KR102280493B1 - GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB) 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 STF2 재조합 단백질 제조용 유전자 카세트를 이용하여 12개의 GnRH가 STF2 N 말단 단편 및 C 말단 단편 내부에 링커로 연결되어 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질의 제조 방법, 및 상기 제조 방법으로 제조된 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 및 이의 용도{GnRH inserted STF2 recombinant protein and uses thereof}

본 발명은 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 12개의 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질의 제조 방법, 및 상기 제조 방법으로 제조된 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

면역거세(immunocastration)란 면역 반응을 유도하여 동물의 생식 기능을 없애는 것으로, 경제적인 이유와 동물학대 방지 측면에서 외과적 거세에 대한 대안으로 제안되어 왔다. 동물의 거세는 성적 충동으로 야기되는 배회, 땅파기, 성적 행동, 난폭한 행동 등을 감소시키고, 고환암, 전립선암 및 직장암 등을 방지하기 위한 건강상의 목적과, 동물의 과도한 개체 증가를 방지하고 그 이용가치를 높이기 위한 목적으로 행해진다. 외과적 거세는 간단하고 쉬운 방법이지만 동물에게 매우 심각한 고통 및 스트레스를 발생시키기 때문에 동물복지 차원에서 문제가 되므로, 최근 스위스, 노르웨이, 벨기에, 네덜란드 등의 유럽국가의 경우 동물의 물리적 거세를 금지하기로 결정하였으며, 오스트레일리아는 외과적으로 웅돈을 거세하는 대신에 면역거세를 시행하는 최초의 국가가 되었고, 우리나라에서도 이와 유사한 조치를 검토하고 있다(Thun R et al., Journal of Physiology and Pharmacology, 57, pp.189-194, 2006).

면역거세 방법은 대부분 성선자극호르몬-분비호르몬(gonadotropin-releasing hormone, 이하 GnRH)에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 백신을 이용하여 실시되고 있다.

GnRH는 10 개의 아미노산으로 이루어진 호르몬으로, 모든 동물에서 거의 동일한 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. GnRH는 시상하부에서 생성되어 뇌하수체에 작용함으로써 성 호르몬인 FSH(follicle stimulating hormone) 및 LH(luteinizing hormone) 의 생성을 촉진시키기 때문에, 시상하부에서 GnRH의 생성을 원천적으로 차단할 경우 거세효과가 발생한다는 연구 결과가 보고되고 있다. GnRH를 항원으로 이용하여 동물에 접종하면 백신을 접종 받은 동물에서는 GnRH를 인식하는 항체가 형성되는데, GnRH를 인식하는 항체가 체내에서 생성되는 GnRH를 제거하여 수컷 및 암컷 동물의 성 성숙을 차단함으로써 거세효과를 발휘한다는 것이다(Adams TE, Animal Reproduction Science, 88, 127-139, 2005).

그러나 GnRH는 동물에서 생성되는 자체 단백질이기 때문에 정상적인 동물의 면역체계에서는 GnRH를 자가항원으로 인식하여 GnRH에 대한 항체를 형성하지 않는다. 따라서 GnRH를 인식하는 항체를 형성시키기 위해서 인위적으로 과량의 GnRH를 투여하거나, GnRH의 항원성을 향상시키기 위해서 캐리어(carrier) 단백질과 융합시켜 투여하는 방법이 시도되고 있다. 최근에 호주에 있는 CSL이라는 회사에서는 캐리어 단백질로서 KLH를 사용하여 거세 백신을 개발한 바 있다. 이 외에도, Pfizer 사가 면역거세 백신으로 Improvac를 개발한 바 있으나, 강력한 면역 반응을 유도하지 못하는 단점을 갖고 있다.

또한, WO92/19746은 GnRH 또는 그의 유사체 및 T-세포 에피토프(T-cell epitope)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 이용한 동물의 면역거세 방법을 개시하고 있고, WO02/22659는 GnRH-I 및 GnRH-Ⅱ 를 이용한 돼지의 면역거세 방법을 개시하고 있고, US5837268는 류코톡신(leukotoxin) 및 GnRH 를 포함하는 키메릭 단백질(chimeric protein)을 이용하여 GnRH에 대한 면역원성을 개선하는 방법을 개시하고 있으나, 동물에게서 보다 강력한 면역 반응을 유도하여 거세 효과를 달성할 수 있는 백신에 대한 요구가 현재까지 계속되고 있다.

한편, STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB) 는 TLR 5(Toll-like receptor 5) 의 리간드로 작용하는 물질로서 후천성 면역 반응(adaptive immune response)의 활성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Huleatt JW et al., Vaccine, 25, 763-775, 2007).

이에, 본 발명자들은 GnRH의 항원성을 향상시키고 모든 동물에게 적용 가능한 면역거세 백신을 개발하기 위하여 노력한 결과, STF2 재조합 단백질 발현용 유전자 카세트를 이용하여 12개의 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 제조할 수 있었고, 상기 12개의 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 접종한 랫트에서 항체의 역가를 평가한 결과 우수한 항원성을 나타내므로, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 동물의 면역 거세 백신으로 개발할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB) 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 생산용 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조 방법으로 제조된 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB)의 N 말단 단편 유전자, 링커를 암호화하는 유전자, GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 12개 연결되도록 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 STF2의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는, GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 생산용 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법을 제공한다.

본 발명의 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB) 재조합 단백질은 12개의 GnRH가 STF2 N 말단 단편 및 C 말단 단편 내부에 링커로 연결되어 STF2의 N 말단 또는 C 말단에 다른 기능기를 더 포함할 수 있고, 많은 항원 결정부를 가지고 있어 랫트에서 GnRH에 대한 항체 형성 효과가 우수하므로, 동물의 성성숙을 예방 및 억제하기 위한 면역거세용 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 gly-gly-gly-ser 링커(GGGS 링커)를 암호화하는 링커 유전자(서열번호 3)를 포함하는 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자(서열번호 1) 및 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자(서열번호 2) 사이에 외래 유전자가 삽입될 수 있는 STF2 유전자 카세트(서열번호 8)를 모식화한 도이다.
도 2는 PCR 기법에 의해 증폭된 STF2 유전자의 C 말단 단편 유전자 산물 및 N 말단 단편 유전자 산물의 전기영동 사진을 나타낸 것으로, M은 100 bp DNA ladder를 나타내고 레인 1은 증폭된 STF2 유전자의 C 말단 단편 유전자 산물을 나타내며 레인 2는 증폭된 STF2 유전자의 N 말단 단편 유전자 산물을 나타낸다.
도 3은 STF2 유전자 카세트를 포함하는 1566 bp PCR 산물의 전기영동 사진을 나타낸 것으로, 레인 1은 1 Kb DNA ladder를 나타내고 레인 2는 STF2 유전자 카세트를 나타낸다.
도 4는 외래 유전자가 삽입될 수 있는 STF2 유전자 카세트에 돼지 유래 GnRH(gonadotropin-releasing hormone) 유전자 12 카피(copy)를 삽입하여 GnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자(서열번호 16)를 모식화한 도이다.
도 5는 GnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자의 전기영동 사진을 나타낸 것으로, M은 100 bp DNA ladder를 나타내고 레인 1은 GnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자를 나타낸다.
도 6은 SDS-PAGE를 이용하여 GnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질 발현 및 정제를 확인한 도이다.
도 7은 GnRH에 대한 항체 역가를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB)의 N 말단 단편 유전자, 링커를 암호화하는 유전자, GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 12개 연결되도록 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 STF2의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는, GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명에서, 상기 "STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB)"는 TLR 5의 리간드로 작용하는 물질로서 후천성 면역 반응의 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명에서 STF2는 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.

또한, 상기 STF2의 N 말단 단편 유전자는 상기 서열번호 21의 염기서열로 나타낼 수 있는 STF2 유전자의 13 bp 내지 717bp로서 705 bp의 N 말단 단편 유전자를 의미한다. 상기 STF2 N 말단 단편 유전자의 5' 말단에 링커를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있고, 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 링커로 연결될 수 있다.

