NO318018B1 - Vaksinebehandling - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører vaksineblanding som inneholder svekkede bakterier.

I senere år har det fremkommet en ny generasjon av levende, orale salmonellavaksiner basert på stammer av Salmonella som er blitt svekket ved innføring av en ikke-reverterende mutasjon i et gen i den aromatiske, biosyntetiske mekanisme i bakterien. Slike stammer er beskrevet f.eks. i EP-A-0322237. De forannevnte, levende, orale salmonellavaksiner er lovende som vaksiner for salmonellose hos mennesker og dyr, og de kan også anvendes effektivt som bærere for avgivelse av heterologe antigener til immunsystemet. Kombinerte salmonellavaksiner er blitt anvendt til å avgi antigener fra virus, bakterier og parasitter, under fremkalling av sekretoriske, humorale og cellemedierte immunresponser på de rekombinante antigener. Kombinerte salmonellavaksiner har stort potensiale som enkelt-dose, orale multivaksine-avgivelsessystemer [.C. Hormaeche et al., FEMS Symposium nr. 63, Plenum, New York; s.71-83,1992].

Det er problemer som må overvinnes ved utvikling av kombinerte salmonellavaksiner. En hovedfaktor er å oppnå et høyt ekspresjonsnivå av det rekombinante antigen i salmonella-vaksinen, slik at det vil være tilstrekkelig til å utløse en immunrespons. Ikke-regulert ekspresjon på høyt nivå av fremmede antigener kan imidlertid være toksisk og påvirke cellenes levedyktighet [I. Charles og G. Dougan, TIBTECH 8, s 117-21,1990], og gjøre vaksinen uvirksom eller forårsake tap det rekombinante DNA. Flere mulige løsninger på dette problem er blitt beskrevet, som f.eks. ekspresjon fra plasmider som har essensielle gener, "on-off" promotorer eller inkorporering av de fremmede gener i salmonellakromosomet.

En alternativ fremgangsmåte for å overvinne det forannevnte problem, ville være å anvende en promotor som er induserbar in vivo. og en slik promotor er E. coli nitritt reduktase-promotoren nirB som induseres under anaerobiose og har vært anvendt i bioteknologien for fremstilling av tetanus toksinfragment C (TetC)

av Clostridium tetani [M.D. Oxer et al., Nucl. Ac. Res., 19, s 2889-92, 1991]. Det er tidligere blitt funnet av oppfinnerne av denne søknad [S.N. Chatfield et al., Bio/Technology, Vol. 10, s 888-92 1992] at en Aro Salmonella som har en konstruksjon som uttrykker TetC fra nirB promotoren (pTETnir15) fremkalte svært høye antitetanus antistoff responser hos mus. Artikkelen av Chatfield et al., ble publisert etter prioritetsdatoen for denne søknad.

Vi har imidlertid også funnet at når det ble forsøkt å uttrykke P28 antigenet fra Schistosoma mansoni alene fra nirB. var den resulterende konstruksjon ikke immunogen.

Tetanus toksoid har vært anvendt i stor utstrekning som et adjuvans for kjemisk koblede gjeste-epitoper [D.A. Herrington et al., Nature, 328. s 257-9 1987]. Den sterke immunogenitet av TetC i Salmonella antydet for oss at det kan være mulig å utnytte denne egenskap til å befordre immun-responsen av gjestepeptidene eller -proteinene. Sammensmelting av to proteiner fører imidlertid ofte til et ikke korrekt sammenfoldet, kimært protein som ikke lenger beholder de individuelle komponenters egenskaper. For eksempel er B-underenheten av Vibrio cholerae (CT-B) og E. coli (LT-B) enterotoksinene kraftige, mukosale immunogener, men genetiske fusjoner til disse underenheter kan forandre bærerens struktur og egenskaper, og følgelig deres immunogenitet [se M. Sandkvist et al., J. Bacteriol. 169, s 4570-6,1987, Clements 1990 og M. Lipscombe et al., Mol. Microbiol 5, s 1385,1990]. Dessuten blir mange heterologe gener uttrykt i bakterier ikke fremstilt i løselige, korrekt foldede, eller aktive former, og har tendens til å akkumulere som uløselige aggregater [se C. Schein et al., Bio/Technology 6, s 291-4,1988 og R. Halenbeck et al., Bio/technology 7, s 710-5, 1989].

Det er et formål ifølge denne oppfinnelse å overvinne de foran nevnte problemer.

Vi har nå funnet at effektiv ekspresjon av rekombinante antigener, og særlig fusjonsproteiner, kan oppnås i bakterier som salmonellae. ved anvendelse av en induserbar promotor som for eksempel nirB og ved inkorporering av en fleksibel hengselregion mellom to antigenkomponenter av fusjonsproteinet. Det har vært vist at de resulterende rekombinante antigener har god immunogenitet. Det er også blitt funnet, overraskende, at det kan oppnås øket ekspresjon av et protein, når et gen som koder for proteinet er bundet til genet for tetanus toksin C fragment.

Følgelig, i et første aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en vaksineblanding omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og en svekket bakterie inneholdende en DNA-konstruksjon omfattende en promotor som er i stand til å frembringe ekspresjon av en sekvens under, og har aktivitet som induseres under, anaerobe betingelser, idet promotoren er operabelt knyttet til en DNA-sekvens som koder for første og andre proteiner sammenknyttet av en kjede aminosyrer som utgjør en hengselregion.

En foretrukket promotor er NirB-promotoren eller en del eller derivat derav som er i stand til å frembringe ekspresjon av en sekvens under anaerobe betingelser. Andre spesielle og foretrukne aspekter av foreliggende oppfinnelse er definert i de avhengige kravene her vedlagt.

Det første og andre protein er fortrinnsvis heterologe proteiner, og kan spesielt være polypeptidimmunogener; for eksempel kan de være antigen-sekvenser avledet fra et virus, en bakterie, en sopp, gjær eller parasitt. Særlig blir det foretrukket at det første nevnte protein er en antigensekvens omfattende tetanus toksin fragment C eller epitoper derav.

Det andre protein er fortrinnsvis en antigen determinant av en patogen organisme. For eksempel kan den antigene determinant være en antigensekvens avledet fra et virus, en bakterie, sopp, gjær eller parasitt.

Eksempler på virusantigensekvenser som det første og/eller andre heterologe protein er sekvenser avledet fra en type av humant immunsviktvirus (HIV) som for eksempel HIV-1 eller HlV-2, CD4 reseptorbindingssete fra HIV, for eksempel fra HIV-1 eller -2, hepatitt A eller B virus, humant rhino-virus som for eksempel type 2 eller type 14, Herpes simplex virus, poliovirus type 2 eller 3, munn- og klovsykevirus (FMDV), rabiesvirus, rotavirus, influensavirus, coxackie-virus, humant papillomavirus (HPV), for eksempel type 16 papillomavirus, E7 proteinet derav, og fragmenter inneholdende E7 proteinet eller dets epitoper; og simian immunsviktvirus (SIV). Eksempler på antigener avledet fra bakterier er de som er avledet fra Bordetella pertussis (f.eks. P69 protein og filament hemagglutinin (FHA) antigener), Vibrio cholerae, Bacillus anathracis, og E. coli antigener som f.eks. E. coli varmelabil toksin B underenhet (LT-B), E. coli K88 antigener, og enterotoksigenet E. coli antigener. Andre eksempler på antigener omfatter celleoverflateantigenet CD4, Schistosoma mansoni P28 glutation S-transferase antigener (P28 antigener) og antigener av ikter, mykoplasma, rundormer, bendel-ormer, Chlam<y>dia trachomatis. og malariaparasitter, f.eks. parasitter av slekten plasmodium eller babesia, f.eks. Plasmodium falciparum. og peptider som koder for immunogene epitoper fra de forannevnte antigener.

