JP2000503004A - 化合物を細胞に輸送するための毒素ペプチドおよび／またはアフィニティハンドルの使用 - Google Patents

化合物を細胞に輸送するための毒素ペプチドおよび／またはアフィニティハンドルの使用

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Abstract

(57)【要約】 化合物を細胞の細胞質に輸送するための方法および組成物を開示する。輸送すべき化合物は、抗原性化合物であってもよく、ポリカチオン性アフィニティハンドルにリンクさせてもよく、またはその両方であってもよい。開示した方法の一つにおいて、炭疸PAポリペプチドのような毒素のB部分もまた、細胞の細胞質への化合物の輸送を増強するために提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 化合物を細胞に輸送するための毒素ぺプチドおよび／または アフィニティハンドルの使用 連邦出資研究に関する声明 本明細書に記載の研究に対する資金は、米国国立衛生研究所（National Insti tute of Health）の交付金A1-22021、A1-22848、およびAI-39558によって提供さ れた。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。 発明の背景 本出願は、1995年12月13日に提出されたUSSN第60/008,518号および1996年６月 ７日に提出されたUSSN第60/019,275号からの優先権を請求する。 本発明は、生体細胞内への化合物の輸送に一般的に関する。 多くの細菌蛋白質毒素は、真核生物標的細胞の特異的な細胞内構成成分を酵素 的に修飾する。これらの酵素が膜バリアーを通過してサイトゾル物質と接触する メカニズムは、多様な生物学的状況におけるそれらの重要性のため、現在研究さ れている。特に関心を集めているのは、効率的かつ安全な一般的蛋白質輸送系へ のそのような毒素の開発である。 細菌毒素はしばしば、AおよびBと呼ばれる２つの機能的に異なる部分を有する 。A部分は触媒活性を含み、B部分は標的細胞へのA部分の細胞質輸送に必要な決 定因子を有する。これらの輸送決定因子は、受容体結合活性を含み、しばしば、 しかし常にではないが、膜貫通活性を含む。ジフテリア毒素のような多くの細菌 毒素は、１本のポリペプチド内に両部分を含む。対照的に、炭疸毒素は、Aおよ びBの機能が異なる蛋白質に存在するクラスである、いわゆるバイナリ毒素の一 員である。異なるとはいえ、AおよびB機能を有する蛋白質は細胞の中毒の際に相 互作用する。炭疸毒素は、２つの代用A部分、浮腫因子（EF；89 kDa）および致 死因子（LF；89k Da）を細胞質に輸送するために、単一のB部分である防御抗原 （PA；８3 kDa）を使用する。 EFはアデニレートサイクラーゼで、LFはマクロファージにおいてサイトカイン 産生（または高濃度で細胞溶解）を誘導する未知活性である。炭疸毒素作用の現 在のモデルによれば、PAはまず、特異的細胞表面受容体に結合する。次に、アミ ノ末端の20 kDa蛋白質（PA20）が細胞のプロテアーゼによって除去されると、受 容体に結合したカルボキシ-末端63 kDaを生じる（PA63）。このプロセシング事 象は、EFおよびLFが競合的に結合するPA63上の結合部位を露出させると考えられ る。毒素受容体複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスによって相互分析され 、エンドソームの酸性環境下でPA63は、EFおよびLFの細胞質への放出を媒介する 。PA63は、酸性条件下の膜においてイオン伝導チャンネルを形成することが示さ れている。最近同定された７量体の環形成型のPA63は、これらのチャンネルなら びにEFおよびLFの移動に適切であるかも知れない。 アミノ末端300残基におけるEFとLFとの配列類似性により、この領域がPAへの 結合、およびPAによる移動に必要な決定因子を含むという仮説が得られた。この 提言は、LFのアミノ末端254残基（LFN）とエンドトキシンAの触媒ドメインとの 融合蛋白質が、PA依存的に細胞内に入ることができることを示す知見によって支 持される。さらに、LFnと、ジフテリア毒素（DTA）のカルボキシ末端のアミノ末 端または酵素的A鎖のいずれかとの融合により、DTAはPAの存在下で哺乳類細胞の 細胞質内へ移動することができる。 異種蛋白質を細胞内に導入するために用いられる毒素には、一般的に２つのク ラスがある。α毒素およびストレプトリジンOのような孔形成性毒素は、膜を透 過可能にすることによって細胞表面で作用する。これらの毒素は広く使用されて いるが、それらは、細胞外培地への細胞内容物の漏出を引き起こすという欠点を 有する。第二のクラスの毒素は、細胞表面に結合し、その後相互分析される毒素 である。これらの毒素はキメラとして作製することができ、受容体結合ドメイン を抗体のような別のドメインに置換して、細胞の特異性を変化させることができ る。今日までに構築されたほとんどのキメラ毒素が、ジフテリア毒素またはエン ドトキシンAのいずれかを利用している。 全てのウイルスならびにいくつかの細菌およびプロトゾア病原体は、哺乳類細 胞内で生存および複製する能力を進化させた。これらの細胞質病原体の免疫認識 は、病原体関連蛋白質からプロセシングされたペプチド抗原の細胞表面提示に基 づいて起こる。これらのペプチドは、主要組織適合抗原複合体（MHC-I）によっ てコードされた宿主クラスI分子と共に提示され、細胞障害性Tリンパ球（CTL） は、 MHC-1と複合体を形成した異物ペプチドの下記の認識を活性化する。活性化CTLは 感染細胞を融解し、サイトカインを分泌して増殖および分化する。これらの段階 のそれぞれが、宿主からの病原体の除去に重要な役割を果たしている。標的細胞 の融解により、有機体はその複製ニッシェ（niche）を奪われ、病原体が液性免 疫系の要素に暴露される。サイトカインの分泌は、局所免疫応答の増強を含む、 多くの作用を示す。CTLクローンの増殖の結果、一連の反応性CTLが増殖し、他の 感染細胞からの病原体のクリアランスが得られるが、分化により、その後のチャ レンジに対してより迅速かつ有効に反応することができる一連の長期生存記憶細 胞が提供される。これらの記憶細胞をプライミングするワクチンにより、再暴露 の際に宿主が防御される。 ワクチンが細胞質病原体による感染を模するためには、インビボで宿主細胞の サイトゾルに標的抗原を導入しなければならない。これは、生きたウイルスまた は細菌ベクターに細菌抗原を発現させることによって；アジュバントを用いて； またはDNA発現ベクター（メリーフら（Melief）、Immun.Reviews 146：167〜177 、1995）；トラベルサリら（Traversari）、Immunogenetics 35:145〜52、1992 ；ホワイトら（White）、Vaccine 13:1111〜1122、1995）の輸送（DNAワクチン ）後のチャレンジによって、得られた。これらの記憶細胞をプライミングするワ クチンにより、再暴露の際に宿主が防御される（シェンら（Shen）Proc.of the Nat'l.Acad.of Sci.92:3987〜91、1995）。 発明の概要 本発明者らは、免疫系による抗体反応を誘発するエピトープを輸送するために 炭疸毒素B部分を用いてもよいことを見出した。さらに、抗原性エピトープを含 む化合物の細胞内への流入の媒介に、「ポリカチオン性アフィニティハンドル」 と名付けたカチオンタグを毒素B部分の代わりに用いることができることを見出 した。いずれの場合にも、PAが存在すれば化合物の流入は容易になる。 本発明者らは、細胞内病原体リステリア・モノシトゲネス（Listeria Monocyt ogenes）由来の細胞障害性Tリンパ球（CTL）エピトープ（LLO91-99）をLFの非毒 性PA-結合ドメイン（LFn；255残基）と融合すると、抗原反応が誘発されること を発見した。さらに、この融合蛋白質をPAと共にBALB/cマウスに注射すると、LL O91- 99 に対するCTL反応がプライミングされた。リステリア・モノシトゲネスをチャ レンジすると、LFn-LLO91-99およびPAをワクチン接種したマウスは、対照マウス と比較して、脾臓および肝臓におけるコロニー形成単位の減少を示した。これら の結果は、炭疸毒素、および同様の膜移動特性を有する他の毒素蛋白質が、研究 および医学的応用のいずれにとっても、一般的CTLペプチド輸送系として有用で あるかも知れないことを示している。核酸を抗原性化合物の代わりに用いること によって、この輸送系を同様に用いて、共有結合した核酸を輸送してもよい。 第一の局面において、本発明は、LFnもしくはポリカチオン性アフィニティハ ンドル、または細胞に輸送すべき抗原性化合物にリンクしたLFn/PAに関連する毒 素輸送系を有する融合分子と細胞を接触させることを含む、細胞の細胞内領域へ の１つ以上の抗原化合物の導入方法を提供する。 いくつかの態様において、抗原性化合物または核酸は、LFnまたはその断片に 共有結合している。本明細書の実施例に提供するように、好ましくは、完全鎖長 のLFnを用いる。しかし、他の毒素輸送および本明細書に記載のポリカチオン性 タグ分子を用いてもよい。もう一つの好ましい態様において、共有結合は、LFn のN-末端またはC-末端である。 一つの態様において、本方法はまた、細胞を毒素のB部分（例えば、炭疸PA、 またはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）と毒素B）と接触させることを 含む。好ましい態様において、B部分は炭疸PA（83 kD）または炭疸PAの63 kDaカ ルボキシ末端ドメイン（PA63）である。 毒素輸送部分またはポリカチオン性アフィニティハンドルと化合物をリンクさ せる結合は、共有結合であってもよく、陰性荷電化合物の場合には、静電気力で あってもよい。様々な好ましい態様において、結合は、ペプチド結合、アミド結 合、チオエステル結合、またはジスルフィド結合のような共有結合である。 本方法のさらに他の好ましいの態様において、融合分子は、該化合物と該毒素 輸送部分またはポリカチオン性アフィニティハンドルとの間の開裂部位をさらに 含む。もう一つの好ましい態様において、融合分子はグリシンスペーサーのよう なスペーサーを含んでもよい。 本発明のもう一つの局面において、細胞に輸送される化合物は核酸である（１ つ以上の防御抗原をコードする）。融合体のLFn、毒素輸送、およびポリカチオ ン部分、ならびに抗原を輸送するための上記方法は、この目的に適合させてもよ い。 もう一つの関連する局面において、本発明は、抗原または抗原コード核酸を細 胞の細胞質に導入するキットを特徴とする。該キットは、毒素部分を含む第一の 部位（例えばLFn部位）またはポリカチオン性アフィニテイハンドル、または、 一つもしくは複数の抗原、もしくは抗原コード化合物を含む第二の部分にリンク された関連毒素分子を有する融合分子を含む。好ましい態様において、該キット はまた炭疸PAを含む。本明細書に記述のいかなる結合によって、第一のペプチド を第二の部分に結合させてもよい。第一のペプチドを第二の部分に結合させる場 合、それがペプチド結合によるペプチドである場合、第二のペプチドのアミノ酸 の少なくとも一つは好ましくは、アルギニンまたはリジンである。 融合分子の好ましい態様において、第二の部分は、DNA、RNA、または抗原から なる群より選択される。 第３の局面において、本発明は、第二のペプチドとの共有結合によってリンク した第一のペプチドを少なくとも含む融合分子と、毒素のB部分（例えば炭疸PA またはPA63）との混合物である組成物を特徴とする。