또한, 상기 STF2의 C 말단 단편 유전자는 상기 서열번호 21의 염기서열로 나타낼 수 있는 STF2 유전자의 727 bp 내지 1521 bp로서 C 말단 795 bp의 C 말단 단편 유전자를 의미한다. 상기 STF2 C 말단 단편 유전자의 3' 말단에 링커를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있고, 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 링커로 연결될 수 있다.

본 발명에서, 상기 "GnRH(gonadotropin-releasing hormone)"는 성선자극호르몬-분비호르몬으로서, 10 개의 아미노산으로 이루어지며, 모든 동물에서 거의 동일한 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명에서 GnRH은 서열번호 10의 염기서열 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다. GnRH는 시상하부에서 생성되어 뇌하수체에 작용함으로써 성 호르몬인 FSH 및 LH 의 생성을 촉진시키는데, GnRH를 항원으로 이용하여 동물에 접종할 경우 GnRH를 인식하는 항체가 형성되며, 상기 항체가 체내에서 존재하는 GnRH를 제거함으로써 수컷 및 암컷 동물의 성 성숙이 차단되어 거세효과가 발생하게 된다.

또한, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질에 사용되는 GnRH는 GnRH 아미노산 서열의 12 카피(copies)를 갖는 것으로서, GnRH가 12개 연결된 다량체 형태를 갖는 것이 바람직하다. 상기 GnRH가 12개 연결되도록 암호화하는 유전자는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열로 나타낼 수 있다.

본 발명에서, 상기 "링커"란 STF2 N 말단 단편 및 STF2 C 말단 단편과 GnRH를 연결하여 재조합 단백질을 만드는 경우, 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 결합시킨 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩티드를 말한다. 링커는 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 그 종류나 아미노산 개수는 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 아미노산 1개 내지 5개가 바람직하다.

또한, 상기 링커는 보다 구체적으로 글라이신(Gly)-글라이신(Gly)-글라이신(글라이신)-세린(Ser)의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열로 나타낼 수 있고, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 STF2 재조합 단백질 발현용 유전자 카세트를 이용하여 12개의 GnRH가 STF2 N 말단 단편 및 C 말단 단편 내부에 링커로 연결되어 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다.

또한, 본 발명은 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 생산용 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 제공한다.

유전자 재조합 방법으로 본 발명의 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 생산하는 과정은 다음 단계를 포함한다.

첫째, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조하는 단계이다. 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열로 나타낼 수 있고, 상기 재조합 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.

상기 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pQE40, pT7, pET/Rb, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있다.

둘째, 상기 발현 벡터를 사용해서 숙주세포를 형질전환시킨 후 배양하는 단계이다. 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있다.

상기 발현 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다.

본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포는 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF 9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주세포의 예이다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다.

셋째, 융합 재조합 단백질의 발현을 유도 및 축적하는 단계이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 유도인자 IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하였고 유도시간은 단백질의 양이 최대화될 수 있도록 조절하였다.

마지막으로, 상기 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계이다. 일반적으로 재조합적으로 생산된 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 융합 재조합 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 및 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 12개의 GnRH가 STF2 N 말단 단편 및 C 말단 단편 내부에 링커로 연결되어 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 카세트를 포함하는 STF2 재조합 단백질 생산용 pQE40 발현 벡터를 제작하여 대장균 M15 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 그 다음, 히스티딘 태그(tag) 단백질용 Ni-NTA 수지를 이용하는 크로마토그래피를 이용하여 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 정제하였다.

또한, 본 발명은 상기 제조된 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 면역 거세용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 백신 조성물은 GnRH에 대한 항체 형성능이 증진되어, 면역 거세용으로 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 분리 및 정제하였고, 상기 정제한 재조합 단백질이 많은 GnRH 항원 결정부를 가지고 있어, 랫트에서 GnRH에 대한 항체 형성 효과가 우수함을 확인하였으므로, 본 발명의 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 동물의 성성숙을 예방 및 억제하기 위한 면역거세용 백신으로 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들로 구성될 수 있고, 면역학적 효과량으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "면역학적 효과량"이란 면역 거세 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며 면역반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.

담체는 당 분야에 공지의 것으로 안정화제, 희석제, 완충액을 포함할 수 있다. 적절한 안정화제는 솔비톨, 락토즈, 만니톨, 전분, 당, 덱스트란 및 포도당 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인 같은 단백질 등을 포함할 수 있다. 적절한 희석제에는 염, Hanks 균형 염, 링거액 등을 포함한다. 적절한 완충액에는 알칼리 금속 인산염, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 토금속 탄산염 등을 포함한다. 또한 백신에는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 면역 아쥬반트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 적절한 면역 아쥬반트에는 아쥬번트의 예는 알루미늄 히드록시드, 프로이드 완전 또는 불완전 아쥬반트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 공지의 투여 경로를 통하여 투여된다. 이와 같은 방법에는 경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 이용할 수 있지만 이에 국한되지는 않으며, 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 체액성 또는 선택적으로 세포-매개성 면역 반응 및/또는 상기 두 면역반응의 조합을 유도할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물의 다양한 양태는 Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., Mach Publishing, Easton, Pennsylvania, U.S.A.를 참조할 수 있다.

또한, 본 발명은 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 백신 조성물을 이용한 면역 거세 방법은 동물 종에 상관없이 인간을 제외한 모든 동물에 적용 가능하다. 상기 동물은 포유동물이 바람직하며, 예를 들어 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 산양, 쥐, 말, 사슴, 원숭이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 하이에나, 들개, 치타, 표범, 재규어, 코끼리, 물소, 살쾡이, 고슴도치, 두더지, 돼지, 다람쥐, 청설모, 오소리, 너구리, 오리너구리, 나무늘보, 반달곰, 흰곰, 불곰, 팬더, 날다람쥐, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄,노루, 코뿔소, 담비, 수달, 바다표범, 물개, 물곰, 바다코끼리, 고래 또는 돌고래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서, 투여는 2 회 이상 실시하는 것이 바람직하다. 예컨대, 1차 예방접종(initial vaccination) 후에 추가접종(booster injections)을 1-10 주 간격으로 1-4 회 정도 실시할 수 있으나, 이는 해당 동물의 종류에 따라 당업자가 적절하게 변형하여 실시할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 외래 유전자 삽입을 위한 STF2 유전자 카세트 제작

STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB)는 N 말단 및 C 말단이 서로 인접해 있는 구조적 특성에 의해 다른 기능을 담당하는 단백질을 추가적으로 발현하기 어려운 단점이 있다. 따라서, 외래 단백질이 STF2 단백질 내부에 삽입된 STF2 재조합 단백질을 생산하기 위하여 도 1의 모식도와 같이 [표 1]에 기재된 염기서열의 gly-gly-gly-ser 링커(GGGS 링커)를 암호화하는 링커 유전자(서열번호 3)를 포함하는 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자(서열번호 1) 및 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자(서열번호 2) 사이에 외래 유전자가 삽입될 수 있는 STF2 유전자 카세트를 제작하였다.

유전자	서열(5'→3')	서열번호
STF2 N 말단 단편 유전자	ATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAATGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGATGTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGACGTATCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCTGTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATT	1
STF2 C 말단 단편 유전자	ACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACTAAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAATGCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATGTCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGATAAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGTTATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGTAAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCATGATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTTAA	2
링커 유전자	GGTGGCGGTAGT	3

<1-1> STF2 유전자 N 말단 단편 제작

GGGS 링커를 암호화하는 링커 유전자(서열번호 3)를 양 말단에 포함하는 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자(서열번호 1)가 삽입된 pRBC TA 벡터를 제작하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, STF2 유전자의 5' 말단에 SpeI 제한효소 사이트 및 링커 유전자를 포함하고, 3' 말단에 Bg1II 제한효소 사이트 및 링커 유전자를 포함하는 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자(STF2-1)를 증폭시키기 위하여, 대한민국등록특허 제10-1298215호에 기재된 방법으로 TA 클로닝 벡터로 클로닝한 STF2 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 하기 [표 2]에 기재된 SpeI_STF2-1_F 프라이머 및 Bg1II_STF2-1_R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 위하여 반응액은 총 20 ㎕로서, iNtRON's MaximeTM PCR PreMix(i-StarTaq) (Cat No. 25180), 각 10 pmol의 SpeI_STF2-1_F 프라이머 및 Bg1II_STF2-1_R 프라이머, 상기 주형 플라스미드 DNA 10 ng을 첨가하여 구성하였고, 하기 [표 3]의 조건으로 PCR을 수행하여 증폭된 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자 산물을 획득하였다(도 2, 레인 2).

