗还包含抗原，该抗原是异源抗原。
在一个实施方案中，本发明提供了一个包含蛋白融合物的免疫原性组合物，该免疫原性组合物由p14.7蛋白与抗原共价连接在一起。在一个实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物由共价连接的编码p14.7蛋白的核酸与编码抗原的核酸组成。
在一个实施方案中，所述抗原是来自人的病原体，或人的病原体起源。在一个实施方案中，所述抗原是来自家畜的病原体，或家畜的病原体起源。
在一个实施方案中，佐剂是(i)SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列的蛋白质，并且具有佐剂活性；(ii)与SEQ ID NO 1的氨基酸序列有至少40％相似性的蛋白质，并且具有佐剂活性；(iii)(i)或(ii)的片段/变体并具有佐剂活性。在一个进一步的实施方案中，该变体和/或片段具有与p14.7蛋白质至少40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％的相似性或同一性。
在一个实施方案中，佐剂是(i)SEQ ID NO 1的同源物，并具有佐剂活性；ii)SEQID NO 1的直向同源物并具有佐剂活性；iii)SEQ ID NO 1的旁向同源物并具有佐剂活性；(iv)(i)或(ii)或(iii)的片段/变体并具有佐剂活性。
在一个实施方案中，佐剂是编码上述p14.7蛋白的核酸，该核酸翻译成蛋白质后具有佐剂活性。在一个实施方案中，佐剂是编码上述p14.7蛋白同源物，或编码上述p14.7蛋白直向同源物，或编码上述p14.7蛋白旁向同源物的核酸，并在翻译成蛋白质后具有佐剂活性。在一个实施方案中，佐剂是编码上述p14.7蛋白片段/变体的核酸，该核酸翻译成蛋白质后具有佐剂活性。
在一个实施方案中，相关核酸的变体和/或片段与编码p14.7蛋白的核酸具有至少40％的同一性或相似性，并且在翻译成蛋白质后保留佐剂活性。在一个实施方案中，相关核酸的变体和/或片段具有与编码p14.7蛋白同源物或编码p14.7蛋白直向同源物或编码p14.7蛋白旁向同源物的核酸的同一性或相似性至少为40％，并且在翻译成蛋白质后保留佐剂活性。
在一个实施方案中，p14.7蛋白质可以直接地与抗原共价连接(例如通过肽键)，或通过合适的接头部分(例如，一个或多个氨基酸的接头/聚甘氨酸接头)，或通过其他类型的化学接头间接地与抗原连接。
在一个实施方案中，一种或多种肽或多肽可以插入在(1)p14.7蛋白和抗原之间；(2)p14.7蛋白和抗原复合体的N末端；(3)p14.7蛋白和抗原复合体的C末端。在一个实施方案中，p14.7蛋白和抗原可以通过肽键共价连接(作为一个融合蛋白)。在一个实施方案中，编码所述p14.7蛋白的核酸相对于编码所述抗原的核酸是5′端。在一个实施方案中，编码所述p14.7蛋白的核酸相对于编码所述抗原的核酸是3′端。
在一个实施方案中，p14.7-抗原融合蛋白还可包含帮助其纯化的结构域，例如：His标签，HA标签，MYC标签，GST标签等。
以上对p14.7蛋白修饰的描述并不限制本发明所涵盖的范围，也不限制本发明所涵盖的可能的修改。
本发明中的重组p14.7-抗原融合蛋白表达载体可以通过本领域的标准技术来构建。这种标准技术可以在相关的专业书中找到，例如，Molecular Cloning，ALaboratoryManual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold SpringHarbour，N.Y.(2001).
在一个实施方案中，p14.7-抗原融合蛋白可通过本领域熟知的许多技术纯化，如反相色谱，高效液相色谱(HPLC)，离子交换色谱法，尺寸排阻色谱，亲和色谱，凝胶电泳等。用于纯化该p14.7-抗原融合蛋白的实际条件将部分取决于净电荷，疏水性，亲水性和生产策略等因素。对于亲和层析纯化，可以使用任何特异性结合p14.7蛋白的抗体，特异性结合抗原的抗体或特异性结合标签(His标签，HA标签，MYC标签，GST标签)的抗体。
本发明所阐述的p14.7-抗原融合蛋白可以用于疾病的预防和治疗。包含p14.7蛋白与异源抗原的免疫原性组合物可用于预防和/或治疗病毒，细菌，真菌，寄生虫等感染，也可用于癌症或其他疾病的预防和/或治疗。本发明提供了使用上述免疫原性组合物来预防和/或治疗传染病，癌症或其它疾病的方法(例如，通过向有此需要的受试者施用有效量的免疫原性组合物)。本发明提供了可作为药物使用的一种疫苗或免疫原性组合物，其包含p14.7-抗原融合蛋白或编码p14.7-抗原融合蛋白的核酸。免疫原性组合物/疫苗制备的一般描述可参考New Trends and Developments in Vaccines，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，Md.，S.A.1978.
