SE462285B - Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer - Google Patents

Description

15 20 25 /a 462 285 bindning' till celler och A-enheten för den direkta 'toxiska aktiviteten pá cellerna. De molekylära aspekterna av kolera- toxinets bindning till tarmceller och andra däggdjursceller och av de skeendena som leder till efterföljande molekylâra aktivering av adenylcyklas genom A-enhetens (och dess A1- fragments) intracellulära verkan har klarlagts i avsevärd detalj (se J Holmgen, Nature 292:413-417, 1981). Under de senaste áren har också kunskap erhållits om de genetiska och biokemiska aspekterna av koleratoxinets syntes, hopfogning och utsöndring i kolerabakterier. CT kodas genetiskt av kromosomalt belägna strukturgener för A- respektive B-subenheterna. Dessa gener har "klonats" från olika kolerabakteriestammar, och deras nukleotidsekvenser har bestämts. Generna för koleratoxinets A- och B-subenheter är ordnade i en gemensam transkriptionsenhet med det sk A-cistronet (QLKA) beläget före B-cistronet (gtxß).

Undersökningar av organisationen av CT-gener i olika ylghglgrae stammar av klassisk och El Tor biotyp, respektive, har antytt att det finns två kopior av CT gener i stammar av klassisk biotyp medan det bara finns en kopia i de flesta El Tor stammar (JJ Hekalanos et al, Nature 306:551-557, 1983). Biosyntesen av CT har visats stå under positiv reglering av en gen, tg5R, som ökar expressionen av gt; màngfaldigt (VL Miller & JJ Hekalanos, Prcc Natl Acad Sci USA, 8l:347l-3475, 1984). IQXR verkar på transkriptionsnivà och finns hos stammar av både klassisk och El Tor biotyp. IQXR ökar troligen transkriptionen av gt; genom att koda för ett regulatoriskt protein som på ett postiivt sätt samverkar med promotorregionen i 933. Studier av det värme- -bakterier (subenhetsstrukturen och funktionen hos LT är mycket lik men labila enterotoxinet (LT) hos 10 15 20 25 462 285 inte identisk med koleratoxinets) har visat att A- och B- subenheterna först syntetiseras i en prekursorform med en ledarpeptid omedelbart före det mogna subenhetsproteinet. Dessa prekursorformer av A- respektive B-subenhet genomgår snabbt en sk processning, dvs ledarpeptiden avlägsnas enzymatiskt, och proteinerna translokeras över bakteriernas inre membran in i det periplasmatiska rummet, där enskilda B-monomerer pentameri- serar och hopfogas med A-subenhet i ett reaktionsförlopp med en halveringstid av 1-2 minuter. Mekanismen för toxinets hop- sättning tycks ske så att A-subenheten binds till B-monomerer eller små B-oligomerer snarare än med den färdiga B-pentameren.

När hopfogningsprocessen har resulterat i komplett toxin, utsöndras hos kolerabakterier det färdiga toxinet extra- cellulärt genom transport över kolerabakteriens yttre membran genom någon typ av interaktion mellan domäner i B-enheten med strukturer i det yttre membranet; denna utsöndring av toxinet hos V, chglerae skiljer sig från förhållandet i E. coli där LT- toxinet förblir i det periplasmatiska rummet och inte utsöndras (TR Hirst & J Holmgren, Proc Natl Acad Sci USA, 84:7418--7422, 1987: SJS Hardy et al, ipig 85:7l09-7113, 1988). Om 'under experimentella betingelser B-subenheterna från CT eller LT produceras i frånvaro av någon A-subenhet (flera sådana stammar eller mutagenes genom har preparerats kemisk genom genavlägsnande med hjälp av rekombinanta DNA-metoder) bildar B- subenheterna pentamerer som utsöndras från kolerabakteier via samma vägar som för det intakta toxinet i allt utom att hopfogningen sker något långsammare i periplasman (TR Hirst et al, Proc Natl Acad Sci USA 81:2645-2649, 1984: SJS Hardy et al, ÅQÅQ, 8527109-7113, 1988). 10 15 20 25 462 285 Vaccination mot kolera genom parenterala injektioner har endast givit ett begränsat och kortvarigt skydd (vanligen mindre än ett 50%-igt skydd under mindre än 6 månader). På grund av den dåliga effekten av sådana parenterala vacciner har när det gäller vaccinframtagning inriktningen istället skiftat till utveckling av perorala vacciner som kan stimulera immunitet i tarmen på ett mera effektivt sätt. Särskilt intresse har härvid dragits till att kunna inkludera koleratoxinets B-subenheter (CTB pentamerer) som är en komponent i sådana perorala koleravacciner (J Holmgren et al, Nature 269:602-604, 1977).

CTB är ett effektivt peroralt immunogen, som i en stor fältprövning har visats ge upphov till skyddande immunitet mot både kolera och diarré orsakad av LT-producerande E. ggli (J Clemens et al, Lancet ii:124-127, 1986; J Infect Dis, 158:372- 377, 1988). Avskiljandet av B-subenheten från den toxiska A- enheten utesluter all risk för att toxisk aktivitet ska kunna àteruppstá, och CTB har givits peroralt 'till mer än 25,000 personer utan nâgra biverkningar. Dessa egenskaper har gjort CTB till en viktig komponent, tillsammans med avdödade hela koleravibrioner, i ett nytt peroralt koleravaccin. Dessutom har nyligen CTB tilldragit sig mycket intresse som immunogent eller bärarprotein för olika andra antigener av peptid- kolkydratnatur, och CTB har också använts som receptorblockerande och receptormodulerande agens för korttidsprofylax av kolera och E¿_gg1irorsakad diarré (RI Glass et al, J Infect Dis, 149:495-500, 1984; ST Donta et al, ihig 1988; SJ McKenzie & JF Halsey, l57:557-564, J Immunol, 10 15 20 25 .r 462 285 133:1818-1824, 1984; A-M Svennerholm et al, J Clin Microbiol, 24:585-590, 1986).