프라이머	서열(5'→3')	서열번호
SpeI_STF2-1_F	ACTAGT SpeI GGTGGCGGTAGT GGGS 링커ATCAACACTAACAGTC	4
Bg1II_STF2-1_R	AGATCT Bg1II ACTACCGCCACC GGGS 링커AATAGTAACAAAGTACTTG	5

PCR 단계	온도(℃)	시간	cycles
1차 변성(First denaturation)	95	5분	1
변성(Denaturation)	95	30초	35
어닐링(Annealing)	52	30초
연장(Extension)	72	1분
최종 연장(Final Extension)	72	7분	1

증폭한 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자 산물을 TA 클로닝 벡터(Real Bio Tech Corporation) 에 TA 클로닝 기법을 이용하여 연결(ligation)하였고 stellar 컴피턴트 세포(Clonetech, USA) 내로 열 충격 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli를 X gal 과 IPTG가 접종되어 있는 암피실린이 포함되어 있는 LB 플레이트 상에 도말하여 37℃에서 16시간 배양한 후 화이트 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니를 암피실린이 포함되어 있는 LB broth에서 하룻밤 배양 후 플라스미드 DNA를 추출하고 DNA 시퀀싱을 통해 양 말단에 GGGS 링커 유전자를 포함하는 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자가 클로닝된 것을 확인하였다. 상기 방법을 통해 양 말단에 GGGS 링커 유전자를 포함하는 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자가 삽입된 재조합 pRBC TA 플라스미드를 획득하였다(이하, 이를 'pRBC[SpeI_STF2-1_Bg1II]'라 명명함).

<1-2> STF2 유전자 C 말단 단편 제조

GGGS 링커를 암호화하는 링커 유전자(서열번호 3)를 5' 말단에 포함하는 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자(서열번호 2)가 삽입된 pRBC TA 벡터를 제작하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, STF2 유전자의 5' 말단에 XhoI 제한효소 사이트 및 링커 유전자를 포함하고, 3' 말단에 XbaI 및 SacI 제한효소 사이트를 포함하는 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자(STF2-2)를 증폭시키기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 증폭된 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자 산물을 획득하였다(도 2,레인 1). PCR을 위하여 하기 [표 4]에 기재된 XhoI_STF2-2_F 프라이머 및 XbaI_SacI_STF2-2_R 프라이머를 이용하였다.

프라이머	서열(5'→3')	서열번호
XhoI_STF2-2_F	CTCGAG XhoI GGTGGCGGTAGT GGGS 링커ACTGGTGCTGATGCC	6
XbaI_SacI_STF2-2_R	TCTAGA XbaI GAGCTC SacITTAACGTAACAGAGACAGCA	7

증폭한 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자 산물을 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 클로닝하고, 형질전환하여 콜로니를 선발한 후 DNA 시퀀싱을 통해 5' 말단에 GGGS 링커 유전자를 포함하는 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자가 클로닝된 것을 확인하였다. 상기 방법을 통해 5' 말단에 GGGS 링커 유전자를 포함하는 STF2 유전자 C 말단 단편 유전자가 삽입된 재조합 pRBC TA 플라스미드를 획득하였다(이하, 이를 'pRBC[XhoI_STF2-2_XbaI_SacI]'이라 명명함).

<1-3> 외래 유전자 삽입을 위한 STF2 유전자 카세트 제조

도 1의 모식도와 같이 GGGS 링커 유전자를 포함하고 STF2 유전자 N 말단 단편 유전자 및 C 말단 단편 유전자 사이에 외래 유전자가 삽입될 수 있는 STF2 유전자 카세트를 포함하는 pRBC TA 벡터를 제작하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <1-2>에서 제조한 pRBC[XhoI_STF2-2_XbaI_SacI] 플라스미드 DNA를 Bg1II(NEB) 및 XbaI(NEB) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pRBC[XhoI_STF2-2_XbaI_SacI] 플라스미드 DNA는 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트(Cat No. EBD-1005)를 사용하여 정제하였다.

또한, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 pRBC[SpeI_STF2-1_Bg1II] 플라스미드 DNA를 Bg1III(NEB) 및 XbaI(NEB) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pRBC[SpeI_STF2-1_Bg1II] 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트(Cat No. EBD-1005)를 사용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 정제한 pRBC[XhoI_STF2-2_XbaI_SacI] 플라스미드 DNA 및 pRBC[SpeI_STF2-1_Bg1II] 플라스미드 DNA를 핵산결합효소인 T2 리가아제(NEB)를 이용하여 결합시킨 후 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 형질전환하여 콜로니를 선발하고, DNA 시퀀싱을 통해 하기 [표 5]에 기재된 염기서열의 N 말단에 링커 유전자를 포함하고, SFT2 유전자 내부에 링커 유전자 및 외래 유전자가 삽입 부위를 포함하는 STF2 유전자 카세트(서열번호 9)가 삽입된 재조합 pRBC TA 플라스미드를 획득하였다(이하, 이를 'pRBC[STF2-1_STF2-2]'이라 명명함).

유전자	서열(5'→3')	서열번호
STF2 N 말단 단편 유전자-GGGS 링커 유전자-외래 유전자 삽입용 클로닝 부위(Bg1II_XhoI 제한효소 사이트)-GGGS 링커 유전자-STF2 C 말단 단편 유전자	ATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAATGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGATGTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGACGTATCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCTGTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGTGGCGGTAGT GGGS링커 AGATCT Bg1II CTCGAG XhoI GGTGGCGGTAGT GGGS 링커ACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACTAAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAATGCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATGTCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGATAAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGTTATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGTAAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCATGATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTTAA	8
GGGS 링커 유전자-STF2 N 말단 단편 유전자-GGGS 링커 유전자-외래 유전자 삽입용 클로닝 부위(Bg1II_XhoI 제한효소 사이트)-GGGS 링커 유전자-STF2 C 말단 단편 유전자	GGTGGCGGTAGT GGGS링커ATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAATGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGATGTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGACGTATCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCTGTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGTGGCGGTAGT GGGS링커 AGATCT Bg1II CTCGAG XhoI GGTGGCGGTAGT GGGS 링커ACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACTAAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAATGCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATGTCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGATAAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGTTATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGTAAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCATGATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTTAA	9

또한, 상기 pRBC[STF2-1_STF2-2]를 주형으로 하여 상기 [표 1]에 기재된 XhoI_STF2-2_F 프라이머 및 상기 [표 2]에 기재된 XbaI_SacI_STF2-2_R 프라이머를 이용하여 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행한 후, PCR 증폭 산물을 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 1566 bp의 STF2 유전자 카세트를 도 3과 같이 확인하였다.

< 실시예 2> 외래 유전자로 GnRH ( gonadotropin -releasing hormone) 12 카피(copy) 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자의 제조

<2-1> swGn 6 카피(copy) 제조

상기 <실시예 1>에서 제작한 외래 유전자를 삽입할 수 있는 STF2 유전자 카세트에 서열번호 10의 염기서열 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래의 GnRH 유전자(swGnRH)를 삽입하기 위하여, swGnRH 유전자를 6 카피 포함하는 pRBC TA 벡터를 하기와 같은 실험을 수행하여 제작하였다.

