WO2009127766A1 - Sistema para la expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana - Google Patents

Sistema para la expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana Download PDF

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WO2009127766A1
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protein
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amino acid
expression
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José DE LA FUENTE GARCÍA
Mario Manuel CANALES GARCÍA-MENOCAL
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Universidad De Castilla La Mancha
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins

Definitions

  • the present invention is within the biotechnological, biochemical, and chemical-pharmaceutical sectors.
  • the object of the invention is a method to expose recombinant polypeptides expressed on the bacterial surface. It may be applied in basic or applied research in molecular biology, biochemistry, biotechnology or in the production of recombinant proteins for various purposes.
  • Surface protein expression has multiple applications, including: to. the development of live vaccines, by exposing heterologous epitopes of human commensals or attenuated pathogenic bacterial cells to elicit the response of antigen-specific antibodies, b. The search for peptide libraries by sequential binding and circumvention or, more efficiently by cell fluorescence classification
  • FACS Fluorescence-activated cell-sorting
  • Anaplasma marg ⁇ nale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) is a tick-borne pathogen that causes bovine anaplasmosis, a disease that causes significant economic losses in livestock production.
  • the MSPIa protein (Major Sur ⁇ ace Protein 1a) is one of the five main surface proteins known from A. marg ⁇ nale and is involved in the adhesion of the pathogen to the hosts and in the interactions of the pathogen with the ticks. This protein has evolved under a positive selective pressure and its molecular size is different between strains of different geographical areas. The variations are due to a sequence of 23 to 31 consecutive amino acids repeated several times, at the N-terminal end, of the region that the protein exposes on the bacterial surface.
  • MSPIa allows bacteria to adhere to bovine erythrocytes and tick cells.
  • the adhesion domain of the protein has been identified precisely in the variable region of the N-terminal end containing repeated peptides.
  • the MSPIa is also involved in the transmission of A. marg ⁇ nale by the ticks of the genus Dermacentor spp. and the repeated peptides of the N-terminal end, which have B cell epitopes, could be involved in the protective response of cattle against infections by A. marg ⁇ nale.
  • Boophilus microplus tick (recently reclassified as Rhipicephalus microplus) significantly affects cattle in tropical and subtropical regions of the planet.
  • the BM86 antigen, encoded by the Bm86 gene, is a glycoprotein isolated from the intestinal cells of R. microplus that has been used in a vaccine against infestations by these ticks.
  • a gene homologous to Bm86, Bm95, was also isolated from a strain of R. microplus (Strain A) and its coding protein, BM95, showed protective capacity against a greater number of tick strains from different geographical regions.
  • the first experiments carried out by the inventors characterized the presence of immunogenic peptides in the BM86 protein. Subsequently it was shown that these peptides were responsible for inducing the protective response of vaccinated cattle against tick infestations.
  • a recombinant protein composed of the immunogenic peptides of BM95 fused with the N-terminal region of the MSPIa protein of A. marg ⁇ nale, is exposed on the surface of living E. coli cells and is recognized by anti-BM86 and anti-MSP1a antibodies.
  • This system provides a novel model of exposure of heterologous proteins on live bacteria cells and also suggests the possibility of using recombinant bacteria in studies of immunization of cattle against tick infestations.
  • a suitable anchor protein must have the following four requirements: it must have a transporter that allows the premature fusion protein to pass through the inner membrane; It must have a strong anchor structure to support the fusion proteins on the cell surface; it must be compatible with the external sequences to be inserted or fused, and finally, it must be resistant to the attack of the proteases present in the periplasmic medium or space.
  • the present invention relates to the use of a portion of the A. marginale MSPIa protein to direct the exposure of other peptides on the cell surface, by means of its N-terminal fusion with this protein.
  • MSPIa the natural size range of the repeated peptides in the N-terminal region of MSPIa (28-289 amino acids) and the exemplary embodiments set forth herein
  • an advantage of using the MSPIa protein instead of other reasons for anchoring membrane proteins to expose peptides on the cell surface is the possibility of exposing polypeptides of different sizes and amino acid composition.
  • a peptide expression system is provided on the bacterial surface, hereinafter the expression system of the invention, characterized in that it comprises an anchorage region to the bacterial membrane and the exposed peptide , where any of the following sequences are used as an anchorage region to the bacterial membrane: to.
  • Peptide comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of the invention means the amino acid sequence of the portion of the MSPIa protein of Anaplasma marg ⁇ nale, or a protein with an identity of at least 80%, and more preferably 90 %, 95%, 98%, and even more preferably 99% with said portion of the MSPIa protein, collected in SEQ ID NO: 1.
  • exposed peptide means the amino acid sequence to be expressed. on the bacterial surface, and that is bound or fused to the amino acid sequence of the invention.
  • peptide includes both the full-length protein, as well as the sequences of shorter polypeptides and peptides.
  • polynucleotide or “polynucleotide sequence”, as used herein, refers to a polymeric form of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term only refers to the primary structure of the molecule. Thus, this term includes double or single stranded DNA, as well as double or single stranded RNA.
  • the bacterium on whose surface the peptide of interest is expressed is Escher ⁇ chia coli (E. coli).
  • Escher ⁇ chia coli (E. coli) a gram negative bacterium, facultative and non-sporulated anaerobic, with a genome of approximately 4.6 kb, is perhaps the most studied prokaryotic organism by man.
  • Some strains of this bacterium are extremely versatile in the laboratory, tolerating genetic manipulation very well and even losing their pathogenic capacity, which is why it is used as a "model organism" for the study of structures, genetic and physiological mechanisms and their extrapolation to large number of microorganisms, including the eukaryotic cell.
  • the exposed peptide is not MSPL
  • a genetic construction, henceforth genetic construction of the invention which would direct the in vitro or intracellular transcription of the polynucleotide sequences of the expression system of the invention, and comprises, less, one of the following types of sequences: a. nucleotide sequence, preferably double stranded, encoding the amino acid sequence of the expression system of the invention, or b. nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a), C. nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d.
  • This method includes the cloning and expression vectors that comprise the nucleic acid molecules of the expression system of the invention.
  • expression vectors include suitable control sequences, such as, for example, control elements for translation (such as start and stop codes) and for transcription (for example, promoter-operator regions, binding sites).
  • the vectors according to the invention can include plasmids and viruses (comprising bacteriophages and eukaryotic viruses), according to procedures well known and documented in the art, and can be expressed in a variety of different expression systems, also well known and documented in Ia technique.
  • Suitable viral vectors include, baculovirus and also adenovirus and vaccine viruses. Many other viral and non-viral vectors are described and are known in the art.
  • the transformed or transfected eukaryotic or prokaryotic host cells which contain a nucleic acid molecule according to the invention, as defined above, also form part of this aspect of the invention. Since the nucleotide and amino acid sequences of the expression system of the invention are related in terms of their evolution, it can be expected that the overall identity of the genomes at the amino acid level, obtained from different strains, populations and / or individuals of Anaplasma marg ⁇ nale , and more specifically at the level of the amino acid sequence that is included in SEQ ID NO: 1, is 80% or more, and more preferably 90% or more and more preferably 95, 98 or 99 % or older. The correspondence between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the sequence belonging to another individual or organism can be determined by methods known in the art.
  • the genetic construction of the invention is included in a plasmid.
  • the exposed peptides can also be prepared by expression in a host cell that contains a recombinant DNA molecule that comprises a nucleotide sequence that is transcribed to the peptides, operatively linked to an expression control sequence, or a vehicle or cloning vector of recombinant DNA containing such a recombinant DNA molecule.
  • the peptides can be expressed by direct injection of a single DNA molecule into a host cell.
  • a method for developing the expression system of the invention which comprises the following steps: a. Introduce the genetic construction of the invention, or a plasmid of the invention, into a host cell, b. Incubate the host cell according to a. in a suitable reaction medium.
  • the cell Host is E. coli.
  • a recombinant peptide from now on recombinant peptide of the invention, obtainable or obtained from the expression system of the invention.
  • the recombinant peptide is obtained from the lysis of the host cell comprising the expression system of the invention, and its subsequent purification.
  • the exposed peptides can be, for example but not limited to them, antigenic peptides that act as vaccines to protect against future infections or to enhance the immune response against infection in subjects or animals already infected.
