NO301175B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av subenhetsprotein fra koleratoksin (CTB) eller hybrid CTB gen-fusjonsprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av subenhetsprotein fra koleratoksin (CTB) eller hybrid CTB gen-fusjonsprotein, i E. coil- eller i Vibrio cholerae-vertsceller eller andre Viirionaceae-bakterievertsceller som naturlig eller ved manipulering mangler evnen til å produsere koleratoksin.

Vibrio cholerae av serogruppe 01 kan indusere alvor-lig diaresykdom når den formerer seg i tarmkanalen av infi-serte individer, ved å frigi kolera toksin (CT) som indu-serer aktiv elektrolytt- og vannutskillelse fra tarmepitélet. Ved analoge mekanismer kan flere andre bakterier, f.eks. Escherichia coli, også forårsake diaré ved frigivelse av

andre enterotoksiner som kan være beslektet eller ubeslektet med CT.

CT er det prototypiske bakterielle enterotoksin. Det

er et protein oppbygget fra to typer underenheter: en enkel A-underenhet med molekylvekt 28,000 og fem B-underenheter, hver med en molekylvekt på 11,600. B-underenhetene er samlet i en ring ved hjelp av tette ikke-kovalente bindinger; A-underenheten er bundet til og sansynligvis delvis innføyet i B-pentamerringen gjennom svakere ikke-kovalente interaksjoner. De to typer underenheter har forskjellige roller i forgiftn-ingsprosessen: B-underenhetene er ansvarlig for cellebinding og A-underenheten for den direkte toksiske aktivitet. De molekylære aspekter av toksinbinding til tarmceller og andre pattedyrceller og av de påfølgende hendelser som fører til aktivering av adenylatcyclase gjennom den intracellu-lære virkning av A-underenheten (og dens Al-fragment) er klar-gjort i betydelig detalj (se J. Holmgren, Nature 292:413-417, 1981). Nylig har også informasjon blitt tilgjengelig vedrørende genetikken og biokjemien av koleratoksin-syntese, sammensetting og utskillelse av V. cholerae bakterier.

CT er kodet for av kromosomale strukturelle gener for henholdsvis A- og B-underenhetene. Disse gener er klonet fra flere stammer og deres nukleotidsekvens er bestemt. Genene for A- og B-underenhetene av CT er arrangert i en enkel transskripsjonsenhet med A-cistronet ( ctxA) forut for B-cistronet ( ctxB). Studier over organisasjonen av CT-gener i

V. cholerae stammer av klassiske og El Tor-biotyper har antydet at det foreligger to kopier av CT-gener i klassiske biotypestammer, mens det kun foreligger en kopi i de fleste El Tor-stammer (JJ Mekalanos et al, Nature 306:551-557, 1983). Syntesen av CT er positivt regulert av et gen, toxR som øker ctx-ekspresjon mangfoldig. (VL Miller og JJ Mekalanos, Proe Nati Acad Sei USA, 81:3471-3475, 1984). ToxR virker på trans-skripsjonsnivået, og er tilstede i stammer av både klassiske og El Tor-biotyper. ToxR øker antagligvis ctx-transkripsjon ved å kode for et regulatorisk protein som positivt veksel-virker med ctx-promotorområdet. Studier over varmelabilt enterotoksin (LT) i Escherichia coli (underenhetsstrukturen og funksjonen av LT er svært lik men ikke identisk med CT), har vist at A- og B-underenhetene innledende syntetiseres som forløpere med et lederpeptid beliggende forut for de modne underenhetsproteiner. Disse forløpere bearbeides hurtig (dvs. at lederpeptidet fjernes) og translokaliseres gjennom den indre membran inn i periplasmaet, hvor ikke-samlede monomere B-underenheter pentameriserer og forbindes med A-underenhet med en halveringstid på 1-2 minutter. Veien for sammensetting av toksin synes å foregå via forbindelse av A-underenhet med B-monomerer eller små oligomerer. Når først det komplette toksin er sammensatt i V. cholerae (i motsetning til E. coli hvor toksinet forblir i periplasmaet) translokaliseres (utskilles) toksinet gjennom den ytre membran av V. cholerae 01 ved en slags interaksjon mellom B-underenhets-områder og den ytre membran (TR Hirst & J Holmgren, Proe Nati Acad Sei USA, 84:7418-74 22, 1987; SJS Hardy et al, ibid, in press, 1988). Dersom B-underenhetene av CT eller LT uttrykkes under fravær av A-underenhet (flere slike stammer er fremstilt ved kjemisk mutagenese eller utslettelser ved hjelp av rekombinant DNA-fremgangsmåter i ctxA- eller eltA-cistronene), danner B-underenhetene pentamerer som deretter utskilles fra V. cholerae via den samme vei som for det intakte toksin med unntak av en tilsynelatende tydelig langsommere sammensetnings-prosess i periplasmaet (TR Hirst et al. Proe Nati Acad Sei USA 81:2645-2649, 1984; SJS Hardy et al, ibid under trykking, 1988). Fordi vaksinasjon mot kolera ved parenteral injeksjon kunne ha gitt beskjeden og kortvarig beskyttelse (vanligvis mindre enn 50 % i mindre enn 6 måneder), har oppmerksomhet blitt rettet mot utvikling av orale vaksiner som stimulerer tarmimmunitet mer effektivt. Spesiell oppmerksomhet er blitt rettet mot CTB-pentamerer som en bestanddel av slike orale koleravaksiner (J Holmgren et al., Nature 269:602-604, 1977).

CTB er effektivt oralt immuniserende middel som i et stort feltforsøk er vist å gi beskyttelse mot både kolera og diaré forårsaket av LT-enterotoksigenisk E. coli (J Clemens et al., Lancet ii:124-127, 1986; J Infect Dis, in press, 1988). Adskillelsen av B-underenhet fra A utelukker enhver risiko for reversjon til toksisitet, og CTB er administrert oralt til fler enn 25 000 mennesker uten noen bivirkninger. Disse trekk har medført at CTB er blitt en viktig bestanddel, sammen med drepte,hele koleravira, av en ny oral kolera-vaksine. Dessuten har CTB nylig tiltrukket seg stor interesse som en immunogen bærer for forskjellige andre peptid- eller karbohydratantigener og er også anvendt som et reseptor-blokkerende og reseptor-modulerende middel for kortvarig profylakse av kolera- og E. coli^-diaré (RI Glass et al, J Infect Dis 149:495-500, 1984; ST Donta et al, ibid 157:557-564, 1988; SJ McKenzie and JF Halsey, J Immunol 133:1818-1824, 1984; A-M Svennerholm et al J Clin Microbiol 24:585-590, 1986).