本発明のこの局面の好まし い態様において、融合物は、少なくともアミノ酸３個であり、かつ少なくとも３ 個のアミノ酸が、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択さ れるか；またはLFn（もしくはその断片）であるか；または炭疸PA毒素系に関連 する毒素系に由来するポリペプチド配列であるような部分を含む。 第４の局面において、本発明は、細胞に輸送すべき化合物にリンクさせたポリ カチオン性アフィニティハンドルを有する分子と細胞を接触させることを含む、 細胞の細胞内領域への分子の導入法を提供する。本発明のこの局面の一つの態様 において、本方法はまた、細胞を毒素のB部分（例えば、炭疸PAまたはウェルシ ュ菌と毒素B）に接触させることを含む。好ましい態様において、B部分は炭疸PA （83 kD）または炭疸Aの63 kDaカルボキシ末端ドメイン（PA63）である。 本発明のこの局面のもう一つの好ましい態様において、ポリカチオン性アフィ ニティハンドルは、アミノ酸残基２〜250個のペプチドを含み、好ましくはアミ ノ 酸残基２〜16個のペプチドを含む。関連する好ましい態様において、ポリカチオ ン性アフィニティハンドルペプチドのアミノ酸の少なくとも２個は、アルギニン 、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択され、該ペプチドを構成するア ミノ酸の少なくとも10％は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群 より選択される。さらにより好ましい態様において、ポリカチオン性アフィニテ ィハンドルは、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択され る、少なくとも３個のアミノ酸を含む。最も好ましくは、ハンドルは少なくとも アルギニン残基６個、リジン残基少なくとも３個、またはヒスチジン残基少なく とも６個を含む。もう一つの好ましい態様において、ポリカチオン性アフィニテ ィハンドルのpKaは6.5〜12.5の間である。 ポリカチオン性アフィニティハンドルと細胞に輸送すべき化合物（または複数 の化合物）とをリンクさせる結合は、共有結合であってもよく、または陰性荷電 化合物の場合、静電気力であってもよい。様々な好ましい態様において、結合は 、ペプチド結合およびアミド結合のような共有結合、チオエステル結合、または ジスルフィド結合である。 本方法の他の好ましい態様において、一つ以上の化合物は、蛋白質毒素分子、 アポトーシス誘発分子、シグナル伝達系路の蛋白質成分、DNA、RNA、抗原、遺伝 子相補物に対する蛋白質、免疫原性抗原、治療的ペプチド、および治療的蛋白質 からなる群より選択される。例えば、ポリカチオンタグはそれに共有結合する２ つの抗原性化合物を有してもよい。 本方法のさらに別の好ましい態様では、融合分子は、化合物と、カチオン性ア フィニティハンドルおよび／または、グリシンもしくはセリンスペーサーのよう なスペーサーとの間の開裂部位をさらに含む。 もう一つの関連する面において、本発明は、細胞の細胞質に化合物を導入する キットを特徴とし、該キットは、細胞内に導入される化合物にリンクしたポリカ チオン性アフィニティハンドルを有する融合分子を含む。好ましい態様において 、該キットはまた、毒素のB部分を含む。例えば、キットはPAポリペプチド（例 えば、PA63）、および上記のように、化合物に共有結合したアフィニティハンド ルを含んでもよく、適当であれば、静電気力によって化合物にリンクすることが 適 したハンドルを提供してもよい。 第６の局面において、本発明は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンから なる群より選択される少なくとも二個のアミノ酸を有する第二の化合物に共有結 合によってリンクされた第一の化合物を少なくとも含む、一つまたは複数のペプ チドを細胞の細胞質に輸送するための融合分子を提供する。第一の化合物は、本 明細書に記述のいかなる共有結合によって第二の化合物に結合させてもよい。第 一の化合物を、ペプチド結合によるペプチドである第二の化合物に結合させる場 合、第二のペプチドのアミノ酸の少なくとも１個は、好ましくはアルギニンまた はリジンである。 融合分子の好ましい態様において、第一の化合物はポリペプチドであり、蛋白 質毒素分子、アポトーシス誘発分子、シグナル伝達系路の蛋白質成分、DNA、RNA 、MHCクラスI抗原、遺伝子相補物の蛋白質、免疫原性抗原、治療的ペプチド、お よび治療的蛋白質からなる群より選択される。 第７の局面において、本発明は、共有結合によって第二のペプチドとリンクさ れる少なくとも一つの第一のペプチドを含む、ポリカチオン性アフィニティハン ドルを含む融合分子と、毒素のB部分（例えば、炭疸PA）との混合物である組成 物を特徴とする。本発明のこの局面において、第二のペプチドはアミノ酸を少な くとも３個有し、少なくとも３個のアミノ酸はアルギニン、リジン、およびヒス チジンからなる群より選択される。さらに、共有結合がペプチド結合である場合 、該アミノ酸の少なくとも１個は、アルギニンまたはリジンである。請求の範囲の用語の定義 「B部分」とは、本明細書の記述の毒素部分を意味する。例えば、炭疸PAまた はウェルシュ菌（clostridium perfringens）のイオータ毒素Bは、当技術分野で 既知のB部分の例である。 「PA」は、本明細書に記述の炭疸PAポリペプチドの少なくとも一つの生物活性 の少なくとも60％、好ましくは90％を有するポリペプチドを意味する。相同体お よび類似体は、本明細書に記述の炭疸PAの特徴を有し、本発明の方法において用 いることができると理解される。 「PA63」は、本明細書に記述のPA63ポリペプチドの少なくとも一つの生物活性 の少なくとも60％を有する本明細書に記述のPAポリペプチドのカルボキシ末端部 分を意味する。好ましくは、PA63は炭疸PAポリペプチドの63 kDカルボキシ末端 断片である。 「ポリカチオン性アフィニティハンドル」は、化合物の生体細胞への流入を促 進することが可能なカチオン性物質を意味する。カチオン性物質は、好ましくは 、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを含むアミノ酸を有するアミノ酸配列で ある。アミノ酸配列は、アルギニン、リジン、および／またはヒスチジンを含む アミノ酸２〜20個の配列を有する限り、２〜250アミノ酸長であってもよい。好 ましくは、アミノ酸配列の２〜20個の少なくとも80％は、アルギニン、リジンお よび／またはヒスチジンの組み合わせを含む。同様に、好ましくは、２〜250個 のアミノ酸配列は、その少なくとも10％がアルギニン、リジン、およびヒスチジ ンからなる群より選択されるアミノ酸を含む。好ましい態様において、２〜20個 のアミノ酸配列のpKAは６〜13である。 「導入する」とは、それによって細胞の細胞外領域に提供される化合物が細胞 の細胞内領域に位置しうる手段を提供することを意味する。好ましくは、化合物 は細胞質に提供される。 「融合分子」は、細胞内に輸送される化合物および毒素輸送分子（例えば、LF n）またはポリカチオン性アフィニティハンドルを含む分子を意味する。 「リンクした」とは、共有的静電気結合によって物理的近位に位置することを 意味する。 「融合した」とは、細胞内に輸送される化合物にアフィニティハンドルを接着 させるいかなる共有的化学結合をも意味する。化合物が核酸である場合、融合は また、静電気結合を通じてのアフィニティハンドルと化合物との間の同時局在性 を意味する。好ましくは、結合は、ペプチド結合、ジスルフィド結合、チオエー テル結合、ペプチド核酸結合、またはアミド結合である。 「混合物」とは、１つ以上の物質の組成物を意味する。混合物は例えば、当技 術分野で既知の方法を用いて研究、診断、または治療目的のために形成してもよ い。 「化合物」は、細胞の細胞内領域へ輸送されることが望ましいいかなる物質を も意味する。例えば、化合物は、治療的ポリペプチド、細胞障害性ポリペプチド 、DNA、RNA（例えば、治療目的のためのアンチセンスRNA）、または抗原性ペプ チドのような小分子であってもよい。 「抗原性化合物」は、蛋白質配列、抗原性断片、または抗原性非ポリペプチド 性分子（例えば、合成化合物）であってもよい。ポリペプチド配列はいかなる起 源からであってもよいが、好ましくは、細菌、ウイルス、または腫瘍抗原ポリペ プチドに由来する。 「由来する」配列とは、コード核酸の抗原性、溶解性、安定性、またはコドン 使用を増強するために修飾された配列を取り込むまたは置換するために修飾され る配列である。誘導体は当業者に既知の技術を用いて作製してもよい。 「炭疸系（またはLFn）に関連する毒素輸送分子」とは、共有結合した化合物 の哺乳類細胞膜の通過を容易にすることが知られている毒素輸送分子を意味する 。 図面の簡単な説明 図１A〜図１D LLO91-99コーティングP815細胞に対するCTL媒介融解。雌性B ALB/cマウスにLFn-LLO91-99＋PAまたはPAを含むもしくは含まないLLO91-99-LFN のいずれかを注射した。 図２ LLO91-999濃度の関数としての剌激の効果。BALB/cマウスに、３ pmol 、0.3 pmol、0.03 pmolまたは0.003 pmolのLFN-LLO91-99のいずれかと混合したP A ６pmolを注射した。回収した脾細胞の刺激５日後、インビトロで、ペプチドで コーティングした、またはコーティングしていない51Cr標識P815細胞を溶解する 細胞の能力に関してアッセイした。 図３ LFn-LLO91-99＋PAで免疫後のリステリア・モノシトゲネス（L.monocy togenes）に対する防御。BALB/cマウス（１群６匹）にLFn-LLO91-99＋PAをワク チン接種し、４週間後にリステリア・モノシトゲネスのLD50の２倍量を静脈内注 射してチャレンジし、肝臓および脾臓を回収し、ならびに臓器当たりのリステリ ア・モノシトゲネスコロニー形成単位の数を測定した。有意性は、ウィルコキソ ンの階級和分析によって計算した。 図４A〜４Cは、DTAのアミノ末端と融合させた様々なペプチドを表す。４Aは、 ヘキサヒスチジンモチーフのポリペプチドを示す；４Bは、融合ペプチドのヘキ サ ヒスチジンモチーフと置換される塩基性、酸性、および中性残基を示す；４Cは 、DTAのアミノ末端に融合したリジン融合ペプチドの異なる長さを示す。 図５は、His-6-DTAによるCHO-K1細胞のPA-媒介蛋白質合成阻害を示すグラフで ある。 図６は、2.0×10-8 M PAの存在下でHis-6-DTA融合蛋白質の細胞障害性に及ぼ すDTAの活性部位変異の効果を示すグラフである。 図７は、アミノ末端融合ぺプチドのアミノ酸組成が、2.0×10-8 M PAの存在下 でCHO-K1細胞における蛋白質合成を阻害するDTAの能力にどの程度影響を及ぼす かを示すグラフである。 図８は、アミノ末端融合蛋白質におけるリジン残基数が、2.0×10-8 M PAの存 在下で蛋白質合成を阻害するDTA-融合蛋白質の能力に影響を及ぼすことを示すグ ラフである。 図９は、LFNが、LFN-DTAの細胞障害性をブロックするが、Lys-6-DTAの細胞障 害性はブロックしないことを示すグラフである。 図10は、Lys-6ペプチドがLys-6-DTAまたはLFN-DTAのいずれかの細胞障害性を 有効にブロックしないことを示すグラフである。配列KKKKKKGSGCGを有するLys-6 -ペプチド（５×10-12〜５×10-4 M）を、PA（２×10-8 M）およびLys-6-DTA（ ５×10-10 M）またはLFN-DTA（１×10-11 M）のいずれかの存在下で、CH0K1細胞 に加えた。 図11は、アフィニティハンドルを欠損するDTAと比較して、アフィニティハン ドルを有するDTAのPA-依存的に増強された細胞への輸送を示すグラフである。 図12は、P60 217〜225ペプチドの輸送を示すグラフである。 図13Aおよび13Bは、１回注射によ２つのエピトープの輸送を示すグラフである 。 