  • MSPIa As mentioned above, a possible advantage of using the MSPIa protein over what has been described above about using membrane protein anchoring motifs to expose proteins on the bacterial surface, if the natural size range of the repeated peptides is taken into account MSPIa (from 28 to 289 amino acids) and the results reported herein, is the possibility of expressing and exposing on the surface of bacteria, peptides of different sizes and compositions.
  • the expressed peptides may have protective antigenic sequences.
  • protective antigen as used in the present invention, defines those antigens capable of generating a host protective (immunogenic) immune response, that is, a host response, which leads to the generation of immune effector molecules, antibodies or cells that sterilize or reduce the reproduction rate of the invading organism or damage, inhibit or kill it, thus "protecting" the host from a clinical or subclinical disease and a loss of productivity.
  • Such protective immune response can be commonly manifested by the generation of antibodies that are capable of inhibiting the metabolic function of the invading organism, leading to an impediment of its normal growth, lack of reproduction and / or death.
  • the polypeptide thus expressed can be a fusion polypeptide comprising a portion that displays the immunogenicity, and an additional peptide encoded by the DNA of the recombinant molecule fused to it, and which is translated into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 .
  • the exposed peptides can therefore be used as an immunogen.
  • These immunogens can also be used as vaccines in animals, and more particularly in mammals, including humans, or produce a response in the production of antibodies in animals. For this, an immunologically effective amount of at least one of these recombinant peptides is administered to mammals including humans.
  • An alternative method of vaccine production is the use of molecular biology techniques to produce a fusion protein that contains one or more of the amino acid sequences of the present invention and a highly immunogenic peptide or protein, against a certain infection. or infestation
  • Another aspect of the invention relates to the expression system of the invention, the genetic construction of the invention, the plasmid of the invention or the recombinant peptide of the invention, for use as a medicine.
  • the medicament is a vaccine.
  • the fused protein or the recombinant peptide is BM95-MSP1.
  • the BM95 peptide could be used to induce protective immune response against infestations by Rhipicephalus microplus ticks in cattle.
  • the expression system object of this preferred embodiment of the invention, consists of a plasmid vector with replication system for E. coli and selection marker by antibiotic resistance, preferably ampicillin.
  • An efficient promoter in E. coli is inserted into this vector, such as the derivatives of operon lactose (lac) and tryptophan (triptych).
  • lac operon lactose
  • triptych tryptophan
  • the gene coding for an MSPIa mutant that lacks six amino acids that precede the repeated peptides and the repeated peptides themselves, but containing the ten previous amino acids to the first transmembrane region of the protein beginning with a codon of ATG initiation.
  • the system constitutes a novel expression system of polypeptides exposed on live E. coli cells for various use.
  • identity refers to the proportion of identical amino acids between two amino acid sequences that are compared.
  • a "vector” is a replicon to which another polynucleotide segment has been attached, to perform the replication and / or expression of the bound segment.
  • control sequence refers to polynucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the coding sequences to which they are linked. The nature of such control sequences differs depending on the host organism; in prokaryotes, said control sequences generally include a promoter, a ribosomal binding site, and termination signals; in eukaryotes, generally, said control sequences include promoters, termination signals, enhancers and, sometimes, silencers. It is intended that the term “control sequences” includes, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include components additional whose presence is advantageous.
  • Operaationally linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way.
  • a control sequence "operatively linked" to a coding sequence is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • a “free reading frame” is a region of a polynucleotide sequence that encodes a polypeptide; This region may represent a portion of a coding sequence or a complete coding sequence.
  • a "coding sequence” is a polynucleotide sequence that is transcribed into mRNA and / or translated into a polypeptide when under control of appropriate regulatory sequences. The limits of the coding sequence are determined by a translation start codon at the 5 'end and a translation end codon at the 3' end.
  • a coding sequence may include, but is not limited to mRNA, cDNA, and recombinant polynucleotide sequences.
  • transfection refers to the introduction or transfer of an exogenous nucleic acid molecule into a eukaryotic cell, including, but not limited to, a ribonucleic or deoxyribonucleic acid molecule (by example, naked RNA or DNA).
  • plasmid refers to a circular fragment of double-stranded DNA, which is found inside almost all bacteria, and that act and replicate independently to bacterial chromosomal DNA and can be transferred from one bacterium to another. They are used as vectors in genetic manipulation.
  • vaccine refers to an antigen preparation used to establish the immune system response to a disease. They are prepared of antigens that once inside the organism cause the response of the immune system, through the production of antibodies, and generate immunological memory producing permanent or transient immunity.
  • medication refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • it also refers to the expression system of the invention, the genetic construction of the invention, the plasmid of the invention or the recombinant peptide of the invention, capable of generating an immune response against an organism given, that is causing such disease in man or animals. It includes, therefore, what is known as a vaccine, as previously defined herein.
  • antigen refers to a cell surface molecule (generally a protein or a polysaccharide), which can induce the formation of antibodies.
  • a cell surface molecule generally a protein or a polysaccharide
  • antigens such as proteins or peptides, polysaccharides and, more rarely, other molecules such as nucleic acids.
  • the expression “therapeutically effective amount” refers to the amount of peptides or genetic constructs that allow their calculated expression to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics typical of said peptides, sequences and constructs and the therapeutic effect to be achieved.
  • the pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • the compositions provided by this invention may be provided by any route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • FIG. 1 Construction of the expression vector of the fused protein BM95-MSP1a
  • A Schematic representation of the procedure used to synthesize the BM95 chimera and fuse it to the MSPIa mutant of A. marg ⁇ nale, which lacks the sequences repeated at the N-terminal end, in the plasmid pAFORI (SEQ ID NO: 9) to generate the protein merged into the expression vector pMBXAF3 (SEQ ID NO: 10).
  • B Prediction of the sequence (SEQ ID NO: 11) and structure of the fused protein MSP1a-BM95 exposed on the membrane of E. coli.
  • the sequences of the bm95 / BM95, msp1a / MSP1a and plasmid chimera are shown in red, orange and black respectively.
  • the position of amino acids (aa) of BM95 included in the chimera is shown.
  • Figure 2. Expression of the recombinant proteins MSPIa, MSPIb and the fused protein BM95-MSP1a in E. coli.
  • the transformed E. coli strains and the control strain were induced with IPTG and cultured for 3.5 hours for the expression of the fused MSPIa, MSPI b and BM95-MSP1a recombinant proteins (arrows).
  • the gel was stained with Coomassie bright blue and the ColorBurst (Sigma, Aldrich) was used as a molecular weight marker in the electrophoresis.
  • FIG. 3 Expression kinetics of the BM95-MSP1a fused protein in E. coli.
  • the strains were transformed with the vector pMBXAF3, cultured in the fermenter and induced with IPTG for the expression of the BM95-MSP1a fused protein (arrow). Samples equivalent to 10 ⁇ g of total proteins were taken at different times after induction with IPTG and run on a 10% polycarylamide gel. The gel was stained with Coomassie bright blue and as a control an E. coli strain transformed only with the vector and induced under the same conditions was included. The ColorBurst marker (Sigma, Aldrich) was used as a molecular weight standard in the electrophoresis gel.
  • FIG. 4 Location of the BM95-MSP1a recombinant protein in the fraction of insoluble proteins associated with E. coli membranes.
  • E. coli cells that expressed the recombinant proteins MSPIa and BM95-MSP1a were used by sonication and the soluble and insoluble protein fractions associated with membranes were separated by centrifugation. 5 ⁇ g of total proteins of the insoluble fraction (P) were loaded into the wells of the gel. The gel was stained with Coomassie bright blue and as a molecular weight marker in the electrophoresis the ColorBurst pattern (Sigma, Aldrich) was used. The position of the recombinant proteins is indicated by arrows.
  • FIG. 6 Recognition of the BM95-MSP1a fused protein by anti-BM86 antibodies.
  • As a positive control 6 ⁇ g of the recombinant BM86 protein was used.
  • Western-blot analysis the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane, exposed to rabbit antibodies against BM86 and revealed with the anti-rabbit conjugate coupled to horseradish peroxidase. The position of the fused protein and BM86 is indicated by arrows.