구체적으로, swGnRH 6 카피 유전자의 5' 말단에 Bg1II 제한효소 사이트를 포함하고, 3' 말단에 XhoI 제한효소 사이트를 포함하는 swGnRH 6 카피 유전자를 증폭시키기 위하여, 대한민국등록특허 제10-1298215호에 기재된 방법으로 pQE40 벡터로 클로닝한 swGnRH 6 카피 유전자 플라스미드 DNA(pGnRH6)를 주형으로 하여 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 증폭된 swGnRH 6 카피 유전자 산물을 획득하였다. PCR을 위하여 하기 [표 6]에 기재된 Bg1II_GnRH6_F 프라이머 및 XhoI-GnRH6_R 프라이머를 이용하였다.

프라이머	서열(5'→3')	서열번호
BglII_GnRH6_F	GTGCTGTCTCTGTTACGTAGATCT Bg1IIGAA	12
XhoI_GnRH6_R	GAGTCCAACTCGAG XhoIATTAAGCTT HindIIITCCCGG	13

증폭한 swGnRH 6 카피 유전자 산물을 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 클로닝하고, 형질전환하여 콜로니를 선발한 후 DNA 시퀀싱을 통해 swGnRH 6 카피 유전자가 클로닝된 것을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 6 카피 유전자가 삽입된 재조합 pRBC TA 플라스미드를 획득하였다(이하, 이를 'pRBC[Bg1II_6copy-GnRH_XhoI]'이라 명명함).

<2-2> swGn 12 카피 제조

상기 <실시예 1>에서 제작한 외래 유전자를 삽입할 수 있는 STF2 유전자 카세트에 12 카피의 swGnRH 유전자를 삽입하기 위하여, swGnRH 유전자를 12 카피 포함하는 pRBC TA 벡터를 하기와 같은 실험을 수행하여 제작하였다.

구체적으로, swGnRH 6 카피 유전자의 5' 말단에 XhoI 및 Bg1II 제한효소 사이트를 포함하고, 3' 말단에 XhoI 제한효소 사이트를 포함하는 swGnRH 6 카피 유전자를 증폭시키기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 pRBC[Bg1II_6copy-GnRH_XhoI]를 주형으로 하여 하기 [표 7]에 기재된 GnRHI_InFusion_F 프라이머 및 GnRHI_InFusion_R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 증폭한 swGnRH 6 카피 유전자 산물을 XhoI(NEB) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 swGnRH 6 카피 유전자 산물을 인서트(insert) DNA로 이용하기 위하여 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다.

프라이머	서열(5'→3')	서열번호
GnRHI_InFusion_F	AAAGCTTAATCTCGAG XhoIAGTAGATCT Bg1IIGAACAT	14
GnRHI_InFusion_R	TACCGCCACCCTCGAGA XhoITTAAGC	15

또한, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 pRBC[Bg1II_6copy-GnRH_XhoI] 플라스미드 DNA를 XhoI(NEB) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pRBC[Bg1II_6copy-GnRH_XhoI] 플라스미드 DNA를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 정제한 인서트 DNA와 pRBC[Bg1II_6copy-GnRH_XhoI] 플라스미드 DNA를 In-fusion cloning 키트(Cat No. 121416, Takara)를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝을 위하여 반응액은 총 10 ㎕로서, 5×In-Fusion HD Enxyme Premix 2 ㎕, 6:1 비율의 인서트 DNA와 pRBC[Bg1II_6copy-GnRH_XhoI] 플라스미드 DNA를 첨가하여 구성하였다. 상기 반응액은 50℃에서 15분 반응시킨 후 아이스에 정치하였다. 상기 클로닝 산물을 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 형질전환하여 콜로니를 선발한 후 DNA 시퀀싱을 통해 swGnRH 12 카피 유전자(서열번호 17)가 클로닝된 것을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 재조합 pRBC TA 플라스미드를 획득하였다(이하, 이를 'pRBC[Bg1II_12copy-GnRH_XhoI]'이라 명명함).

<2-3> swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자 제조

도 4의 모식도와 같이 GGGS 링커 유전자를 포함하는 STF2 유전자 N 말단 및 C 말단 단편 유전자 사이에 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 유전자 카세트를 포함하는 pRBC 벡터를 제작하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-3>에서 제작한 pRBC[STF2-1_STF2-2] 플라스미드 DNA를 Bg1II(NEB) 제한효소 및 XhoI(NEB) 제한효소를 이용하여 절단한 후 DokDo-Prep Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다.

또한, 상기 실시예 <2-2>에서 제작한 pRBC[Bg1II_12copy-GnRH_XhoI] 플라스미드 DNA를 Bg1II(NEB) 제한효소 및 XhoI(NEB) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 절단된 swGnRH 12 카피 유전자 산물을 인서트 DNA로 이용하기 위하여 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 정제한 pRBC[STF2-1_STF2-2] 플라스미드 DNA 및 인서트 DNA를 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 In-fusion cloning 키트(Cat No. 121416, Takara)를 사용하여 클로닝하였다. 상기 클로닝 산물을 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 형질전환하여 콜로니를 선발한 후 DNA 시퀀싱을 통해 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 유전자 카세트가 클로닝된 것을 확인하였다. 상기 방법을 통해 하기 [표 8]에 기재된 염기서열의 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 유전자 카세트(서열번호 17)가 포함된 재조합 pRBC TA 플라스미드를 획득하였다(이하, 이를 'pRBC[STF2-1_12copy-GnRH_STF2-2]'라 명명함).

유전자	서열(5'→3')	서열번호
STF2 N 말단 단편 유전자-GGGS 링커 유전자- swGnRH 12 카피-GGGS 링커 유전자-STF2 C 말단 단편 유전자	ATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAATGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGATGTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGACGTATCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCTGTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGTGGCGGTAGT GGGS링커 AGATCT Bg1IIGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGGTACCGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAAAGCTTAATCTCGAGAGTAGATCTGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGGTACCGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAAAGCTTAATCTCGAG XhoI GGTGGCGGTAGT GGGS링커ACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACTAAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAATGCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATGTCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGATAAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGTTATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGTAAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCATGATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTTAA	16
GGGS 링커 유전자-STF2 N 말단 단편 유전자-GGGS 링커 유전자-swGnRH 12 카피-GGGS 링커 유전자-STF2 C 말단 단편 유전자	GGTGGCGGTAGT GGGS링커ATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAATGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGATGTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGACGTATCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCTGTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGTGGCGGTAGT GGGS링커 AGATCT Bg1IIGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGGTACCGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAAAGCTTAATCTCGAGAGTAGATCTGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGGTACCGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAAAGCTTAATCTCGAG XhoI GGTGGCGGTAGT GGGS링커ACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACTAAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAATGCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATGTCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGATAAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGTTATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGTAAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCATGATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTTAA	17

< 실시예 3> swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질의 제조

<3-1> swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자 발현 벡터 제작

swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질 생산을 위하여, 발현 벡터로서 pQE40 벡터에 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자를 하기와 같은 실험을 수행하여 클로닝 하였다.

구체적으로, swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자를 증폭시키기 위하여, 상기 실시예 <2-3>에서 제작한 pRBC[STF2-1_12copy-GnRH_STF2-2]를 주형으로 하여 하기 [표 9]에 기재된 pQE40_STF2_InFusion_F 프라이머 및 pAE40_STF2_InFusion_R 프라이머를 이용하여 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 후 증폭된 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 유전자 산물을 인서트 DNA로 이용하기 위하여 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다(도 5).