図14Aおよび14Bは、多エピトープによるワクチン接種を示すグラフである。 図15は、ジスルフィドリンク化合物（LLO91-99）の輸送を示すグラフである。 図16は、LCMUエピトープNP 118〜126の輸送を示すグラフである。 図17は、LCMVエピトープNP 396〜404の輸送を示すグラフである。 詳細な説明 略語:DTA＝ジフテリア毒素の触媒ドメイン；EF＝炭疸浮腫因子；LF＝炭疸致死 因子；LFN=完全鎖長のLFのアミノ末端254残基を含むLFのPA結台ドメイン；PA＝ 炭疸防御抗原；PA63＝炭疸防御抗原のカルボキシ末端63 kD；TCA＝トリクロロ酢 酸。概観 蛋白質、小ペプチド、および他の化合物の真核細胞の細胞質内の効率的な輸送 により、重要な多くの生物医学的および研究的適用が提供される。これらの適用 は、蛋白質の相補性（嚢胞性繊維症患者における野生型CFTR蛋白質の誘導のよう な）、特定の遺伝子疾患に対する療法、特異的MHCクラスI制限免疫応答を誘発す る抗原提示、および関連するCD8+細胞質Tリンパ球のクローン増殖、細胞質標的 蛋白質活性の調節、蛋白質生物活性の条件発現、およびインビトロで修飾（例え ば、リン酸化、放射性標識、イソプレニル化、エピトープタグ、または変異）さ れた蛋白質の導入を含む。適用はまた、DNA（例えば、遺伝子治療のため）また はRNA（例えば、治療のためのアンチセンスRNA）を含んでもよい。同様に、研究 診断的または治療利用目的のために小分子を輸送することも望ましいと考えられ る。本発明者らは、上記目標を達成するための新規方法および化合物を提供する 。 抗原および核酸コード抗原の輸送 本発明者らは、インビボおよびインビトロにおいて、細胞内作用毒素である炭 疸毒素を用いて、CTLエピトープを宿主細胞の細胞質内に導入する新規方法につ いて記述する。 炭疸毒素は、致死と浮腫の２つの毒性作用を誘発するバイナリの組み合わせに おいて作用する３つの蛋白質を含む。致死因子（LF）および浮腫因子は細胞内作 用型蛋白質で、そのいずれも真核細胞のサイトゾルに移動するためには防御抗原 （PA）を必要とする。まず、LFおよびEFは、細胞表面上で蛋白質溶解的に活性化 されたPA（PA63）に競合的に結合する。蛋白質複合体はエンドサイトーシスされ 、LF/EFはエンドソーム酸性化の後サイトゾルに移動する。最近、LFのアミノ末 端254個のアミノ酸ドメイン（LFn）がPAと相互作用することが判明した。LFnは 、PA結合および移動に必要な全ての情報を含むように思われるが、致死活性を欠 如している。さらなる研究により、LFnに遺伝子融合された異種蛋白質は、PAの 存在下 で培養哺乳類細胞のサイトゾルに輸送されることが示された。 LFnに融合したCTL反応性エピトープは、サイトゾルに輸送され、インビボでCT L反応を生じることがわかった。この仮説を調べるため、まず、細胞質細菌であ るリステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）からCTLエピトープ を選択した。驚くほど強い抗原反応が認められ、それに対する哺乳類の免疫反応 が望ましい他の抗原性断片は、特異的免疫を産生するために当業者によって容易 に置換されると考えられる。実際、さらなるリステリア菌、ウイルスおよび癌エ ピトープを本発明の方法に用いてもよいことを以下に示す。 本発明者らの実験で用いた系において、インビボおよびPAの存在下でのみ起こ る輸送は、提示がエピトープのサイトゾル輸送に依存し、LFN-LLO91-99が分解し た後のMHC-1の外部負荷の結果ではないことを示唆している。 毒素系を用いるにあたって、本発明者らは、他のエピトープ輸送系に付随する 多くの複雑性を回避する。この系は、生きたもしくは弱毒化されたウイルスまた は細菌の使用を必要とせず、同様に、動物へのアジュバントの投与または外来DN Aの意図しない導入を避ける。この系は、防御のためにCTL反応を必要とする広範 囲の疾患の治療に用いられる可能性がある。例えば、CTLエピトープは病原性ウ イルスおよび細菌について特徴付けがなされている。これらのエピトープのそれ ぞれが、対応する微生物疾患に対するLFN-PA媒介ペプチドワクチン接種の候補と なる。さらに、毒素に基づく抗腫瘍ワクチンの開発のための基礎として役立つ可 能性があるいくつかの癌関連CTLエピトープが最近同定された。抗原性ペプチド 本発明で用いてもよい抗原性ペプチドの実例を以下に示す。これらは、単なる 例示的な実例で、本発明を制限することを意味するものではない。 ヒト乳頭腫ウイルス16ペプチド（例えば抗原E6およびE7、E7ペプチド49〜57 R AHYNIVTF）；ヒトP53ペプチド（例えば、V10ペプチドFYQLAKTCPV）；ヒト免疫不 全ウイルスペプチド（例えば、gp 120、P18ペプチドRIQRGPGRAFVTIGK）；MUC-I ヒト癌抗原ペプチド；MAGE遺伝子ファミリーの蛋白質由来ペプチド（例えば、MA GE-1 SAYGEPRKL、MAGE-3 FLWGPRALV）；ヒトチロシナーゼ蛋白質由来ペプチド（ 例えば、Tyr-A2-1 MLLAVLYCL、Try-A@-2 YMNGTMSQV）；リステリオリジン-Oペプ チ ド、例えばLLO91-99 GYKDGNEYI）；P60ペプチド（例えば、P60217-225 KYGVSVQD I）；MART-1ペプチド(例えば、M-9 AAAAAGIGILTV、M10-3 EAAGIGILTV）；BAGE-1 ペプチド（例えば、AARAVFLAL）；P1Aペプチド（例えば、P815A35-43 LPYLGWLVF ）；コネキシン（Connexin）ギャップ接合部由来ペプチド（例えば、MUt 1 FEQN TAQP、MUT 2 FEQNTAQA）；以下の病原体に由来するペプチド／蛋白質；サイトメ ガロウイルス、B型肝炎、ヒトヘルペスウイルス１〜５、狂犬病ウイルス、麻疹 ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、赤痢菌、ヒト型結核菌およびトリ 型結核菌、チフス菌およびネズミチフス菌、HTLV-I、II、水痘-帯状抱疹ウイル ス、天然痘、ポリオ、黄熱病、脳炎ウイルス、およびエプスタイン-バーウイル ス。輸送ツールとしての他の毒素 炭疸毒素と有意な構造的機能類似性を有するいかなるバイナリ毒素も本発明の 方法において用いられる。DNA の輸送 細胞内輸送に関する本発明者らの知見に基づき、アグロバクテリウム・ツメフ アシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のVirE2ような核酸結合蛋白質と の融合を含む構築物を本発明の方法において用いてもよい。そのような融合物は 核酸を細胞内に輸送するために用いてもよい。これは、当業者に既知の定法を用 いて行ってもよい。ポリカチオン性アフィニティハンドル 大腸菌における組換え蛋白質として発現されると、本発明のアフィニティハン ドルDTA融合蛋白質は、ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性を示す。DTA単独で は細胞内に移動せず、したがって細胞に対して作用を及ぼさないため（非常に高 濃度の場合を除く）、細胞障害性を、CHOK1細胞へのDTAのPA媒介移動の手段とし て用いることができる。PAの存在下での移動の増強はまた、CHOK1細胞に対する これらの融合物の細胞障害性を用いて測定してもよい。ポリカチオン性アフィニ ティハンドルDTA融合蛋白質の細胞障害性は、このDTA細胞障害アッセイを用いる と、蛋白質合成の阻害によることが判明した。DTA部分のADP-リボシル化活性を 減弱させる変異をアフィニティハンドルDTA融合分子に導入すると、得られた融 合分子の細胞障害性は劇的に減少した。このように、ポリカチオン性アフィニテ ィハン ドルはそれ自身が毒性に関与することなく、細胞質への輸送を増加させる。PAポ リペプチドの存在はこの現象を大きく増強する。 いかなる陽イオンペプチドもある程度作用するが、リジン残基を含むアフィニ ティハンドル融合ペプチドは、アルギニンまたはヒスチジン残基を含むアフィニ ティハンドルより細胞内流入を容易にした。酸性または中性の親水性残基のみを 含むペプチドは、細胞への化合物のPA媒介輸送の目的にとっては、LFNの非機能 的置換であるように思われた。したがって、アフィニティハンドルの全体的なカ チオン特性が、細胞質への化合物のPA媒介輸送を調整するために必要な本質的特 徴であると考えられる。 これらの結果から、異種化合物のPA媒介移動にはLFNの存在が必要でないこと が示される。さらに、アフィニティハンドルはPAが存在しなくとも化合物の移動 を増強する可能性がある。本発明のアフィニティハンドルは異種化合物に物理的 にリンクさせてもよく、PAと併用して用いて、有効な、非毒性の異種化合物輸送 系を作製してもよい。物理的リンケージは共有結合であってもよく、核酸の移動 の場合には、静電気的であってもよい。理論 本発明のアフィニティハンドルがそれによって作用するメカニズムは明らかに されていないが、本明細書に開示される驚くべき結果を説明できる考えられる一 つの理論は以下の通りである。これまでの証拠から、受容体媒介エンドサイトー シスによって相互分析されたA-B毒素は、毒素のA部分と毒素のB部分との間の直 接の分子的接触を必要とすることが示唆された。DTおよび多くの他の毒素に関し て、AおよびB部分は共有結合しており、炭疸のようなバイナリ毒素に関しては、 AおよびB部分の間に高親和性結合相互作用がある。本明細書に開示の実験は、炭 疸PAが、PA-オリゴマーの別の部位またはエンドサイトーシスの間に受容体結合P Aと共に相互分析される異なる細胞表面成分のいずれかと結合する異種蛋白質ま たは他の化合物の移動を容易にすることができることを示唆している。 Lys-6-DTAが受容体結合PA63とは異なる細胞表面成分に結合するという理論か ら、カチオン性アフィニティハンドルが細胞質へのDTAの輸送をどのように促進 するかについて考えられる説明が示唆される。ポリ塩基ペプチドは、酸性ドメイ ンが 露出されている蛋白質のように、PA63以外の表面成分に対する結合親和性を有し てもよい。そのような表面成分の候補には、CHOK1細胞の膜蛋白質構成物の主な クラスであることが判明した酸性糖蛋白質（ラーブら（Raab）、1990、J.Cell.P hysiol.144（Ｉ）:52〜61；ラーブら（Raab）、1986、Exp.Cell.Res.165（１）: 92〜106）と共に、原形質膜上の酸性リン脂質が含まれる。蛋白質および合成ペ プチドによる多くの試験で、蛋白質-脂質相互作用の重要なメカニズムとして、 塩基性アミノ酸側鎖と酸性リン脂質ヘッドグループとの静電気的相互作用が確認 された（ゲニス（Gennis R.B.）、1989、生体膜：分子構造と機能（Biomembrane s：Molecular Structure and Function）、86、87、196、197頁、Springer-Verl ag New York，Inc.）。ミエリン塩基蛋白質は、主に塩基性残基と酸性リン脂質 との静電気的相互作用によって接着する膜蛋白質のプロトタイプである。フォス フォリパーゼC、プロテインキナーゼC、ミリストリル化アラニンに富むCキナー ゼ基質（「MARCKS」）、pp60v-src（ラウス肉腫ウイルスのv-src発癌遺伝子）、 およびラクトフェリンは全て、膜相互作用に特に重要であることが示されている 塩基性残基の集団を含む（ビューザーら（Buser）、1995、Mol.Membrane Biol.1 2（１）:69〜75）。MARCKSおよびpp60v-srcの膜結合領域を模するモデルペプチ ドによる試験で、ペプチド中の各塩基性残基が酸性リン脂質に独立して結合し、 １kcal/molに等しい顕微鏡結合エネルギーを生じることが示された。 