  • molecular weight markers were used: ⁇ -galactosidase: 125 kDa; Phosphorylase: 101 kDa and bovine serum albumin: 56.2 kDa (BioRad, Richmond, CA, USA).
  • Plasmid pAFORI was constructed to express a mutant MSPIa protein that does not contain repeated amino acid sequences.
  • the mspi ⁇ gene that comes from clone per1 of the Oklahoma isolate was amplified by PCR. This gene codes for an MSPIa mutant that lacks six amino acids before repeated sequences; but which contains the 10 amino acids prior to the first transmembrane region of the protein.
  • the primers inroduced an ATG initiation codon and the EcoRI and BgIII restriction sites for the phase cloning of the sequence that encodes for the recombinant polypeptide, all in a vector for expression in E. coli.
  • the chimeric protein of Bm95 was constructed by means of a PCR to result in a gene coding so that the protein had the three immunogenic peptides (SEQ ID NO: 3) corresponding to amino acid sequences 21 to 35; 132 to 147 and 397 to 410 of BM95 respectively (SEQ ID NO: 4) (Figs. 1A and 1B).
  • a PCR reaction was carried out with oligonucleotides B5 (SEQ ID NO: 7) and B3 (SEQ ID NO: 8) to amplify the chimera of Bm95 and introduce an ATG initiation codon and the sites for restriction enzymes Xhol and EcoRI for cloning in the pAFORI vector (Fig. 1A).
  • the PCR reaction was performed using 10 pmol of each first in a final volume of 50 ⁇ l (1.5 mM MgSO4, 1 X RJ / Thermus flavus buffer (TfI) of the avian myeloblastosis virus (AMV), 0.2 mM of each deoxynucleotide triphosphate (dNTP), 5 units of AMV RT, and 5 units of TfI DNA polymerase) using the RT-PCR Access system (Promega, Madison; Wl, EU). The reactions took place in a Techne automatic thermal cycler (model TC-512, Cambridge, England) for 35 cycles.
  • each cycle consisted of a denaturation stage at 94 0 C for 30 seconds and a 1 min banding / extension stage at 68 0 C.
  • the products of Ia PCR were visualized by electrophoresis in a 1% agarose gel and the size of the amplified fragments was compared with a band pattern (1 Kb Plus DNA Ladder, Promega).
  • the PCR product (amplicon) was purified on resin columns (Wizard, Promega), and was digested with the enzymes Xhol and EcoRI to clone it into the pAFORI vector and generate the vector pMBXAF3 for the expression of the BM95-MSP1a fused protein ( Fig. 1A).
  • the MSP1a protein contains repeated peptides in the N-terminal region that are exposed on the surface of A. marg ⁇ nale and that are involved in the interaction of the pathogen with the receptors of the host cells.
  • the size of the repeated regions of MSPIa varies between 28 and 289 amino acids. These regions are also exposed on the surface of the bacterium when the recombinant protein is expressed in E. coli.
  • the plasmid pAFORI encoding an MSPIa mutant that lacks 6 amino acids before repeated sequences; but containing 10 amino acids before the first transmembrane region of the putative protein was used as a vector for the expression of BM95 peptides exposed on the surface of E. coli.
  • the BM95 chimera expressed in this study presented 29 amino acids (Fig. 1 B), which puts it within the size range of the repeated sequences of MSPIa.
  • the tac promoter of the pARORI vector which is highly inducible, allowed high levels of expression of the native MSPIa, mutant MSPIa and MSPI b recombinant proteins.
  • the plasmids were transformed into the E. coli strain JM109 for the induction of the recombinant protein BM BM-MSP1a expression, as is the case with the MSPIa and MSPIb naive proieins, used as conyrol in the experiments. In cons ⁇ rucations, the genes expressed were under the conirol of the iac induction promoter.
  • the E. coli strains were cul ⁇ ivaron ⁇ ransformadas in LB (Luria-Bertani) I suplemen ⁇ ado with 50 .mu.g / ml ampicillin and 0.4% (w / v) glucose at 37 0 C hasia one óp ⁇ ica uDO ⁇ OOnm density of 0.4.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-io-galactoside
  • the transformed E. coli strains were culminated in 10 ml of LB medium lasting 2 hours in a Orbital shaker at 37 0 C and 200 rpm. Subsequently, the cultures were inoculated in 250 ml of medium, incubated under the same conditions for 4 h until reaching 1 uDO ⁇ OOnm and used to inoculate a Biostast Bplus Kirtator (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany) with 4 L of culture medium .
  • the fermentations were carried out at 37 0 C and pH 7.0 controlled by the addition of 1 M HCI or 4M NaOH and at a concentration of dissolved oxygen in the medium greater than 30%, controlled by stirring at a constant air flow of 0.5 l / min.
  • the culture was grown to 0.4 uDO ⁇ OOnm, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM and fermentation was continued for an additional 3.5 h to induce the expression of recombinant proteins.
  • Cell growth was monitored throughout the entire process by measuring the optical density at 600 nm.
  • the cells were harvested by centrifugation at 3,800 xg for 10 min at 4 0 C and subsequently 1 g samples of the precipitated cells were resuspended in 5 ml of rupture buffer solution (100 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCI, PMSF 1 mM, MgCI2 x 6H2O 5 mM and Triton X-100 0.1% (v / v)).
  • a Heidolph DIAX 900 sonicator (Bandelin Sonopuls, Berlin, Germany) was used, equipped with a titanium micropoint, model MS73, 3 mm in diameter and 192 mm in length that was submerged 10 mm in the cell suspension.
  • the frequency of the equipment was set at 2kHz and the acoustic power at 70 kW.
  • the break cycle consisted of intervals of 5 seconds of action and 5 seconds of rest until completing 10 minutes of total break time.
  • the membrane-associated insoluble protein fraction was separated from the soluble proteins by centrifugation at 12,500 xg for 15 min at 4 0 C and stored at -20 0 C. This fraction was subsequently resolved on an electrophoresis gel as It is described below, and the band of the protein of interest was extracted from the gel for use in rabbit immunization experiments.
  • nitrocellulose membranes were blocked with a solution of 5% semi-skimmed milk (w / v) for 1 h at room temperature, washed three times in tramponated tris solution (TBS, Tris ⁇ CI 25 mmol / L , 150 mmol / L NaCI, pH 7.6) and were incubated for 1 h at room temperature with the serum of rabbits previously immunized with Gavac (Revetmex, Mexico) or with vaccines containing recombinant proteins.
  • Rabbit antisera were diluted at concentrations of 1: 1000 or 1: 5000 respectively in a 3% (w / v) solution of bovine serum albumin (BSA) in TBS buffer solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • the membranes were washed another three times TBS and incubated again with a rabbit anti-IgG polyclonal antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP, Sigma-Aldrich) diluted 1: 1000 in TBS. After washing the membranes again, the color rebelled using the substrate 3,3,5,5 'tetramethylbenzidine (TMB, Promega, USA) for 20 minutes.
  • the immunofluorescence assay of living cells was done using polyclonal antibodies against MSPIa, BM86 and the fused BM95-MSP1a protein produced in rabbits. Positive and negative controls included recombinant proteins MSPIa and MSPI b expressed in E. coli.
  • Induced cells of 1 ml of culture were separated by centrifugation at 5000 x g for 5 min. and washed with 1 ml of phosphate buffered solution (PBS). They were collected again by centrifugation, resuspended in 100 ⁇ l of preimmune or immune rabbit serum and incubated for 30 minutes at room temperature. After incubation, they were again separated, washed with PBS and resuspended in 100 ⁇ l of fluorescein-labeled goat anti-rabbit IgG solution (KPL, Inc., Gaithersburg, MD, USA) diluted 1: 100 in goat serum 3 % (Sigma Aldrich) in PBS.
  • PBS phosphate buffered solution
  • the molecular weight of the BM95-MSP1a fused protein was estimated between
  • the antigenic characterization of the BM95-MSP1a fusion protein was performed by immunofluorescence of living cells.
  • the BM95-MSP1a protein was not only recognized by rabbit specific antibodies immunized with the fused protein (Fig. 50), but also by antibodies against the MSPIa protein (Fig. 5M) and against BM86 (Fig. 5N).
  • sera from rabbits immunized with the recombinant protein recognized the protein fused by Western blotting (Fig. 6).