프라이머	서열(5'→3')	서열번호
pQE40_STF2_InFusion_F	TCACCATCACGGATCCATCAACACTAACAGT	18
pQE40_STF2_InFusion_R	TCAGCTAATTAAGCTGAGCTCTTAACGTAA	19

또한, 상기 pQE40 벡터를 BamHI(NEB) 및 HimdIII(NEB) 제한효소를 이용하여 절단하고, DokDo-Prep Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 정제한 pQE40 플라스미드 DNA 및 인서트 DNA를 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 In-fusion cloning 키트(Cat No. 121416, Takara)를 사용하여 클로닝하였다. 상기 클로닝 산물을 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 형질전환하여 콜로니를 선발한 후 DNA 시퀀싱을 통해 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 유전자 카세트가 클로닝된 것을 확인하였다. DNA 시퀀싱을 통해 서열번호 16의 염기서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 유전자가 포함된 재조합 pQE 발현 벡터를 획득하였다(이하, 이를 'pQE40[STF2-1_12copy-GnRH_STF2-2]'라 명명함).

	아미노산 서열	서열번호
swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 유전자	MRGSHHHHHHGSINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGGSRSEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGGTEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGKLNLESRSEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGGTEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGEHWSYGLRPGKLNLEGGGSTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR*	20

<3-2> swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질 발현 및 정제

swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질은 QIAexpressionist(Qiagen) 프로토콜에 따라 하기와 같이 발현 및 정제하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서 획득한 pQE40[STF2-1_12copy-GnRH_STF2-2]를 M15 컴피턴트 세포(Qiagen, USA) 내로 열 충격 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli를 X gal 과 IPTG 가 접종되어 있는 암피실린이 포함되어 있는 LB 플레이트 상에 도말하여 37℃에서 16시간 배양한 후 화이트 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니를 암피실린이 포함되어 있는 LB broth에서 16시간 배양한 후 배양 산물 10 ㎖를 LB broth 1 ℓ에 접종해서 OD 600 값이 0.9에 도달할 때까지 배양하고 IPTG 1mM을 넣어 단백질 발현을 유도하였다. 그 후 원심분리를 실시하여 펠렛을 얻은 후 -20℃에서 16시간 보관 후 용해(lysis) 버퍼를 이용하여 펠렛을 용해시킨 후 다시 원심분리를 실시하여 상층액을 취해 Ni-NTA 레진과 실온에서 1시간 30분 동안 교반(shaking)한 후 컬럼에 내렸다. 그 후 하기 [표 11] 및 [표 12]에 기재된 pH 6.3의 세척 (washing) 버퍼인 C버퍼로 두 번 세척한 후 pH 5.9의 용출 (elution) 버퍼인 D버퍼로 4번 용출하고 pH 4.5 의 용출(elution) 버퍼인 E 버퍼로 용출하였다. 그 후 SDS-PAGE 를 이용하여 발현 및 정제를 확인한 결과 약 72.49KD의 밴드가 확인 되었다(도 6).

버퍼 C (1 ℓ)
100 mM NaH2PO4	13.8 g NaH2PO4 H2O (분자량 137.99 g/mol)
10 mM Tris-Cl	1.2 g Tris base (분자량 121.1 g/mol)
8 M 요소	480.5 g (분자량 60.06 g/mol)
HCl을 사용하여 pH 6.3으로 조절

버퍼 D (1 ℓ)
100 mM NaH2PO4	13.8 g NaH2PO4 H2O (분자량 137.99 g/mol)
10 mM Tris-Cl	1.2 g Tris base (분자량 121.1 g/mol)
8 M 요소	480.5 g (분자량 60.06 g/mol)
HCl을 사용하여 pH 5.9로 조절
버퍼 E (1 ℓ)
100 mM NaH2PO4	13.8 g NaH2PO4 H2O (분자량 137.99 g/mol)
10 mM Tris-Cl	1.2 g Tris base (분자량 121.1 g/mol)
8 M 요소	480.5 g (분자량 60.06 g/mol)
HCl을 사용하여 pH 6.3으로 조절

따라서, 상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>의 결과를 통해, 상기 <실시예 2>에서 제작한 STF2 유전자 카세트를 이용하여 목적 유전자를 삽입할 수 있으며, 목적 유전자가 삽입된 STF2 유전자 카세트를 발현 벡터에 클로닝하여 목적 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 생산할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 4> 랫트에서 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질의 항원성 확인

총 12마리의 4주령 수컷 Spraque Dawley (SD) 랫트를 6마리씩 2개의 그룹으로 구성하였다; 그룹 1; swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질 50 ㎍, 그룹 2; 대조군.

그룹 1은 swGnRH 12 카피 유전자가 삽입된 STF2 재조합 단백질과 freud's imcomplete adjuvant를 동량으로 혼합하여 접종하였고, 그룹 2는 대조군으로 아무것도 접종하지 않았다. 상기 접종은 5 주령의 랫트에 1차 접종을 실시하고 2주 간격으로 세 번의 추가 접종을 실시하였다. 모든 그룹의 랫트는 접종 전에 미정맥에서 채혈을 하였고 마지막 백신접종 2주 후 안락사 하기 전에 복대정맥에서 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 혈청 분리를 실시하여 추후 ELISA를 이용한 GnRH 항체 검사에 사용하였다.

각각의 접종 전과 안락사 전에 채혈한 혈액에 존재하는 GnRH 에 대한 항체를 측정하기 위하여, KLH-GnRH 단백질을 코팅버퍼 (carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.6) 에 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후 96-웰 ELISA 플레이트(SPL)에 웰 당 100 ㎕씩 분주한 후 4℃에 16시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼(PBST: Phosphate buffered saline tween 20)로 3회 세척 후 차단(blocking) 버퍼(5% skim milk-PBST)를 웰 당 100 ㎕씩 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후 세척 버퍼로 3회 세척 후 랫트의 혈청을 희석(dilution) 버퍼 (2.5% skim milk-PBST)에 40×로 희석하여 각 웰 당 100 ㎕씩 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후 세척 버퍼로 5회 세척 후 HRP(horseradish peroxidase) 접합된 항-랫트 항체 (Bethyl)를 희석(dilution) 버퍼(2.5% skim milk-PBST)에 10000×로 희석한 후 각 웰 당 100 ㎕씩 넣어준 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세척 버퍼로 5회 세척 후 TMB 용액(KPL)을 각 웰 당 50 ㎕씩 넣어 10분간 반응시켰다. 그 후 각 웰 당 50 ㎕의 반응정지용액(stop solution, 1 M HCl)을 넣어 준 후 ELISA 리더기로 450 nm 의 파장으로 수치를 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 접종을 하지 않은 그룹은 항체가 형성되지 않는 것에 반해 접종 그룹의 랫트는 2차 접종 이후부터 항체 역가가 증가하는 것을 확인하였다(도 7).