Dessa observationer har understrukit ett behov av att kunna öka utbytet av CTB för storskalig produktion, helst på ett sådant sätt att man på samma gång kan undvika nackdelen i nuvarande preparatíonsmetoder (se JL Tayot et al, Eur J Biochem 113:249- 258, 1981) att behöva rena CTB-proteinet från toxiskt aktivt toxin.

Mot denna bakgrund, och med hjälp av de strategier och procedurer som beskrivs i denna ansökan, har vi därför konstruerat olika överexpressionssystem för såväl CTB som CTB- hybridproteiner (fusionsproteiner) i vilka olika system genen för CTB (eller motsvarande gen för hybrid-proteinet) är under transkriptionskontroll av en stark främmande (icke-koleratoxin) promotor. Vår framgång i dessa avseenden kontraster-ar med tidigare försök via olika procedurer av JJ Mekalanos et al (Nature 306:551-557, 1983) att uppnå överexpression av CT med användning av ett av de promotorsystem (QLQP) som beskrivs i ett av våra exempel: Mekalanos et al rapporterade att deras försök att använda tagP-promotorn misslyckades genom att de resulterar i produktion av mindre mängder av CTB än vad som erhölls med den naturliga ctx promotorn.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Genom användning av rekombinanta DNA-metoder har vi kunnat erhålla sk överexpressionssystem för syntes av koleratoxinets B-subenhet (CTB) eller derivat av CTB inkluderande hybrid- 10 15 20 25 462 285 fusionsproteiner av CTB. Dessa system kännetecknas av att expressionen (transkriptionen) av den gen som kodar för CTB eller CTB-derivatproteinet har bringats under kontroll av en stark främmande promotor (dvs en som normalt inte är involverad i expression av koleratoxin) i plasmidvektorer med bred värdcells-specificitet . De beskrivna genkonstruktionerna fungerar oberoende av de för koleratoxinsyntes normala regleringssystemen som bestäms av den naturliga CT-promotorn respektive tggR-systemet. Två olika sådana överexpressions- system exemplifieras i ansökan: ett i vilket CTB uttrycks antingen inducibelt eller konstitutivt under kontroll av den sk gagP promotorn, och ett annat system i vilket expressionen av CTB kontrolleras av den sk T? RNA polymeras-beroende promotorn.

I dessa exempel har de genkonstruktioner som tillåter överexpression placerats i plasmidvektorer med bred värdcells- specificitet, vilket tillåter produktion av stora mängder av CTB eller CTB-derivatproteiner från olika bakteriearter, t ex E, ggli' och som hârbärgerar dessa plasmider.

Möjligheten att använda de beskrivna, av främmande promotor- kontrollerade överexpressionssystemen för produktion av CTB- derivat i form av hybrid-fusionsproteiner exemplifieras också i ansökan, genom att där beskrivs fuseringen av en syntetisk DNA- sekvens som kodar för en icke-toxisk decapeptid (framtagen från det värmestabila enterotoxinet STa från E_._ç_oli) till genen för CTB samt expressionen av det erhållna genfuseringsproteinet i kolerabakterier under kontroll av tagP-promotorn. 10 15 20 462 285 DEFINITIONER ocn FÖRKORTNINGAR Termerna CTB respektive CTB-derivat i ansökan avser varje protein eller peptid (med undantag av LTB från E¿_gQli) med sádana egenskaper att proteinet eller peptiden kan påvisas med hjälp av immunserum (antiserum) framställt mot det CTB protein som kodas av plasmiden pJS162 som beskrivs i denna ansökan.

Termen främmande promotor avser varje promotor som karakteri- seras av att vara annorlunda än den naturliga ctx-promotorn.

Termen främmande ledarpeptid avser varje peptidsekvens på en proteinmolekyl som underlättar translokeringen av ett protein, i denna ansökan translokeringen av CTB eller CTB-derivat, över cellmembran så länge som peptidsekvensen ifråga är annorlunda än de naturliga ledarpeptiderna för koleratoxinets subenheter.

Den gängse nomenklaturen, såsom den används i t ex E-L Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, New York (1987) tillämpas i ansökan för att definiera DNA restriktions endonukleaser, restriktionsställen och restriktionssekvenser.

Oligodeoxynukleotider och aminosyror benämns i ansökan med sina respektive konventionella en-bokstavs och tre-bokstavsförkort- ningskoder. 10 15 20 25 462 285 8 em e em el . OHB N " _ V B KO O V O ro v ' ' - Baserat pà teoretiska överväganden och preliminära försök förmodade vi att överexpression.av CTB från en främmande (icke- CT) promotor möjligen skulle kunna erhållas om genen för CTB kunde föras så nära den främmande promotorn som möjligt, helst så att allt icke-CT-kodande DNA av V, chglerae ursprung kunde undvikas mellan den främmande promotorn och genen för CTB. I föreliggande exempel beskriver vi procedurer i vilka denna strategi har använts med framgång för att konstruera ett överexpressionssystem för produktion av CTB genom att CTB-genen under expressionskontroll av inducerbar placerats ;agP promotor.