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Abstract

Sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana caracterizado porque se utiliza como región de anclaje a la membrana la secuencia conservada de la proteína MSP1a de Anaplasma marginale.

Description

SISTEMA PARA LA EXPRESIÓN DE PEPTIDOS SOBRE LA SUPERFICIE BACTERIANA.
La presente invención se encuentra dentro de los sectores biotecnológico, bioquímico, y químico-farmacéutico. El objeto de Ia invención es un método para exponer polipéptidos recombinantes expresados sobre Ia superficie bacteriana. Podrá ser aplicado en investigaciones básicas o aplicadas en biología molecular, bioquímica, biotecnología o en Ia producción de proteínas recombinantes para diversos fines.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La tecnología que permite Ia expresión de una proteína o péptido, uniéndola a Ia superficie celular, por ejemplo de microorganismos como bacterias o levaduras, tiene numerosas aplicaciones dependiendo del tipo de proteína expresada en Ia superficie, y por tanto, un enorme interés industrial.
Por eso, el interés por exponer proteínas o péptidos sobre Ia superficie de bacterias vivas ha ido en aumento en áreas de investigación bioquímica, de biología molecular y biotecnología. La exposición de proteínas heterólogas empleando motivos de anclaje a membrana de proteínas como los LamB, OmpA, PhoE, TratT, OprF, Oprl, FHA, INP, fimbrias, y AIDA-I y el sistema de auto-exposición han servido ya para expresar antígenos y enzimas. La proteína que se desea exponer tiene que ser fusionada con Ia proteína o proteínas de anclaje, que son a menudo proteínas de Ia superficie celular o fragmentos de éstas ("carríer proteins"), mediante una fusión N-terminal, una fusión C-terminal, o una fusión sandwich. Las características de Ia proteína de anclaje, Ia proteína expuesta y el método de fusión afecta Ia eficiencia de Ia expresión en Ia superficie de proteínas.
La expresión de proteínas en superficie tiene múltiples aplicaciones, incluyendo: a. el desarrollo de vacunas vivas, al exponer epítopos heterólogos de comensales humanos o células bacterianas patogénicas atenuadas para elicitar Ia respuesta de anticuerpos antígeno-específicos, b. Ia búsqueda de librerías de péptidos por unión secuencial y elusión o, más eficientemente por clasificación celular por fluorescencia
(Fluorescence-activated cell-sorting, FACS), c. producción de anticuerpos expresando antígenos de superficie para obtener anticuerpos policlonales en animales, d. bioadsorventes para eliminar compuestos químicos perjudiciales y metales pesados, e. biocatálisis por inmovilización de enzimas, f. desarrollo de biosensores por anclaje de enzimas, receptores u otros componentes sensibles a señales para el diagnóstico, propósitos industriales o medioambientales, g. detección de cambios de aminoácidos en péptidos diana tras mutagénesis al azar.
Anaplasma margínale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) es un patógeno trasmitido por garrapatas que causa Ia anaplasmosis bovina, una enfermedad que ocasiona pérdidas económicas importantes en Ia producción ganadera. La proteína MSPIa (por sus siglas del inglés Major Suríace Protein 1a) es una de las cinco proteínas principales de superficie conocidas de A. margínale y está involucrada en Ia adhesión del patógeno a los hospedadores y en las interacciones del patógeno con las garrapatas. Esta proteína ha evolucionado bajo una presión selectiva positiva y su tamaño molecular es diferente entre cepas de distintas áreas geográficas. Las variaciones se deben a que una secuencia de 23 a 31 aminoácidos consecutivos se repite distinto número de veces, en el extremo N-terminal, de Ia región que Ia proteína expone sobre Ia superficie bacteriana.
Se ha demostrado que MSPIa permite a Ia bacteria adherirse a los eritrocitos bovinos y a las células de garrapatas. El dominio de adhesión de Ia proteína ha sido identificado precisamente en Ia región variable del extremo N-terminal que contiene los péptidos repetidos. La MSPIa también está involucrada en Ia transmisión de A. margínale por las garrapatas del género Dermacentor spp. y los péptidos repetidos del extremo N-terminal, que poseen epítopos celulares B, podrían estar involucrados en Ia respuesta protectiva del ganado frente a las infecciones por A. margínale. La garrapata Boophilus microplus (recientemente reclasificada como Rhipicephalus microplus) afecta considerablemente al ganado bovino de las regiones tropicales y subtropicales del planeta. El antígeno BM86, codificado por el gen Bm86, es una glicoproteína aislada de las células intestinales de R. microplus que ha sido utilizada en una vacuna contra las infestaciones por estas garrapatas. Un gen homólogo al Bm86, el Bm95, fue aislado también de una cepa de R. microplus (Cepa A) y su proteína codificante, Ia BM95, mostró capacidad protectora frente a un mayor número de cepas de garrapatas de diferentes regiones geográficas. Los primeros experimentos realizados por los inventores, caracterizaron Ia presencia de péptidos inmunogénicos en Ia proteína BM86. Posteriormente se demostró que estos péptidos eran los responsables de inducir Ia respuesta protectora del ganado vacunado frente a las infestaciones por garrapatas.
En Ia presente invención se demuestra que una proteína recombinante, compuesta por los péptidos inmunogénicos de BM95 fusionados con Ia región N-terminal de Ia proteína MSPIa de A. margínale, se expone sobre Ia superficie de células vivas de E. coli y es reconocida por anticuerpos anti-BM86 y anti-MSP1a. Este sistema aporta un modelo novedoso de exposición de proteínas heterólogas sobre células vivas de bacterias y además sugiere Ia posibilidad de emplear bacterias recombinantes en estudios de inmunización del ganado frente a infestaciones de garrapatas.
Para el éxito de Ia expresión de Ia proteína en Ia superficie celular, el motivo de anclaje es el elemento más importante. Constituye el núcleo de esta tecnología Ia elección de un motivo capaz de expresar una proteína o péptido heterólogo en Ia superficie celular de forma efectiva. Una proteína de anclaje adecuada debe poseer los siguientes cuatro requerimientos: debe tener un transportador que permita a Ia proteína de fusión prematura pasar a través de Ia membrana interna; debe tener una fuerte estructura de anclaje para sostener las proteínas de fusión en Ia superficie celular; debe ser compatible con las secuencias externas a ser insertadas o fusionadas, y por último, debe ser resistente al ataque de las proteasas presentes en el medio o espacio periplásmico.
Los sistemas de expresión conocidos hasta el momento presentan desventajas, siendo Ia fundamental Ia limitación para Ia presentación en membrana de polipéptidos con diferente número y composición de aminoácidos, uno de los aspectos principales que aborda el objeto de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al empleo de una porción de Ia proteína MSPIa de A. margínale para dirigir Ia exposición de otros péptidos sobre Ia superficie celular, mediante su fusión N-terminal con esta proteína. Teniendo en cuenta el rango de tamaño natural de los péptidos repetidos en Ia región N-terminal de MSPIa (28-289 amino ácidos) y los ejemplos de realización expuestos en esta memoria, una ventaja de usar Ia proteína MSPIa en lugar de otros motivos de anclaje de proteínas de membrana para exponer péptidos sobre Ia superficie celular, es Ia posibilidad de exponer polipéptidos de diferentes tamaños y composición de aminoácidos.
De acuerdo con un primer aspecto de Ia presente invención, se proporciona un sistema de expresión de péptidos sobre Ia superficie bacteriana, de aquí en adelante sistema de expresión de Ia invención, caracterizado porque comprende una región de anclaje a Ia membrana bacteriana y el péptido expuesto, donde se utiliza como región de anclaje a Ia membrana bacteriana cualquiera de las siguientes secuencias: a. Péptido que comprende Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. b. Una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con Ia SEQ ID NO: 1.
De aquí en adelante, por "secuencia aminoacídica de Ia invención" se entiende Ia secuencia de aminoácidos de Ia porción de Ia proteína MSPIa de Anaplasma margínale, o una proteína con una identidad de, al menos, el 80%, y más preferiblemente el 90%, el 95%, el 98%, y aún más preferiblemente el 99% con dicha porción de Ia proteína MSPIa, recogida en Ia SEQ ID NO: 1. Y se entenderá por "péptido expuesto" Ia secuencia de aminoácidos que se quiere expresar sobre Ia superficie bacteriana, y que está unida o fusionada a Ia secuencia aminoacídica de Ia invención.