Særlige antigener omfatter Schistosoma mansoni P28 i full lengde, og oligomerer (f.eks. 2, 4 og 8-merer) av det immuno-gene P28 aa 115-131 peptid

(som inneholder både en B- og T-celle-epitop), og humant papillomavirus E7 protein, Herpes simplex antigener, munn- og klovsykevirusantigener og simian immunsviktvirusantigener.

Promotorsekvensen er en som har aktivitet som induseres som respons på en forandring i det omgivende miljø, og et eksempel på en slik promotorsekvens er en som har aktivitet som induseres av anaerobe betingelser. Et spesielt eksempel på en slik promotorsekvens er nirB promotoren som er beskrevet, f.eks. i internasjonal patentsøknad PCT/GB92/00387. NirB promotoren er blitt isolert fra E. coli. hvor den styrer ekspresjon av et operon som omfatter nitrittreduktase-genet njrB (Jayaraman et al., J.Moi. Biol. 196, 781-788,1987), og nirD. nirC. cvsG (Peakman et al., Eur. J. Biochem. 191, 315-323,1990). Den reguleres både av nit ritt og av forandringer i oksygentrykket i miljøet, og blir aktiv når den utarmes på oksygen (Cole, Biochem, Biophys. Acta. 162. 356-368, 1968). Respons på anaerobiose blir befordret gjennom proteinet FN R, som virker som en transkripsjonsaktivator, i en mekanisme felles for mange anaerobe respiratoriske gener. Ved delesjon og mutasjonsanalyse er den del av promotoren som gir respons utelukkende på anaerobiose, blitt isolert, og ved sammenligning med andre anaerobisk regulerte promotorer, er det identifisert et konsensus FNR bindingssete (Bell et al., Nucl. Acids. Res. 17, 3865-3874,1989; Jayaraman et al., Nucl. Acids, Res. 17,135-145, 1989). Det er også blitt vist at avstanden mellom det mulige FNR bindingssetet og -10 homologi-regionen er kritisk (Bell et al., Molec. Microbiol. 4,1753-1763,1990). Det blir derfor foretrukket å anvende bare den del av nirB promotoren som gir respons utelukkende på anaerobiose. Som anvendt heri skal referanser til nirB promotoren referere til selve promotoren eller en del eller et derivat derav som er i stand til å befordre ekspresjon av en kodesekvens under anaerobe betingelser. Den foretrukne sekvens, og som inneholder nirB promotoren, er: AATTCAGGTAAATT-TGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGG CC (SEK ID NR: 1).

Hengselregionen er en region utformet til å befordre den uavhengige folding av både det første og andre protein ved å tilveiebringe både romlig og temporal separasjon mellom domenene.

Hengselregionen er typisk en sekvens som koder for en høy andel av prolin og/eller glycin-aminosyrer. Hengselregionen kan være sammensatt fullstendig av prolin og/eller glycin-aminosyrer. Hengselregionen kan omfatte én eller flere glycin-prolindipeptidenheter.

Hengselregionen kan f.eks. inneholde opp til ca. 15 aminosyrer, f.eks. minst 4, og fortrinnsvis 6 til 14 aminosyrer, idet antallet aminosyrer er slik at det gir fleksibilitet mellom det første og andre protein.

I en utførelse kan hengselregionen tilsvare i alt vesentlig hengseldomenet i

et antistoff immunoglobulin. Særlig vil hengselregionene av IgG antistoffer være rike på proliner [T.E. Michaelson et al., J. Biol. Chem. 252, 833-9, 1977], som blir antatt å tilveiebringe en fleksibel forbindelse mellom de antigenbindende og hale-domenene.

Uten å ønske å være bundet av noen som helst teori, blir prolinene antatt å danne den stive del av hengselet, ettersom ringstrukturen karakteristisk for denne aminosyren, vil hindre rotasjon omkring peptidbindingen som man forbinder prolin-resten med en nabo-aminosyre. Denne egenskap blir antatt å forhindre prolin, og naborester, fra å adoptere den ordnede struktur av en alfa-heliks eller beta-streng. Fleksibilitet blir antatt å skyldes glycin, den enkleste aminosyre, med svært begrenset sterisk behov. Glycin antas å fungere som en fleksibel albu i hengselet. Andre aminosyrer kan være substituert for glycin, særlig de uten voluminøse sidekjeder, som f.eks. alanin, serin, asparagin og treonin.

I en foretrukket utførelse er hengselregionen en kjede av fire eller flere aminosyrer som definerer sekvensen

hvor Pro er prolin, X og Y begge er glycin eller en aminosyre som har en ikke-voiuminøs sidekjede; Z er en hvilken som helst aminosyre; p er et positivt, helt tall; q er et positivt, helt tall på fra 1 til 10; og r er 0 eller et positivt, helt tall større enn 0.

Hengselregionen kan være en bestemt region heterolog med både det første og andre protein eller kan defineres ved en karboksyendedel av det første protein eller en aminoendedel av det andre protein.

Kodoner som sjelden blir anvendt i E. coli [H.Grosjean et al., Gene 18, 199-209,1982] og Salmonella blir valgt til å kode for hengselet, ettersom slike sjeldne kodoner blir ansett å forårsake ribosomal pausering under translasjon av bud-bringer RNA og tillate den korrekte folding av polypeptid-domener [I.J. Purvis et al., J. Mol. Biol. 193, 413-7, 1987]. Hvor det er mulig, blir det dessuten valgt restriksjonsenzymer for kloningsregionen, som når de translateres i den resulterende fusjon, ikke koder for voluminøse eller lavere sidegrupper.

I et foretrukket aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse nirB-promotorsekvensen operabelt sammenlenket med en DNA-sekvens som koder for første og andre polypeptid-immunogener sammenlenket med en hengselregion, hvori det første polypeptid-immunogen omfatter tetanus toksinfragmet C eller epitoper derav.

Det er blitt funnet at ved å tilveiebringe en DNA-sekvens som koder for tetanus toksin fragment C (TetC) sammenlenket via en hengselregion med en andre sekvens som koder for et antigen, blir ekspresjonen av sekvensen i bakterieceller øket i forhold til konstruksjoner hvori fragment C og hengselregionen er fraværende. Ekspresjonsnivået av P28 proteinet i full lengde av S. mansoni når det ble uttrykt som en fusjon med TetC, var for eksempel høyere enn når P28 proteinet ble uttrykt alene fra nirB-promotoren. TetC fusjonene med P28 proteinet i full lengde av S. mansoni og dets tandem epitoper var alle løselige og ble uttrykt i både E. coli og S. tv<p>himurium. TetC-P28 fusjonsproteinet var dessuten i stand til å bli affinitetsrenset med en glutation agarosematriks, hvilket antyder at P28 hadde foldet seg korrekt til å adoptere en konformasjon som fremdeles var i stand til å binde seg til sitt naturlige substrat.

Stabil ekspresjon av det første og andre heterologe protein sammenlenket ved hengselregionen kan oppnås in vivo. De heterologe proteiner kan uttrykkes i en svekket bakterie som således kan anvendes som vaksine.

Den svekkede bakterie kan velges fra slektene Salmonella. Bordetella. Vibrio. Haemophilus. Neisseria og Yersinia. Alternativt kan den svekkede bakterie være en svekket stamme av enterotoksigen Escherichi coli. Særlig følgende arter kan nevnes: S. t<yp>hi - årsaken til human tyfoid feber; S. typhimurium - årsaken til salmonellose i flere dyrearter; S, enteritidis - en årsak til matforgiftning hos mennesker; S. choleraesuis - en årsak til salmonellose hos svin; Bordetella <p>ertussis - årsaken til kikhoste; Haemophilus influenzae - en årsak til meningitt; Neisseria <g>onorrhoeae - årsaken til gonorre; og Yersinia - en årsak til matforgiftning.