Disse resultater har understreket et behov for å øke utbyttet av CTB for produksjon i stor skala, ideelt ved samtidig å unngå ulempen ved de for tiden anvendte fremstillings-f remgangsmåter (se JL Tayot et al, Eur J Biochem 113: 249-258, 1981) som gjør det nødvendig å rense CTB-proteinet fra aktivt toksin.

Det er derfor, ved hjelp av strategier og fremgangsmåter beskrevet i foreliggende patentsøknad, konstruert høy-ekspresjonsystemer for CTB og CTB-fusjonsproteiner i hvilke CTB-genet (eller genet for det hybride fusjonsprotein) er under kontroll av sterke fremmede (non-koleratoksin) promotorer. Det vellykkede resultat erholdt ved den foreliggende oppfinnelse i denne henseende står i motsetning til tidligere forsøk ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter beskrevet av JJ Mekalanos et al (Nature 306:551-557, 1983) for å oppnå dette mål ved anvendelse av en av promotorene (tacP) beskrevet i en av eksemplene i den foreliggende oppfinnelse,

da disse forsøk ble rapportert å mislykkes fordi de førte til ekspresjon av mindre CTB enn;det som ble oppnådd med den naturlige ctx-promotor.

Foreliggende oppfinnelse angår således fremgangsmåte for fremstilling av subenhetsprotein fra koleratoksin (CTB) eller hybrid CTB gen-fusjonsprotein, i E. coli- eller i Vibrio ciiolerae-vertsceller eller andre ViJbrionaceae-bakterievertsceller som naturlig eller ved manipulering mangler evnen til å produsere koleratoksin, kjennetegnet ved at nevnte vertsceller inneholder et ekspresjonssystem inneholdende en DNA-sekvens som koder for nevnte CTB eller hybrid CTB gen-fusjonsprotein i kombinasjon med en sekvens som koder for lederpeptidet fra LTB, og hvor nevnte sekvenser er koblet sammen ved anvendelse av oligonukleotider, og er under transkripsjonskontroll av tacP-eller T7RNA-polymerasepromoteren, og hvor det mellom promot-eren og ribosombindingssetet ikke finnes DNA av V. cholerae-opprinnelse, hvorpå vertscellene dyrkes, CTB utskilles fra cellen og isoleres fra dyrkingsmediet.

Ved anvendelse av rekombinant DNA-fremgangsmåter er

det ved den foreliggende oppfinnelse oppnådd høyekspresjon-systemer for B-underenheten av koleratoksin (CTB) eller CTB-derivater, innbefattet fusjonsproteiner av CTB. Karakteristisk for disse systemer er ekspresjon av genet som koder for CTB eller CTB-derivatproteiner bragt under kontroll av en sterk fremmed (non-koleratoksin) promotor i plasmidvektorer fra et bredt vertområde. De beskrevne genkonstruksjoner er uavheng-ige av de naturlige CT promotor- og toxR-ekspresjonsreguler-ingssystemer. To slike høyekspresjonsystemer er eksemplifisert, et hvori CTB uttrykkes på en indusibel eller konstitutiv måte under kontroll av tacP-promotoren, og et annet hvori CTB-ekspresjon kontrolleres av den T7 RNA-polymerase-avhengige promotor. I disse eksempler er genkonstruksjonene som tillater høyekspresjon tilstede i plasmider fra et bredt vertområde. Dette tillater produksjon av høye nivåer av CTB eller CTB-derivater fra forskjellige bakteriearter, f.eks. E. coli

og V. cholerae, som inneholder disse plasmider. Tilgjengelig-

heten av de fremmed promotor- høyekspresjonsystemer for fremstilling av CTB-derivater i form av fusjonsproteiner er også eksemplifisert gjennom fusjonen av en syntetisk DNA-sekvens som koder for et ikke-toksisk decapeptid, avledet fra E. coli varmestabilt enterotoksin (STa), med CTB-genet og ekspresjon av genfusjonsproteinet i V. cholerae under kontroll av tacP-promotoren.

Definisjoner og forkortelser

Betegnelsene CTB og CTB-derivater som anvendt i den foreliggende søknad, definerer ethvert protein eller peptid (med unntak av E. coli LTB) med egenskaper som tillater det å bli gjenkjent av immunserum (antiserum) fremstilt mot CTB-proteinet kodet for av plasmidet pJS162 beskrevet i den foreliggende søknad.

Betegnelsen fremmed promotor definerer enhver promotor kjennetegnet ved at den er forskjellig fra den naturlig forekommende ctx-promotor.

Betegnelsen fremmed lederpeptid definerer enhver peptid-sekvens på et proteinmolekyl som letter translokaliseringen av et protein, i den foreliggende søknad translokaliseringen av CTB eller CTB-derivater, gjennom cellemembraner kjennetegnet ved at peptidet er forskjellig fra de naturlig forekommende lederpeptider for koleratoksin-underenheter.

Standardnomenklaturen som anvendt i f.eks. E-L Winnacker, From Genes to Clones, WCH Publishers, New York

(1987) følges for å definere DNA-restriksjonsendonucleaser, restriksjonsseter og restriksjonssekvenser. Oligodeoxynucleotider og aminosyrer.refereres til med de konvensjonelle en-bokstav og tre-bokstavs forkortelseskoder.

Eksempler

Eksempel 1. Rekombinant system for induserbar overekspresjon av CTB under tacP- kontroll 1. 1 Gen ( DNA)- manipulasjoner for å bringe CTB- genet under kontroll av induserbar tacP.

Basert på teoretiske betraktinger og innledende forsøk ble det antatt at overekspresjon av CTB fra en fremmed (non-koleratoksin)-promotor kunne oppnås dersom CTB-genet kunne bringes så nær de fremmede promotorer som mulig, ideelt ved å unngå ethvert non-CTB-kodene DNA av V. cholerae-opp-rinnelse mellom promotoren og CTB-genet. I dette eksempel beskrives fremgangsmåter som anvender denne strategi for å konstruere et vellykket overekspresjonsystem for CTB-produksjon ved å plassere CTB-genet under ekspresjonskontroll av induserbar tacP-promotor.