El término "péptido", tal como se usa en Ia presente invención, incluye tanto Ia proteína de longitud completa, como las secuencias de polipéptidos y péptidos más cortas.
El término "polinucleótido" o "secuencia polinucleotídica", como aquí se usa, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos. Este término sólo se refiere a Ia estructura primaria de Ia molécula. Así, este término incluye ADN de cadena doble o sencilla, al igual que ARN de cadena doble o sencilla. También incluye todos los tipos de modificaciones conocidas (marcadores conocidos en Ia técnica, metilación, remates, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótidas como, por ejemplo, aquellas con uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, triésteres de fósforo, amidatos de fósforo, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, tioatos de fósforo, ditioatos de fósforo, etc.), aquellos que contienen mitades colgantes, como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), al igual que formas no modificadas del polinucleótido. Por "secuencia polinucleotídica de Ia invención" se entiende Ia secuencia polinucleotídica que codifica para Ia secuencia aminoacídica de Ia invención, y que puede ser, por ejemplo, Ia SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia bacteria en cuya superficie se expresa el péptido de interés es Escheríchia coli (E. coli). Escheríchia coli (E. coli), una bacteria gram negativa, anaerobia facultativa y no esporulada, con un genoma de aproximadamente 4,6 kb, es quizá el organismo procariota más estudiado por el hombre. Algunas cepas de esta bacteria son enormemente versátiles en laboratorio, tolerando muy bien Ia manipulación genética e incluso perdiendo su capacidad patogénica, por Io que se emplea como "organismo modelo" para el estudio de las estructuras, los mecanismos genéticos y fisiológicos y su extrapolación a gran número de microorganismos, incluida Ia célula eucariota.
En otra realización de este aspecto de Ia invención, el péptido expuesto no es MSPL
De acuerdo con otro aspecto de Ia presente invención, se proporciona una construcción genética, de aquí en adelante construcción genética de Ia invención, que dirigiría Ia trascripción in vitro o intracelular de las secuencias polinucleotídicas del sistema de expresión de Ia invención, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. secuencia de nucleótidos, preferentemente de doble cadena, que codifica Ia secuencia aminoacídica del sistema de expresión de Ia invención, o b. moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c. moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d. secuencia de nucleótidos de a), b), ó c), preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales {silencers), etc..
Este método incluye los vectores de clonación y expresión que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos del sistema de expresión de Ia invención. Tales vectores de expresión incluyen secuencias de control adecuadas, tales como, por ejemplo, elementos de control de Ia traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de Ia transcripción (por ejemplo, regiones de promotor-operador, sitios de unión). Los vectores conforme a Ia invención pueden incluir plásmidos y virus (comprendiendo bacteriófagos y virus eucarióticos), de acuerdo con procedimientos bien conocidos y documentados en Ia técnica, y pueden expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes, asimismo bien conocidos y documentados en Ia técnica. Los vectores virales adecuados incluyen, baculovirus y también adenovirus y virus vacunales. Muchos otros vectores virales y no virales están descritos y son conocidos en Ia técnica.
Se conoce, así mismo, una variedad de técnicas que pueden utilizarse para introducir tales vectores en células procarióticas o eucarióticas para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en Ia bibliografía.
Las células hospedadoras eucarióticas o procarióticas transformadas o transfectadas, que contienen una molécula de ácido nucleico conforme a Ia invención, como se definió anteriormente, también forman parte de este aspecto de Ia invención. Dado que las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del sistema de expresión de Ia invención son afines en cuanto a su evolución, puede esperarse que Ia identidad global de los genomas al nivel de los aminoácidos, obtenidos de distintas cepas, poblaciones y/o individuos de Anaplasma margínale, y más concretamente a nivel de Ia secuencia aminoacídica que se recoge en Ia SEQ ID NO: 1 , sea de un 80% o mayor, y más preferiblemente de un 90% o mayor y más preferiblemente de un 95, un 98 o un 99% o mayor. La correspondencia entre Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 1 y Ia secuencia perteneciente a otro individuo u organismo se puede determinar por métodos conocidos en Ia técnica.
Múltiples de estos sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia (Sambrook et al., 1989) y forman parte de Ia presente invención.
En una realización particular de este aspecto de Ia invención, Ia construcción genética de Ia invención está incluida en un plásmido.
Los péptidos expuestos también pueden prepararse por expresión en una célula hospedadora que contiene una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que se transcribe a los péptidos, unida operativamente a una secuencia de control de Ia expresión, o un vehículo o vector de clonación de ADN recombinante que contiene tal molécula de ADN recombinante. Alternativamente, los péptidos pueden expresarse por inyección directa de una simple molécula de ADN en una célula hospedadora.
En otro aspecto de Ia invención se proporciona un método para elaborar el sistema de expresión de Ia invención, que comprende los siguientes pasos: a. Introducir Ia construcción genética de Ia invención, o un plásmido de Ia invención, en una célula hospedante, b. Incubar Ia célula hospedante según a. en un medio de reacción adecuado.
En una realización particular de este aspecto de Ia invención, Ia célula hospedante es E. coli.
En otro aspecto de Ia invención se proporciona un péptido recombinante, de ahora en adelante péptido recombinante de Ia invención, obtenible u obtenido a partir del sistema de expresión de Ia invención. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el péptido recombinante se obtiene a partir de Ia lisis de Ia célula hospedante que comprende el sistema de expresión de Ia invención, y su posterior purificación.
Los péptidos expuestos, pueden ser, por ejemplo pero sin limitarnos a ellos, péptidos antigénicos que actúan como vacunas para proteger contra futuras infecciones o para potenciar Ia respuesta inmune contra Ia infección en sujetos o animales ya infectados.
Como se ha comentado anteriormente, una posible ventaja de usar Ia proteína MSPIa sobre Io descrito anteriormente acerca de emplear motivos de anclaje de proteínas de membrana para exponer proteínas sobre Ia superficie bacteriana, si se tiene en cuenta el rango de tamaño natural de los péptidos repetidos de MSPIa (de 28 a 289 aminoácidos) y los resultados reportados en esta memoria, es Ia posibilidad de expresar y exponer sobre Ia superficie de las bacterias, péptidos de diferentes tamaños y composiciones.
Los péptidos expresados pueden presentar secuencias antigénicas protectoras. La expresión "antígeno protector", tal como se usa en Ia presente invención, define aquellos antígenos capaces de generar una respuesta inmune (inmunogénica) protectora del hospedador, es decir, una respuesta del hospedador, que conduce a Ia generación de moléculas efectoras inmunes, anticuerpos o células que esterilizan o reducen Ia tasa de reproducción del organismo invasor o Io dañan, inhiben o matan, "protegiendo" así al hospedador de una enfermedad clínica o subclínica y de una pérdida de productividad. Tal respuesta inmune protectora puede manifestarse comúnmente por Ia generación de anticuerpos que son capaces de inhibir Ia función metabólica del organismo invasor, conduciendo a un impedimento de su crecimiento normal, falta de reproducción y/o muerte.
El polipéptido así expresado puede ser un polipéptido de fusión que comprende una porción que despliega Ia inmunogenicidad, y un péptido adicional codificado por el ADN de Ia molécula recombinante fusionado a él, y que se traduce a Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 1.
Los péptidos expuestos se pueden, por tanto, usar como inmunógeno. Estos inmunógenos pueden también ser usados como vacunas en animales, y más particularmente en mamíferos, incluyendo humanos, o producir una respuesta en Ia producción de anticuerpos en animales. Para ello, una cantidad efectiva inmunológicamente de al menos uno de estos péptidos recombinantes es administrado a mamíferos incluyendo humanos.
Un método alternativo de Ia producción de vacunas es el uso de técnicas de biología molecular para producir una proteína de fusión que contiene una o varias de las secuencias aminoacídicas de Ia presente invención y un péptido o proteína altamente inmunogénico/a, frente a una determinada infección o infestación.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al sistema de expresión de Ia invención, Ia construcción genética de Ia invención, el plásmido de Ia invención o el péptido recombinante de Ia invención, para su uso como medicamento. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el medicamento es una vacuna.