Svekkingen av bakterien kan forklares ved en ikke-reverterende mutasjon i et gen i den biosyntetiske mekanisme for aromatisk aminosyre i bakterien. Det er minst 10 gener involvert i syntesen av chorismat, forbindelsen i forgreningspunktet i biosyntesemekanismen for den aromatiske aminosyre. Flere av disse finnes på vidt forskjellige lokasjoner på bakteriegenomet, f.eks. aroA (5-enolpyruvylshikimat-3-fosfat-syntase), aroC (chorismat syntase), aroD (3-dihydroquinat dehydratase) og aroE (shikimat dehydrogenase). En mutasjon kan derfor forekomme i aroA. aroC. aroD. eller aroE genet.

Fortrinnsvis vil imidlertid en svekket bakterie ha en ikke-reverterende mutasjon i hver av 2 atskilte gener i sin biosyntesemekanisme for aromatisk aminosyre. Slike bakterier er beskrevet i EP-A-0322237. Doble aro-mutanter som er egnet er a ro A aroC. aroA aroD. og aroA aroE. Andre bakterier som har mutasjoner i andre kombinasjoner av aroA. aroC. aroD og aroE genene er imidlertid anvendelige. Særlig foretrukket er Salmonella doble aro mutanter, for eksempel doble aro mutanter av S. typhi eller S. tvphimurium. særlig aroA aroC. aroA aroD og aroA aroE mutanter. Alternativt kan den svekkede bakterie ha en ikke-reverterende mutasjon i et gen som vedrører reguleringen av ett eller flere andre gener (EP-A-0400958). Fortrinnsvis vil mutasjonen foregå i om<p>R genet eller et annet gen involvert i regulering. Det er et stort antall andre gener som er involvert i regulering, og er kjent for å gi respons på miljømessige stimuli (Ronson et al., Cell 49, 579-581).

Denne type av svekket bakterie kan ha en annen mutasjon i et annet gen. Fortrinnsvis vil det andre gen være et gen som koder for et enzym involvert i en essensiel biosyntesemekanisme, særlig gener involvert i prechorismat-mekanismen involvert i biosyntesen av aromatiske forbindelser. Den andre mutasjon er derfor fortrinnsvis i aroA. aroC eller aroD genet.

En annen type av svekket bakterie er en hvor svekkelsen bringes i stand ved tilstedeværelsen av en ikke-reverterende mutasjon i DNA av den bakterie som koder, eller som regulerer ekspresjonen av DNA som koder for et protein som frembringes som respons på miljømessig påkjenning. Slike bakterier er beskrevet i WO 91/15572. Den ikke-reverterende mutasjon kan være en delesjon, et innskudd, en inversjon eller substitusjon. En delesjonsmutasjon kan dannes ved anvendelse av et transposon.

Fusjonsproteiner (fortrinnsvis i alt vesentlig i ren form) uttrykt ved bakterien, anvendes ved fremstillingen av vaksinen. For eksempel har man funnet at et renset TetC-P28 fusjonsprotein vil være immunogent i seg selv. Oppfinnelsen tilveiebringer et vaksinepreparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, og som aktiv bestanddel, en svekket bakterie eller et fusjonsprotein som definert heri tidligere.

Vaksineblandingen kan omfatte ett eller flere egnede adjuvanser.

Vaksineblandingen presenteres fortrinnsvis i lyof ilisert form, for eksempel i kapselform, for oral administrering til en pasient. Slike kapsler kan tilveiebringes med et enterisk belegg omfattende for eksempel Eudragit "S", Eudragit "L", cellulose-acetat, celluloseacetat-ftalat eller hydroksypropylmetyl-cellulose. Disse kapsler kan anvendes som sådanne, eller alternativt kan det lyofiliserte materiale rekonstitueres før administrering, for eksempel som en suspensjon. Rekonstitu-sjon gjennomføres fordelaktig i buffer ved egnet pH for å sikre organismenes levedyktighet. For å beskytte de svekkede bakterier og vaksinen mot mågens surhet, administreres fordelaktig et natriumhydrogenkarbonat-preparat før hver administrering av vaksinen. Alternativt kan vaksinen fremstilles for parenteral administrering, intranasal administrering, eller administrering i brystene.

Vaksineblandingen ifølge denne oppfinnelse, kan anvendes ved profylaktisk behandling av en vert, særlig en human vert, men også muligvis en dyrevert. En infeksjon forårsaket av en mikroorganisme, særlig et patogen, kan derfor forebygges ved administrering av en effektiv dose av en svekket bakterie i en vaksineblanding ifølge denne oppfinnelse. Bakterien vil da uttrykke et heterologt protein eller heterologe proteiner som er i stand til å fremstille antistoff mot mikroorganismen. Den anvendte dosering vil være avhengig av forskjellige faktorer omfattende vertens størrelse og vekt, typen av den formulerte vaksine og karakteren av det heterologe protein.

En svekket bakterie i vaksineblandingen ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles ved transformering av en svekket bakterie med en DNA-konstruksjon som definert heri tidligere. En hvilken som helst egnet transformeringsteknikk kan anvendes, som for eksempel elektroporering. På denne måten kan det oppnås en svekket bakterie som er i stand til å uttrykke et protein eller flere proteiner som er heterologe med bakterien. En kultur av den svekkede bakterie kan dyrkes under aerobe betingelser. En tilstrekkelig mengde av bakterien fremstilles således for formulering som en vaksine, slik at det foregår minimal ekspresjon av det heterologe protein.

DNA-konstruksjonen kan være en replikabel ekspresjonsvektor omfattende nirB promotoren operabelt bundet til en DNA-sekvens som koder for tetanus toksin

C fragmentet eller epitoper derav, og det andre heterologe protein, sammenlenket med en hengselregion. nirB promotoren kan innsettes i en ekspresjonsvektor som allerede inkorporerer et gen som koder for ett av de heterologe proteiner (f.eks. tetanus toksin C fragment) istedenfor den eksisterende promotor som kontrollerer ekspresjon av proteinet. Hengselregionen og det gen som koder for det andre heterologe protein (f.eks. en antigensekvens) kan deretter innsettes. Ekspresjonsvektoren bør naturligvis være forlikelig med den svekkede bakterie som vektoren skal innsettes i.

Ekspresjonsvektoren tilveiebringes med hensiktsmessige transkripsjons- og translasjons-kontrollelementer omfattende, i tillegg til nirB promotoren, et transkripsjonstermineringssete og translasjonsstart og -stoppkodoner. Det tilveiebringes et hensiktsmessig ribosombindingssete. Vektoren vil typisk omfatte et replikasjons-startssted, og om ønsket, et valgbart markørgen, slik som et antibiotisk resistensgen. Vektoren kan være et plasmid.

Oppfinnelsen skal nå illustreres ved referanse til følgende eksempler og de vedlagte tegninger, hvori: Figur 1 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av et mellomproduktplasmid pTECHI ifølge ett trekk av denne oppfinnelsen. Figur 2 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av et andre mellomproduktplasmid pTECH2. Figur 3 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av et plasmid ifølge denne oppfinnelse ved anvendelsen av mellomproduktplasmidet i Figur 2 som utgangsmateriale. I Figur 3 skal B = BamHI. E = EcoRV. H = Hindlll: X Xbal;

S = Spel.

Figur 4 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av et plasmid som inneholder repeterende epitoper (repitoper).