DNA som koder for E. coli-LTB-lederen har et enkelt EcoRI-restriksjonssete ved dets 5<1->ende lokalisert motstrøms like ved ribosom-bindingssetet som nylig er anvendt for å inn-føye LTB-genet etter den sterke tacP-promotor og således frem-bringe plasmidet pMMB68 (M Sandkvist et al, J Bacteriol 169: 4570:4576, 1987). For å høste fordel av dette strategisk plasserte EcoRI-sete (som mangler i CTB-genet) til å bringe ekspresjonen av CTB under kontroll av den samme promotor, ble det bestemt å genetisk sammensmelte det moden CTB-protein med lederpeptidet av LTB i det i et bredt vert område forekommende plasmid pMMB68. CTB-genet fra pCVD30 (stammende fra V. cholerae 01-stamme 0395, klassisk biotype, Ogawa serotype) har et Ndel-sete ved posisjonen for aminosyre 18 i lederpeptidet, mens LTB-genet har en SacI-gjenkjennelsessekvens ved begynnelsen av det modne protein. Fusjon av CTB-genet ved dets 5' Ndel-ende med 3' Sacl-enden i LTB-genet, via en syntetisk linker som vist i Fig. IA, førte til substitusjon av CTB-lederpeptidet med peptidet i LTB. Det resulterende plasmid pJS162, som er vist i Fig. IB, inneholdt det hybride CTB-gen som et EcoRI- HindIII-DNA-segment medstrøms fra tacP-promotoren. (Alle figurer og tabeller finnes i søknadens appendiks).

Følgende fremgangsmåte ble anvendt for å erholde de ovenfor beskrevne konstruksjoner. pMMB68-plasmidet i E. coli-stamme HB101 ble tilveiebragt av M. Sandquist, Universitetet i Umeå. Plasmid pCVD30 i E. coli HB101 ble erholdt fra Dr. J. Kaper, University of Maryland, Baltimore, USA. (For detaljert beskrivelse av disse plasmider se M. Sandquist et al, J Bacteriol 169:4570-4576, 1987 og JB Kaper et al, Biotecnology 2:345-349, 1984). De ufosforylerte oligodeoxynucleotider anvendt for å forbinde sacl 3<1->enden av LTB-lederen til 5' Ndel-sekvensen av CTB ble innkjøpt som enkelstrenger fra immunologisk avdeling. Biomedisinsk senter, Universitetet i Uppsala. Disse strenger ble ordnet parvis ved å blande ekvimolare mengder av hver streng og inkubering av blandingen over natten ved romtemperatur. Det resulterende dobbel-strengede oligonucleotid hadde SacI- og NdeI-kompatible enkel-strengede forlengelser og kunne derfor sammenføyes direkte med SacI- HindiII-begrenset pMMB68. Ligering ble ut-ført ved inkubering av et tidobbelt molart overskudd oligo-nucleot id i forhold til plasmid DNA over natten ved 4 °C med T4-ligase. Til ligeringsblandingen ble deretter tilsatt, i ekvimolare mengder med hensyn til vektor plasmid-DNA, et renset Ndel- Hindlll-fragment fra plasmid pCVD30 inneholdende CTB-genet, og ligasereaksjonen ble deretter fortsatt ved 4 °C i ytterligere 18 timer. Det ligerte DNA ble deretter transformert i kompetente E. coli HBlOl-celler med utvelgelse for ampicillin resistens (100 ^fg/ml). Alle enzymer anvendt i disse fremgangsmåter ble innkjøpt fra Boehringer Mannheim, GmBH, Forbundsrepublikken Tyskland, og ble anvendt som anbefalt av leverandøren. Rensing av plasmid-DNA ble utført med alkali-lysis-fremgangsmåten, og transformasjonen i E. coli med calsium-rubidiumklorid-fremgangsmåten i overenstemmelse med den detaljerte beskrivelse ifølge T Manniatis et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

For å bekrefte at de forutsagte sekvenser var dannet etter kloning ble det hybride gen subklonet i M13 og sekvens-analysert ved dideoxynucleotidfremgangsmåten ifølge F Sanger et al, Proe Nati Acad Sei, USA 74:5463-5467, 1977. Den be-stemte sekvens bekreftet sekvensen rapportert for LTB-leder-delen (J Leong et al, Infect Immun 48:73-77, 1985) og viste en høy grad av samlet homolo.gy med tidligere rapportert El Tor og klassiske CTB modne sekvenser (ML Gennaro & P Greenway, Nucleic Acids 11:3855-3861, 1983; H Lockman & JB Kaper, J Biol Chem 258:13722-13726, 1983; JJ Mekalanos et al, Nataure 306:551-557, 1983; A Kurosky et al, J Biol Chem 252:7257-7264, 1977; CY Lai, J Biol Chem 252:7249-7256, 1977). En sammenligning mellom det rekombinante CTB ifølge den foreliggende oppfinnelse (fra en V. cholerae 0395 klassisk stamme) og disse andre sekvenser er presentert i Fig. 2. 1. 2 Ekspresjon av det tacP- kontrollerte CTB- gen i V.

cholerae

Plasmid pJS162 inneholdende CTB-genet under kontroll av tacP (Fig. 1) ble overført ved konjugasjon fra en hjelper E. coli-stamme, S17-1 (R Simon et al, Biotechnology 2:784-791, 1983) enten til V. cholerae 01-stamme JBK70 (El Tor biotype) (JB Kaper et al. Nature 308:655-658, 1983) eller El Tor eller klassisk V. cholerae- stammer. For å oppnå denne overføring ble pJS162-plasmid DNA først reisolert fra E. coli HB101 og innført i E. coli S17-1 ved transformasjon under anvendelse av de samme fremgangsmåter fra Manniatis et al (1982) som referert til i avsnitt 1.1 ovenfor. De transformerte S17-l-celler ble deretter anvendt som donororganismer i konjugeringseksperimenter med de forskjellige V. cholerae mottakerstammer. Konjugasjoner ble utført som følger. De transformelle S17-1-donororganismer og de mottakende V. cholerae-celler ble dyrket i 10 ml LB-medium supplert med de egnede antibiotika ved 37 °C over natten uten omrysting. Fra hver kultur ble 3 ml bakteriesuspensjon deretter ført gjennom et Millipore -filter type GS 0,22 m ved hjelp av en sprøyte, først donoren og deretter mottakercellekulturen, for således å bringe disse celler i nær kontakt med hver-andre på filteroverflaten. Filteret ble deretter forsiktig plassert på en LB-agarplate uten antibiotika og inkubert ved 37 °C i tilnærmet 3 timer. Deretter ble filteret overført til et testrør inneholdende 5 ml LB-næringsløsning, bakterier ble suspendert ved omristing av røret, og tilnærmet 0,1 ml av den blandede bakterielle suspensjon ble deretter inkubert i LB-næringsløsning med egnet antibiotisk kontrautvelgelse av donorcellene. Bakterieblandingen ble dyrket i LB-næringsløsning inneholdende 50 U/ml polymyxin B og 100 yUg/ml ampicillin for kontrautvelgelse av donoren når V. cholerae-stammer av El Tor-biotypen var mottakerne av pJS162. Når plasmidet ble overført til V. cholerae-stammer av den klassiske biotype, ble rifampycin-resistente derivativer av disse stammer først isolert, og i disse tilfeller ble utvelgelse for de mottakende rifampycin-resistente vibriostammer utført ved anvendelse av LB-næringsløsning inneholdende 50 Hg/ml rifampycin og 100 yUg/ml ampicillin.