En otra realización preferida de Ia invención, Ia proteína fusionada o el péptido recombinante es BM95-MSP1. El péptido BM95 podría ser utilizado para inducir respuesta inmune protectora contra las infestaciones por garrapatas Rhipicephalus microplus, en el ganado bovino.
El sistema de expresión, objeto de esta realización preferida de Ia invención, consta de un vector plasmídico con sistema de replicación para E. coli y marcador de selección mediante resistencia a antibiótico, preferiblemente ampicilina. En este vector se inserta un promotor eficiente en E. coli, como los derivados del operon lactosa (lac) y triptofano (tríp). Frente al promotor se inserta el gen codificante para un muíante de MSPIa que carece de seis aminoácidos que preceden a los péptidos repetidos y los propios péptidos repetidos, pero que contiene los diez aminoácidos anteriores a Ia primera región transmembranal de Ia proteína comenzando con un codón de iniciación ATG. Finalmente se insertan los sitios de restricción Xhol y EcoRI para el clonaje de polipéptidos en fase con MSPIa para Ia expresión expuesta sobre Ia membrana de E. coli. (FIG. 1 ). El sistema constituye un sistema novedoso de expresión de polipéptidos expuestos sobre células vivas de E. coli para diverso uso.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias aminoácidicas que se comparan.
Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar Ia replicación y/o expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control. "Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar Ia expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para Ia expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que Ia expresión de Ia secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco de lectura libre" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de Ia secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de Ia traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.
Tal y como se usa en esta memoria, el término "transfección" se refiere a Ia introducción o transferencia de una molécula de ácido nucleico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucleico o desoxiribonucleico (por ejemplo, ARN ó ADN desnudo).
El término "plásmido" se refiere a fragmento circular de ADN bicatenario, que se encuentra en el interior de casi todas las bacterias, y que actúan y se replican de forma independiente al ADN cromosómico bacteriano y pueden transferirse de unas bacterias a otras. Se utilizan como vectores en manipulación genética. En el contexto de Ia presente invención el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para establecer Ia respuesta del sistema inmune a una enfermedad. Son preparados de antígenos que una vez dentro del organismo provocan Ia respuesta del sistema inmunitario, mediante Ia producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de Ia presente invención se refiere, también, al sistema de expresión de Ia invención, Ia construcción genética de Ia invención, el plásmido de Ia invención o el péptido recombinante de Ia invención, capaz de generar una respuesta inmune frente a un organismo dado, que está causando dicha enfermedad en el hombre o los animales. Incluye, por tanto, Io que se conoce como vacuna, tal y como se ha definido previamente en esta memoria.
El término "antígeno" en esta memoria se refiere a una molécula (generalmente una proteína o un polisacárido) de superficie celular, que puede inducir Ia formación de anticuerpos. Hay muchos tipos de moléculas diferentes que pueden actuar de antígenos, como las proteínas o péptidos, los polisacáridos y, más raramente, otras moléculas como los ácidos nucleicos.
En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de péptidos o construcciones genéticas que permitan su expresión calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos péptidos, secuencias y construcciones y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia. Las composiciones proporcionadas por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Construcción del vector de expresión de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a (A). Representación esquemática del procedimiento usado para sintetizar Ia quimera BM95 y fusionarla a Ia muíante de MSPIa de A. margínale, que carece de las secuencias repetidas en el extremo N- terminal, en el plásmido pAFORI (SEQ ID NO: 9) para generar Ia proteína fusionada en el vector de expresión pMBXAF3 (SEQ ID NO: 10). (B) Predicción de Ia secuencia (SEQ ID NO: 11 ) y estructura de Ia proteína fusionada MSP1a-BM95 expuesta sobre Ia membrana de E. coli. Las secuencias de Ia quimera bm95/BM95, msp1a/MSP1a y del plásmido se muestran en rojo, naranja y negro respectivamente. Se muestra Ia posición de los aminoácidos (aa) de BM95 incluidos en Ia quimera. Figura 2. Expresión de las proteínas recombinantes MSPIa, MSPIb y de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a en E. coli. Las cepas de E. coli transformadas y Ia cepa control se indujeron con IPTG y se cultivaron durante 3.5 horas para Ia expresión de las proteínas recombinantes MSPIa, MSPI b y BM95-MSP1a fusionada (flechas). El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie y como marcador de peso molecular en Ia electroforesis se usó el ColorBurst (Sigma, Aldrich).
Figura 3. Cinética de expresión de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a en E. coli. (A) Las cepas fueron transformadas con el vector pMBXAF3, cultivadas en el fermentador e inducidas con IPTG para Ia expresión de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a (flecha). Se tomaron muestras equivalentes a 10 μg de proteínas totales a diferentes tiempos después de Ia inducción con IPTG y se corrieron en un gel de policarilamida al 10%. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie y como control se incluyó una cepa E. coli transformada sólo con el vector e inducida en las mismas condiciones. El marcador ColorBurst (Sigma, Aldrich) se usó como patrón de pesos moleculares en el gel de electroforesis. (B) El crecimiento celular se monitoreó midiendo Ia densidad óptica (OD6oonm) del cultivo durante Ia fermentación. La concentración de proteínas se determinó mediante el sistema de electroforesis automatizado Experion (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y Ia concentración de las proteínas de interés se expresó como porciento de las proteínas totales (linea roja). El momento de inducción con IPTG se indica en Ia figura.
Figura 4. Localización de Ia proteína recombinante BM95-MSP1a en Ia fracción de proteínas insolubles asociadas a las membranas de E. coli. Muestras equivalentes a 10 μg de proteínas totales de E. coli transformadas sólo con el vector (C-) ó con los vectores de expresión de MSPIa o BM95-MSP1a (C+), después de 3.5 h. de inducción, se cargaron en cada pocilio de un gel de policacrilamida al 10%. Las células de E. coli que expresaron las proteínas recombinantes MSPIa y BM95-MSP1a fueron usadas por sonicación y las fracciones de proteínas solubles e insolubles asociadas a membranas se separaron por centrifugación. 5 μg de proteínas totales de Ia fracción insoluble (P) fueron cargados en los pocilios del gel. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie y como marcador de pesos moleculares en Ia electroforesis se usó el patrón ColorBurst (Sigma, Aldrich). La posición de las proteínas recombinantes se indica con flechas.
Figura 5. Exposición de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a sobre Ia superficie de E. coli. En Ia inmunofluorescencia de células vivas de las cepas de E. coli transformadas que expresaron las proteínas MSPIa (A-E), MSPI b (F-J) y Ia proteína fusionada BM95-MSP1a (K-O) estas reaccionaron con el anticuerpo primario o el suero pre-inmune (B, G, L), MSPIa (C, H, M), BM86 (D, I, N) y BM95-MSP1a (E, J, O), seguido por una reacción secundaria con un anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de conejo marcado con peroxidasa (Aumento 1000X).
Figura 6. Reconocimiento de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a por anticuerpos anti-BM86. Muestras equivalentes a 10 μg de proteínas totales de E. coli, después de 3.5 h de inducción con IPTG para expresar las proteínas recombinantes MSPIa o BM95-MSP1a, se cargaron en cada pocilio, en un gel de poliacrilamida al 10%. Como control positivo se usaron 6 μg de Ia proteína recombinante BM86. Para el análisis de Western-blot, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, expuestas a anticuerpos de conejo contra BM86 y reveladas con el conjugado anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano. La posición de Ia proteina fusionada y de Ia BM86 se indica con flechas. En Ia electroforesis de proteínas se usó como marcadores de peso molecular: β-galactosidasa: 125 kDa; fosforilasa: 101 kDa y albúmina sérica bovina: 56.2 kDa (BioRad, Richmond, CA, USA).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN.
EJEMPLO 1. CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA FUSIONADA A MSP1 a
El plásmido pAFORI se construyó para expresar una proteína muíante de MSPIa que no contiene las secuencias repetidas de aminoácidos. El gen mspiα que proviene del clon per1 , del aislado Oklahoma se amplificó mediante PCR. Este gen codifica para una muíante MSPIa que carece de seis aminoácidos antes de las secuencias repetidas; pero que contiene los 10 aminoácidos aníeriores a Ia primera región íransmembranal de Ia proíeína. Los primers inírodujeron un codón de iniciación ATG y los sitios de resíricción EcoRI y BgIII para Ia clonación en fase de Ia secuencia que codifica para el polipéptido recombinante, todo en un vector para Ia expresión en E. coli.