<110> Konkuk University-Industry Cooperation Foundation <120> GnRH inserted STF2 recombinant protein and uses thereof <130> P2017-027 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 705 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 1 atcaacacta acagtctgtc gctgctgacc cagaataacc tgaacaaatc ccagtccgca 60 ctgggcaccg ctatcgagcg tctgtcttct ggtctgcgta tcaacagcgc gaaagacgat 120 gcggcaggtc aggcgattgc taaccgtttc accgcgaaca tcaaaggtct gactcaggct 180 tcccgtaacg ctaacgacgg tatctccatt gcgcagacca ctgaaggcgc gctgaacgaa 240 atcaacaaca acctgcagcg tgtgcgtgaa ctggcggttc agtctgctaa cagcaccaac 300 tcccagtctg acctcgactc catccaggct gaaatcaccc agcgcctgaa cgaaatcgac 360 cgtgtatccg gccagactca gttcaatggc gtgaaagtcc tggcgcagga caacaccctg 420 accatccagg ttggcgccaa cgacggtgaa actatcgata tcgatctgaa gcagatcaac 480 tctcagaccc tgggtctgga ctcactgaac gtgcagaaag cgtatgatgt gaaagataca 540 gcagtaacaa cgaaagctta tgccaataat ggtactacac tggacgtatc gggtcttgat 600 gatgcagcta ttaaagcggc tacgggtggt acgaatggta cggcttctgt aaccggtggt 660 gcggttaaat ttgacgcaga taataacaag tactttgtta ctatt 705 <210> 2 <211> 795 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 2 actggtgctg atgccgccaa aaatggcgat tatgaagtta acgttgctac tgacggtaca 60 gtaacccttg cggctggcgc aactaaaacc acaatgcctg ctggtgcgac aactaaaaca 120 gaagtacagg agttaaaaga tacaccggca gttgtttcag cagatgctaa aaatgcctta 180 attgctggcg gcgttgacgc taccgatgct aatggcgctg agttggtcaa aatgtcttat 240 accgataaaa atggtaagac aattgaaggc ggttatgcgc ttaaagctgg cgataagtat 300 tacgccgcag attacgatga agcgacagga gcaattaaag ctaaaactac aagttatact 360 gctgctgacg gcactaccaa aacagcggct aaccaactgg gtggcgtaga cggtaaaacc 420 gaagtcgtta ctatcgacgg taaaacctac aatgccagca aagccgctgg tcatgatttc 480 aaagcacaac cagagctggc ggaagcagcc gctaaaacca ccgaaaaccc gctgcagaaa 540 attgatgccg cgctggcgca ggtggatgcg ctgcgctctg atctgggtgc ggtacaaaac 600 cgtttcaact ctgctatcac caacctgggc aataccgtaa acaatctgtc tgaagcgcgt 660 agccgtatcg aagattccga ctacgcgacc gaagtttcca acatgtctcg cgcgcagatt 720 ctgcagcagg ccggtacttc cgttctggcg caggctaacc aggtcccgca gaacgtgctg 780 tctctgttac gttaa 795 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 ggtggcggta gt 12 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeI_STF2-1_F <400> 4 actagtggtg gcggtagtat caacactaac agtc 34 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bg1II_STF2-1_R <400> 5 agatctacta ccgccaccaa tagtaacaaa gtacttg 37 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XhoI_STF2-2_F <400> 6 ctcgagggtg gcggtagtac tggtgctgat gcc 33 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI_SacI_STF2-2_R <400> 7 tctagagagc tcttaacgta acagagacag ca 32 <210> 8 <211> 1536 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF2 recombinent gene cassette <400> 8 atcaacacta acagtctgtc gctgctgacc cagaataacc tgaacaaatc ccagtccgca 60 ctgggcaccg ctatcgagcg tctgtcttct ggtctgcgta tcaacagcgc gaaagacgat 120 gcggcaggtc aggcgattgc taaccgtttc accgcgaaca tcaaaggtct gactcaggct 180 tcccgtaacg ctaacgacgg tatctccatt gcgcagacca ctgaaggcgc gctgaacgaa 240 atcaacaaca acctgcagcg tgtgcgtgaa ctggcggttc agtctgctaa cagcaccaac 300 tcccagtctg acctcgactc catccaggct gaaatcaccc agcgcctgaa cgaaatcgac 360 cgtgtatccg gccagactca gttcaatggc gtgaaagtcc tggcgcagga caacaccctg 420 accatccagg ttggcgccaa cgacggtgaa actatcgata tcgatctgaa gcagatcaac 480 tctcagaccc tgggtctgga ctcactgaac gtgcagaaag cgtatgatgt gaaagataca 540 gcagtaacaa cgaaagctta tgccaataat ggtactacac tggacgtatc gggtcttgat 600 gatgcagcta ttaaagcggc tacgggtggt acgaatggta cggcttctgt aaccggtggt 660 gcggttaaat ttgacgcaga taataacaag tactttgtta ctattggtgg cggtagtaga 720 tctctcgagg gtggcggtag tactggtgct gatgccgcca aaaatggcga ttatgaagtt 780 aacgttgcta ctgacggtac agtaaccctt gcggctggcg caactaaaac cacaatgcct 840 gctggtgcga caactaaaac agaagtacag gagttaaaag atacaccggc agttgtttca 900 gcagatgcta aaaatgcctt aattgctggc ggcgttgacg ctaccgatgc taatggcgct 960 gagttggtca aaatgtctta taccgataaa aatggtaaga caattgaagg cggttatgcg 1020 cttaaagctg gcgataagta ttacgccgca gattacgatg aagcgacagg agcaattaaa 1080 gctaaaacta caagttatac tgctgctgac ggcactacca aaacagcggc taaccaactg 1140 ggtggcgtag acggtaaaac cgaagtcgtt actatcgacg gtaaaaccta caatgccagc 1200 aaagccgctg gtcatgattt caaagcacaa ccagagctgg cggaagcagc cgctaaaacc 1260 accgaaaacc cgctgcagaa aattgatgcc gcgctggcgc aggtggatgc gctgcgctct 1320 gatctgggtg cggtacaaaa ccgtttcaac tctgctatca ccaacctggg caataccgta 1380 aacaatctgt ctgaagcgcg tagccgtatc gaagattccg actacgcgac cgaagtttcc 1440 aacatgtctc gcgcgcagat tctgcagcag gccggtactt ccgttctggc gcaggctaac 1500 caggtcccgc agaacgtgct gtctctgtta cgttaa 1536 <210> 9 <211> 1548 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF2 recombinent gene cassette <400> 9 ggtggcggta gtatcaacac taacagtctg tcgctgctga cccagaataa cctgaacaaa 60 tcccagtccg cactgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ctggtctgcg tatcaacagc 120 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt tcaccgcgaa catcaaaggt 180 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360 aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaatg gcgtgaaagt cctggcgcag 420 gacaacaccc tgaccatcca ggttggcgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480 aagcagatca actctcagac cctgggtctg gactcactga acgtgcagaa agcgtatgat 540 gtgaaagata cagcagtaac aacgaaagct tatgccaata atggtactac actggacgta 600 tcgggtcttg atgatgcagc tattaaagcg gctacgggtg gtacgaatgg tacggcttct 660 gtaaccggtg gtgcggttaa atttgacgca gataataaca agtactttgt tactattggt 720 ggcggtagta gatctctcga gggtggcggt agtactggtg ctgatgccgc caaaaatggc 780 gattatgaag ttaacgttgc tactgacggt acagtaaccc ttgcggctgg cgcaactaaa 840 accacaatgc ctgctggtgc gacaactaaa acagaagtac aggagttaaa agatacaccg 900 gcagttgttt cagcagatgc taaaaatgcc ttaattgctg gcggcgttga cgctaccgat 960 gctaatggcg ctgagttggt caaaatgtct tataccgata aaaatggtaa gacaattgaa 1020 ggcggttatg cgcttaaagc tggcgataag tattacgccg cagattacga tgaagcgaca 1080 ggagcaatta aagctaaaac tacaagttat actgctgctg acggcactac caaaacagcg 1140 gctaaccaac tgggtggcgt agacggtaaa accgaagtcg ttactatcga cggtaaaacc 1200 tacaatgcca gcaaagccgc tggtcatgat ttcaaagcac aaccagagct ggcggaagca 1260 gccgctaaaa ccaccgaaaa cccgctgcag aaaattgatg ccgcgctggc gcaggtggat 1320 gcgctgcgct ctgatctggg tgcggtacaa aaccgtttca actctgctat caccaacctg 1380 ggcaataccg taaacaatct gtctgaagcg cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg 1440 accgaagttt ccaacatgtc tcgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ttccgttctg 1500 gcgcaggcta accaggtccc gcagaacgtg ctgtctctgt tacgttaa 1548 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 10 gaacattggt catatggact acggccggga 30 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 11 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII_GnRH6_F <400> 12 gtgctgtctc tgttacgtag atctgaa 27 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XhoI_GnRH6_R <400> 13 gagtccaact cgagattaag ctttcccgg 29 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRHI_InFusion_F <400> 14 aaagcttaat ctcgagagta gatctgaaca t 31 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRHI_InFusion_R <400> 15 taccgccacc ctcgagatta agc 23 <210> 16 <211> 1941 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF2-1_12xGnRH_STF2-2 <400> 16 atcaacacta acagtctgtc gctgctgacc cagaataacc tgaacaaatc ccagtccgca 60 ctgggcaccg ctatcgagcg tctgtcttct ggtctgcgta tcaacagcgc gaaagacgat 120 gcggcaggtc aggcgattgc taaccgtttc accgcgaaca tcaaaggtct gactcaggct 180 tcccgtaacg ctaacgacgg tatctccatt gcgcagacca ctgaaggcgc gctgaacgaa 240 atcaacaaca acctgcagcg tgtgcgtgaa ctggcggttc agtctgctaa cagcaccaac 300 tcccagtctg acctcgactc catccaggct gaaatcaccc agcgcctgaa cgaaatcgac 360 cgtgtatccg gccagactca gttcaatggc gtgaaagtcc tggcgcagga caacaccctg 420 accatccagg ttggcgccaa cgacggtgaa actatcgata tcgatctgaa gcagatcaac 480 tctcagaccc tgggtctgga ctcactgaac gtgcagaaag cgtatgatgt gaaagataca 540 gcagtaacaa cgaaagctta tgccaataat ggtactacac tggacgtatc gggtcttgat 600 gatgcagcta ttaaagcggc tacgggtggt acgaatggta cggcttctgt aaccggtggt 660 gcggttaaat ttgacgcaga taataacaag tactttgtta ctattggtgg cggtagtaga 720 tctgaacatt ggtcatatgg actacggccg ggagaacatt ggtcatatgg actacggccg 780 ggagaacatt ggtcatatgg actacggccg ggaggtaccg aacattggtc atatggacta 840 cggccgggag aacattggtc atatggacta cggccgggag aacattggtc atatggacta 900 cggccgggaa agcttaatct cgagagtaga tctgaacatt ggtcatatgg actacggccg 960 ggagaacatt ggtcatatgg actacggccg ggagaacatt ggtcatatgg actacggccg 1020 ggaggtaccg aacattggtc atatggacta cggccgggag aacattggtc atatggacta 1080 cggccgggag aacattggtc atatggacta cggccgggaa agcttaatct cgagggtggc 1140 ggtagtactg gtgctgatgc cgccaaaaat ggcgattatg aagttaacgt tgctactgac 1200 ggtacagtaa cccttgcggc tggcgcaact aaaaccacaa tgcctgctgg tgcgacaact 1260 aaaacagaag tacaggagtt aaaagataca ccggcagttg tttcagcaga tgctaaaaat 1320 gccttaattg ctggcggcgt tgacgctacc gatgctaatg gcgctgagtt ggtcaaaatg 1380 tcttataccg ataaaaatgg taagacaatt gaaggcggtt atgcgcttaa agctggcgat 1440 aagtattacg ccgcagatta cgatgaagcg acaggagcaa ttaaagctaa aactacaagt 1500 tatactgctg ctgacggcac taccaaaaca gcggctaacc aactgggtgg cgtagacggt 1560 aaaaccgaag tcgttactat cgacggtaaa acctacaatg ccagcaaagc cgctggtcat 1620 gatttcaaag cacaaccaga gctggcggaa gcagccgcta aaaccaccga aaacccgctg 1680 cagaaaattg atgccgcgct ggcgcaggtg gatgcgctgc gctctgatct gggtgcggta 1740 caaaaccgtt tcaactctgc tatcaccaac ctgggcaata ccgtaaacaa tctgtctgaa 1800 gcgcgtagcc gtatcgaaga ttccgactac gcgaccgaag tttccaacat gtctcgcgcg 1860 cagattctgc agcaggccgg tacttccgtt ctggcgcagg ctaaccaggt cccgcagaac 1920 gtgctgtctc tgttacgtta a 1941 <210> 17 <211> 1953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF2-1_12xGnRH_STF2-2 <400> 17 ggtggcggta gtatcaacac taacagtctg tcgctgctga cccagaataa cctgaacaaa 60 tcccagtccg cactgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ctggtctgcg tatcaacagc 120 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt tcaccgcgaa catcaaaggt 180 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360 aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaatg gcgtgaaagt cctggcgcag 420 gacaacaccc tgaccatcca ggttggcgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480 aagcagatca actctcagac cctgggtctg gactcactga acgtgcagaa agcgtatgat 540 gtgaaagata cagcagtaac aacgaaagct tatgccaata atggtactac actggacgta 600 tcgggtcttg atgatgcagc tattaaagcg gctacgggtg gtacgaatgg tacggcttct 660 gtaaccggtg gtgcggttaa atttgacgca gataataaca agtactttgt tactattggt 720 ggcggtagta gatctgaaca ttggtcatat ggactacggc cgggagaaca ttggtcatat 780 ggactacggc cgggagaaca ttggtcatat ggactacggc cgggaggtac cgaacattgg 840 tcatatggac tacggccggg agaacattgg tcatatggac tacggccggg agaacattgg 900 tcatatggac tacggccggg aaagcttaat ctcgagagta gatctgaaca ttggtcatat 960 ggactacggc cgggagaaca ttggtcatat ggactacggc cgggagaaca ttggtcatat 1020 ggactacggc cgggaggtac cgaacattgg tcatatggac tacggccggg agaacattgg 1080 tcatatggac tacggccggg agaacattgg tcatatggac tacggccggg aaagcttaat 1140 ctcgagggtg gcggtagtac tggtgctgat gccgccaaaa atggcgatta tgaagttaac 1200 gttgctactg acggtacagt aacccttgcg gctggcgcaa ctaaaaccac aatgcctgct 1260 ggtgcgacaa ctaaaacaga agtacaggag ttaaaagata caccggcagt tgtttcagca 1320 gatgctaaaa atgccttaat tgctggcggc gttgacgcta ccgatgctaa tggcgctgag 1380 ttggtcaaaa tgtcttatac cgataaaaat ggtaagacaa ttgaaggcgg ttatgcgctt 1440 aaagctggcg ataagtatta cgccgcagat tacgatgaag cgacaggagc aattaaagct 1500 aaaactacaa gttatactgc tgctgacggc actaccaaaa cagcggctaa ccaactgggt 1560 ggcgtagacg gtaaaaccga agtcgttact atcgacggta aaacctacaa tgccagcaaa 1620 gccgctggtc atgatttcaa agcacaacca gagctggcgg aagcagccgc taaaaccacc 1680 gaaaacccgc tgcagaaaat tgatgccgcg ctggcgcagg tggatgcgct gcgctctgat 1740 ctgggtgcgg tacaaaaccg tttcaactct gctatcacca acctgggcaa taccgtaaac 1800 aatctgtctg aagcgcgtag ccgtatcgaa gattccgact acgcgaccga agtttccaac 1860 atgtctcgcg cgcagattct gcagcaggcc ggtacttccg ttctggcgca ggctaaccag 1920 gtcccgcaga acgtgctgtc tctgttacgt taa 1953 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pQE40_STF2_InFusion_F <400> 18 tcaccatcac ggatccatca acactaacag t 31 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pQE40_STF2_InFusion_R <400> 19 tcagctaatt aagctgagct cttaacgtaa 30 <210> 20 <211> 658 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STF2-1_12xGnRH_STF2-2 <400> 20 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Asn Thr Asn 120 124 129 134 Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala 139 144 149 Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser 154 159 164 Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala 169 174 179 Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile 184 189 194 199 Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn 204 209 214 Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn 219 224 229 Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu 234 239 244 Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys 249 254 259 Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp 264 269 274 279 Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu 284 289 294 Gly Leu Asp Ser Leu Asn Val Gln Lys Ala Tyr Asp Val Lys Asp Thr 299 304 309 Ala Val Thr Thr Lys Ala Tyr Ala Asn Asn Gly Thr Thr Leu Asp Val 314 319 324 Ser Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ile Lys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Asn 329 334 339 Gly Thr Ala Ser Val Thr Gly Gly Ala Val Lys Phe Asp Ala Asp Asn 344 349 354 359 Asn Lys Tyr Phe Val Thr Ile Gly Gly Gly Ser Arg Ser Glu His Trp 364 369 374 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 379 384 389 Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Thr Glu His Trp 394 399 404 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 409 414 419 Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Lys Leu Asn Leu Glu 424 429 434 439 Ser Arg Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp 444 449 454 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 459 464 469 Gly Gly Thr Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp 474 479 484 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 489 494 499 Gly Lys Leu Asn Leu Glu Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ala Asp Ala Ala 504 509 514 519 Lys Asn Gly Asp Tyr Glu Val Asn Val Ala Thr Asp Gly Thr Val Thr 524 529 534 Leu Ala Ala Gly Ala Thr Lys Thr Thr Met Pro Ala Gly Ala Thr Thr 539 544 549 Lys Thr Glu Val Gln Glu Leu Lys Asp Thr Pro Ala Val Val Ser Ala 554 559 564 Asp Ala Lys Asn Ala Leu Ile Ala Gly Gly Val Asp Ala Thr Asp Ala 569 574 579 Asn Gly Ala Glu Leu Val Lys Met Ser Tyr Thr Asp Lys Asn Gly Lys 584 589 594 599 Thr Ile Glu Gly Gly Tyr Ala Leu Lys Ala Gly Asp Lys Tyr Tyr Ala 604 609 614 Ala Asp Tyr Asp Glu Ala Thr Gly Ala Ile Lys Ala Lys Thr Thr Ser 619 624 629 Tyr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Thr Lys Thr Ala Ala Asn Gln Leu Gly 634 639 644 Gly Val Asp Gly Lys Thr Glu Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Thr Tyr 649 654 659 Asn Ala Ser Lys Ala Ala Gly His Asp Phe Lys Ala Gln Pro Glu Leu 664 669 674 679 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp 684 689 694 Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val 699 704 709 Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn 714 719 724 Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr 729 734 739 Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr 744 749 754 759 Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu 764 769 774 Leu Arg <210> 21 <211> 1521 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 21 atggcacaag taatcaacac taacagtctg tcgctgctga cccagaataa cctgaacaaa 60 tcccagtccg cactgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ctggtctgcg tatcaacagc 120 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt tcaccgcgaa catcaaaggt 180 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360 aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420 gacaacaccc tgaccatcca ggttggcgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480 aagcagatca actctcagac cctgggtctg gactcactga acgtgcagaa agcgtatgat 540 gtgaaagata cagcagtaac aacgaaagct tatgccaata atggtactac actggacgta 600 tcgggtcttg atgatgcagc tattaaagcg gctacgggtg gtacgaatgg tacggcttct 660 gtaaccggtg gtgcggttaa atttgacgca gataataaca agtactttgt tactattggt 720 ggctttactg gtgctgatgc cgccaaaaat ggcgattatg aagttaacgt tgctactgac 780 ggtacagtaa cccttgcggc tggcgcaact aaaaccacaa tgcctgctgg tgcgacaact 840 aaaacagaag tacaggagtt aaaagataca ccggcagttg tttcagcaga tgctaaaaat 900 gccttaattg ctggcggcgt tgacgctacc gatgctaatg gcgctgagtt ggtcaaaatg 960 tcttataccg ataaaaatgg taagacaatt gaaggcggtt atgcgcttaa agctggcgat 1020 aagtattacg ccgcagatta cgatgaagcg acaggagcaa ttaaagctaa aactacaagt 1080 tatactgctg ctgacggcac taccaaaaca gcggctaacc aactgggtgg cgtagacggt 1140 aaaaccgaag tcgttactat cgacggtaaa acctacaatg ccagcaaagc cgctggtcat 1200 gatttcaaag cacaaccaga gctggcggaa gcagccgcta aaaccaccga aaacccgctg 1260 cagaaaattg atgccgcgct ggcgcaggtg gatgcgctgc gctctgatct gggtgcggta 1320 caaaaccgtt tcaactctgc tatcaccaac ctgggcaata ccgtaaacaa tctgtctgaa 1380 gcgcgtagcc gtatcgaaga ttccgactac gcgaccgaag tttccaacat gtctcgcgcg 1440 cagattctgc agcaggccgg tacttccgtt ctggcgcagg ctaaccaggt cccgcagaac 1500 gtgctgtctc tgttacgtta a 1521 <210> 22 <211> 506 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 22 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 85 90 95 Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile 100 105 110 Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly 115 120 125 Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu 130 135 140 Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu 145 150 155 160 Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Ser Leu Asn Val Gln 165 170 175 Lys Ala Tyr Asp Val Lys Asp Thr Ala Val Thr Thr Lys Ala Tyr Ala 180 185 190 Asn Asn Gly Thr Thr Leu Asp Val Ser Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ile 195 200 205 Lys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ala Ser Val Thr Gly Gly 210 215 220 Ala Val Lys Phe Asp Ala Asp Asn Asn Lys Tyr Phe Val Thr Ile Gly 225 230 235 240 Gly Phe Thr Gly Ala Asp Ala Ala Lys Asn Gly Asp Tyr Glu Val Asn 245 250 255 Val Ala Thr Asp Gly Thr Val Thr Leu Ala Ala Gly Ala Thr Lys Thr 260 265 270 Thr Met Pro Ala Gly Ala Thr Thr Lys Thr Glu Val Gln Glu Leu Lys 275 280 285 Asp Thr Pro Ala Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Asn Ala Leu Ile Ala 290 295 300 Gly Gly Val Asp Ala Thr Asp Ala Asn Gly Ala Glu Leu Val Lys Met 305 310 315 320 Ser Tyr Thr Asp Lys Asn Gly Lys Thr Ile Glu Gly Gly Tyr Ala Leu 325 330 335 Lys Ala Gly Asp Lys Tyr Tyr Ala Ala Asp Tyr Asp Glu Ala Thr Gly 340 345 350 Ala Ile Lys Ala Lys Thr Thr Ser Tyr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Thr 355 360 365 Lys Thr Ala Ala Asn Gln Leu Gly Gly Val Asp Gly Lys Thr Glu Val 370 375 380 Val Thr Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Asn Ala Ser Lys Ala Ala Gly His 385 390 395 400 Asp Phe Lys Ala Gln Pro Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Thr Thr 405 410 415 Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala 420 425 430 Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile 435 440 445 Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg 450 455 460 Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala 465 470 475 480 Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln 485 490 495 Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 500 505 <210> 23 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12xGnRH <400> 23 gaacattggt catatggact acggccggga gaacattggt catatggact acggccggga 60 gaacattggt catatggact acggccggga ggtaccgaac attggtcata tggactacgg 120 ccgggagaac attggtcata tggactacgg ccgggagaac attggtcata tggactacgg 180 ccgggaaagc ttaatctcga gagtagatct gaacattggt catatggact acggccggga 240 gaacattggt catatggact acggccggga gaacattggt catatggact acggccggga 300 ggtaccgaac attggtcata tggactacgg ccgggagaac attggtcata tggactacgg 360 ccgggagaac attggtcata tggactacgg ccggga 396