Produksjon av CTB fra V. cholerae-stammer inneholdende pJS162-plasmidet ble bestemt som følger. For induksjon med isopropyl-/3-D-thio-galactopyranosid (IPTG) ble kulturer dyrket ved 37 °C til den ønskede optiske tetthet (A,__) i LB-bUU næringsløsning supplert med anitbiotika, og deretter ble IPTG tilsatt til den ønskede konsentrasjon. Dyrkningen ble fortsatt i 4 timer og cellene og kultur-supernatanten ble adskilt ved sentrifugering. Cellepelleter ble forsiktig vasket og resuspendert i et opprinnelig volum kald fosfatbuffret fysiologisk saltoppløsning pH 7,2, og deretter knust ved 2 soniske utsendelser på 30 sekunder ved anvendelse av en miniprobe (Branson sonifikator). Nivåene av CTB i kultursupernatanter og knuste celler ble deretter bastart vad GM1-EL I SA-f rem-gangsmåten ved anvendelse av det monoklonale antistoff LT39 (A-M Svennerholm & J Holmgren, Curr Microbiol 1:19-23, 1978). Konjugal overføring av pJS162 til den toksin-avledete JBK70 V. cholerae-stamme førte til produksjon av 40-50 yUg/ml CTB fra denne stamme etter dyrkning i LB-medium og induksjon med IPTG; mer enn 95 % av dette CTB ble utskilt i kulturmediet ( Fig. 3). Ekspresjon av CTB til nivåer opp til 50-100 /Ug/ml ble også oppnådd i andre toksin- eller CTA-avledete klassiske og El Tor-stammer, til hvilke pJS162-plasmidet var overført,når disse stammer ble dyrket under tilstedeværelse av IPTG ( Tabell 1). Dette representerte en markert overekspresjon av CTB sammenlignet med nivåene produsert av mange villtype eller rekombinante V. cholerae-stammer under-søkt, innbefattet den hypertoksigeniske 569B-stamme som for tiden anvendes for fremstilling av CTB til vaksineproduksjon. Fordi det rekatbinante CTB kodet for av pJS162 ble utskilt ekstra-cellulært når produsert av V. cholerae, kunne det deretter lett renses med høyt utbytte fra kultursupernatantene fra hver av disse stammer ved anvendelse av f.eks. reseptor-spesifikk affinitetskromatografi på lyso-GMl gangliosid (17), se eksempel 4 nedenfor.

Eksempel 2 Overekspresjon av CTB ved anvendelse av

en konstitutiv tacP- promotor

I denne konstruksjon ble CTB-genet i plasmid pJS162, beskrevet i eksempel 1 ovenfor, utskåret og deretter innføyd i en plasmidvektor pKK223-l, som inneholder tacP-promotoren, men ikke lacl^-genet til stede i pJS162 som er ansvarlig for IPTG-avhengighet.

Det ble anvendt de samme standard fremgangsmåter for isolering av plasmid DNA og for DNA-utskjæring, ligering, transformering til E. coli og konjugasjon i V. cholerae som beskrevet i eksempel 1. CTB-genet i plasmid pJS162 ble utskåret i form av et EcoRI- HindllI-fragment og deretter ligert til EcoRI- HindiII-begrenset plasmid pKK223-l (Pharmacia, Uppsala, Sverige) som inneholder tacP-promotoren motstrøms for EcoRI-setet. Dette frembragte plasmid pJS7523-l som ble overført til E. coli HB101 ved transformasjon, og det ble også overført til V. cholerae-stammer JBK70 og JS1395 ved konjugasjon ved hjelp av E. coli-hjelperstamme S17-1. lad—-genet i pJS162 koder for store mengder lacl-repressor og fra-været av dette gen i plasmid pJS7523-l fører til nesten IPTG-uavhengig ekspresjon av CTB under kontroll av tacP ved bakteriestammer som inneholder pJS7523-l-plasmidet. Dette ble testet ved dyrkning av E. coli 101-celler inneholdende pJS7523-l i LB-næringsløsning supplert med 100 jUg/ml ampicillin ved 37 °C til en optisk tetthet A,.. = 1,0 i dobbelte

600

sett testrør, og deretter tilsettning av IPTG ved 100 /U.g/ml til et sett, men ikke til det andre, og deretter fort-settelse av inkuberingen av bakteriekulturene i ytterligere 4 timer ved 37 °C. Kulturprøver ble deretter utsatt for ultra-sonikering ved 2 soniske utsendelser på 30 sekunder under anvendelse av en miniprobe (Branson sonificator) for å bryte ned cellene, og etter sentrifugering ble de ultrasonikerte kulturer analysert for deres innhold av CTB under anvendelse av GMl-ELISA-fremgangsmåten som også er beskrevet i eksempel 1. De erholdte resultater viste at forholdsvis høye nivåer, 2-7 ^yg/ml, av CTB ble dannet under totalt fravær av IPTG, og disse nivåer var kun 2-3 ganger lavere enn de

som ble oppnådd under tilstedeværelse av IPTG. Dette står dramatisk i motsetning til effekten av IPTG på ekspresjon av CTB under kontroll av tacP i pJS162, hvor nivåene av CTB er upåviselige ved fravær av IPTG (se eksempel 1,

fig. 2). Selv om CTB-ekspresjon i pJS7523-l fremdeles er regulert av lacl-lactoseoperon-repressoren viser disse resul-

tater at ekspresjonen praktisk talt er konstitutiv. Dette skyldes sansynligvis det faktum at den kromosomalt innkodede lacl-repressor ikke produseres i tilstrekkelige mengder for effektivt å bindes til både lac-operatoren i kromosomet og tacP i det høyt antall kopierte plasmid pJS7523-l.