LFおよびEFのチャンネル形成および細胞質輸送にリンクした７量体PA構造の発 見により、PAオリゴマーによって形成された孔が、蛋白質が膜を移動する際の導 管を提供する可能性があるとする仮定は魅力的である。または、PAはエンドソー ムを脱安定化させることによって、およびその中に両成分がエンドサイトーシス されている小胞の破裂を誘発することによってLys-6-DTAを遊離させてもよい。 PAおよびLys-6-DTAが同じエンドソームの中に共に相互分析されるメカニズム にも関わらず、これらの結果は、アフィニティハンドルの特異的アミノ酸配列ま たは輸送される化合物の特性に特異的でないように思われる。したがって、これ らの結果は、一般的な移動系の要素を定義する。融合分子のPA媒介輸送の利点 既存の毒素キメラ輸送系とは対照的に、本発明の炭疸毒素系は、毒素B部分と の 融合蛋白質を産生する必要がない。これによって、逆にB部分および／または輸 送すべき標的化合物が構造的に不活化される可能性が生じる、長い融合蛋白質の 不適当な折り畳み方に関連する問題が緩和される。さらに、LFNを小さいカチオ ン融合ペプチドに置換すれば、移動蛋白質の生物活性の立体妨害の可能性が減少 するかも知れない。加えて、短いカチオンペプチドアフィニティハンドルは、融 合蛋白質の精製を促進するためのアフィニティハンドルタグとして二重の目的を 果たすことができる。そのような技法は、ヒスチジンに富むハンドルを有する化 合物の精製に関して当技術分野で周知である（すなわち、Niキレートクロマトグ ラフィーによって）；本発明者らは、本明細書にリジンに富むハンドルを有する 化合物の精製法を記述する。カチオン性アフィニティハンドル 好ましいカチオン性アフィニティハンドルは、多数のリジン、ヒスチジンおよ び／またはアルギニン残基を含むペプチドである。本発明者らの実験から、３〜 10個の連続したリジン残基がこの系では奏功し、残基数が多くなれば、異種蛋白 質の輸送がより容易になることが示された。リジン、ヒスチジン、またはアルギ ニンを用いて得られるpKa範囲は、以下の一つ以上に富むハンドルの領域に関し て６〜13の間となるはずである：リジン、アルギニン、またはヒスチジン。ペプ チド結合に加えて、ジスルフィド、チオエーテル、またはアミド結合を用いてポ リカチオン性アフィニティハンドルを異種蛋白質または他の化合物に結合させる ことができる。さらに、静電気力を用いて、アフィニティハンドルを核酸にリン クさせてもよい。カチオン性アフィニティハンドルを構成する塩基性残基の間に 散在する中性残基は、細胞への化合物の輸送の増強を阻害しないと考えている。PA の起源 PAは、例えば、炭疸菌（Bacillus anthracis）のスターン（Sterne）株から精 製してもよく、または他の既知の手段によって合成してもよい。炭疸菌では、PA の遺伝子はpXO1と呼ばれるプラスミド上に位置する（ミルネら（Milne）、1994 、J.of Biol.Chem. 269（32）:20607〜20612）。PA63は完全鎖長のPAの代用とす ることができる。これは、標的細胞が完全鎖長のPAをPA63に開裂するために必要 な蛋白質を欠損している場合、好ましいアプローチである。PA63断片は、陰イオ ン 交換クロマトグラフィーによってトリプシン処理PAから精製してもよい（ミルネ ら（Milne）、1994、前記）。PAコード遺伝子はクローニングおよびシークエン シングされており（ボドキンら（Vodkin）、1983、Cell 34:693〜697）、これを 用いて精製PAポリペプチドを得てもよい。細胞に輸送する化合物 提供されるPA媒介輸送系は、異なる様々な化合物を細胞に輸送するために用い てもよい。本方法は、化合物とリンクさせるカチオン性アフィニティハンドルが アフィニティハンドル-化合物融合分子を形成することが必要なだけである。こ れは、共有結合を用いて行ってもよく、核酸のように陰性荷電化合物の場合は、 静電気的結合を用いて行ってもよい。次に、融合分子を、化合物の細胞内への輸 送を可能にするために十分量のPAの前、後、または同時に、標的細胞に提供して もよい。開裂可能なアフィニティハンドル アフィニティハンドルは、細胞の内部で開裂することが知られている配列また は他の基質によって、化合物にリンクしてもよい。ハンドルが大きい場合、また はそうでなければハンドルが化合物の活性を妨害することが認められる場合には 、アフィニティハンドルをリンクさせるために開裂可能なスペーサーの使用が望 ましいかも知れない。蛋白質溶解的に開裂したポリペプチド配列は、この目的に 用いてもよい配列のタイプの一例である。グリシンスペーサー 約７残基のスペーサー長は、本明細書に記述の輸送系においてよく認容されて いる。他の長さのスペーサーでも上手くゆくはずで、提供される系において調べ ることができる（例えば、２〜100個の間）。スペーサーは、アフィニティハン ドルにおけるポリカチオン残基が、サティリカルに（satyrically）ブロックさ れないよう、それによって細胞の会合／結合を防止するよう十分な長さでなけれ ばならない。グリシン残基は、有意な二次構造要素を形成しない傾向があり、し たがってスペーサーに柔軟性を与える可能性があるため、スペーサーにとって都 合がよいが、他のアミノ酸を用いてもよい。アフィニティハンドルを接着させる結合 対象の化合物にアフィニティハンドルを接着させるために用いられる結合のタ イプは、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、アミド結合、またはペプチド 核酸結合（例えば、リボース間リンケージ）であってもよい。アフィニティハン ドルと異種蛋白質とのペプチド結合は、アフィニティハンドルのコード配列を、 標的とする蛋白質のコード配列のフレーム内で遺伝子融合させることによって構 築してもよい。ジスルフィド結合は、アフィニティハンドル中のシステインと、 標的とする蛋白質中のシステインとの間で構築してもよい。システインは、それ らが既に存在しない場合には、アフィニティハンドルまたは標的とする蛋白質の コード配列の中に作製してもよい。次に、結合形成は溶液酸化によって行っても よい。チオエーテル結合はシステイン残基とハロゲンのような強い脱離基を有す る脂肪族炭素との間に構築してもよい。アミド結合は強い脱離基を含むいかなる カルボニル化合物と１級、２級または３級アミンを含む化合物との間に形成され ると考えられる。リジン残基は１級アミンを含む化合物のよい例である。 上記に加えて、核酸輸送（または他の高度陰性荷電化合物）が望ましい場合、 核酸とアフィニティハンドルとの間の静電気力を用いて、ハンドルを化合物に結 合させてもよい。または、ペプチド-核酸リンケージを用いてもよい（例えば、 ニールセンら（Nielsen,P.E.）、Trends in Biotechnology 11:384〜386（1993 ）；アガウオォールス＆アイアー（Agarwals and Iyer,RP）、Current Opinion in Biotechnology 6:12〜19（1995）参照。）標的細胞タイプ 本発明は細胞タイプによって制限されないが、PA依存的方法に関しては、標的 とされる細胞タイプは機能的PA受容体を発現しなければならない。今日まで、試 験した全ての細胞タイプがPAに結合することができた（レップラ（Leppla, S.H. ）総説；レップラ（Leppla, S.H.）、1991、The Anthrax Toxin Complex inアラ ウフ、フリアー（J.E.Alouf, J.H.Freer）編「細菌蛋白質毒素の資料集」（Sour cebook of Bacterial Protein Toxins）Academic Press,London）。 以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を制限するための ものではない。 実施例 実施例１．材料および方法 細胞培養-CHO-K1細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（アメ リカンタイプカルチャーコレクション、ベセスダ、MD、ATCCCCL61）から得た。 細胞は、10％仔ウシ血清、ペニシリンG 500単位/ml、および硫酸ストレプトマイ シン500 単位/ml（ライフテクノロジーズ、インク、グランドアイランド、NY） を補添したハムF-12培地で増殖させた。細胞培養は単層として維持し、５％C02 の湿潤大気中で増殖させた。 DTA 融合蛋白質の構築、発現、および精製−全ての遺伝子操作には標準的なプ ロトコルを用いた（例えば、アウスベルら（Ausubel）、1987、分子生物学の最 新のプロトコル（Current Protocols in Mol.Biol.）、John Wiley and Sons,Ne w York）。DTA＋17残基アミノ末端ポリヒスチジン融合ペプチドをコードする完 全合成遺伝子を開始基質として用いて、これらの試験において記述される構築物 を産生した。多塩基-DTA融合蛋白質は、望ましい配列を含むプライマーを用いた PCR反応によって産生し、合成遺伝子のアミノ末端とのアニーリングのためにデ ザインした（アウスベルら（Ausubel）、1987、分子生物学の最新のプロトコル （Current Protocols in Mol.Biol.）、John Wiley and Sons,New York、補足20 ）。構築物は全て大腸菌発現ベクターpET15bにクローニングし、Ncol-BamHI断片 を置換した（ノバゲン、インク、マディソン、WI）。ライゲーション反応物を大 腸菌XL1-Blue（ストラタジーン、ラホヤ、CA）の中に形質転換した。プラスミド DNAを、適当な配列の存在下で増幅、精製、およびスクリーニングした（アウス ベルら（Ausubel）、1987、分子生物学の最新のプロトコル（Current Protocols in Mol.Biol.）、John Wiley and Sons，New York）。次に、正しい配列を保有 することが確認されたこれらの遺伝子構築物を、大腸菌発現宿主BL21（DE3）の 中に形質転換した（スタディア＆モファット（Studier and Moffatt）、1986、1 986、J.ofMol.Biol.189:113〜130）。 pET15bに発現された組換え蛋白質は、Ni2+-充填カラム上でのアフィニティク ロマトグラフィーによる蛋白質の精製を可能にする、アミノ末端ヘキサ-ヒスチ ジンタグと共に産生される（ブランケら（Blanke）1994、Biochemistry 33:5155 〜5161）。簡潔に述べると、BL21（DE3）/pET15b-ペプチド-DTAの培養は、ルリ アブロ ス-アンピシリン（100μg/ml）中でOD600 nmが0.6〜1.0になるまで増殖させ、蛋 白質発現は１ mM IPTGを約４時間加えることによって誘発した。細胞を超音波に よって融解し、遠心して透明にし、Ni2+-充填カラム（ブランケら（Blanke）199 4、前記）上に載せた。クロマトグラフィー工程は、His-6-DTAの精製用に予め決 定した方法に従って実施した（ブランケら（Blanke）1994、前記）。緩衝液およ び樹脂は全て製造元が明記した通りであった。カラムを洗浄し、イミダゾールと 共に蛋白質を溶出した。溶出蛋白質を脱塩し、さらに、陰イオン交換クロマトグ ラフィー（ファースト-プロテイン液体クロマトグラフィーシステム上で登録商 標モノＱカラム；ファルマシア）によって精製した。精製蛋白質約10mgを培養１ Lから得た。 NAD:EF-2 ADP- リボシルトランスフェラーゼ活性−NAD:EF-2 ADPリボシルトラ ンスフェラーゼ活性アッセイは、反応混合物のトリクロロ酢酸（TCA）-沈殿可能 なEF-2分画への[32P]-NADのADPリボース部分の取り込みの初速度を測定する。こ のアッセイは、本質的に記述の通り（ブランケら（Blanke）1994、前記）に実施 し、初速度はデュプリケートにおける３つの直線的な時点の回収によって決定し た。