Figur 5 illustrerer antistoffresponser mot rekombinant

S. mansoni protein P28 som påvist ved ELISA i mus intravenøst inokulert med SL3261, SL3261(pTETnir15), SL3261 (pTECH2), SL3261 (pTECH2-monomer), SL3261 (pTECH2-dimer), SL3261 (pTECH2-tetramer), SL3261(pTECH2-oktamer) og SL3261 (pTEHC1-P28). I Figur 5 blir resultatene uttrykt som OD i individuelle mus ved intervaller etter immunisering. Figur 6 illustrerer antistoffresponser mot TetC som påvist ved ELISA i mus inokulert som i Figur 5. Figur 7 illustrerer antistoffresponser mot peptid 115-131 av P28 proteinet koblet til ovalbumin som påvist ved ELISA i mus intravenøst inokulert med SL3261, SL3261(pTECH2), SL3261(pTECH2-monomer), SL3261(pTECH2-dimer), SL3261 (pTECH2-tetramer) og SL3261(pTECH2-oktamer). Figur 8 illustrerer antistoffrespons mot TetC som påvist ved ELISA hos mus inokulert oralt med SL3261(pTECH1-P28). Figur 9 illustrerer antistoffresponser mot rekombinant P28 som påvist ved ELISA i mus inokulert som i Figur 8. Figur 10 illustrerer skjematisk fremstillingen av for-skjellige konstruksjoner fra pTECH 2 mellomproduktplasmidet. Figur 11 illustrerer skjematisk strukturen av tripartit proteinstrukturer ("heteromerer") fremstilt ved anvendelse av pTECH2.

Figur 12 viser DNA-sekvensen av vektoren pTECHI.

(SEK ID NR: 17).

Figur 13 viser DNA-sekvensen av vektoren pTECH2.

(SEK ID NR: 18).

Figur 14 illustrerer skjematisk restriksjonssetene på vektoren pTECH2.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av pTECHI

Fremstillingen av pTECHI, et plasmid som inkorporerer nirB promotoren og TetC genet, og en DNA-sekvens som koder for en hengselregion og som inneholder restriksjonsendonuklease-seter for å tillate innsetting av et gen som koder for et andre- eller gjeste-protein, er illustrert i Figur 1. Ekspresjonsplasmid pTETnir15, utgangsmaterialet vist i Figur 1, ble konstruert fra pTETtac115 (Makoff et al., Nucl. Acids Res. 17, 10191-10202,1989); ved å erstatte EcoRI- Apal regionen (1354bp) inneholdende lad genet og tac promotoren med følgende par av oligo 1 og 2:

Oligo-1

Oligonukleotidene ble syntetisert på en Pharmacia Gene Assembler, og de resulterende plasmider bekreftet ved sekvensering (Makoff et al., BioAechnology Z, 1043-1046, 1989).

pTETnir15 plasmidet ble deretter anvendt for konstruksjonen av det nye pTECHI plasmid som inkorporerer en polylinkerregion egnet som sete for innsetting av heterologt DNA for å styre ekspresjonen av fragment C fusjonsproteiner. pTETnir15 er et kjent pAT153-basert plasmid som styrer ekspresjonen av fragment C. Det er imidlertid ingen naturlig forekommende beleilige restriksjonsseter tilstede på 3'-enden av TetC-genet. Derfor ble det innført målseter, foregått av en hengselregion, i 3'enden av TetC-kode-regionen ved hjelp av primere skreddersydd med "add-on" adaptersekvenser (Tabell 1), ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen (PCR) [K. Mullis et al., Cold spring Harbor Sym. Quant. Biol. 51., 263-273, 1986]. Følgelig ble pTETnir15 anvendt som templat i en PCR reaksjon ved anvendelse av primere tilsvarende regioner som dekker Sadl og BamHI setene. Antisens-primeren i denne opp-formering var skreddersydd med en 38 base 5'adaptorsekvens. Antisensprimeren var utformet slik at en sekvens som koder for nye Xbal. Spel og BamHI seter ble inkorporert i PCR produktet. Dessuten ble det inkorporert DNA-sekvenser som koder for ytterligere ekstra aminosyrer omfattende prolin (hengselregionen) og et translasjonsstopp-kodonsignal i ramme med den åpne leseramme for fragment C.

PCR produktet ble gel-renset og spaltet med Sadl og BamHI. og klonet inn i den resterende 2,8 kb vektor pTETnir15 som tidligere var blitt spaltet med Sadl og BamHI. Det resulterende plasmid renset for transformerte kolonier og betegnet pTECH 1, er vist i Figur 1. Heterologe sekvenser slik som sekvensen som koder for Schistosoma mansoni P28 glutation S-transferase (P28) ble klonet inn i Xbal Spel og

BamHI setene ifølge kjente fremgangsmåter.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av PTECH2

For ytterligere å forbedre anvendbarheten av pTECHI, ble det innført en kort linkersekvens mellom Xbal og BamHI setene i pTECHI for å tillate retningskloning av oligonukleotider, og også for å lette konstruksjonen av flere tandem epitoper ("repitoper") (Figur 2). Det ble syntetisert to komplementære oligonukleotider som har restriksjonsenzym-målsetene for BamHI. EcoRV. Hindlll, Spel, etterfulgt av et translasjons-stoppkodon (Tabell 1). Oligonukleotidene ble skreddersydd med Xbal og BamHI kohesive ender; imidlertid ble BamHI målsekvensen utformet til å omfatte en feilparring, og etter kloning, blir dette restriksjonssetet i pTEHCI ødelagt. Denne versjon av vektoren ble betegnet pTECH2.

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av pTECHI- P28

En P28 genekspresjonskassett ble fremstilt ved PCR ved anvendelse av pUC19-P28 DNA (en vennlig gave fra Dr. R. Pierce, Pasteur Institute, Lille) som templat. Oligonukleo-tidprimere ble utformet for å oppformere P28 genet i full lengde ved å begynne ved startkodonet og terminere med stopp-kodonet. Dessuten ble sens- og antisens-primere skreddersydd med restriksjonssete for henholdsvis Xbal og BamHI. Produktet ble gel-renset og spaltet med Xbal og BamHI. og deretter klonet inn i pTECHI som tidligere var blitt spaltet med disse enzymer, og deretter gelrenset.

Eks<p>resjon av TetC- P28 fusjons<p>roteinet

Ekspresjon av TetC-P28 fusjonsproteinet ble evaluert ved SDS-PAGE og Western blotting av bakterieceller som har denne konstruksjon. Det ble funnet at fusjonsproteinet holder seg løselig, kryssreagerer med antisera mot både TetC og P28, og også har den forventede molekylvekt, 80kDal, for en fusjon i full lengde.

Fusjonsproteinet var stabilt uttrykt i flere forskjellige genetiske bakgrunner omfattende E. coli (TG2) og S. tvphimurium

(SL5338.SL3261) som bedømt ved SDS-PAGE og Western blotting.

Av interesse var et mindre bånd på 50 kDal som ko-migrerer med TetC-hengselproteinet al., ene og kryssreagerer eksklusivt med anti-TetC sera og er synlig i en Western blot. Ettersom kodon-seleksjonen i hengselregionen er blitt utformert til å være sub-optimal, kan de sjeldne kodoner forårsake pauser under translasjon som leilighetsvis kan føre til for tidlig terminering av translasjonen, og således forklare dette bånd.

Affinitetsrensina av TetC- P28 fusjonen

Glutation er det naturlige substrat for P28, en glutation S-transferase. Aminosyrerestene involvert i binding av glutation blir antatt å være rommelig atskilt i den primære struktur av polypeptidet og brakt sammen under dannelse av en glutationbindingslomme i den tertiære struktur (P. Reinemer et al., EMBO, J8, 1997-2005, 1991). For å måle hvorvidt P28 komponenten av fusjonen hadde foldet seg korrekt for å anta en konformasjon i stand til å binde glutation, ble dens evne til affinitetsrensning på en glutation-agarosematriks testet. De oppnådde resultatene (ikke vist) demonstrerte at TetC-P28 i virkeligheten kan binde seg til matriksen og at bindingen er reversibel, ettersom fusjonen kan elueres i konkurranse med fri glutation.