Eksempel 3 Ekspresjon av CTB fra den T7- RNA polymerase- avhengige promotor

I dette eksempel dokumenteres at det også er mulig å oppnå overekspesjon av CTB ved å bringe CTB-genet under ekspresjonskontroll av en annen,sterk,fremmed (ikke-koleratoksin) promotor, den T7-RNA-polymerase-avhengige promotor.

Det strukturelle gen for CTB (innbefattet den LTB-lederpeptid-innkodende sekvens) inneholdt i plasmid pJS162 ble på nytt utskåret og innføyet i T7-5 plasmidvektoren som inneholder den høyt spesifikke og sterke T7-RNA polymerase-avhengige promotor (S Tabor and CC Richardson, Proe Nati Acad Sei USA 82:1074-1078, 1985). Ekspresjon fra denne promotor krever tilstedeværelse av T7-RNA-polymerase som tilveie-bringes ved hjelp av et komplementerende plasmid (pGPl-2); RNA-polymerasen kodet for av dette plasmid blir selv uttrykt under kontroll av en promotor som kan induseres ved en endring av dyrkningstemperaturen (vanligvis fra 30 °C til 42 °C).

De anvendte fremgangsmåter for isolasjon av plasmid DNA og for DNA-utskjæring, ligering, transformasjon til E. coli og konjugal overføring til V. cholerae var vesentlig de samme som de beskrevne i eksempel 1. CTB i pJS162 ble utskåret i form av et EcoRI- HindiII-fragment som deretter ble innføyet i EcoRI- Hindlll-fordøyet plasmid vektor pT7-5 (erholdt fra Dr S Tabor, Harvard University, Mass, USA). Det dannede nye plasmid ble deretter transformert til E. coli 101 inneholdende plasmid pGPl-2 (også erholdt fra Dr Tabor). Når disse transformerte E. coli-organismer ble dyrket i LB-næringsløsning supplert med egnede antibiotika i forhold til de to typer plasmider inneholdt i cellene (kanamycin 50 fJLg/ ml; ampicillin 100 yU.g/ml), produserte cellene ikke påviselige nivåer av CTB ved 30 °C, mens derimot den på-følgende endring av dyrkningstemperaturen fra 30 oC txl 42 °C førte til ekspresjon av 2-3 jJi g/ml CTB i E. coli som bestemt ved hjelp av GMl-ELISA. CTB-genet i sammen med T7-RNA polymerase-avhengig promotor ble deretter også subklonet i form av en PvuII- Hindlll-innføyelse i EcoRV- HindIII-fordøyet plasmid pBR325. Det nye plasmid (pJS7535) ble deretter mobili-sert fra en E. coli-stamme inneholdende plasmid pRK2013 inn i V. cholerae JBK70, til hvilken plasmid pGPl-2 tidligere var overført ved konjugasjon fra den samme E. coli-donor. Tilstedeværelse av de to plasmider var mulig fordi de hadde kompatible replikasjonsutgangspunkter, og fordi pJS7525 koder for resistanse mot kloramfenicol (og ampicillin) mens pGPl-2 inneholder genet for kanamycinresistanse. Når V. cholerae JBK70 inneholdende plasmider pJS725 og pGPl-2 ble dyrket i LB-næringsløsning supplert med 25 jt- Lg/ ml kloramf enicol og 50 fÅg/ ml kanamycin til en høy optisk tetthet ved 30 °C, produserte organismene upåviselige nivåer av CTB, mens en endring av dyrkningstemperaturen til 42 °C førte til den forutsagte T7-RNA polymerase-avhengige økning i CTB-ekspresjon til nivåer på 75-100 ^Ug/ml av CTB i V. cholerae-kultursupernatantene. Resultatene beskrevet i dette eksempel beviste definitvt både at overekspresjon av CTB ved forskjellige fremmede (ikke-koleratoksin) promotorer virkelig er mulig,

og at overekspresjon er uavhengig av det toxR-regulatoriske system fordi en av faktorene som fører til høy ekspresjon av CTB, som påvirket av toxR, er en dyrkningstemperatur på tilnærmet 30 °C (MJ Betley et al, Ann Rev Microbiol 40:577-605, 1986). Det induserbare system beskrevet heri var mini-malt ved den optimale temperatur for toxR og maksimalt ved

en toxR-ikke-optimal temperatur.

Eksempel 4 Karakterisering av rekombinant CTB kodet for av plasmid pJS162 i V. cholerae

Noen av egenskapene av rekombinant CTB fremstilt ved hjelp av konstruksjonene beskrevet i de tidligere eksempler er karakterisert. De erholdte resultater, som eksemplifisert heri med renset CTB innkodet fra plasmid pJS162 uttrykt i V. cholerae JBK70, viser at det rekombinante CTB, til tross for noen få aminosyreforskjeller, ikke er vesentlig forskjellig fra CTB renset fra villtype V. cholerae 569B koleratoksin i noen av de testede struktur-funksjonelle og immunologiske egenskaper.

4. 1 Rensing av CTB og aminoterminalbestemmelse

V. cholerae El Tor JBK70 organismer inneholdende plasmid pJS162 ble dyrket ved 30 °C under .kontinuerlig omristing i 2 LB-medium inneholdende 100 yug/ml ampicillin og 100 JA g/ml IPTG. Etter dyrkning ble bakteriene og bakterielt avfall fjernet ved sentrifugering og det rekombinante CTB renset ved affinitetskromatografi på en lyso-GMl-gangliosid-Spherosil -kolonne ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av JL Tayot et al, Eur J Biochem 113:249-258, 1981. Renset CTB ble underkastet bestemmelse av de aminoterminale rester som beskrevet av H von Bahr-Lindstrom et al, J Prot Chem 1: 257-262, 1982.