I E. coli har det DNA som kodar för ledarpeptiden på LTB ett enstaka EQQRI restriktionsstålle i sin 5'-ända beläget precis framför ("uppströms") det ribosombindande stället: detta restriktionsställe har nyligen använts för att infoga genen för flL_ggli LTB bakom den starka ;ggP promotorn varvid en plasmid benämnd pMMB68 erhållits av H Sandkvist et al (J Bacteriol 169: 4570-4576, 1987). För att kunna dra fördel av detta strategiskt belägna EQQRI ställe (som saknas i CTB-genen) för att överföra expressionen av CTB till att kontrolleras av denna promotor (tggP) beslöt vi att genetiskt fusera det mogna CTB-proteinet 10 15 20 25 462 285 till ledarpeptiden för LTB i pMMB68, som är en plasmid med lämpligt bred värdcellsspecificitet. CTB-genen frán pCVD30 (ursprungligen från y¿_ghglgrgg 01 stam 0395, klassisk biotyp, Ogawa serotyp) har ett ädel ställe vid positionen för aminosyra (AS) 18 i ledarpeptiden medan LTB-genen har ett §ggI sekvens i början av det "mogna" proteinet. Fusering av CTB-genen via dess 5' ädel ända till 3' åagl ändan i LTB-genen med hjälp av en syntetisk oligonukleotid-"linker" som visas i Fig 1A ledde till att ledarpeptiden i CTB ersattes av ledarpeptiden för LTB. Den som visas i Fig 1B, erhållna plasmiden, benämnd pJS162, innehöll härigenom den hybrida CTB-genen som ett EcoRI-HindIII DNA-segment. nerströms om tacP promotorn. (Alla figurer och tabeller som hänvisas till finns i Appendix till ansökan).

De procedurer som användes för att erhålla de ovannämnda konstruktionerna var sonl beskrivs i det följande. Plasmiden pMMB68 i 5. coli stammen HB10l tillhandahölls vänligen av M Sandkvíst, Umeå universitet. Plasmiden pCVD30 i E, coli HBl01 erhölls från dr J Kaper, University of Maryland, Baltimore, USA. (För en detaljerad beskrivning av dessa plasmider se M Sandkvíst et al, J Bacteriol 169:4570-4576, 1987 och JB Kaper et al, Biotechnology 2:345-349, 1984). De icke fosforylerade oligodeoxynukleotiderna som användes för att. koppla ygagl 3' ändan av LTB-ledarsekvensen till 5' ädel-sekvensen i CTB-genen inhandlades som enkelsträngar fràn Immunologiska institutionen, Biomedicinska Centret, Uppsala universitet där de tillverkats på vår beställning. Dessa strängar parades genom att blanda sträng och sedan inkubera molärt lika mängder av varje blandningen i rumstemperatur över natten. Den erhållna 10 15 20 25 /C 462 285 dubbelsträngade oligonukleotiden hade äggl- respektive de- förenliga enkelsträngade utskott och kunde därigenom direkt kopplas till pMMB68 som behandlats med åagl och HigdIII restriktionsenzymer. I-Iopfogningen skedde genom att inkubera ett i molära termer lo-faldigt överskott av oligonukleotid till plasmid DNA vid 4°C över natten tillsammans med ligeringsenzym T4 (T4 ligas). Till ligeringsblandningen tillsattes sedan i lika molär mängd med avseende pá vektorplasmid-DNA ett renat ggLeI-fiiggIII fragment från plasmid pCVD30 innehållande CTB- genen, och hopfogningsreaktionen med ligas tilläts sedan fortsätta i ytterligare 18 timmar vid 4°C. Det ligerade DNA' t infördes sedan genom transformation in i kompetenta E_,__ç_o_1_,i_ HB101 celler med selektion för ampicillinresistens (100 ug/ml).

Alla enzymer som användes i dessa procedurer köptes från Boehringer Mannheim, GmBH, Västtyskland och användes enligt tillverkarens rekommendationer. Reningen av plasmid-DNA skedde med den sk lut-lys-metoden, och transformationen in i E, cgli med den sk kalcium-rubidiumklorid-metoden i enlighet med de detaljerade metodbeskrivningarna i T Manniatis et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