EKSEMPEL 4

Konstruksjon av pTECH2- P28( aa115- 131) peptidfusioner

Komplementære oligonukleotider som koder for aa115-131 peptidet ble utformet med en kodonseleksjon for optimal ekspresjon i E. coli [H. Grosjean et al., ideml Oligonukleotidene ble skreddersydd med Bglll og Spel kohesive ender som ble dannet ved annilering og klonet inn i pTECH2 som tidligere var blitt spaltet med BamHI og Spel (Figur 3).

Gjentatte tandemkopier av epitopene (repitopene) ble konstruert i pTECH2 ved følgende metode. Den rekombinante fusjonsvektor ble spaltet med Xbal og Spel og til hver spalting ble tilsatt et andre restriksjonsenzym som kapper unikt på andre steder i vektoren, f.eks. Pstl som gjør en kapping eksklusivt i ampicillin-resistensgenet (Figur 4). DNA-frag-menter som inneholder epitopsekvensene kan renses fra hver av de doble spaltinger, blandes og deretter ligeres. Xbal spalter sin målsekvens under dannelse av et 5-CTAG-overheng som er forlikelig med Spel overhenget. Etter ligering, blir gjenkjenningssekvensene i begge disse enzymer ødelagt. På denne måte kan Xbal- Spel restriksjonssetene forbli unike, og fremgangsmåten kan enkelt og effektivt gjentas for å konstruere rekombinante fusjonsvektorer som uttrykker fire eller åtte tandemkopier av epitopene (Figur 4). En lignende strategi er anvendt av andre ved generering av et multimert fusjonsprotein for fremstilling av et neuropeptid [T. Kempe et al., Gene 39, 239^5, 1985].

Ekspresjon av TetC- peptidfusionsproteinet

Ekspresjon av TetC-peptidfusjonene som monomere, dimere, tetramere og oktamere tandempeptid-gjentagelser ble evaluert ved SDS-PAGE og Western blotting av de bakteriestammer som har konstruksjonene. Fusjonsproteinene holder seg løselige, kryssreagerer med begge antisera mot TetC og P28, og har også den forventede molekylvekt (Figur 5). Dessuten blir fusjons-proteinene uttrykt i flere forskjellige genetiske bakgrunner omfattende E. coli (TG2) og S. tv<p>himurium (SL5338, SL3261) som bedømt ved SDS-PAGE og Western blotting. Det syntes å være en viss nedbrytninngn av de repitoper som besto av et større antall kopier, som angitt ved tilsynekomsten av svake bånd med lavere molekylvekt som kan sees i Western blots probet med anti-P28 antistoffet.

Størrelsen av båndene antydet at de besto av et redusert kopiantall fusjoner med TetC. Som tilfellet var med TetC-P28 fusjonen beskrevet ovenfor, var ekspresjonsnivået for TetC peptidfusjonene mindre enn det for TetC alene fra pTECH2, med ekspresjonsvinået gradvis avtagende med økende kopiantall.

EKSEMPEL 5

Immunolo<g>iske studier

Stabilitet av plasmidkonstruksionene in vivo og immunisering av mus

BALB/c mus ble gitt ca. 10<6> cfu i/v eller 5x10<9> oralt av S. tvphimurium SL3261 og SL3261 som har de forskjellige konstruksjoner. Levedyktige tellinger på homogenater av lever, milt og (for oralt inokulerte mus) lymfeknuter gjennomført fra dagene 1-8 (epitopfusjoner) og 1-11 (vektor, oktamer og P28 fusjoner) var de samme på medier med og uten ampicillin, hvilket viste at plasmidene ikke var gått tapt under vekst i vevene.

Antistoffresponser i mus immunisert intravenøst

Antistoffresponser på TetC- P28 fusjonen

Haleblødninger ble tatt ukentlig på ukene 3 til 6 på dyr fra hver gruppe på 8 mus. Figur 5 viser at hos mus immunisert med salmonella som uttrykker TetC-P28 fusjonen, fremkom det antistoffresponser på rekombinant P28 etter uke 3, og var positive i 6/6 mus fra uke 4 og fremover. Ingen anti-P28 antistoffer ble påvist i sera fra mus immunisert med enten SL3261 eller SL3261-pTETnir15 eller pTECH2.

Alle mus immunisert med salmonella som uttrykker TetC, enten alene eller som TetC-P28 fusjonen (men ikke med salmonella alene), gjorde at antistoff mot TetC fremkom så tidlig som den 3dje uke (Figur 6).

Antistoffresponser på TetC- peptidfusionene

Mus immunisert med salmonella som uttrykker TetC sammen-smeltet med flere kopier av aa115-131 peptidet, ble avblødet som ovenfor, og disse sera testet ved ELISA mot det syntetiske 115-131 peptid kjemisk konjugert med ovalbumin, og mot rekom-binant P28. Figur 7 viser at antistoffresponser på peptidet ble påvist så tidlig som uke 3 og øket deretter, med responser som var sterkere og fusjoner som inneholdt større antall kopier av peptidet. De oktamere fusjoner fremkalte de beste responser med 4-5 positive mus. Ingen antistoffresponser ble påvist mot ovalbumin monomer eller rekombinant P28 i mus immunisert enten med SL3261, pTECH2 eller den monomere epitop-fusjonen.

Noen av disse anti-epitopsera gjenkjente P28 proteinet i full lengde i ELISA (Figur 5). En mus injisert med den dimere fusjon var positiv ved uke 5, en annen mus injisert med den tetramere fusjon var positiv ved uke 3. Deretter kunne sera fra minst 2 mus injisert med den oktamere fusjon konsekvent gjenkjenne P28 fra uke 4 opp til uke 6.

Det viste seg altså at antistoffresponsene mot repitopene forbedret seg dramatisk med økende kopiantall, og at de tetramere og oktamere repitopfusjoner var de mest potente. Ingen antistoffresponser på den monomere fusjon ble påvist.

Antistoffrespons på TetC hos mus immunisert med de forskjellige fusjoner.

Antistoffresponsen på TetC var ikke den samme i alle grupper; addisjonen av C-terminale fusjoner til TetC modifiserte klart responsen. Figur 6 viser at antistoffresponsen på TetC fremkalt av vektoren pTECH2 (TetC-hengsel alene) var signifikant mindre enn TetC responsen på foreldrevektoren, pTETnir15. Overraskende viser det seg at addisjonen til TetC av fusjoner med økende størrelse dramatisk gjenoppretter responsen på TetC. Anti-TetC-responsen på den største fusjonen, P28 i full lengde i pTECHI, var lik responsen på TetC oppnådd fra foreldreplasmidet (under de testede betingelser). Sera fra mus injisert med ikke-rekombinant SL3261 reagerte ikke med TetC på noe som helst tidspunkt under den testede periode.

Antistoffresponser hos mus immunisert oralt

Grupper på 10 mus ble immunisert oralt med ca. 5x10<9> cfu av CL32161 alene eller med pTECHI, eller pTECH1-P28, gitt intragastrikalt i 0,2 ml via en tvangsforingsslange. Avblødninger tatt fra uke 3 til uke 10 viste at de fleste mus som fikk de rekombinante salmonella laget antistoff mot TetC så tidlig som uke 3 (Figur 8). Mus immunisert med TetC-P28 fusjonen laget antistoff mot P28 som var påvisbart i ca. halvparten av musene ved uke 8, og deretter gikk ned (Figur 9).