Spaltning av forløperpeptidet i det rekombinante CTB ville naturlig ha blitt forutsagt å finne sted ved enten ett eller begge de opprinnelige lederpeptidase ,-gjenkjennelses-seter i LTB eller CTB. Identifisering av den første aminosyre i det rensede protein ga både Tyr- og Ala-rester. Dette og det faktum at det rekombinante CTB var ubetydelig større enn nativ CTB som bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacryl-amidgel elektroforese (NaDodSo^/PAGE), se Fig. 4, antydet at proteolytisk bearbeidelse av lederpeptidet hadde funnet sted mellom Gly kodet for av linkeren (posisjon -5) og Tyr -4,så vel som mellom denne sistnevnte aminosyre og Ala -3 se Fig. 2. Når resten av den behandlede CTB på nytt ble underkastet aminoterminal bestemmelse, ble Ala- og His-rester nå identifisert, noe som bekreftet de postulerte spaltningsposisjoner og som tilveiebragte bevis for at det rekombinante CTB inneholdt korte peptidforlengelser ved dens amino-ende bestående av enten 3 eller 4 aminosyrer. 4. 2 Reseptor- gjenkjennende og reseptor- blokkerende egenskaper

Tilstedeværelsen av de få ekstra aminosyrer i CTB påvirket ikke dens gjenkjennelse av GMl-reseptoren. Bindings-affiniteten for plastbelagt GMl-gangliosid ble sammenlignet for det rekombinante CTB og renset referanse-CTB fra stamme 569B (gave fra Dr. J Armand, Institut Mérieux, Frankrike)

ved å teste forskjellige konsentrasjoner under anvendelse av GMl-ELISA-fremgangsmåte, og ingen forskjell ble avslørt. Bi-beholdelse av høy bindingsaffinitet overfor GMl-gangliosid

ble da også benyttet ved rensingen av CTB på lyso-GMl-Spherosil som beskrevet ovenfor.

Eksperimenter ble også utført for å bestemme evnen til det rekombinante CTB å blokkere koleratoksin-reseptorer i kanintarmer, sammenlignet med 5 69B CTB. Disse eksperimenter ble utført på en slik måte at hver av CTB-preparatene ble injisert i avsnørte tarmslynger i dyret ca. 10 minutter før injeksjonen av en dose (0,2 |^g) av renset koleratoksin kjent for å indusere omfattende utskillelse av tarmfluider (eksperi-mentell kolera) i fravær av spesifikk reseptorblokkering (de detaljerte fremgangsmåter er beskrevet av J Holmgren et al, Infect Immun 38:424-433, 1982). De erholdte resultater viste at de rekombinante preparater og 569B CTB-preparatene utviste lignende reseptor-blokkerende aktivitet. Begge preparater var i stand til fullstendig å forhindre kolera-sekresjon når tilsatt til 5 cm lange avsnørte tarmslynger i en mengde på 50 jjg i et 1 ml volum umiddelbart før injeksjonen av koleratoksin (fra 569B V. cholerae) i slyngene. I kontrollslynger forhåndsbehandlet med buffer alene i stedet for CTB og deretter injisert med den samme dose koleratoksin, forekom en markert akkumulering av fluider 1,7 +_ 0,2 ml/cm, og i slynger forbehandlet med 10 /4g eller mindre mengde CTB før injiseringen av toksin,forekom kun delvis eller ingen reduksjon av fluidakkumulering sammenlignet med de buffer-forbehandlede kontroller. 4. 3 Oligomerisering og evne til assosiasjon med A-underenhet

I andre eksperimenter ble det vist at det rekombinante CTB beholdt en upåvirket evne til både oligomerisering og assosiering med A-underenhet av koleratoksin (CTA). For disse undersøkelser ble renset CTA (fremstilt fra 569B CT; List Biological Laboratories) blandet med renset rekombinant CTB eller 569B CTB i det molare CTB til CTA-forhold normalt funnet i intakt CT, f ar å gi en total protein-konsentras jon på 200 ^<g/ml. Etter blanding ble prøvene surgjort med 0,2 M glycinbuffer pH 2,7 og deretter nøytrali-sert ved dialyse over natten mot 0,05 M Trisbuffer pH 8,0 som ble utskiftet flere ganger. De nøytraliserte prøver ble deretter testet ved hjelp av GM1-ELISA med underenhet-spesifikke monoklonale antistoffer som beskrevet av SJS Hardy et al, Proe Acad Sei USA, in press 1988. Mengdene av 569B CTA som assosierte med rekombinant CTB eller 569B CTB for å gi holotoksin ble beregnet ved anvendelse av ubehandlet homo-log koleratoksin som referanse. Resultatene er vist tabell 2. Disse resultater viser en høy gjenvinnelse av immunoreaktiv CTB, som heller er et mål for pentamer CTB enn mono-mer CTB,fordi det påvisende CTB-spesifikke monoklonale antistoff er kjent for kun å reagere med den B-pentamere form. Resultatene viser også en høy gjenvinnelse av immunoreaktiv CTA, som er et direkte mål for mengden av CTA assosiert med CTB,fordi uassosiert CTA ikke ville binde seg til de GM1-belagte plastbrønner og således ikke bli påvist. Det rekombinante CTB og det rensede referanse 569B CTB oppfører seg meget likt i disse eksperimenter (tabell 2).

4. 4 Immunologiske egenskaper for rekombinant CTB

Voksne kaniner ble gitt tre subcutane injiseringer med 30 J4g av det rekombinante CTB eller 569B CTB med inter-valler på to uker mellom injeksjonene. Proteinene ble gitt med fullstendig Freund's hjelpemiddel i den første inokuler-ing og deretter med ufullstendig hjelpemiddel. To uker etter den tredje immunisering ble dyrene blodtappet og serum ble innsamlet for analyse.

Doble diffusjon-i-gel immunopresipiteringsanalyser

ad modum Ouchterlony ble utført ved anvendelse av mikro-kammersystemet beskrevet av C. Wadsworth, Int Arch Allergy 17:165-177, 1957. Undersøkelsene ble utført med det rensede rekombinante CTB og 569B CTB og deres tilsvarende kanin-immunsera som reaksjonsdeltakere. Resultatene viste koaliser-ende immunopresipiteringsbånd uten noen "sporer" mellom det rekombinante og native CTB, noe som viste immunologisk lik-het ( Fig. 5).

Titrering av antitoksin antistoffer i kanin-immun-sera mot henholdsvis rekombinant CTB og 569B CTB, ble utført ved GMl-ELISA ved anvendelse av renset rekombinant CTB og 569B CTB som antigener festet til GMl-belagte plater (A-M Svennerholm et al, J Infect Dis 147:514-521, 1983). Anti-CTB-titerne i GMl-ELISA var like, varierende mellom 4x10<5 >1x10 for anti-rekombinant CTB og anti-569B CTB, som testet med .ihver av de to CTB-preparater som fast f ase-antigen.