För att säkerställa att de predikterade sekvenserna hade erhållits efter kloning subklonades hybridgenen i H13 och sekvenserades med den sk dideoxynukleotid-metoden som utveck- lats av F Sanger et al, Proc Natl Acad Sci, USA 74:5463-5467, 1977. Den genom detta förfarande bestämda sekvensen konfirmerade den rapporterade sekvensen för LTB:s ledarpeptid (J Leong et al, Infect Immun 48:73-77, 1985) och visade en hög 10 15 20 25 U _ _ _ 462 285 grad av överensstämmelse (homologi) med tidigare rapporterade gensekvenser för "moget" CTB från El Tor och klassiska kolerastammar (ML Gennaro & P Greenaway, Nucleic Acids Res 11: 3855-3861, 1983; H Lockman & JB Kaper, J Biol Chem 258:13722- 13726, 1983; JJ Mekalanos et al, Nature 306:551-557, 1983: A Kurosky et al, J Biol Chem 252:7257-7264, 1977: CY Lai, J Biol jämförelse mellan oligo- Chem 25227249-7256, 1977). En nukleotidsekvensen (och därav kodade aminosyror) i vår rekombinanta CTB-gen (frán, stam V. cholerae 0395 klassisk biotyp) och dessa andra sekvenser presenteras i figur . 1.2. ression av den tacP-kontro e ade CTB- enen ' V.cholerae Plasmiden pJS162 innehållande CTB-genen under kontroll av tggP (figur 1) överfördes genom konjugering från en sk hjälpar- E¿ggli;stam, S17-1 (R Simon et. al, Biotechnology 2:784-791, 1983) till antingen V. gholerge 01-stammen JBK70 (biotyp El Tor) (JB Kaper' et al, Nature 308:655-658, 1983) eller till För att andra El Tor eller klassiska V. o e ae stammar. åstadkomma denna överföring reisolerades först DNA från pJS162- plasmiden ur E¿_gQli HB101 och infördes i E. ggli S17-1 genom transformation med användning av de procedurer i Manniatis et al (1982) som refererades till i sektion 1.1 ovan. De transformerade S17-1-cellerna användes sedan som donator- organismer i konjugeringsförsök med de olika mottagar-stammarna av V. cholegae. Konjugeringarna utfördes enligt följande. De transformerade S-17-1 givarorganismerna och V. ghglerae mottagarcellerna odlades över natten utan skakning och vid en temperatur av 37°c i io m1 La medium till vilket tillsatte de 10 15 20 25 12 462 285 för selektion lämpliga antibiotika. Från varje kultur togs sedan 3 ml bakteriesuspension och trycktes genom ett MilliporeR filter av typ GS 0.22 um med hjälp av en injektionsspruta, vilket sedan mottagar-cellerna först givarcellerna och förfarande förde dessa celler i nära kontakt med varandra på filtrets yta. Filtret placerades sedan varsamt pà en LB- agarplatta utan antibiotika och inkuberades i ca 3 timmar vid 37°C. Därefter överfördes filtret till ett provrör innehållande 5 ml LB-buljong, bakterierna överfördes till suspension genom att röret skakades, och sedan togs ca 0.1 ml av den blandade inkuberades i bakteriesuspensionen och ny LB-buljong med lämplig antibiotika-motselektion av givarcellerna. Bakterie- blandningen odlades i LB-buljong innehållande 50 enheter/ml av polymyxin B och 100 ug/ml ampicillin för motselektion av givarcellerna när y¿_ghg1erge stammar av El Tor-biotyp användes som mottagare för pJS162. När' plasmiden istället överfördes till yL_ghg1e;gg stammar av klassisk biotyp isolerades först rifampycin-resistenta derivat av dessa stammar, och selektionen för rifampycin-resistenta pJSl62-mottagarstammar skedde sedan genom odling i LB-buljong som innehöll 50 ug/ml rifampycin och 100 ug/ml ampicillin.

Produktionen av CTB från y¿_ghgler§e stammar som härbärgerade pJSl62-plasmiden bestämdes enligt följande. För inducering med isopropyl-ß-D-tio-galaktopyranosid (IPTG) odlades bakterie- kulturer till önskad täthet (0D600) vid en temperatur av 37°C i LB-buljong innehållande lämpliga antibiotika och sedan tillsattes IPTG till önskad koncentration. Inkuberingen fortsatte sedan i ytterligare 4 timmar och celler och odlings- 10 15 20 25 /X 462 285 supernatanter separerades genom centrifugering. Cellsedimenten tvättades varsamt och resuspenderades i en ursprungsvolym av 7.2, varefter cellerna kalv-fosfatbuffrad koksalt, pH desintegrerades med ultraljud (tvâ 30-sekunders behandlingar med hjälp av en "Branson sonifier miniprobe"). Koncentra- tionerna av CTB i supernatanter och ultrasonikerade celler bestämdes i efterhand med den sk GM1-ELISA-metoden med användning den monoklonala antikroppen LT39 (A-M Svennerholm & J Holmgren, Curr Microbiol 1:19-23, 1978). Resultaten visade att överföringen (genom konjugering) av pJS162 till den genetiskt toxin-deleterade V. cholerae JBK70-stammen ledde till produktion av 40-50 ug/ml av CTB från denna stam efter odling i LB-medium med IPTG-inducering; mer än 95% av det bildade CTB utsöndrades i kulturmediet (Figur 3). Produktion av CTB i koncentrationer av upp till 50-100 ug/ml erhölls också i andra toxin- eller A-subenhets-deleterade klassiska och El Tor- stammar till vilka pJS162-plasmiden överförts under förut- sättning att stammarna odlades i närvaro av IPTG (Iabgll_l).