使用p14.7蛋白作为佐剂的益处：1)分子量小，易于与特异性抗原连接。p14.7蛋白是仅含有128个氨基酸的小分子量多肽。通过常规的遗传工程操作，小分子量的p14.7蛋白可以很容易地与其他抗原连接在一起；2)p14.7蛋白质就像一种载体蛋白，与其他抗原连接时，具有增强对该抗原的免疫应答能力。在不添加常规佐剂的情况下p14.7蛋白可替代匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)作为载体蛋白有效地诱导免疫应答，这使其适用于作为人或牲畜的免疫疫苗成分；3)当制备单管疫苗试剂时，铝盐佐剂或水包油乳液佐剂很难进行冷冻或冻干处理，而以单链蛋白形式存在的p14.7-抗原融合蛋白(不含铝盐佐剂或水包油乳液佐剂)比较容易用冻干方法处理，免疫原性组合物/疫苗经冻干处理后会有助于疫苗的分配和储存，特别是在冷链管理有困难的地区；4)用p14.7-CH2CH3蛋白免疫的小鼠在整个免疫期间处于健康状态，这可能有利于解决p14.7蛋白作为佐剂的安全性论证问题；5)5型腺病毒通常被用于临床试验(Stephan A.Vorburger等，2002)，p14.7蛋白由5型腺病毒的E3区编码，这有利于被批准作为佐剂应用于临床试验。
例子
以下的例子显示说明了本发明的优选实施方案。本发明所公开的例子代表该技术在实践中的优选方案，因此可以考虑作为实践的首选模式。然而，本发明可以在所公开的具体实施例中进行许多改变，并且仍然可以获得在不脱离本发明的精神和范围的情况下得到类似的结果。
质粒DNA构建体
本发明中所描述的CH2CH3蛋白表达的质粒DNA构建体(Pcdna3-CH2CH3，CH2CH3是人IgG重链恒定区2和区域3)和p14.7-CH2CH3融合蛋白表达的质粒DNA构建体(Pcdna3-p14.7-CH2CH3)可依据常规的基因工程和分子克隆技术而构建，详见Molecular Cloning，ALaboratory Manual，3rdedition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold SpringHarbour，N.Y.(2001)。
蛋白质生产
本发明所使用的CH2CH3蛋白和p14.7-CH2CH3融合蛋白由CHO细胞(R80007，Invitrogen，Carlsbad，CA)依据CHO细胞生产商提供的方案生产。简而言之，DNA序列验证的质粒(Pcdna3-CH2CH3或Pcdna3-p14.7-CH2CH3)被用于转染CHO细胞。转染的CHO细胞在无血清的CHO表达培养基(Cat#12651-014)中培养，培养箱的培养参数是37℃，95％湿度和8％CO2。根据制造商提供的方案使用FreeStyle TM MAX细胞转染试剂进行转染(Cat#16447100，Invitrogen，Carlsbad，CA)。转染的细胞在以135rpm旋转的轨道振荡器平台上孵育6至7天。根据制造商提供的方案，制备的蛋白质通过protein A agarose(Cat#20333，Thermo Fisher)进行纯化。
小鼠免疫
小鼠的免疫依照抗体专业书籍(Antibodies：A Laboratory Manual，Secondedition，by Ed Harlow，David P Lane，CSHL Press)所描述的方法进行。简言之，纯化的蛋白质通过腹腔注射给小鼠进行免疫。免疫接种蛋白质溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，不添加常规佐剂如铝盐佐剂或水包油乳剂佐剂。对于初次免疫(第0天)使用不与任何常规佐剂混合，只溶于PBS中的50ug蛋白质(CH2CH3蛋白质或p14.7-CH2CH3蛋白质)。对于第14天和第21天的增强免疫，也是使用不与任何常规佐剂混合，只溶于PBS中的50ug蛋白质(CH2CH3蛋白质或p14.7-CH2CH3蛋白质)。
免疫反应测试