反応混合物は、50 mMトリス塩酸、pH 8.0、１mM EDTA、10 mM DTT、50μgBS Aml-1、50μM NAD、0.5μM EF-2、および酵素を含んだ。反応は25℃でインキュ ベートし、アリコットをデュプリケート試料から２、３、および４分に採り、３ MM濾紙上に直接ピペッティングした（ホワットマン、ヒルズボロ、OR）。濾紙パ ッドを直ちに氷冷５％TCAに入れ、プラットフォームロッカー上で、捨てた洗浄 液中にカウントが検出されなくなるまで、ゆるく攪拌しながら15分間に３〜５回 洗浄した。次に濾紙パッドを氷冷メタノールで５分間２回洗浄し、乾燥して、登 録商標1209ラックベータシンチレーションカウンター（LKB、ピスキャタウェイ 、NJ）において、登録商標ベックマンレディセイフ液体シンチレーションカクテ ル（ベックマン、コロンビア、MD）３ mLを用いて計数した。初速度は、反応液 の利用が10％未満での５分間の計数の増加（マイナスバックグラウンド）に基づ いて計算した。蛋白質合成阻害アッセイ−CHO-K1細胞をコスター96ウェルクラスタープレート において４×104細胞／ウェルの密度で、実験開始約18時間前に播種した（コス タ ーインク、ケンブリッジ、MA）。PA（２×10-8 hs M）および融合蛋白質（図２ 〜７に示す濃度）をハムF-12培地中の細胞に加えた。37℃で24時間後、培地を除 去し、細胞をPBS（ギブコBRL、グランドアイランド、NY）で洗浄し、L-[3,4,5-3 H]-ロイシン（１μCi/ml；デュポンNEN、ボストン、MA）を補添したL-ロイシン 欠乏培地（ギブコBRL）を加えた。１時間後、細胞を氷冷PBSで洗浄し、その後氷 冷TCA（10％）で洗浄した。蛋白質合成は酸不溶性材料への放射活性の取り込み によって測定し、非中毒対照細胞による取り込みの百分率として表現した。全て のアッセイをデュプリケートで実施した。このアッセイのバリエーションを図２ 〜７に示す。 脾細胞の採集−マウス脾細胞を採集して、記述のように（スターバックら（St arbach）、J.of Immun.153:1603、1994）以下の修正を加えてCTLを剌激した。免 疫および対照マウスからの脾細胞を単離し、RP-10で１回洗浄した。刺激剤とし て用いた細胞は、無傷で放射線照射し（2000 rad）、10 μM滅菌LLO91-99ペプチ ドで治療した同系の脾細胞であった。刺激剤細胞はペプチドの存在下で１時間イ ンキュベートし、次にRP-10で１回洗浄した。培養は、免疫または対照マウスの いずれかからの３×107個の刺激剤細胞および脾細胞３×107個を含んだ。これら は、37℃、70％CO2で全量RP-10 20 mlとしてT-75フラスコを垂直にしてインキュ ベートした。実施例２．リステリア・モノシトゲネスLLO91-99抗原によるワクチン接種 リステリア・モノシトゲネスは、マクロファージのサイトゾル中で生存する通 性細胞内細菌病原体である。貧食の後、リステリオリジン-O（LLO）がファゴソ ーム膜を融解し、細菌がサイトゾル中に逃れることを可能にする。LLOは宿主細 胞によって蛋白質溶解的にプロセスされ、MHC-Iに関係して細胞表面に提示され るペプチドを産生する。LLOのプロセシングの結果、H-2 Kd-制限CTLによって認 識されるノナメリック（nonameric）ペプチドLLO91-99（GYKDGNEYI）（ビラヌー バら（Vilanueva）、J.of Immun.155:5227〜5223、1995）。養子免疫細胞移入試 験により、LLO91-99に特異的なCTLは、リステリア・モノシトゲネス（L.monocyt ogenes）に対する防御に十分であることを示し、ワクチン候補としてのLLO91-99 を示唆した（ハーティら（Harty）、J.of Exp.Med.175:1531〜8、1992）。 LLO91-99をコードするDNA配列を、LFNをコードする遺伝子断片の5'または3'末 端に遺伝子融合した。融合物、LFN-LLO91-99およびLLO91-99-LFNを発現プラスミ ドpET-15bにクローニングし、組換え蛋白質を大腸菌BL-21に発現させて、精製し た。PAは、弱毒株の炭疸菌（Bacillus anthracis）の培養上清から、確立された プロトコル（レップラ（Leppla）、Adv.in Cyc.Nuc.& Prot.Phosph.Res.17:189 〜98、1984）に従って単離した。 BALB/cマウス（１群５匹）に、融合蛋白質、LFN-LLO91-99またはLLO91-99-LFN のいずれかを30 pmol、＋PA６ pmolを腹腔内注射した。対照群のマウスには、LF N-LLO91-99単独、LLO91-99-LFN単独、PA単独、LLO91-99単独またはPA＋LLO91-99 を注射した。注射後14日目に、動物を屠殺し、３×107個の脾細胞を、LLO91-99 ペプチドをコーティングした同系脾細胞上で剌激した。インビトロでの刺激後５ 日目、LLO91-99をコーティングしたH-2d肥満細胞腫であるP815を融解能に関して 細胞をアッセイした。図１に示すように、ペプチドコーティングP815の融解はP8 15細胞単独の融解より実質的に高く、マウスがLLO91-99特異的CTL反応を示した ことを示している。プライミングは、LLO91-99がカルボキシまたはアミノ末端に 融合されているか否かに関わらず起こった（図１）。対照はいずれもLLO91-99特 異的CTL反応を刺激しないため、これはLFN-媒介PA-依存的事象であることを示し ている。 この輸送系の効率は、固定量のPAを減少量のLFN-LLO91-99と共に注射すること によって調べた。マウスに、PA ６ pmolをLFN-LLO91-99の３ pmol、0.3 pmol、0 .03 pmolまたは0.003 pmolのいずれかと混合して注射した。14日後に脾細胞を採 取して、インビトロで５日間刺激後のCTL活性をアッセイした。図２に示すよう に、プライミングはLFN-LLO91-99の0.3 pmolもの低濃度で得られた。 次に、LFN-LLO91-99融合蛋白質でワクチン接種したマウスが、リステリア・モ ノシトゲネス（Listeria monocytogenes）によるチャレンジから防御されるか否 かを明らかにする実験を行った。先の実験と同様に、BALB/cマウスをLFN-LLO91- 99 30 pmol＋PA ６ pmolで免役した。免疫後４週間目に、マウスにLD50の２倍量 （11）（１×104コロニー形成単位）のリステリア・モノシトゲネスを静脈内に チャレンジした。感染後48時間目にマウスを屠殺し、脾臓および肝臓を採取した 。 図３に示すように、ワクチン接種マウスでは、対照マウス（PBS単独）と比較し て、これらの臓器に存在するコロニー形成単位の数が有意に少なかった。ワクチ ン接種群は肝臓では平均で30倍少なく、脾臓では平均で約20倍少ない細菌数を示 した。実施例３．リステリア・モノシトゲネスからの別のエピトープの輸送 上記のように、本発明者らは、LFn-PA系を用いたリステリオリジン-Oに由来す るCTLエピトープLLO91-99の輸送を証明した。エピトープは、LFnのいずれかの末 端に融合して輸送することができ、CTL反応はリステリア・モノシトゲネスによ るチャレンジからの防御を提供する。上記データに加えて、本発明者らは、リス テリア・モノシトゲネスからのもう一つの既知のCTLエピトープについても同様 の結果を得た。このエピトープ、P60217-225は、LFn-PAによって効率よく輸送さ れるように思われ、他のエピトープ輸送と同様に、LFn媒介およびPA依存的であ る。結果を図12に示す。実施例４．病原性ウイルスであるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LMCV）からの エピトープの、マウスの２つのハプロタイプへの輸送。 本発明者らは、LCMVからの２つのCTLエピトープの輸送にLFn-PA輸送系を用い てもよいことを発見した。調べた両エピトープは、ウイルスのヌクレオカプシド 蛋白質に由来し、一つはH2bハプロタイプで、もう一つはH2dである。これらの２ つの異なるエピトープの輸送は、この系がマウスの１つ以上のハプロタイプに作 用することを証明している。データを図17に示す。実施例５．２つの癌防御エピトープの輸送 癌モデルに用いた２つのエピトープを輸送した。最初のエピトープは卵白アル ブミンに由来するOVA257-265である。このエピトープは、卵白アルブミンを発現 するように形質転換された腫瘍細胞株EG7に発現されている。OVA257-265は必ず しも腫瘍由来抗原である必要はないが、固形腫瘍に対する炭疸毒素系のワクチン 接種能力をアッセイするための非常に都合のよいアプローチを提供する。第二の エピトープはP815Aでマウス肥満細胞腫P815に由来する。実施例６．同じ遺伝子融合の一部としての、または異なるLFn分子上の２つのエ ピトープの１回注射による輸送。 この実施例では、本発明者らは、１回の注射で１つ以上のエピトープに対する CTL反応を産生することができることを示す。両エピトープを同じ蛋白質上に発 現する融合物を作製することによって、または個別にLFnに融合したエピトープ の混合物を注射することによってこれを実施した。 P60217-225またはLLO91-99のいずれかと融合させたLFnの混合物を注射したマ ウスは、エピトープのそれぞれに対して強いCTL反応を示した。 多数のエピトープを１つの融合物で投与する有効性を調べるため、LLO91-99と 融合させたLFnおよびLCMVのH2dエピトープを発現するLFn構築物を作製した。こ の融合物を注射したマウスは、両エピトープに対して強いCTL反応を示した。こ れらの結果を図13および図14に示す。 これらの結果を考慮して、本発明者らは、このシステムを用いれば、１回の注 射で１つ以上の感染体に対して防御することができると考えている。実施例７．ジスルフィド結合によるLFnに融合したエピトープの輸送 CTLエピトープをLFn-PA系で輸送するもう一つのアプローチとして、本発明者 らは、LLO91-99をLFnとジスルフィド結合させ、このエピトープに対するCTL反応 をアッセイした。他の配列に加えて１個のシステインを含むように、LLO91-99の 合成型を作製した。次に、このペプチドを、システイン１個を含むLFnの変異体 へと酸化した。このヘテロダイマーおよびPAを注射したマウスは、LLO91-99特異 的CTL反応を示した。図15は、これらの結果を示す。このアプローチはフォルミ ル化ペプチドを輸送する方法を提供する。実施例８．この系が多連続エピトープについてもインビボで作用することの証明 いずれのエピトープ輸送系にも関する一つの主な懸念は、おそらく、担体に対 する免疫応答のため、有効に用いられるのは１回限りであろうということである 。ここに本発明者らは、本発明者らのLFn輸送系では多数回注射が可能であるこ とを示す。この試験において、マウスにまず、LFn-LCMV（H2b）＋PAを注射した 。この注射の４週間後、マウスにLFN-LLO91-99＋PAを注射した。２週間後、マウ スのLLO91-99に対するCTL反応をアッセイする。マウスは強いLLO91-99 CTL反応 を示し、初回注射による妨害を受けなかったことが判明する。この方法論を用い て、他の組み合わせを調べてもよい。実施例９．この系の全体的な特異性を証明するために１つの変異を含むエピトー プの使用 この系がどれほど特異性であるかをまさに示すため、本発明者らは、１個の変 異を含むCTLエピトープのペプチド特異的CTL反応の刺激能を調べた。LCMV118-12 6 エピトープにおいて１個のアミノ酸を変化させると（QからE）、全てのCTL刺激 活性が失われた。この結果はさらに、この反応のペプチド特異性を確認し、LFn もPAもCTLペプチドと無関係にはいかなる反応も剌激していないことを確認した 。