Dessa produktionsnivåer representerade en markant över- expression av CTB i jämförelse med de koncentrationer som producerades av ett stort antal undersökta V. cholerae-stammar av såväl vildtyp som rekombinant-DNA-typ inkluderande den högproducerande stammen 5698 som för' närvarande används för vaccinproduktion. Efterson det framställning av CTB för rekombinanta CTB-proteinet som kodas av pJS162 utsöndrades extracellulärt när det producerades av V, cholerae-bakterier kunde det sedan lätt renas med högt utbyte från odlingssuper- natanterna från vilken som helst av dessa kolerastammar t ex med användning av den receptor-specifika affinitietskromato- 10 15 20 25 I? 462 285 grafiska metoden pà lyso-GM1-gangliosid (metod enligt JL Tayot et al, Eur J Biochem ll3:249-258, 1981), se exempel 4 nedan. v onst'tut' xem e . " e e ess°o av a vän i tacP prgmgtgt I denna konstruktion skars med enzymatisk teknik CTB-genen ut ur plasmiden pJS162 (som beskrevs i exempel 1 ovan) och genen insattes sedan i en ny plasmidvektor pKK223-1, som innehåller tag? promotorn men inte den lggI9 gen som finns i pJS162 och som är ansvarig för IPTG-beroendet.

Samma standardprocedurer för isolering av plasmid-DNA och för utskârning, ligering, transformation in i §t__ggli och konjugativ överföring av DNA till yt__ghglet§e användes som beskrevs i exempel l ovan. CTB-genen i plasmid pJS162 skars med ett EQQRI-HÅQQIII fragment och ligerades sedan till Itgkl-fligdllï restrikterad motsvarande restriktionsenzymer ut som plasmid pKK223-1 (fràn Pharmacia, Uppsala), vilken senare plasmid innehåller tag? promotorn uppströms EQQRI-stället.

Detta förfarande genererade plasmiden pJS7523-1 vilken genom transformation infördes i Et_ggli HB101 samt också överfördes till yt_ghglg;ae-stammarna JBK70 och JS1395 genom konjugering med hjälp av Et_ggli hjâlparstammen S17-l. Laglí-genen i pJS162 kodar för stora mängder av lgtlfl-repressor och frånvaron av denna gen i plasmiden pJS7523-1 resulterar i en praktiskt taget IPTG-oberoende expression av CTB under kontroll av tag? i bakteriestammar som härbärgerar pJS7523-l. Detta testades genom att vid 37°C odla Et_ggli 101 celler som härbärgerar pJS7523-1 i LB-buljong tillsatt med 100 pg/ml ampicillin till en täthet 10 15 '20 25 /F av 00600 = 1.0 i duplíkatuppsättningar av provröâóšarezfâešr IPTG tillsattes i en koncentration av 100 pg/ml till den ena uppsättningen men inte till den andra med fortsatt inkubering av' bakteriekulturerna i. ytterligare 4 'timmar vid 37°C. Prov från odlingen exponerades sedan för ultraljudbehandling i form av två 30-sekunders ultra-ljudsstötar med användning av en "Branson sonifier míniprobe“ för att spräcka cellerna, och efter centrifugering analyserades sedan de ultraljudsbehandlade kulturerna med avseende på sitt innehåll av CTB med GMl-ELISA- metoden (också beskriven i exempel 1). Resultaten visade att relativt höga koncentrationer, 2-7 pg/ml, CTB producerades i frånvaro av IPTG, och dessa nivåer var bara 2-3 gånger lägre än de som erhölls i närvaro av IPTG. Detta står i skarp kontrast till effekten av IPTG på expressionen av CTB under kontroll av tagP in pJS162, där i frånvaro av IPTG produktionen av CTB var under detektionsnivån (se exempel 1, figur 2). Resultaten visar att, fastän expressionen av CTB i PJS7523-1 fortfarande regleras av Lgl laktosoperonrepressorn är expressionen ändå praktiskt taget konstitutiv. Detta beror troligen på det faktum att den kromosomalt kodade lagl repressorn inte produceras i tillräckliga mängder för att effektivt binda till både lag- operatorn i kromosomen och till tag? i plasmiden pJS7523-1 som kan finnas i ett stort antal kopior per cell.

Exempel 3. EXPRESSION AV CTB UNDER KONTROLL AV Q7 RNA YHERAS-BERO ROH R I detta exempel dokumenterar vi att det också är möjligt att åstadkomma överexpression av CTB genom att placera CTB-genen 10 15 20 25 /6 462 285 under expressionskontroll av en annan stark främmande (icke-CT) promotor, den sk T7 RNA polymeras-beroende promotorn.

Strukturgenen för CTB (inkluderande den DNA-sekvens som normalt kodar för ledarpeptiden i LTB) i plasmiden pJS162 utskars enzymatiskt från denna plasmid och insattes i plasmidvektorn T7-5 som innehåller den mycket specifika och starka T7-RNA polymeras-beroende prmotorn som beskrivits av S Tabor och CC Richardson (Proc Natl Acad Sci USA 82:1074-1078, 1985).

Expression från denna promotor kräver närvaro av T7-RNA polymeras vilket tillhandahålles med hjälp av en komplement- plasmid (pGP1-2); det RNA-polymeras som kodas av denna plasmid uttrycks under kontroll av en promotor som kan induceras genom en förändring i odlingstemperaturen (vanligen från 30°C till 42°c).