Antistoffresponser hos mus immunisert med det rensede fusions- protein

Mus ble immunisert subkutant med affinitetsrenset TetC-P28 fusjonsprotein adsorbert på aluminiumhydroksyd. Kontroller fikk kommersielt tetanustoksoid alene. Preliminære resultater viser at dyr som fikk fusjonsproteinet, lager en antistoffrespons på både TetC og P28 (data ikke vist). Intet anti-P28-antistoff ble påvist hos mus som fikk tetanus toksoid.

T- celle responser på TetC oa P28

Mus ble immunisert i/v med ca. 10<6> cfu av SL3261, SL3261(pTetnir15) og SL3261(pTEHC1-P28). Seks måneder senere ble det målt T-celle responser som 1L-2/IL-4 produksjon mot løselig ekstrakt av hele salmonella-celler, TetC, rekombinant P28 og helt, voksent ormantigen som beskrevet i avsnittet med overskriften Materialer og Metoder nedenfor. Tabell 2 viser at celler fra begge grupper fremkalte en IL-2/IL-4 respons på det natriumhydroksydbehandlede salmonellaekstrakt og på TetC. Celler fra mus immunisert med salmonella som uttrykte TetC-P28 fusjonen ga imidlertid også respons på både rekombinant P28 og helt ormekstrakt.

Salmonella-avgivelsessystemet hadde således fremkalt både humoral og cellulær (T-celle)-immunrespons på P28.

Salmonella som uttrykte de rekombinante antigener, holdt seg alle i musevevene såvel som foreldrestammen, og plasmidene gikk ikke tapt in vivo.

Konstruksjoner som uttrykte høyere molekylære fusjoner (full lengde P28 og oktamer) viser seg å være de mest immunogene. Det kan være at immunresponsen var blitt befordret av bærer-TetC som frembrakte ytterligere T-celle hjelperepitoper [Francis et al., Nature 330: 168-170, 1987]. Etter uke 4 ga alle musene immunisert med celler som bar pTECHI-P28 respons på både TetC og også P28-proteinet i full lengde etter i/v immunisering. Mus immunisert oralt ga også respons på TetC og P28, selv om ikke alie musene ga respons på P28. Det kan godt være at responsen på P28 kunne forbedres ved gjentatt immunisering. Forbedrede konstruksjoner bestående av kodonoptimaliserte hengselregioner, kodonoptimalisert P28, og multiple kopier av P28 i full lengde, er for tiden under fremstilling.

Antistoffresponsene på epitopene forbedret seg dramatisk med økende kopiantall, hvorav de tetramere og oktamere "repi-top"-fusjoner hadde den høyeste potens.

EKSEMPEL 6

Kloning av HPVE7 protein i pTECH2

HPVtype 16 E7 proteingenet i full lengde ble klonet inn i plasmid pTECH2 ved innsetting av genet i ramme i BamHI setet i vektorhengselregionen.

E7 genet ble oppnådd fra plasmid pGEX16E7 (S.A. Comerford et al., J. Virology, 65, 4681-90, 1991). Genet i dette plasmidet er flankert av to restriksjonsseter: et 3' BamHI sete og et 5' EcoRI sete. pGEX16E7 DNa ble spaltet med EcoRI og buttendet ved en oppfyllingsreaksjon ved anvendelse av Sequenase (DNA polymerase fra USB). Det ble deretter spaltet med BamHI under avgivelse av det 0,3 Kbp E7 gen i full lengde.

Det gelrensede gen ble ligert til BamHI-EcoRV dobbeltspaltet pTECH2, og denne ligeringsblanding ble anvendt til transformering av kompetente E. coli HB101 bakterier.

Rekombinante kolonier ble utvalgt ved koloniblotting ved anvendelse av to monoklonale antistoffer mot HPV16E7 protein som prober, nemlig 6D og 4F (R.W. Tindle, et al., J.Gen Vir. 71,1347-54,1990). En av disse koloniene, betegnet pTE79, ble valgt for ytterligere analyse.

Proteinekstrakter fra pTE79 transformerte E. coli dyrket under både aerobe og anaerobe betingelser, ble fremstilt og analysert ved SDS-PAGE og Western blotting. Vekst under anaerobe betingelser resulterte i ekspresjon av et rekombinant molekyl på ca. 60 kDal som reagerte med de monoklonale antistoffer 6D og 4F og et kanin polyklonalt serum mot Tetanus fragment C.

EKSEMPEL 7

Konstruksjon av pTECH2- aD

Et immunologisk viktig antigen fra herpes simplex virus type 1 [HSV1] er glykoprotein D, betegnet gD1 (R.J. Watson et al., Science 218, 381-383, 1982). En avkappet gD1 genkassett, som manglet de transmembrane og cytoplasmiske domener aa26-340, ble syntetisert ved PCR. De anvendte PCR primere er vist i Tabell 3. Foroverprimeren ble utformet til å kode for N-terminus av det modne protein, og reversprimeren kodet for aminosyrene umiddelbart 5' til det transmembrane domene. Dessuten ble primerne skreddersydd med henholdsvis BamHI og Spel restriksjonsseter. Templatet for PCR reaksjonen var plasmidet pRWFG [et HSV1 gD BamHI-J klon fra Patton-stammen i pBR322; en vennlig gave fra Dr. T. Minson, Cambridge University]. Oppformeringsproduktet ble spaltet med BamHI og Spel og klonet inn i pTECH2 som tidligere var blitt spaltet med de respektive enzymer.

Ekspresjon av TetC-gD1 fusjonsproteinet ble bestemt ved SDS-PAGE og Western blotting av bakteriestammer som hadde konstruksjonene. Western blots ble probet med enten anti-TetC polyklonale sera eller et monoklonalt antistoff rettet mot aminosyrene 11-19 av det modne gD [betegnet LP16, levert fra Dr. T. Minson, Cambridge]. Fusjonsproteinet blir uttrykt som et 85 kDal bånd synlig på Western blots sammen med lavere molekylære bånd ned til 50 kDal i størrelse. De lavere mole-kylære bånd kunne tilsvare proteolytiske spaltingsprodukter av gD eller representere produktene av fortidlig translasjonsterminering innenfor koderegionen av gD på grunn av ribosomal pausering. Fusjonsproteinet uttrykkes i salmonella-stammene

SL5338 og SL3261.

EKSEMPEL 8

Konstruksjon av PTECH2- FMDV/ SIV repitoper

Peptider fra munn- og klovsykevirus (FMDV; serotype A12] viral protein 1 [VP1; aa136-159] og V2 løkken fra simian immunsviktvirus [SIV] kappeprotein [gp120; aa171-190] ble klonet inn i pTECH2 [M.P. Broekhuijsen et al., J. Gen Virol. 68, 3137-45, 1987; K.A. Kent et al., AIDS Res. and Human Retro. 8:1147-1151, 1992].

Komplementære oligonukleotider som koder for peptidene ble utformet med en kodonseleksjon for optimal ekspresjon i E. coli [H. Grosjean et al., Gene, 18,

199-209,1982]. Oligonukleotidene er vist i Tabell 3. Oligonukleotidene ble skreddersydd med Bglll og Spel kohesive ender som ble dannet ved anilering og klonet inn i pTECH2 som tidligere var blitt spaltet med BamHI og Spel (Figur 3). Dimere, tetramere og oktamere fusjoner av disse peptider ble konstruert som tidligere beskrevet.

Ekspresjon av TetC-fusjonene ble evaluert ved SDS-PAGE og Western blotting med et polyklonalt serum rettet mot TetC, og monoklonale antistoffer rettet mot enten FM DV eller SIV epitopene. FMDV og SIV repitopkonstruksjonene uttrykte TetC-fusjonsproteinene i både SL5338 og SL3261.