La proteína quimera de Bm95 se construyó mediante una PCR para resultar en un gen codificante de manera que Ia proteína tuviera los tres péptidos inmunogénicos (SEQ ID NO: 3) que corresponden a las secuencias de aminoácidos 21 a 35; 132 a 147 y 397 a 410 de BM95 respectivamente (SEQ ID NO: 4) (Figs. 1A y 1B).
Primero se sintetizaron dos oligonucleótidos, el Bmtinδ (SEQ ID NO: 5) y el Bmtin3 (SEQ ID NO: 6) y se hibridaron en Ia región central de solapamiento (región de solapamiento Tm=92 0C) (Fig. 1A). Posteriormente se realizó una reacción de PCR con los oligonucleótidos B5 (SEQ ID NO: 7) y B3 (SEQ ID NO: 8) para amplificar Ia quimera de Bm95 e introducir un codón de iniciación ATG y los sitios para las enzimas de restricción Xhol y EcoRI para Ia clonación en el vector pAFORI (Fig. 1A).
La reacción de PCR se realizó usando 10 pmol de cada primer en un volumen final de 50 μl (1.5 mM MgSO4, 1 X tampón RJ/Thermus flavus (TfI) del virus de Ia mieloblastosis aviaria (AMV), 0.2 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (dNTP), 5 unidades de AMV RT, y 5 unidades de TfI ADN polimerasa) empleando el sistema RT-PCR Access (Promega, Madison; Wl, EU). Las reacciones tuvieron lugar en un termociclador automático Techne (modelo TC-512, Cambridge, Inglaterra) durante 35 ciclos. Después de un paso inicial de desnaturalización a 94 0C durante 30 segundos, cada ciclo consistió de una etapa de desnaturalización a 94 0C durante de 30 segundos y una etapa de anillamiento/extensión de 1 min a 68 0C. Los productos de Ia PCR se visualizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se comparó el tamaño de los fragmentos amplificados con un patrón de bandas (1 Kb Plus DNA Ladder, Promega). El producto de PCR (amplicón) se purificó en columnas de resina (Wizard, Promega), y fue digerido con las enzimas Xhol y EcoRI para clonarlo en el vector pAFORI y generar el vector pMBXAF3 para Ia expresión de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a (Fig. 1A). La proteína MSP1a contiene péptidos repetidos en Ia región N-terminal que se exponen sobre Ia superficie de A. margínale y que están involucrados en Ia interacción del patógeno con los receptores de las células hospedadoras. El tamaño de las regiones repetidas de MSPIa varía entre 28 y 289 aminoácidos. Estas regiones también se exponen sobre Ia superficie de Ia bacteria cuando Ia proteína recombinante es expresada en E. coli.
El plásmido pAFORI codificante para una muíante de MSPIa que carece de 6 aminoácidos antes de las secuencias repetidas; pero que contiene 10 aminoácidos antes de Ia primera región transmembranal de Ia proteína putativa se usó como vector para Ia expresión de los péptidos de BM95 expuestos sobre Ia superficie de E. coli. La quimera BM95 expresada en este estudio presentó 29 aminoácidos (Fig. 1 B), Io que Ia sitúa dentro del rango de tallas de las secuencias repetidas de MSPIa. Adicionalmente, el promotor tac del vector pARORI , que es altamente inducible, permitió altos niveles de expresión de las proteínas recombinantes MSPIa nativa, MSPIa muíante y MSPI b.
EJEMPLO 2. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA FUSIONADA BM95-MSP1a.
Los plásmidos fueron transformados en Ia cepa JM109 de E. coli para Ia inducción de Ia expresión de Ia proíeína recombinaníe BM95-MSP1a, íal y como ocurre con las proíeínas naíivas MSPIa y MSPIb, usadas como conírol en los experimeníos. En las consírucciones, los genes expresados esíuvieron bajo el conírol del promoíor de inducción íac. Las cepas de E. coli íransformadas se culíivaron en medio LB (Luria-Bertani) suplemeníado con 50 μg/ml de ampicilina y 0.4% (p/v) de glucosa, a 37 0C hasía una densidad ópíica de 0.4 uDOΘOOnm. Para inducir Ia expresión de las proíeínas recombinaníes se adicionó Isopropil-β-D-íio-galacíósido (IPTG) hasía una conceníración final de 0.5 mM y Ia incubación se coníinuó duraníe 3.5 horas.
Para producir las proíeínas recombinaníes, las cepas de E. coli íransformadas se culíivaron en 10 mi de medio LB duraníe 2 horas en un agitador orbital a 37 0C y 200 rpm. Posteriormente los cultivos se inocularon en 250 mi de medio, se incubaron en las mismas condiciones durante 4 h hasta alcanzar 1 uDOΘOOnm y se usaron para inocular un termentador Biostast Bplus (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania) con 4 L de medio de cultivo. Las fermentaciones en realizaron a 37 0C y pH 7.0 controlado por adición de HCI 1 M ó NaOH 4M y a una concentración de oxígeno disuelto en el medio superior al 30%, controlada mediante agitación a flujo de aire constante de 0.5 l/min. El cultivo se creció hasta 0.4 uDOΘOOnm, se Ie añadió IPTG hasta una concentración final de 0.5 mM y se continuó Ia fermentación durante 3.5 h más para inducir Ia expresión de las proteínas recombinantes. El crecimiento celular se monitoreó a Io largo de todo el proceso midiendo Ia densidad óptica a 600 nm.
Las células se cosecharon por centrifugación a 3,800 x g durante 10 min a 4 0C y posteriormente muestras de 1 g de las células precipitadas se resuspendieron en 5 mi de solución tampón de ruptura (Tris-HCI 100 mM pH 7.5, NaCI 150 mM, PMSF 1 mM, MgCI2 x 6H2O 5 mM y Tritón X-100 0.1 % (v/v)). Para romper las células se empleó un sonicador Heidolph DIAX 900 (Bandelin Sonopuls, Berlín, Alemania) equipado con una micropunta de titanio, modelo MS73, de 3 mm de diámetro y 192 mm de longitud que se sumergió 10 mm en Ia suspensión de células. La frecuencia del equipo se fijó en 2OkHz y Ia potencia acústica en 70 kW. Durante Ia ruptura, Ia suspensión de células en tubos de 15 mi se mantuvo en un baño helado para prevenir el sobrecalentamiento. El ciclo de ruptura consistió de intervalos de 5 segundos de actuación y 5 segundos de descanso hasta completar 10 minutos de tiempo de ruptura total. Después de Ia ruptura Ia fracción de proteínas insolubles asociadas a membrana se separó de las proteínas solubles por centrifugación a 12,500 x g durante 15 min a 4 0C y se almacenó a -20 0C. Posteriormente esta fracción se resolvió en un gel de electroforesis como se describe más adelante, y Ia banda de Ia proteína de interés se extrajo del gel para usarla en los experimentos de inmunización en conejos.
Los niveles de expresión de las proteínas recombinantes y las concentraciones de proteínas durante Ia fermentación y en los pasos de purificación se determinaron usando el sistema semiautomático para electroforesis Experion (Bio-Rad, Hercules, CA, EU). Para hacer las determinaciones se cargaron 4 μl de las muestras en el Chip Pro 260 (Experion, Bio-Rad) y se analizaron en el Experion siguiendo las instrucciones del fabricante.
La expresión de las proteínas recombinantes se detectó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% (Criterion XT, Bio-Rad). Las muestras, de 10 μg de proteínas totales, fueron aplicadas en cada pocilio y las corridas electroforéticas se realizaron a corriente constante de 2OmA durante 4 h. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R250 o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa PROTRAN BA85 (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania) en una unidad de transferencia semi-seca Minie-Genie Electroblotter (Idea Scientific, Corvallis, OR, E. U.) siguiendo las instrucciones del fabricante, para luego ser analizadas por Western blot.