De metoder som användes för isolering av plasmid-DNA och för excidering, ligering, transformation till E_,__g9_1_i respektive konjugering till var väsentligen desamma som de som beskrevs i exempel 1. CTB i pJS162 exciderades som ett EgQRI- fiiggiIII fragment som sedan insattes i EgQRI-HÅQQIII enzym- behandlad plasmidvektor pT7-5 (som erhållits från Dr S Tabor, Harvard University, Mass, USA). Den därvid erhållna nya plasmiden transformerades sedan in i E_.__ç_ç_1_i 101 bakterier innehållande plasmiden pGP1-2 (också från dr Tabor). När dessa transformerade E. coli bakterier odlades i LB-buljong med lämpliga antibiotika tillsatta med hänsyn till de två typerna av plasmider i cellerna (kanamycin 50 Pg/ml; ampicillin 100 lig/ml) producerade cellerna inte upptäckbara nivåer av CTB vid 10 15 20 25 17- 462 285 en temperatur av 30°C, medan en efterföljande förändring i odlingstemperaturen frán 30°C till 42°C resulterade i expression av 2-3 pg/ml CTB i §_._go_l_,i_ (bestämning med GHl- tillsammans med T7 RNA polymeras- ELISA-metod) . CTB-genen beroende promotor subklonades sedan som ett PvuII-flindIII fragment som sattes in i §coRV-J-_I;LndIII digererad plasmid -pBR325. Den nya plasmiden (pJS7525) överfördes sedan från en §_._ gul; stam som innehöll plasmiden pRK20l3 till V. o erae JBK70-celler till vilka plasmiden pGPl-2 tidigare överförts genom konjugering från samma E. coli givarceller. Den samtidiga närvaron av bägge plasmiderna var möjlig därför att de har förenliga replikeringsursprung och på grund av att pJS7525 kodar för resistens mot kloramfenikol (och ampicillin) medan pGPl-2 har en gen som kodar för kanamycinresistens. När Væholerge JBK70 innehållande plasmiderna pJS7525 och pGPl-2 odlades till hög täthet i LB-buljong innehållande 25 pg/ml kloramfenikol och 50 pg/ml kanamycin vid en temperatur av 30°C producerade inte bakterierna upptäckbara nivåer av CTB, medan en efterföljande ökning i odlingstemperaturen till 42°C resulterade i den förväntade T7 RNA polymeras-beroende ökningen i expressionen av CTB till nivåer av 75-100 pg/ml i odlings- Resultaten bevisade supernatanterna f rån V . ch . definitivt både att det är möjligt att åstadkomma överexpression av CTB med hjälp av olika främmande promotor- system (av icke-koleratoxinursprung) och att den erhållna över- expressionen är oberoende av det sk tggk-regulatoriska systemet eftersom en av de faktorer som leder till hög expression av CTB under styrning av tlR är en låg odlingstemperatur kring 30°C (MJ Betley et al, Ann Rev Microbiol 40:577-605, 1986). Det 10 15 20 25 /X 462 285 inducibla system som här beskrivits för expression av CT var mini:-lt vid den optimala temperaturen för tgxk och maximalt vid en icke-optimal temperatur för LQXR.

Exempel 4.

Vi har karakteriserat några av de egenskaper som kännetecknar rekombinant CTB som framställts med hjälp av de genkonstruktioner som beskrivits i de föregående exemplen. Vára resultat, här exemplifierade med renframställd CTB som kodats från plasmiden pJSl62 i V; cnglgrge-stammen JBK70, visar att det rekombinanta CTB-proteinet trots några få aminosyra- skillnader jämfört med CTB som renats fràn koleratoxin producerat av vildtypstammen y¿_ghg1g;gg 5695, inte skiljer sig pá något pàvisbart sätt i nâgra av de strukturellt-funktionella eller immunologiska egenskaperna som undersökts. . e ' v tå ' v ' y¿__ghg1grgg El Tor JBK70-bakterier innehållande plasmiden pJSl62 odlades vid 30°C under kontinuerlig skakning i 2 liter LB-medium innehållande 100 pg/ml ampicillin och 100 pg/ml IPTG.

Efter odlingen avlägsnades bakterier och bakteriefragment genom centrifugering. Det rekombinanta CTB-proteinet i supernatanten renades sedan genom affinitetskromatografi pá en lyso-GMl gangliosid-SpherosilR pelare med användning av den procedur som beskrivits av JL Tayot et al, Eur J Biochem 113:249-258, 1981.

Bestämning av de aminoterminala aminosyraresterna i det renade CTB bestämdes sedan enligt beskrivningen av H von Bahr- Lindström et al, J Prot Chem 1:25?-262, 1982. ö; l0 15 20 25 19 462 285 Klyvningen av prekursorpeptiden i det rekombinanta CTB- proteinet borde enligt våra förutsägelser ske vid endera eller bägge av de igenkänningsställen för sk ledarpeptidas som är kända i de ursprungliga LTB- respektive CTB-proteinerna som kodas av den hybrida CTB-genen. Vår bestämning av den första, dvs den aminoterminala aminosyran i det renade CTB-proteinet visade både Tyr och Ala rester. Tillsammans med det faktum att det rekombinanta CTB-proteinet var något större än det nativa CTB-proteinet vid undersökningar med natriumdodesyl-sulfat polyakrylamidge1-elektrofores (NaDodSO4/PAGE), se figur 4, pekade detta på att proteolytisk klyvning av ledarpeptiden hade skett såväl mellan den Gly-rest som kodas av vår linker-DNA (position -5) och Tyr -4 som mellan denna senare aminosyra och Ala -3 (see figur 2). När återstoden av det behandlade CTB- proteinet utsattes för en ny rond av aminoända-bestämning identifierades nu Ala- respektive His-rester vilket konfirmerar de postulerade klyvningspositionerna och ger belägg för att det rekombinanta CTB-proteinet jämfört med det nativa CTB-proteinet sin aminoända innehöll korta peptidutskott) i från 5698 bestående av antingen 3 eller 4 aminosyror. kera d e e ska r 4.2 ece to -' e ånn nde ece tor-b Närvaron av de få extra aminosyrorna i det rekombinanta CTB- proteinet påverkade inte proteinets förmåga att känna igen GM1- receptorn. Bindningsaffiniteten för plast-bunden GM1-gangliosid jämfördes för det rekombinanta CTB-proteinet och renat referens-CTB från stam 569B (gåva från dr J Armand, Institut Mérieux, Frankrike). Detta skedde genom att undersöka olika 10 15 20 25 20 462 285 koncentrationer med användning av GM1-ELISA-metodíken och ingen skillnad kunde avslöjas mellan de bägge proteinerna. Den höga bindningsaffiniteten för GH1-gangliosid i det rekombinanta CTB- proteinet togs också fördel av i reningen på lyso-GM1- SpherosilR som beskrivits ovan.