EKSEMPEL 9

Konstruksjon av PTECH2 - gp120- P28 peptidheteromerer

For å undersøke muligheten for avgivelse av mer enn én epitoptype fra ett enkelt molekyl av TetC, er det laget fusjoner med P28 og SIV repitopene for å frembringe et tripartittprotein. Denne konstruksjonsform er blitt lettet ved den modulære karakter av vektoren som tillater sammenstilling av vektormoduler inneholdende forskjellige repitoper. Disse "heteromerer" uttrykker enten tandem dimerer eller tetramerer av P28 og SIV repitopene. For å undersøke effekten av stillingen til en bestemt repitop i TetC repitop A-repitop B fusjonen på dens ekspresjonsnivå, stabilitet og immunogenitet, er de omvendte kombinasjoner også blitt konstruert, dvs. TetC- repitop B-repitop A, som vist i Figur 11. "Heteromerer" kon-struert på denne måte er TetC-P28 dimer-SIV dimer, TetC-SIV-dimer-P28 dimer, TetC-P28 tetramer-SIV tetramer og TetC-SIV tetramer-P28 tetramer.

Ekspresjon av tripartittfusjonene ble evaluert ved SDS-PAGE og Western blotting ved anvendelse av antistoffreagensene beskrevet ovenfor. Disse heteromerkonstruksjoner uttrykkes alle i salmonella-stammene SL5338 og SL3261, men overraskende er ekspresjonsnivået og stabiliteten høyere i en dimer-dimer- og tetramer-tetramer-kombinasjon (TetC-gp120-P28) enn den omvendte.

EKSEMPEL 10

MATERIALER OG METODER

Plasmider, oliqonukleotider, og polymerasekjedereaksjonen

Plasmidet pTETnir15 styrer ekspresjonen av fragment C fra tetanus toksin under kontroll av nirB promotoren [Chatfield et al., idem Oxer et al., idem]. TetC-hengselfusjonsvektoren pTECHI ble konstruert fra pTETnir15 ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) beskrevet av Mullis et al., 1986. PCR ble gjennomført ved anvendelse av den høyst pålitelige, termostabile DNA-polymerase fra Pvrococcus furiosus. som har en assosiert 3'-5' eksonuklease korrekturleseaktivitet [K.S. Lundberg et al., Gene 108:1-6,1991]. Oppformeringsreaksjonen ble gjennomført ifølge produsentens instruksjoner (Stratagene).

Bakterie- stammer

De anvendte bakteriestammer var E. coli TG2 (recA; [J. Sambrook et al., Molecular doning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York, 1989]) S. tvphimurium SL5338 fqalE r' m+ [A. Brown J. Infect. Dis. 155: 86-92, et al., J. Infect. Dis. 155: 86-92,1987]) og SL3261 (aroA; [S.K. Hoiseth et al., Nature 291, 238-9, 1981]. Bakteriene ble dyrket i enten L eller YT-substrat og på L-agar med ampicillin (50 pg/ml) om nødvendig. Plasmid DNA fremstilt i E. coli ble først modifisert ved transformasjon inn i SL5338 for å øke effektiviteten av elektroporeringen i SL3261 aroA ( r+ m) vaksinen. For elektroporering ble cellene som ble dyrket i midtlogfasen, høstet og vasket i halvparten av det opprinnelige dyrkingsvolum av iskaldt vann, 1/10 volum av iskald glycerol (10%), og endelig ble cellene slemmet opp igjen til en konsentrasjon på 10<10> celler/ml i iskald glycerol (10%). Til en forhåndskjølt kyvette ble tilsatt en blanding av 60 pl celler og 100 ng av plasmid DNA. Cellene ble pulset ved anvendelse av en Porator fra Invitrogen (setting: spenning - 1750 pv, kapasitans = 40 uF, motstand - 500). Forvarmet L-substrat supple-mentert med 20 mM glukose ble tilsatt umiddelbart, og cellene dyrket ved 37°C under forsiktig omrysting i 1 -1,5 timer. Cellene ble deretter platet ut på L-agarplater inneholdende ampicillin, og inkubert ved 37°C i 16 timer.

SDS- PAGE oa Western blotting

Ekspresjon av TetC fusjonene ble testet ved SDS-PAGE og Western blotting. Celler dyrket i midtlogfasen med antibiotisk seleksjon ble høstet ved sentrifuge ring, og proteinet fraksjonert ved 10% SDS-PAGE. Proteinene ble overført til en nitrocellulosemembran ved elektroblotting og omsatt med enten et polykionalt kaninantiserum rettet mot TetC eller P28 proteinet i full lengde. Blotterne ble deretter probet med geit-antikanin-lg konjugert med pepperrotperoksydase (Dako, UK), og fremkalt med 4-klor-1-naftol.

Glutation- aaarose affinitetsrensinq.

Bakterieceller som uttrykte TetC full lengde P28 gen fusjonen ble dyrket til logfase, avkjølt på is og høstet ved sentrifugering ved 2500xg i 15 minutter ved 4°C. Cellene ble slemmet opp igjen i 1/15 av det opprinnelige volum av iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) og lyset ved ultralydbehandling i en MSE Soniprep. Det uløselige materialet ble fjernet ved sentrifugering, og til supernatanten ble tilsatt 1/6 volum av 50% velling av på forhånd svellede glutation agaroseperler.

(Sigma, UK). Etter forsiktig blanding ved romtemperatur i 1 time, ble perlene oppsamlet ved sentrifugering ved 10OOxg i 10 sekunder. Supernatanten ble kastet, og perlene slemmet opp igjen i 20 volumer av kald PBS-0,5% Triton X-100, og perlene oppsamlet igjen ved sentrifugering. Vasketrinnet ble gjentatt ytterligere 3 ganger. Fusjonsproteinet ble eluert ved tilsetning av et volum av 50 mM Tris-HCI, pH 8,0 inneholdende 5,0 mM redusert glutation (Sigma). Etter forsiktig blanding i 10 minutter, ble perlene pelletert som tidligere, og supernatanten fjernet. Elueringstrinnet ble gjentatt ytterligere 5 ganger, og supernatantfraksjonene analysert ved SDS-PAGE.

Dvr

BALB/c hunnmus ble kjøpt fra Harlan Olac UK Blackthom, Bicester, UK, og anvendt når de var minst 8 uker gamle.

Inokulering oa levedyktig telling av organ- homoaenater

Bakterier ble dyrket i tryptisk soyavelling (Oxoid) supplementeret med 100 pg/l ampicillin etter behov. For intravenøs inokulering ble stasjonære kulturer fortynnet i PBS, og dyrene ble gitt ca. 10<6> cfu i en lateral halevene i 0,2 ml. For oral inokulering ble bakteriene dyrket i kulturer som ble rystet over natten, konsentrert ved sentrifugering, og dyrene fikk ca. 5x10<9> cfu i 0,2 ml intragastrikalt via en tvangsforingsslange. Inokulumdosene ble kontrollert ved levedyktige tellinger på tryptisk soyaagar. For levedyktige tellinger på organhomogenater ble grupper av 3 mus avlivet med mellomrom, leveren og milten og (for oralt inokulerte mus) ble en pulje av mesenteriske lymfeknuter homogenisert separat i 10 ml destillert vann i en Colworth stomacher [CE. Hormaeche, Immunology 37, 311-318,1979] og levedyktige tellinger gjennomført på tryptisk soyaagar supplementert med 100 pg/ml ampicillin.