Para el análisis por Western blot, las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con una solución de leche semidesnatada al 5 % (p/v) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron tres veces en solución de tris tramponada (TBS, TrisΗCI 25 mmol/L, NaCI 150 mmol/L, pH 7.6) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el suero de los conejos inmunizados previamente con Gavac (Revetmex, México) o con las vacunas que contenían las proteínas recombinantes. Los antisueros de conejo fueron diluidos a concentraciones de 1 :1000 o 1 :5000 respectivamente en una solución al 3% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) en solución tampón TBS. Posteriormente, las membranas se lavaron otras tres veces TBS y se incubaron nuevamente con un anticuerpo policlonal anti-lgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase, HRP, Sigma-Aldrich) diluido 1 :1000 en TBS. Después de lavar nuevamente las membranas se rebeló el color empleando el sustrato 3,3'5,5' tetrametilbenzidina (TMB, Promega, EUA) durante 20 minutos. El ensayo de inmunofluorescencia de células vivas, para detectar Ia expresión de Ia proteína recombinante fusionada BM95-MSP1a, se hizo usando los anticuerpos policlonales contra MSPIa, BM86 y Ia proteína fusionada BM95-MSP1a producidos en conejos. Como controles positivos y negativos se incluyeron las proteínas recombinantes MSPIa y MSPI b expresadas en E. coli.
Las células inducidas de 1 mi de cultivo (aproximadamente 3x108) se separaron por centrifugación a 5000 x g durante 5 min. y se lavaron con 1 mi de solución tamponada de fosfatos (PBS). Se colectaron nuevamente por centrifugación, se resuspendieron en 100 μl de suero de conejo preinmune o inmune y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras Ia incubación, fueron nuevamente separadas, lavadas con PBS y resuspendidas en 100 μl de solución de IgG de cabra anti-conejo marcado con fluoresceína (KPL, Inc., Gaithersburg, MD, USA) diluida 1 :100 en suero de cabra al 3% (Sigma Aldrich) en PBS. Se incubaron nuevamente, durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el complejo célula-anticuerpos se separó por centrifugación, se lavó con PBS y se resuspendió en 100 μl de suero de cabra al 3% en PBS. Finalmente las células fueron extendidas en laminillas de vidrio y secadas al aire, antes de ser fijadas en metanol y lavadas con PBS. Las extensiones de células secas se montaron sobre un portaobjetos con Mowiol/glicerol/1 ,4- diazabiciclo-(2,2,2)-octano (DAPCO, Sigma) y se examinaron con un microscopio de epifluorescencia (Eclipse 5Oi, Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA).
Con el plásmido pMBXAF3 construido se logró un alto nivel de expresión de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a en E. coli. En el fermentador, Ia proteína fusionada BM95-MSP1a comenzó a acumularse después de las 0.5 h. de inducción con IPTG y su concentración final alcanzó el 2.8 % de Ia proteína total producida por las células a las 3.5 h. de inducción (Figs. 3A and 3B).
El peso molecular de Ia proteína fusionada BM95-MSP1a se estimó entre
65 y 70 kDa por SDS-PAGE (Figs. 2 and 3A). Este valor estuvo en concordancia con Ia estimación teórica de 67 kDa, de los cuales, 62 kDa corresponden a los 5 primeros aminoácidos que preceden a Ia proteína quimera BM95 y a Ia región de MSPIa y 5 kDa a Ia quimera BM95 (Fig. 1B).
Se realizó un experimento para caracterizar y purificar a Ia proteína fusionada BM95-MSP1a. Las células de E. coli se rompieron por sonicación y, las fracciones de proteínas solubles e insolubles asociadas a membranas se separaron por centrifugación. Los resultados mostraron que, tanto Ia proteína fusionada BM95-MSP1a como Ia proteína recombinante MSPIa, se localizan en Ia fracción insoluble asociada a las membranas y no hubo evidencias de su acumulación en el citoplasma (Fig. 4).
EJEMPLO 3. INMUNIZACIÓN DE CONEJOS Y PREPARACIÓN DE ANTISUEROS.
Tres grupos de dos conejos de raza Nueva Zelanda se inmunizaron en las semanas 0, 3 y 6 con dosis de 1 mi que contenían 50 μg de las proteínas purificadas MSPIa y de fusión BM95-MSP1a, adyuvadas en Montanide ISA 50 V2 (Seppic, Paris, Francia), y BM86 (Gavac, Revetmex, México). Las vacunas se suministraron por vía subcutánea usando una jeringa de tuberculina con aguja de 27Y2G. Dos semanas después de Ia última inmunización se tomaron muestras de sangre de cada conejo en tubos estériles, se trasladaron al laboratorio, se obtuvieron los sueros por centrifugación y posteriormente se almacenaron a -20 0C. Los conejos se mantuvieron y cuidaron de acuerdo con las normas de Uso de Animales de Laboratorio.
Se hizo un estudio de inmunofluorescencia con células vivas (IFA) para analizar si Ia proteína fusionada BM95-MSP1a estaba expuesta sobre Ia superficie de E. coli (Fig. 5). Empleando como controles células de E.coli que expresaron las proteínas recombinantes MSPIa y MSPI b y usando los sueros de conejo pre-inmune se obtuvieron los resultados esperados (Figs. 5A-L). Además de ello, Ia IFA de Ia cepa de E. coli que expresó Ia proteína de fusión BM95-MSP1a mostró que Ia proteína estaba expuesta sobre Ia superficie de las células (Figs. 5K-O).
La caracterización antigénica de Ia proteína de fusión BM95-MSP1a se realizó por inmunofluorescencia de células vivas. La proteína BM95-MSP1a no sólo fue reconocida por los anticuerpos específicos de conejo inmunizado con Ia proteína fusionada (Fig. 50), sino también por anticuerpos contra Ia proteína MSPIa (Fig. 5M) y contra BM86 (Fig. 5N). Además, los sueros de conejos inmunizados con Ia proteína recombinante reconocieron a Ia proteína fusionada mediante Western-blot (Fig. 6). Estos resultados indicaron que los epítopos de Ia proteína fusionada que son expuestos sobre Ia superficie de Ia célula se reconocieron por anticuerpos anti-BM86 y demostraron que los epítopos de BM95 se tradujeron correctamente y mantuvieron su antigenicidad aún después de Ia fusión.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Sistema de expresión de péptidos sobre Ia superficie bacteriana caracterizado porque comprende una región de anclaje a Ia membrana bacteriana y el péptido expuesto, donde Ia región de anclaje a Ia membrana bacteriana es cualquiera de las siguientes secuencias: a. Péptido que comprende Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ; o b. Una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con Ia SEQ ID NO: 1 ;
2. Sistema de expresión de péptidos según Ia reivindicación anterior, donde Ia bacteria es E. coli.
3. Construcción genética que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. secuencia de nucleótidos que codifica Ia secuencia aminoacídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o b. moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c. moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d. secuencia de nucleótidos de a), b), ó c), preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.
4. Plásmido que comprende Ia construcción genética según Ia reivindicación 3.
5. Método para elaborar el sistema de expresión de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, que comprende los siguientes pasos: a. Introducir una construcción genética según Ia reivindicación, 3 o un plásmido según Ia reivindicación 4, en una célula hospedante. b. Incubar Ia célula hospedante según a. en un medio de reacción adecuado.
6. Método según Ia reivindicación anterior, donde Ia célula hospedante es E. col i.
7. Péptido recombinante que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia invención y Ia secuencia de aminoácidos del péptido expuesto, obtenido a partir del sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de Ia construcción genética según Ia reivindicación
3, o del plásmido según Ia reivindicación 4.
8. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, construcción genética según Ia reivindicación 3, plásmido según Ia reivindicación 4 o péptido recombinante según Ia reivindicación 7, para su uso como medicamento.
9. Sistema de expresión según Ia reivindicación anterior, donde el medicamento es una vacuna.
10. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde Ia secuencia de aminoácidos del péptido expuesto comprende Ia SEQ ID NO: 3.
11 . Uso del sistema de expresión según Ia reivindicación anterior para Ia elaboración de una vacuna para inmunizar frente a garrapatas del género Rhipicephallus.
12. Uso del péptido recombinante según Ia reivindicación 7 como inmunógeno.
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