Försök utfördes också för att bestämma förmågan hos det rekombinanta CTB-proteinet jämfört med CTB från 569B bakterier att kunna blockera receptorer iför' koleratoxin i tarmen hos kaniner. Försöken utfördes på ett sådant sätt att endera av de bägge CTB-preparationerna injicerades i ligerade tarmslyngor i djuret ca 10 min före det att samma tarmslynga injicerades med renat koleratoxin i en dos (0.2 pg) som från våra förförsök var känd att inducera en kraftig vätskesekretion från tarmen (experimentell kolerasjukdom) om det inte förelåg någon specifik receptorblockeringseffekt (de detaljerade procedurerna i denna försöksuppsâttning har beskrivits av J Holmgren et al, Infect Immun 38:424-433, 1982). De erhållna resultaten visade att de bägge CTB-preparationerna, rekombinant respektive nativt 569B, hade likartad receptorblockerande aktivitet. Bägge preparationerna förebyggde fullständigt den koleriska vätske- sekretionen när de tillsattes i en mängd av 50 pg i 1 ml volym till ca 5 cm långa ligerade tarmslyngor just före injiceringen av koleratoxin (som kom från 569B -bakterier) i slyngorna. I kontrollslyngor som förbehandlades med buffert istället för CTB och sedan injicerades med samma dos av koleratoxin inträffade en kraftig vätskeansamling, 1.7i0.2 ml/cm. I tarmslyngor som förbehandlades med 10 pg eller lägre mängder av CTB före toxininjektionen sågs en partiell eller »n 10 15 20 25 62.! 462 285 ingen reduktion av vätskeansamlingen jämfört med de buffert- förbehandlade kontrollslyngorna. 4.3 Oligomerisering och förmåga att binda A-subenhet I andra undersökningar visades att det rekombinanta CTB- proteinet också var cpàverkat i sin förmåga att både oligomerísera och att binda koleratoxinets A-subenhet (CTA).

Dessa studier tillgick så att renat CTA (framställt från 569B CT: List Biological Laboratories) blandades med renat rekombinant eller 5698 CTB-protein i samma molära förhållande av CTB till CTA som normalt finns i intakt CT; blandningen utfördes så att den totala proteinkoncentrationen var 200 pg/ml. Efter blandningen surgjordes blandningsprov med 0.02 M glycinbuffert, pH 2.7, varefter proven neutraliserades genom dialys över natten mot flera byten av 0.05 M Tris-buffert, pH 8.0. De neutraliserade proven testades sedan med GM1-ELISA med användning av subenhet-specifika monoklonala antikroppar på sätt som vi nyligen beskrivit (SJS Hardy et al, Proc Natl Acad Sci USA, 85:7l09-7113, 1988). Mängderna av 569B CTA som bands till rekombinant eller 5698 CTB-protein och gav upphov till holotoxin kalkylerades med användning av obehandlat homologt koleratoxin som referens. Resultaten visas i tabell 2. De demonstrerar en hög återvinning av immunoreaktivt CTB-protein, vilket utgör ett direkt mätt på pentamer-formen snarare än mcnomer-formen av CTB eftersom den (HB-specifika monoklonala antikropp som användes för påvisningen är känd för att endast reagera med pentamerformen av CTB. Resultaten visar också en hög återvinning av immunoreaktivb CTA, vilket är ett direkt mått på mängden av CTA som bundita till CTB efterson icke- 10 15 20 25 QL 462 285 bunden CTA inte skulle kunna binda till de Gill-klädda plastskàlarna och därigneom förbli Som visas i oupptäckt. tabell 2 uppför sig det rekombinanta CTB-proteinet och det renade referens-CTB-proteinet från 569B V, gholerag på ett mycket likartat sätt i dessa försök. 4. 's a e os o Vuxna kaniner gavs 3 subkutana immuniseringar med 30 pg av antingen rekombinant CTB eller .nativt 569B CTB med 2 veckors intervall mellan- de olika injektionerna. Proteinerna gavs tillsammans med ett komplett Freund's adjuvans i den första inokuleringen och sedan med ett inkomplett adjuvans. Två veckor efter den tredje immuniseringen blöddes djuren och serum togs till vara för analys.