これらの結果を図16に示す。実施例10．系の初回ワクチン接種後６ケ月間の防御提供能 本発明者らは、LFn-LL091-99でワクチン接種したマウスが注射後少なくとも６ ケ月までリステリア・モノシトゲネスに対して防御されることを認めた。実施例11．アフィニティハンドルを有するリポーター融合蛋白質の構築 これらの実施例で産生される融合構築物に関して、ジフテリア毒素の触媒ドメ インであるDTAをコードする合成遺伝子を利用した。これらの試験において用い られたアミノ末端融合ペプチドの配列を図４に示す。DTAは、移動を調べるには 特に適したリポーター分子である：細胞の細胞質の中に導入すると、DTAは伸長 因子（EF-2）のADP-リボシル化を触媒し、因子を不活化し、それによって蛋白質 合成を停止させることによって細胞死を引き起こす。DTA単独では非常に高濃度 を除いて、細胞に対してほとんど作用を示さないため、PAの細胞質への移動媒介 能は、DTA-融合蛋白質の蛋白質合成阻害能を測定することによって調べた。 最初の実験で用いたヘキサ-ヒスチジン-DTA融合蛋白質（His-6-DTA）は、大腸 菌における組換え蛋白質として発現され、ニッケルキレートアフィニティクロマ トグラフィーによってまず精製された。続いて陰イオン交換FPLCを行うと、His- 6-DTAの均一な精製が得られた。修飾されたトロンビン認識部位で融合ペプチド を蛋白質溶解的に開裂することによって、DTAを得て、真のDTAのアミノ末端配列 を生じるように操作した。最後にNi2+-カラムを通過させると、融合ペプチドか らDTAが分離し、未消化のHis-6-DTAが得られた。精製His-6-DTAは、構築された 全ての融合蛋白質と共に、DTに対する抗血清と交叉反応し、DTAと同様のADPリボ シル化活性を示した。脱塩細胞溶解物中の他の全てのDTA融合蛋白質の細胞障害 性実験 を実施した。実施例12．ヘキサヒスチジンアフィニティハンドルを用いたDTAの輸送 PAの存在下では、His-6-DTAは、DTAより100倍強い細胞障害性を示した（図５ ）。PAがなければ、His-6-DTAは調べた濃度範囲ではCHO-K1細胞に対して障害性 を示さなかった。PAの存在下または非存在下では、DTAは調べた最高濃度（５×1 0-7hs M）においてある程度の細胞障害性を示した。対照として、LFN-DTA融合蛋 白質は、これまでの報告のように、PAの存在下または非存在下において同じ滴定 曲線を示し、EC50値は３×10-13 Mであった。PAの非存在下では、DTAがなぜHis- 6-DTAより細胞障害性が強いのかはわからない。一つの説明は、これらのアッセ イで用いられた組織培養処理プレートの表面上の露出されたカルボキシル基とHi s-6-DTAの多塩基ペプチドとの静電気的相互作用によるHis-6-DTAの欠如であろう 。実施例13.DTAにおける活性部位変異は、毒性がDTAの細胞質への輸送によるもの であることを確認する。 PA依存的蛋白質合成の阻害がEF-2のADP-リボシル化によるものであることを確 認するため、本発明者らは、His-6-DTA構築物の中に５個の活性部位変異を導入 した。これらの変異-H21N、H21R、H21A、Y65A、およびW65A-は、インビトロでAD P-リボシルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ、３、70、120、670および200,00 0倍減少させた。細胞障害性減少のパターンは、インビトロにおけるADP-リボシ ルトランスフェラーゼ活性の減少と相関した（図６）。 これらの結果は、ポリヒスチジン融合ペプチドが、CHO-K1細胞の細胞質へのDT AのPA媒介流入を増強したことを示している。実施例14．その他のカチオンタグもPA依存的アフィニティハンドルとして機能す る 本発明者らは、３個の残基をリジン（Lys-6-DTA）、アルギニン（Agr-6-DTA） 、およびグルタミン（Glu-6-DTA）に置換することによって、６個のヒスチジン 残基がPA媒介移動の増強に関与するか否かを調べた。対照として、６個のヒスチ ジンを中性配列セリン-セリン-グリシン-セリン-セリン-グリシン（SSGSSG-DTA ）に置換した（図４）。PAの存在下で蛋白質合成を阻害する能力をアッセイする と、Lys-6-DTAがHis-6-DTAより100倍細胞障害性が強いことを発見したが（図７ ）、A rg-6-DTAはHis-6-DTAと同様の細胞障害性を示した。PAの存在下では、SSGSSG-DT AおよびGlu-6-DTAは、CHO-K1細胞に対して細胞障害性を示さなかつた（図７）。 これらの結果は、融合ペプチドにおいて化学的に塩基性の側鎖を有する６個の残 基がDTAのPA媒介移動にとって十分であることを示し、一級アミン（Lys）は、こ の系においてイミダゾール（His）またはグアニジン（Arg）側鎖より有効である ことを示している。さらに、中性または酸性タグペプチドは、細胞質へのDTAのP A媒介移動を増強しない。 Lys-6-DTAがArg-6-DTAより細胞障害的であるか否かは初め明確でなかった。し かし、後の実験では、CHO-K1細胞と37℃で24時間インキュベートすると、SDS-PA GE分析によってArg-6-DTAがDTAに類似の低分子量種に広く変換されている結果と なった。His-6-DTAおよびLys-6-DTAと共に同様にインキュベートしても、検出可 能な分解が得られなかった。これらの結果は、Arg-6-DTAのアルギニン残基が細 胞表面で蛋白質溶解性崩壊を受けやすい可能性があることを示している。実施例15．３、８、10または12個のリジンを有するアフィニティハンドルの試験 リジン残基は、DTAのCH0-K1細胞へのPA-媒介移動を増強する上で最も有効であ ったため、本発明者らは、リジンタグDTA融合蛋白質を用いて続く実験を行った 。Lys-6-DTAに関しては、本発明者らは簡便な２工程の精製プロトコルを開発し た。最初の工程は、アミノ末端ペプチドの局在する陽性荷電を活用するためにデ ザインされた；重力フロー陽イオン交換クロマトグラフィー（ホワットマンP-11 樹脂、ヒルズボロ、OR）を用いて粗抽出物を分解した。第二の工程として、登録 商標モノ-Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーの結果、Lys-6-DTAの均一な精製が 得られた。 本発明者らは、アミノ末端融合ペプチドにおける３、８、10、または12個のリ ジンに置換して、陽性荷電残基数がPA媒介DTA移動にどのように影響を及ぼすか を調べた（図４C）。Lys-3-DTA..Lys-8-DTAN Lys-10-DTA、およびLys-12-DTAを 粗溶解物中に調製して、Lys-6-DTAと比較してそれらの蛋白質合成阻害能を調べ た（図８）。アフィニティハンドルにおけるリジン残基数は、認められた蛋白質 合成の阻害と直接相関した。本発明者らは、アフィニティハンドル中のリジン残 基数が増加すれば、細胞表面またはPA63に対する全体的な親和性が増加すると考 える。 しかし、アフィニティハンドル中に遺伝子操作できるリジン残基の数には実際的 な上限があるかも知れない。これは本明細書に提供される材料を用いて容易に試 験される。 本発明者らは、Lys-12-DTA融合蛋白質は大腸菌における発現が不良で、崩壊を 受けやすいように思われることを認めた。これらの結果は、Lys-10-DTAを輸送効 率における上限として認めるわけではないが、Lys-10タグ蛋白質の発現および精 製の容易さは、それが２つの構築物より実際的である可能性を示唆している。実施例16．アフィニティハンドルの輸送はPA結合部位上でのLFnとは無関係であ る 。 この研究から生じた疑問は、これらの多塩基融合ペプチドがPAまたは細胞 表面の別の成分に直接結合するか否かという点である。Lys-6-DTAがLFとしてPA の同じ部位に結合するのであれば、LFNはPAと競合することによって細胞障害性 をブロックするはずである。先に報告したように、LFNはLFN-DTA融合蛋白質から 細胞を用量依存的に防御しない。しかし、図９に示すように、PAおよびLys-6-DT Aの存在下でCH0-K1細胞と共にインキュベートすると、LFNは、LFNの1000倍モル 過剰でも、融合蛋白質の細胞障害効果から細胞を防御しない。関連する実験にお いて、配列KKKKKKGSGCGを有する合成ペプチドは、５×107モル過剰でもLFN-DTA のPA-依存的細胞障害効果からCHO-K1細胞を防御しなかった（図10）。同じペプ チドはまた、Lys-6-DTAのPA-依存的細胞障害効果からCH0-K1細胞をわずかに防御 することができたが、これは100,000倍モル過剰の場合に限られ、Lys-6-DTA結合 部位の数が非常に多いか、またはLys-6-DTA結合部位に対する合成ペプチドの内 在的に弱い結合親和性のいずれかを示唆している。併せて、これらの結果は、Ly s-6-DTAおよびLFNが同一のPA結合部位を共有しないことを示している。実施例17．異種蛋白質の相互交換可能な特性 エキソ酵素S（緑嚢菌（Psuedomonas aeruginosa）由来）を用いて、本発明者 らが提供するPA-媒介移動系の普遍性に取り組んだ。最初の実験は、アフィニテ ィハンドルがなければ細胞流入の証拠を示さないエキソ酵素Sが、PAの存在下で アミノ末端ポリヒスチジン融合蛋白質によりタグをつけると細胞に流入すること ができることを示した。PAの存在下で細胞生存率の減少によって測定すると、Hi s-6タグエキソ酵素Sは細胞に入る。実施例18．カチオン性アフィニティハンドルを用いたPA-依存型化合物輸送。 本発明者らは、アフィニティハンドルにおける塩基性残基が、PAの非存在下に おいても、細胞の細胞質へのDTAの流入を媒介できることを示すデータを得た（ 図11）。蛋白質合成阻害は、PAの非存在下でリジンアフィニティハンドル-DTAが 通常の蛋白質合成阻害実験で用いられた最高濃度に達する濃度で（すなわち、５ e-7 M le-6 M）認められた；この蛋白質合成の阻害はアフィニティハンドル中の リジン残基の数が増加するにつれてより顕著となった。特に、５e-7MのLys-10-D TAは、蛋白質合成を対照の25％にまで減少させた。そのようなアフィニティハン ドル-DTAがPAの非存在下で明らかに細胞内に入るメカニズムは不明であるが、細 胞表面成分またはPAに対するハンドルの親和性のおそらく増加に関連すると本発 明者らは推察する。実施例19．インビボでのポリカチオン性アフィニティハンドルの利用 この実施例では、本発明者らは、ポリカチオンタグアプローチをインビボで試 験した。単純なリポーター系として、６個のリジンと融合したジフテリア毒素の 酵素的ドメイン（DTA）を用いる。マウスに、Lys-DTA＋PAを注射し、細胞の死亡 によって輸送をアッセイする。本発明者らは、Lys-6-DTA＋PAを注射したマウス が生存しないことを発見する。PAを伴わないLys-DTA、またはDTA＋PAを注射した マウスは影響を受けなかった。これらの結果は、DTA輸送がPA媒介およびリジン タグ依存的であることを示している。本発明者らの結果は、ポリカチオン性アフ ィニティハンドル系が異種分子のインビボ輸送に関する可能性を有することを示 している。 本発明者らの態様は以下の請求の範囲内にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/20 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｎ 31/22 ６３１Ｐ 43/00 ６４３Ｂ Ａ６１Ｋ 38/00 39/02 39/02 39/04 39/04 39/112 39/112 39/12 39/12 39/13 39/13 39/165 39/165 39/20 39/20 39/205 39/205 39/21 39/21 39/245 39/245 39/25 39/25 39/285 39/285 39/29 39/29 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 14/195 14/32 14/32 19/00 19/00 14/005 // Ｃ０７Ｋ 14/005 14/47 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ミルン ジル シー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ブ ルックリン ケンウッド ストリート 30 (72)発明者 リスザック エリカ エル. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ブ ルックリン フランシス ストリート 30 (72)発明者 バラード ジムニー ディー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 チ ェストナット ヒル ミドルセックス ロ ード ＃３ 142 (72)発明者 スターンバッチ マイケル エヌ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ードハム カントリー ウェイ 304