本发明通过流式细胞术来测试小鼠对CH2CH3蛋白或p14.7-CH2CH3融合蛋白的免疫应答。增强免疫后第7天通过尾静脉采集小鼠的血液，通过13,000rpm五分钟离心沉淀来收集血清，并以1∶2,000稀释收集到的血清。HEK293CH2CH3细胞首先用100ul稀释的血清染色，然后用抗小鼠IgG PE第二抗体染色(R&D系统，#F0102B)。在FACS-Calibur装置上进行流式细胞术检测。CellQuest软件是用于获取数据(BD BioSciences，Mountain View，CA)。FACS染色和荧光测量依照Current Protocols in Immunology(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach and Strober，Wiley-Interscience，2002)中所描述的方法实施。用FlowJo软件分析所有流式细胞术数据(TreeStar，San Carlos，CA)。如图1A所显示，用未接种任何蛋白的小鼠血清染色HEK293CH2CH3细胞(一种CH2CH3蛋白在细胞表面稳定表达的细胞系)，流式细胞检测结果显示血清中没有针对CH2CH3蛋白特异性的抗体；如图1B所显示，用CH2CH3蛋白接种的小鼠的血清染色HEK293CH2CH3细胞，流式细胞检测结果显示只有很少的针对CH2CH3蛋白特异性的抗体在血清中存在；如图1C所显示，用p14.7-CH2CH3蛋白接种的小鼠的血清染色HEK293CH2CH3细胞，流式细胞检测结果显示血清中存在高滴度的针对CH2CH3蛋白特异性的抗体；如图1D所显示，用接种p14.7-CH2CH3蛋白的小鼠的血清染色的亲本HEK293细胞(该细胞没有CH2CH3蛋白表达)，流式细胞检测结果未显示结合活性，这证明用p14.7-CH2CH3蛋白接种的小鼠血清中的抗体是特异性地针对CH2CH3蛋白的。
新版乙型肝炎疫苗生产和冻干处理
冻干处理含蛋白质的药物如疫苗是一种延长保质期并增加对热应激抵抗力的常用方法(Kasper et al，2013；Wang W，2000)。然而，冻干处理含有佐剂如铝盐或水包油乳剂的疫苗则特别具有挑战性。为了开发新的可以进行冻干处理的乙型肝炎疫苗，可以根据基因工程和分子克隆的一般技术构建p14.7-HBsAg(p14.7蛋白和乙型肝炎表面抗原融合表达)质粒DNA构建体。可根据美国专利US 5242812 A(乙型肝炎疫苗的生产和纯化方法)进行p14.7-HBsAg蛋白疫苗的生产和纯化。纯化的p14.7-HBsAg融合蛋白不需要配制铝盐佐剂，因为其中的p14.7蛋白片段本身就具有很强的佐剂活性。这种新版乙型肝炎疫苗是一种单链蛋白质，没有铝盐佐剂或水包油乳液佐剂，可直接进行冻干处理而制成由一种单瓶形式的疫苗。旧版含铝盐佐剂的乙型肝炎疫苗在冻融应激后其稳定性和功效就有可能降低，而新版p14.7-HBsAg融合蛋白乙型肝炎疫苗不含铝盐或水包油乳液的佐剂，其稳定性可通过冻干处理来改善。另外，当使用p14.7-HBsAg融合蛋白作为乙型肝炎疫苗时，就没有必要考虑使用铝盐佐剂的安全性问题。冻干处理的以一个单瓶形式制备的新版乙型肝炎疫苗有利于疫苗的分配和储存，特别是在难以进行冷链管理的地区。
所有其他亚单位疫苗，如炭疽疫苗，百日咳疫苗等，也可以根据本文公开的新版乙型肝炎疫苗生产原理进行生产和冻干处理，只要疫苗是仅含有p14.7-抗原融合蛋白。
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Claims (4)
1.一种包含p14.7蛋白和抗原的免疫原性组合物，其中所述p14.7蛋白和所述抗原直接或间接连接在一起。
2.权利要求1中的免疫原性组合物，其中所述抗原是来自人的病原体，或人病原体来源的抗原；或其中所述抗原是来自家畜病原体，或家畜病原体来源的抗原。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述p14.7蛋白是：
i)SEQ ID NO：1的氨基酸序列并具有佐剂活性的蛋白质；
ii)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少40％相似的蛋白质，并具有佐剂活性；
iii)具有佐剂活性的SEQ ID NO：1的蛋白质的同源物；
iv)具有佐剂活性的SEQ ID NO：1的蛋白质的直向同源物；
v)具有佐剂活性的SEQ ID NO：1的蛋白质的旁向同源物；
vi)具有佐剂活性的i)，ii)，iii)，iv)或v)的片段/变体。
4.一种编码权利要求1或一种编码权利要求3的免疫原性组合物的核酸，其中编码所述p14.7蛋白的核酸是：
i)编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列并具有佐剂活性蛋白质；
ii)编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少40％相似，并具有佐剂活性的蛋白质；
iii)编码具有佐剂活性的SEQ ID NO：1的蛋白质的同源物。
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