Nøytraliserende antistoffer ble bestemt ved hjelp av hudtest-fremgangsmåtenifølge JP Craig (Nature 207:614-616, 19651) ved anvendelse av renset 569B CT som testtoksin. Varme-inaktivert serum ble blandet i seriefortynninger med like volumer av renset 569B CT, 40 ng/ml i fysiologisk fosfatbuffret saltoppløsning supplert med 10 mg/ml bovint serum-albumin, og 0,1 ml av blandingen ble deretter testet når gjen-værende toksisitet ved intradermal injeksjon. De nøytrali-serende antitoksin-titere viste heller ingen forskjell mellom hverken rekombinant CTB eller 569B CTB. Begge typer antisera var i stand til fullstendig å nøytralisere 2 ng CT ved konsentrasjoner ned til lxl0~4

Eksempel 5 TACP- styrt overekspresjon av et hybrid

CTB gen- fusjonsprotein

Manipuleringene beskrevet i eksempel 1 for å bringe CTB-genet under tacP-kontroll innbefattet med hensikt inn-føringen av enkle enzym-restriksjonsseter for genfusjoner i de CTB-aminoterminale ender. Kloning inn i disse seter tillater oppbygning av CTB-avledete hybride proteiner som bærer f.eks. forskjellige formodete vaksinasjonspeptid-antigener som også er under den samme ekspresjonskontroll av fremmede promotorer, f.eks. tacP, som beskrevet for CTB selv i de tidligere eksempler. Gjennomførbarheten av denne fremgangsmåte eksemplifiseres heri ved fusjonen av et varmestabilt E. coli enterotoksin (STa)-beslektet peptid,kodet for av syntetiske oligodeoxynucleotider,til amino-enden av CTB i

et tacP-styrt overekspresjonsystem.

5. 1 Konstruksjonsbeskrivelse

Plasmid pJS162 som inneholder enkle SacI og Xmal (Smal) restriksjonsseter ved forbindelsesstedet mellom lederpeptidet og modent CTB (se Fig. IB) ble fordøyet med de tilsvarende to enzymer og ligert til et syntetisk oligo-deoxynucleotid som koder for det STa-beslektede decapeptid Cys-Ala-Glu-Leo-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys via SacI og Xmal kompatible ender (se Fig. 6). Det resulterende pJS8 plasmid ble derved tilveiebragt, under kontrollen av tacP-promotoren, med et hybrid gen som koder for et fusjonsprotein hvor det STa-beslektede decapeptid, flankert av noen få ekstra aminosyrer, var kovalent bundet til den aminoterminale ende av modent CTB som vist i Fig. 6. Sekvensen av det sammensmeltede STa-beslektede decapeptid var identisk med et område i nativ STa med unntak av substitusjonen av en cysteinrest med alanin. Den utvalgte sekvens var basert på den tidligere påvisning av kapasiteten av et • ikke-toksisk syntetisk nona-decapeptid som inneholder denne aminosyreerstatning for spesifikt å binde et anti-STa monoklonalt antistoff med evnen til å nøytralisere E. coli STa (A-M Svennerholm et al, FEMS Microbiol Lett, in press 1988). Den heri sammensmeltede sekvens er imidlertid kortere og omfatter kun ti aminosyrer innbefattet fire cysteiner.

De eksperimentelle fremgangsmåter og reagenser anvendt i denne oppbygning var som nærmere beskrevet nedenfor . E. coli-stamme HB101 ble anvendt som forbigående vert for plasmidisoleringer. V. cholerae-stamme JS1569 er et rifampycin-resistent derivativ av stamme CVD103. E. coli S17-1 ble anvendt for konjugal overføring av plasmider til stamme JS1569. Kilden og videre egenskaper for disse stammer er beskrevet i eksempel 1. Isolering av plasmid DNA ved alkali-lysis-fremgangsmåten innbefattende sentrifugering i CsCl/ethidiumbromid-gradienter, DNA-transformasjoner til E. coli og konjugasjoner til V. cholerae ble også utført i overenstemmelse med Maniatis et al (1982) og som nærmere beskrevet i eksempel 1. Betingelser anvendt for restriksjon og ligering av DNA var som anbefalt av leverandøren av de forskjellige enzymer. Enzymer ble ervervet fra Boehringer-Mannheim og New England Biologics. De syntetiske oligodeoxynucleotider som koder for det STa-beslektede decapeptid og tilgrensende aminosyrer ble ervervet i form av komplementære individuelle strenger fra Avdeling for Immunologi (Dr Lena Samuelsson), Biomedisinsk Senter Uppsala, Sverige. Etter pardannelse ved romtemperatur under betingelser beskrevet i eksempel 1, inneholdt det syntetiske dobbel-strengede oligo-deoxynucleotid enkel-strengede ender forenelige med SacI ved 5'-enden og ved Xmal ved 3'-enden.

5. 2 TacP- styrt ekspresjon av ST decapeptid- CTB-fusjonsprotein

Kulturer av E. coli 101 eller V. cholerae JS1569 inneholdende pJS8-plasmidet ble dyrket over natten eller inntil de nådde den ønskede optiske tetthet (600 nm) under kontinuerlig omristing ved 37 °C ( E. coli) eller ved 30 °C ( V. cholerae) i flytende LB-medium inneholdende ampicilin (100 / Ag/ ml) og/eller rifampycin (50 ^ig/ml) som egnede mengder. Induksjon av ekspresjon fra tacP-promotoren ved isopropyl-f> -D-thio-galacatopyranosid (IPTG) ble oppnådd enten ved tilsetning av denne forbindelse ved starten av dyrkningen (0,4 mM sluttkonsentrasjon) eller ved.først å dyrke stammene til O-D-^r,^ Of5 under fravær av indusereren, og deretter til-DUU

setning av IPTG og forsettelse av dyrkningen i ytterligere 4 timer før innhøsting. Etter dyrkningen ble bakterie-cellene og kultursupernatantene adskilt ved sentrifugering i 5 minutter i en mikrosentrifuge (Eppendorf). Cellepelleter ble suspendert i kald fosfatbuffret saltoppløsning (pH 7,2) og knust ved to soniske utsendelser på 30 sekunder (Branson sonikator). Påvisning av STa- og CTB-antigener i super-natanter og cellesonikater ble utført ved GMl-ELISA som beskrevet ved anvendelse av monoklonale antistoffer mot henholdsvis nativ STa og CTB (J Sanchez et al, FEBS Letters 208: 194-198, 1986).