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．毒素輸送分子およびポリカチオン性アフィニティハンドルからなる群より選 択される、抗原性化合物にリンクされている輸送分子を含む融合分子に、細胞を 接触させることを含む、抗原性化合物を細胞の細胞質に導入する方法。 ２．毒素輸送分子およびポリカチオン性アフィニティハンドルからなる群より選 択される、抗原性化合物コード核酸にリンクされている輸送分子を含む融合分子 に、細胞を接触させることを含む、抗原性化合物をコードする核酸を、細胞の細 胞質に導入する方法。 ３．細胞を毒素のB部分に接触させることをさらに含む、請求項１または２記載 の方法。 ４．毒素輸送分子が炭疸のLFnである、請求項１または２記載の方法。 ５．B部分が炭疸PAである、請求項３記載の方法。 ６．炭疸PAが、炭疸PAの63 kDaカルボキシ末端ドメインである、請求項５記載の 方法。 ７．ポリカチオン性アフィニティハンドルが、アミノ酸残基２〜250個のペプチ ドを含む、請求項１または２記載の方法。 ８．ポリカチオン性アフィニティハンドルがアミノ酸残基２〜16個のペプチドを 含む、請求項７記載の方法。 ９．ペプチドのアミノ酸の少なくとも２個が、アルギニン、リジン、およびヒス チジンからなる群より選択され、該ペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも10 ％が、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択される、請求 項７記載の方法。 10．ハンドルが、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択さ れる少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項９記載の方法。 11．ハンドルが少なくとも６個のアルギニン残基を含む、請求項10記載の方法。 12．ハンドルが少なくとも３個のリジン残基を含む、請求項９記載の方法。 13．ハンドルが少なくとも６個のヒスチジン残基を含む、請求項９記載の方法。 14．ポリカチオン性アフィニティハンドルのpKaが6.5〜12.5である、請求項１ま たは２記載の方法。 15．抗原性化合物が、ヒト乳頭腫ウイルス16ペプチド（例えば、抗原E6およびE7 、E7ペプチド49〜57RAHYNIVTF）；ヒトP53ペプチド（例えば、V10ペプチドFYQLA KTCPV）；ヒト免疫不全ウイルスペプチド（例えば、gp 120、P18ペプチドRIQRGP GRAFVTIGK）;MUC-Iヒト癌抗原ペプチド；MAGE遺伝子ファミリーの蛋白質由来ペ プチド（例えば、MAGE-1 SAYGEPRKL、MAGE-3 FLWGPRALV）；ヒトチロシナーゼ蛋 白質由来ペプチド（例えば、Tyr-A2-1 MLLAVLYCL、Try-A@-2 YMNGTMSQV）；リス テリオリジン-Oペプチド、例えばLLO91-99 GYKDGNEYI）；P60ペプチド（例えば 、P60217-225 KYGVSVQDI）；MART-1ペプチド（例えば、M-9 AAAAAGIGILTV、M10- 3EAAGIGILTV）；BAGE-1ペプチド（例えば、AARAVFLAL）；P1Aペプチド（例えば 、P815A35-43 LPYLGWLVF）；コネキシン（Connexin）ギャップ接合部由来ペプチ ド（例えば、Mut 1 FEQNTAQP、MUT 2 FEQNTAQA）；以下の病原体に由来するペプ チド／蛋白質：サイトメガロウイルス、B型肝炎、ヒトヘルペスウイルス１〜５ 、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、赤痢菌、 ヒト型結核菌およびトリ型結核菌、チフス菌およびネズミチフス菌、HTLV-I、II 、水痘-帯状抱疹ウイルス、天然痘、ポリオ、黄熱病、脳炎ウイルス、ならびに エプスタイン-バーウイルスからなる群より選択される、請求項１または２記載 の方法。 16.核酸が、DNAおよびRNAからなる群より選択される請求項２記載の方法。 17．融合分子が、輸送分子を化合物にリンクさせるペプチド結合をさらに含む、 請求項９記載の方法。 18．ペプチド結合が輸送分子のアミノ末端である、請求項17記載の方法。 19．ペプチド結合が輸送分子のカルボキシ末端である、請求項17記載の方法。 20．融合分子が、輸送分子を化合物にリンクさせるアミド結合をさらに含む、請 求項１または２記載の方法。 21．融合分子が、輸送分子を化合物にリンクさせるチオエーテル結合をさらに含 む、請求項１または２記載の方法。 22．融合分子が、輸送分子を化合物にリンクさせるジスルフィド結合をさらに含 む、請求項１または２記載の方法。 23．融合分子が、化合物とポリカチオン性アフィニティハンドルとの間の開裂部 位をさらに含む、請求項１または２記載の方法。 24．融合分子が、化合物と輸送分子との間のスペーサーをさらに含む、請求項１ または２記載の方法。 25．抗原性化合物にリンクしたポリカチオン性アフィニティハンドルまたは毒素 輸送分子を有する融合分子を含む、細胞の細胞質に抗原性化合物を導入するため のキット。 26.化合物にリンクしたポリカチオン性アフィニティハンドルを有する融合分子 を含む、細胞の細胞質に化合物を導入するためのキット。 27．毒素のB部分をさらに含む、請求項25または26記載のキット。 28．B部分が炭疸PAである、請求項27記載のキット。 29．ポリカチオン性アフィニティハンドル、LFN、またはLFNに関連する毒素分子 からなる群より選択されるポリペプチドである第二の化合物に、共有結合によっ てリンクされた抗原性化合物を含む、抗原性化合物を細胞の細胞質に輸送するた めの融合分子。 30．第二の化合物に共有結合した少なくとも２つの抗原性化合物を有する、請求 項29記載の融合分子。 31．ポリカチオン性アフィニティハンドル、LFN、またはLFNに関連する毒素分子 からなる群より選択されるポリペプチドである第二の化合物に、共有結合によっ てリンクされた核酸を含む、細胞の細胞質に核酸を輸送するための融合分子。 32．抗原性化合物が、ヒト乳頭腫ウイルス16ペプチド（例えば、抗原E6およびE7 、E7ペプチド49〜57 RAHYNIVTF）；ヒトP53ペプチド（例えば、V10ペプチドFYQL AKTCPV）；ヒト免疫不全ウイルスペプチド（例えば、gp 120、P18ペプチドRIQRG PGRAFVTIGK）；MUC-Iヒト癌抗原ペプチド；MAGE遺伝子ファミリーの蛋白質由来 ペプチド（例えば、MAGE-1 SAYGEPRKL、MAGE-3 FLWGPRALV）；ヒトチロシナーゼ 蛋白質由来ペプチド（例えば、Tyr-K2-1 MLLAVLYCL、Try-A@-2 YMNGTMSQV）；リ ステリオリジン-Oペプチド、例えばLLO91-99 GYKDGNEYI）；P60ペプチド（例え ば、P60217-225 KYGVSVQDI）；MART-1ペプチド（例えば、M-9 AAAAAGIGILTV、M 10-3EAAGIGILTV）；BAGE-1ぺプチド（例えば、AARAVFLAL）;P1Aペプチド（例え ば、P815A35-43 LPYLGWLVF）；コネキシン（Connexin）ギャップ接合部由来ペプ チド（例えば、Mut 1 FEQNTAQP、MUT 2 FEQNTAQA）；以下の病原体に由来するペ プチ ド／蛋白質：サイトメガロウイルス、B型肝炎、ヒトヘルペスウイルス１〜５、 狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、赤痢菌、ヒ ト型結核菌およびトリ型結核菌、チフス菌およびネズミチフス菌、HTLV-I、II、 水痘-帯状庖疹ウイルス、天然痘、ポリオ、黄熱病、脳炎ウイルス、ならびにエ プスタイン-バーウイルスからなる群より選択される、請求項29記載の融合分子 。 33．抗原性化合物がDNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項30記載の融 合分子。 34．ポリカチオン性アフィニティハンドルであるポリペプチド、LFNであるポリ ペプチド、またはLFNに関連する毒素輸送系に由来するポリペプチドである第二 の化合物に共有結合によってリンクされた抗原性化合物を含む融合分子と、毒素 のB部分との混合物を含む、組成物。 35．ポリカチオン性アフィニティハンドルであるポリペプチド、LFNであるポリ ペプチド、またはLFNに類似の毒素輸送系に由来するポリペプチドである第二の 化合物に共有結合によってリンクされた核酸を含む融合分子と、毒素のB部分と の混合物を含む、組成物。 36．化合物に共有結合したポリカチオン性アフィニティハンドルを含む融合分子 に、細胞を接触させることを含む、細胞の細胞質に融合分子を導入する方法。 37．細胞を毒素のB部分と接触させることをさらに含む、請求項１記載の方法。 38．B部分が炭疸PAである、請求項２記載の方法。 39．炭疸PAが炭疸PAの63 kDaカルボキシ末端ドメインである、請求項３記載の方 法。 40．ポリカチオン性アフィニティハンドルがアミノ酸残基２〜250個のペプチド を含む、請求項１記載の方法。 41．ポリカチオン性アフィニティハンドルがアミノ酸残基２〜16個のペプチドを 含む、請求項５記載の方法。 42．ペプチドのアミノ酸の少なくとも２個が、アルギニン、リジン、およびヒス チジンからなる群より選択され、該ペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも10 ％が、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択される、請求 項５記載の方法。 43．ハンドルが、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択さ れる少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項７記載の方法。 44．ハンドルが少なくとも６個のアルギニン残基を含む、請求項８記載の方法。 45．ハンドルが少なくとも３個のリジン残基を含む、請求項８記載の方法。 46．ハンドルが少なくとも６個のヒスチジン残基を含む、請求項８記載の方法。 47．ポリカチオン性アフィニティハンドルのpKaが6.5〜12.5の間である、請求項 １記載の方法。 48．化合物が、蛋白質毒素分子、アポトーシス誘発分子、シグナル伝達経路の蛋 白質成分、DNA、RNA、MHCクラスI抗原、遺伝子相補物の蛋白質、治療的ペプチド および治療的蛋白質からなる群より選択される、請求項１記載の方法。 