Claims (14)

1. 서열번호 1로 표시되는 STF2(salmonella typhimurium flagellin fljB)의 N 말단 단편 유전자, 링커를 암호화하는 유전자, GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 12개 연결되도록 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 STF2의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자로부터 암호화되는 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 포함하는, 면역 거세용 백신 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는, 면역 거세용 백신 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 GnRH가 12개 연결되도록 암호화하는 유전자는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열로 이루어진, 면역 거세용 백신 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 16로 표시되는 염기서열로 이루어진, 면역 거세용 백신 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 면역 거세용 백신 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 아쥬반트(adjuvant)를 추가적으로 포함하는, 백신 조성물.
    
13. 제1항 내지 제5항, 또는 제12항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법.
    
14. 제 13항에 있어서, 상기 동물은 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 산양, 쥐, 말, 사슴, 원숭이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 하이에나, 들개, 치타, 표범, 재규어, 코끼리, 물소, 살쾡이, 고슴도치, 두더지, 돼지, 다람쥐, 청설모, 오소리, 너구리, 오리너구리, 나무늘보, 반달곰, 흰곰, 불곰, 팬더, 날다람쥐, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄,노루, 코뿔소, 담비, 수달, 바다표범, 물개, 물곰, 바다코끼리, 고래 또는 돌고래인, 동물의 면역 거세 방법.
    

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