Det STa-beslektede decapeptid-CTB-hybrid, kodet for

av pJS8,ble først identifisert i transformert E. coli 101 dyrket under tilstedeværelse av IPTG som beskrevet ovenfor. Plasmid pJS8 ble deretter overført ved konjugasjon fra en hjelper E. coli-stamme (S17-1) til V. cholerae JS1569 (ved anvendelse av de samme fremgangsmåter som beskrevet i eksempel 1). Ekspresjonen av det hybride gen i denne organ-isme, ble deretter studert etter dyrkning med tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av IPTG i løpet av den logar-itmiske fase av veksten, og den cellulære lokalisering av decapeptid-CTB-proteinet ble likeledes bestemt på en lignende måte som beskrevet for CTB alene i eksempel 1. Resultatene i Fig 7 viser at det hybride protein ble dannet på en klart IPTG-avhengig måte og ble fullstendig utskilt til det ekstracellulære miljø. Denne lokalisering av deca-

peptid-CTB muliggjorde dens rensning ved lyso-GMl-affinitetskromatografi på samme måte som beskrevet for rekombinant CTB alene i eksempel 4.

5. 3 Egenskaper for genfusjon- decapeptid- CTB hybrid protein

For å studere egenskapene for decapeptid-CTB ble det hybride protein renset fra kultursupernatanter av Vibrio cholerae-stamme JS1569 inneholdende plasmid pJS8,ved enkel-trinns affinitetskromatografi vesentlig ifølge JL Tayot et al, Eur J Biochem, 113:249-258, 1981.

5 jUg av det rensede protein eller referanse-CTB ble deretter underkastet elektroforese på 13,5 % SDS-polyacrylamid-geler i fravær av p-mercaptoethanol. Proteinprøver ble enten kokt eller hensatt ved romtemperatur i prøvebuffer før elektroforese for derved å analysere proteinet i deres pentamere og monomere former (se TR Hirst & J Holmgren, Proe Nati Acad Sei USA, 84:7418-7422, 1987). De adskilte proteiner ble deretter elektrooverført til nitrocellulose for reaksjon med anti-STa eller anti-CTB monoklonale antistoffer etter-fulgt av inkubasjon med anti-mus IgG koblet til peroxidase (Jackson Biologicals). Immunoreaktive proteinbånd ble til-slutt utviklet ved anvendelse av —kloronaphtol-substrat. Resultatene er vist i Fig 8. Reaksjon med anti-CTB avslørte bånd ved de forventede posisjoner for de pentamere former

av kontroll-CTB eller STa-beslektet decapeptid-CTB hybrid protein. Inkubasjon av de respektive kokte og ukokte prøver med anti-STa monoklonalt antistoff utviklet bånd tilsvarende de pentamere og monomere former av decapeptid-CTB-proteinet, men ga en negativ reaksjon med enten de pentamere eller monomere former av kontroll-CTB. Den monomere form av CTB reagerte ikke med anti-CTB mens derimot en mindre reaksjon av den monomere form av decapeptid-CTB med dette antistoff ble observert.

Decapeptid-CTB-proteinet utviste ingen toksisitet når testet i mengder opp til 10 yU g ved analysebestemmelsen med intragastrisk injeksjon i museunger, utført som beskrevet av A-M Svennerholm et al, FEMS Microbiol Letters, under

trykking, 1988. Samtidig testet,renset nativ STa (erholdt

fra Dr A-M Svennerholm) ga positive tester i museunger i

mengder ned til 1 ng, dvs. en 10000-ganger lavere dose. Det STa-beslektede decapeptid-CTB hybride protein var i stand til effektivt å binde anti-STa monoklonale antistoffer både i GMl-ELISA og i immunoblott-analyser; se Fig 7 og 8. Det hybride protein utviste i tillegg et antall egenskaper

karakteristisk for CTB-andelen, som evnen til å pentamerisere, cg å bindes til GMl-reseptoren,og å bli utskilt av V. cholerae; Disse egenskaper ble bestemt ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet i eksempel 4 for rekombinant CTB alene.

Når det rensede protein ble anvendt for å immunisere kaniner,forårsaket det dannelse av antistoffer som kryss-reagerte med nativ STa. Anti-STa-titeret bestemt ved ELISA

under anvendelse av syntetisk, plastovertrukket STa som fast fase-antigen, økte fra et upåviselig nivå i preimmuni-seringsserum til et titer på 1:2000 etter tre subcutane immuniseringer, som fint holdt mål med de oppnådde titere i kaniner ved immunisering med et kjemisk avledet hybrid protein bærende nativ STa. Immunogeniteten sammen med mangelen på toksisitet av det STa-beslektede decapeptid-CTB-protein og dets evne til å gjenkjenne GMl-tarmreseptoren gjør det hybride protein til en kandidat for et toksoid for oral immunisering mot STa-assosiert E. coli-diaré hos dyr og mennesker.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av subenhetsprotein fra koleratoksin (CTB) eller hybrid CTB gen-fusjonsprotein, i E. coli- eller i Vibrio cholerae-vertsceller eller andre Viiriojiaceae-bakterievertsceller som naturlig eller ved manipulering mangler evnen til å produsere koleratoksin, karakterisert ved at nevnte vertsceller inneholder et ekspresjonssystem inneholdende en DNA-sekvens som koder for nevnte CTB eller hybrid CTB gen-fusjonsprotein i kombinasjon med en sekvens som koder for lederpeptidet fra LTB, og hvor nevnte sekvenser er koblet sammen ved anvendelse av oligonukleotider, og er under transkripsjonskontroll av tacP- eller T7RNA-polymerasepromoteren, og hvor det mellom promot-eren og ribosombindingssetet ikke finnes DNA av V. cholerae-opprinnelse, hvorpå vertscellene dyrkes, CTB utskilles fra cellen og isoleres fra dyrkingsmediet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes ett eller begge av oligonukleotidene 5'-CCC GGG-3' eller 5'-TAC CCG GGA GCT-3' ved fusjon til CTB-genet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes ett eller begge av nukleotidene 5'-AGA ATT CAC TGC GCT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCA TGCC-3' eller 5'-CCG GGG CAT GCA GGA TTA CAA CAC AAT TCA GCG CAG TGA ATT CTA GCT-3', ved fusjon til CTB-genet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes oligo-nukleotidsekvenser som koder for dekapeptidet NH2-Cys Ala Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys-COOH, ved fusjon til CTB-genet.