49．融合分子が、ポリカチオン性アフィニティハンドルを化合物にリンクさせる ペプチド結合をさらに含む、請求項７記載の方法。 50．ペプチド結合がポリカチオン性アフィニティハンドルのアミノ末端である、 請求項７記載の方法。 51．ペプチド結合がポリカチオン性アフィニティハンドルのカルボキシ末端であ る、請求項７記載の方法。 52．融合分子が、ポリカチオン性アフィニティハンドルを化合物にリンクさせる アミド結合をさらに含む、請求項１記載の方法。 53．融合分子が、ポリカチオン性アフィニティハンドルを化合物にリンクさせる チオエーテル結合をさらに含む、請求項１記載の方法。 54．融合分子が、ポリカチオン性アフィニティハンドルを化合物にリンクさせる ジスルフィド結合をさらに含む、請求項１記載の方法。 55．融合分子が、化合物とポリカチオン性アフィニティハンドルとの間の開裂部 位をさらに含む、請求項１記載の方法。 56．融合分子が、化合物とポリカチオン性アフィニティハンドルとの間のスペー サーをさらに含む、請求項１記載の方法。 57．化合物にリンクしたポリカチオン性アフィニティハンドルを有する融合分子 を含む、細胞の細胞質に化合物を導入するためのキット。 58．毒素のB部分をさらに含む、請求項22記載のキット。 59．B部分が炭疸PAである、請求項23記載のキット。 60．アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群より選択される少なくと も二つのアミノ酸を有するポリペプチドであって、共有結合がペプチド結合であ る場合は少なくとも一つのアミノ酸がアルギニンまたはリジンである第二のポリ ペプチドに共有結合によってリンクされた第一のポリペプチドを含む、細胞の細 胞質に第一のポリペプチドを輸送するための融合分子。 61．第一のポリペプチドが、蛋白質毒素分子、アポトーシス誘発分子、シグナル 伝達経路の蛋白質成分、DNA、RNA、MHCクラスI抗原、遺伝子相補物の蛋白質、治 療的ペプチド、および治療的蛋白質からなる群より選択される、請求項25記載の 融合分子。 62．アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択される少なくとも ３個のアミノ酸を有するポリペプチドであって、共有結合がペプチド結合である 場合は少なくとも１個のアミノ酸がアルギニンまたはリジンである第二のポリペ プチドに共有結合によってリンクされた第一のペプチドを含む融合分子と、毒素 のB部分との混合物を含む、組成物。 63．(ａ)核酸と(ｂ)静電気力によって該核酸の非常に近位に存在するポリカチオ ン性アフィニティハンドルとを細胞に接触させることを含む、細胞の細胞内領域 に核酸を導入する方法。
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6592872B1 (en) * 1996-09-17 2003-07-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Targeting antigens to the MHC class I processing pathway with an anthrax toxin fusion protein
GB9713122D0 (en) * 1997-06-20 1997-08-27 Chiron Spa Novel method of DNA transfer into cells
DE19735105A1 (de) * 1997-08-13 1999-03-04 Univ Albert Ludwigs Freiburg Transportsystem zur Einbringung von Proteinen in Zielzellen mit Hilfe eines Fusionsproteins, Nucleinsäurekonstrukte kodierend für die Komponenten des Transportsystems und Arzneimittel, die Komponenten des Transportsystems umfassen
US6737511B1 (en) * 1999-08-16 2004-05-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Receptor-mediated uptake of an extracellular BCL-xL fusion protein inhibits apoptosis
AU2001261171A1 (en) 2000-05-04 2001-11-12 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for the treatment and prevention of bacterial infection
ATE360071T1 (de) 2000-12-05 2007-05-15 Wisconsin Alumni Res Found Rezeptor für ein toxin aus bacillus anthracis
AU2008203414B2 (en) * 2001-03-28 2012-08-16 General Hospital Corporation Methods of delivery of exogenous proteins to the cytosol and uses thereof
CA2442020C (en) 2001-03-28 2017-03-14 President And Fellows Of Harvard College Methods of delivery of exogenous proteins to the cytosol and uses thereof
US7442686B2 (en) 2001-04-12 2008-10-28 Bioaxone Therapeutique Inc. Treatment of macular degeneration with ADP-ribosyl transferase fusion protein therapeutic compositions
MXPA04007252A (es) * 2002-01-29 2005-03-31 Wyeth Corp Composiciones y metodos para modular los hemicanales de conexina.
US7201912B2 (en) * 2002-04-12 2007-04-10 Emergent Biodefense Operation Lansing Inc. Recombinant immunogenic compositions and methods for protecting against lethal infections from Bacillus anthracis
US20060246079A1 (en) * 2003-11-14 2006-11-02 Morrow Phillip R Neutralizing human antibodies to anthrax toxin
WO2005081749A2 (en) * 2004-01-23 2005-09-09 Avanir Pharmaceuticals, Inc. Neutralizing human antibodies to anthraxtoxin
DE102004035606A1 (de) * 2004-07-22 2006-03-30 Biotecon Therapeutics Gmbh Carrier für Arzneimittel zur Gewinnung der oralen Bioverfügbarkeit
US20080287384A1 (en) * 2005-09-19 2008-11-20 Marsha Rosner Methods of Identifying Agents Having Antiangiogenic Activity
EP2537932B1 (en) * 2006-02-21 2016-04-27 President and Fellows of Harvard College Compositions for and methods of identifying antigens
AU2007259329A1 (en) * 2006-05-12 2007-12-21 Farris, Darise Anthrax compositions and methods of use and production
WO2010144794A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Baculovirus-expressed fusion polypeptide vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
CN102573883A (zh) 2009-06-12 2012-07-11 疫苗技术公司 用于促进细胞-介导的免疫应答的方法和组合物
CN102549425A (zh) 2009-06-12 2012-07-04 疫苗技术公司 用于测量细胞介导的免疫应答的诊断试验所用的方法和组合物
AU2010306940A1 (en) 2009-10-12 2012-06-07 Smith, Larry Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
CA2824154A1 (en) * 2011-01-10 2012-07-19 President And Fellows Of Harvard College Method for delivering agents into cells using bacterial toxins
WO2013126690A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Modified microbial toxin receptor for delivering agents into cells
GB201311057D0 (en) * 2013-06-21 2013-08-07 Univ Greenwich Antisense oligonucleotide compositions
WO2015188094A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 President And Fellows Of Harvard College Methods for targeted modification of genomic dna
JP2018525021A (ja) 2015-08-27 2018-09-06 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 疼痛の治療を目的とする組成物及び方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5130129A (en) * 1990-03-06 1992-07-14 The Regents Of The University Of California Method for enhancing antibody transport through capillary barriers
US5591631A (en) * 1993-02-12 1997-01-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anthrax toxin fusion proteins, nucleic acid encoding same

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