Måling av antistoffres<p>onser

Antistoffer ble målt ved fastfase immunoassay. 96-brønners flatbundede plater ble belagt med enten 0,1 ug av TetC (en vennlig gave fra Dr. N. Fairweather, the Wellcome Foundation, Beckenham UK) eller 1 pg rekombinant P28 (en vennlig gave fra Dr. R. Pierce, Pasteur Institute, Lille, Frankrike) i 100 pl av 0,1 M karbonatbuffer, pH 9,6. Etter inkubering over natten ved 4°C, ble platene inkubert i 1 time ved 37°C. Blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter ble utført ved inkubering med 200 pl 2% casein (BDH, Poole, UK) i PBS pH 7,0 i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket 3 ganger med 0,05% Tween 20 (Sigma) i PBS med en halvautomatisk ELISA vasker (Titertek, Flow/ICN, Herts. UK). 100 pl sera fra inokulerte mus fortynnet 1:20 i 2% casein ble tilsatt til hver brønn, og platene inkubert i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket som ovenfor, og 100 pl av pepperrotperoksydase konjugert geit-antimusimmunoglobuliner (Dako, Bucks UK), fortynnet ifølge produsentens instruksjoner i 2% casein i PBS, ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket som ovenfor, og ytterligere 3 vaskinger ble utført med PBS alene. Platene ble fremkalt ved anvendelse av 3,3\3,3'-tetra-metylbenzidin-dihydroklorid (Sigma) ifølge produsentens instruksjoner ved anvendelse av fosfat/sitratbuffer, pH 5,0 og 0,02% hydrogenperoksyd. Platene ble inkubert i 10-15 minutter ved 37°C, hvoretter reaksjonen ble stanset med 25 pl 3M H2S04 (BDH). Platene ble avlest i en ELISA avleser ved 450 nm.

Måling av T- cellerespons

Milt fra mus vaksinert 6 måneder på forhånd ble fjernet aseptisk, og enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt ved mosing av miltene gjennom en rustfri stålsikt ved hjelp av et plaststempel. Cellene ble vasket 1 gang i RPMI1640 medium (Flow/ICN) ved 300xg og inkubert i Gey's løsning for å lyse de røde celler. Hvite celler ble vasket ytterligere 2 ganger som ovenfor, og slemmet opp igjen i komplett medium, dvs. RPMI1640 supplementert med 100 U/ml pencillin G (Flow/ICN), 100 pg/ml streptomycin (Flow/ICN), 2x10'<5>M B-merkapto-etanol (Sigma), 1 mM N-(2-hydroksyetyl-piperazin-N'-(2-etansulfonsyre) (HEPES)

(Flow/ICN) og 10% varmeinaktivert nyfødt bovint serum (Northumbria Biolabs, Northumberland, UK). For isolering av T-celler ble miltcellene behandlet som ovenfor, og etter lyse av røde celler, ble de hvite celler slemmet opp igjen i varm (37°C) RPMI1640 og passert gjennom en Wigzell glassperlekolonne, [H. Wigzell et al., Scand. J. Immunol 1: 75-87,1972].

Cellene ble platet ut ved 2x10<6>/ml i et sluttvolum på 200 pl av komplett medium i 96-brønners plater i nærvær av de relevante antigener. Disse var enten et al., kalibehandlet helcelle løselig ekstrakt av S. tv<p>himurium C5 fremstilt som beskrevet hos Villarreal et al., [Microbial Pathogenesis 13: 305-315,1992] ved 20 pg/ml sluttkonsentrasjon; TetC ved 10 pg/ml; rekombinant Schistosoma mansoni P28 ved 50 pg/ml; og S. mansoni helt voksent orme-ekstrakt (en vennlig gave fra Dr. D. Dunne, Cambridge University) ved 20 pg/ml. Cellene ble inkubert i en atmosfære med 95% fuktighet, 5% C02, 37°C.

Materceller for T-celler for dyr immunisert med SL3261 (pTECHI-P28) ble oppnådd fra syngene BALB/c naive milter fremstilt som ovenfor. For mus immunisert med pTETnir15, ble matercellene oppnådd fra dyr immunisert på lignende måte. Etter lyse av røde celler og 2 vaskinger med RPMI1640, ble cellene røntgenbestrålt ved 2000 rad og vasket ytterligere 2 ganger. Disse antigen-presenterende celler ble slemmet opp igjen i komplett medium under dannelse av et sluttforhold på 1:1 med T-celler.

IL- 2 produksjon og bestemmelse

T-cellesuspensjoner ble platet ut som ovenfor. Etter 2 dager, ble det høstet 50pl supematant og tilsatt til 1x104 celler pr. brønn (CTLL-2(IL-2 avhengig) i 50 pl medium. CTLL-2 celler ble levert fra Dr. J. Ellis, University College, London UK og holdt i RPMI1640 supplenentert som ovenfor, med nyfødt bovint serum substituert for føtalt bovint serum. Etter 20 timer, ble tilsatt 20 pl av MTT ved en konsentrasjon på 5 mg/ml i PBS. MTT transformasjonen ble målt som angitt annet sted [Tada et al., J. Immunol. Methods 93:157-165,1986]. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet av den optiske tetthet av triplikater avlest ved 570 nm ved anvendelse av et referansefilter på 630 nm. Signifikansen ble bestemt ved Studenfs t-test.

BAKTERIEPRØVER I DEPOT

Salmonella tv<p>himurium stammene SE3261 -pTECHI, SL3261 -pTECHI - P28, SL3261-pTECH2, SL3261-pTEHC2-P28 oktamer og PTE79 er deponert i the National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, den 15. juli 1993 under depotnummerne henholdsvis NCTC 12831, NCTC 12833, 12832, 12834 og 12837.

(2) INFORMASJON FOR SEK ID NR: 18:

(i) SEKVENS KARAKTERISTIKA:

(A) LENGDE: 3769 basepar

(B) TYPE: nukleinsyre

(C) TYPESTRENG: dobbelt

(D) TOPOLOGI: sirkulær

<ii) MOLEKYLTYPE: DNA (genomisk)

(iii) HYPOTETISK: NEI

(iii) ANTI-SENS: NEI

(xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEK ID NR: 18:

Claims (11)

1. Vaksineblanding omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og en svekket bakterie inneholdende en DNA-konstruksjon omfattende en promotor som er i stand til å frembringe ekspresjon av en sekvens under, og har aktivitet som induseres under, anaerobe betingelser, idet promotoren er operabelt knyttet til en DNA-sekvens som koder for første og andre proteiner sammenknyttet av en kjede aminosyrer som utgjør en hengselregion.

2. Vaksineblanding ifølge krav 1, karakterisert ved at promotoren er nirB promotoren eller en del eller et derivat derav som er i stand til å frembringe ekspresjon av en sekvens under anaerobe betingelser.

3. Vaksineblanding ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at hengselområdet omfatter prolin og/eller glycin aminosyrer.

4. Vaksineblanding ifølge hvert av de foregående krav, karakterisert ved at det første protein er en antigensekvens omfattende tetanus toksin C fragment eller epitoper derav.

5. Vaksineblanding ifølge hvert av de foregående krav, karakterisert ved at det andre protein er en antigen-determinant av en patogen mikroorganisme.

6. Vaksineblanding ifølge krav 5, karakterisert ved at den antigene determinant er en antigensekvens som stammer fra en virus, bakterie, sopp, gjær eller parasitt.

7. Vaksineblanding ifølge krav 6, karakterisert ved at den antigene sekvens stammer fra P28 proteinet av Schistosoma mansoni.

8. Vaksineblanding ifølge krav 6, karakterisert ved at den antigene sekvens stammer fra humant papilloma virus (HPV).

9. Vaksineblanding ifølge krav 6, karakterisert ved at den antigene sekvens stammer fra herpes simplex virus.

10. Vaksineblanding ifølge krav 6, karakterisert ved at den antigene sekvens stammer fra munn-og-klovsykevirus (FMDV).

11. Vaksineblanding ifølge hvert av de foregående krav, karakterisert ved at den svekkede bakterie er valgt fra slekten Salmonella.