Immunoprecipitationsanalyser med dubbeldiffusion-i-gel-teknik ad modum Ouchterlony utfördes med användning av det mikrokammar-system som beskrivits av C Wadsworth, Int Arch Allergy 17:165-177, 1957. Undersökningarna utfördes med det renade rekombinanta CTB-proteinet respektive 5698 CTB och deras motsvarande kaninimmunsera som reaktanter. Resultaten visade immunoprecipitationsband som sammansmälte utan några "sporrar" rekombinanta respektive nativa mellan de CTB-proteinerna indikerande immunologisk identitet (Figur 5).

Titrering av antitoxin-antikroppar i kaninimmunsera mot rekombinant respektive nativt 5698 CTB företogs med GHl-ELISA: renat rekombinant respektive 5698 CTB vidhäftade till Gill- klädda mikrotiterplattor användes härvid som antigener (A-M 10 15 20 25 25 462 285 Svennerholm et al, J Infect Dís 147:514-521, 1983). Resultaten visade att anti-CTB-titrarna bestämda med GM1-ELISA var ungefär lika höga, mellan 4xl05 - 1xl05, i anti-rekombinant respektive anti-569B CTB oavsett vilken av de tvâ CTB-preparationerna som användes som solid-fas antigen.

Neutraliserande antikroppar bestämdes med. JP Craigs hudtest (Nature 207:614-616, 1965) med användning av renat 569B CT som testtoxin. Värmeinaktiverat serum blandades härvid i seriespädningar med lika volymer av renat 569B CT, 40 ng/ml i fysiologisk fosfatbuffrad koksaltlösning tillsastt med 10 mg/ml av bovint serumalbumin, och 0.1 ml av blandningen undersöktes sedan med avseende på kvarstående toxisk aktivitet genom injektion intradermalt (i kanin). De neutraliserande antitoxin- titrarna skilde sig inte mellan sera framställda mot rekombinant CTB respektive 569B CTB. Båda typerna av antisera kunde komplett neutralisera den använda testdosen av CT, 2 ng, i spädningskoncentrationer ner till 1xl0'4.

De olika manipulationer som beskrevs i exempel 1 för att placera CTB-genen under kontroll av tag? promotorn inkluderade med avsikt också introduktionen av specifika restriktions- ställen för enzymer för att möjliggöra genfuseringar till aminoändan av CTB. Inkloning av DNA-sekvenser i. dessa restriktionsställen tillåter konstruktion av CTB-deriverade hybridproteiner som kan innebàlla t ex olika för vaccinbruk 10 15 20 25 24 462 285 tänkbara peptidaantigener på ett sådant sätt att hybrid- proteinerna ifråga också finns under samma expressionskontroll av främmande promotorer, t ex tagP som i de föregående exemplen beskrivits för CTB-protei net självt . Den praktiska tillämpningen av detta tillvägagångssätt exemplifieras här genom beskrivningen av fuseringen av en peptid, som är strukturellt relaterad till det värmestabila L__ggl_i entero-_ toxinet STa och som kodas av syntetiska oligodeoxynukleotider, till aminoändan av CTB i ett gagP-dirigerat överexpressions- system. 5.1 s av konst t'o Plasmiden pJS162 som innehåller enkla 351 respektive Qgmal (_$_maI) restriktionsställen vid övergången mellan ledarpeptiden och det mogna CTB-proteinet (se figur 113) digererades med motsvarande två enzymer och ligerades sedan till en syntetisk oligodeoxynukleotid som kodar för den STa-relaterade deca- peptiden Cys-Ala-Glu-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys via åaçl och ängel-kompatibla ändarna (se figur 6). Den resulterande pJS8 plasmiden påfördes därigenom, under kontroll av tag? promotorn, en hybridgen som kodar för ett fusionsprotein där den STa- relaterade decapeptiden, flankerad av några få extra amino- syror, kovalent kopplats till aminoändan av det mogna CTB- proteinet såsom indikeras i figur 6. Sekvensen för den fuserade STa-relaterade decapeptiden var identisk med en region i det nativa STa-toxinet utom i att en cysteinrest ersatts med alanin. Den valda sekvensen baserades på det tidigare fyndet att en icke-toxisk syntetisk nonadecapeptide som innehåller denna speciella aminosyrasekvens specifikt kunde binda en 10 15 20 25 if 462 285 monoklonal antikropp riktad mot STa som i sin tur också visat förmåga att kunna neutralisera E¿_ggli STa (A-M Svennerholm et al, FEMS Microbiol Lett, 55:23-28, 1988). Jämfört med denna tidigare nonadekapeptid är emellertid den sekvens som fuserades kortare och innehåller endast 10 aminosyror inkluderande fyra cysteiner.

De experimentella procedurer och reagenser som användes i denna IL__gg1i-stammen plasmidisoleringar. konstruktion specificerasc i det följande.

HB101 användes som övergàngsvärd för V. e -stammen JS1569 är ett rifampicin-resistent derivat E. ggli S17-1 överföring av plasmider till stam JSl569. av stam CVD103. användes för konjugativ Dessa stammars ursprung och ytterligare egenskaper beskrevs i exempel 1. inkluderande plasmíd-DNA med lut-lysmetoden Isolering av centrifugering i CsCl/ethidiumbromid-gradienter, DNA-trans- formationer till E. coli och konjugeringar till yåghglgrag utfördes också enligt Maniatis et al (1982) och som specificerades i exempel 1. De betingelser som användes för restriktering respektive ligering av DNA var i enlighet med tillverkarnas rekommendationer av de olika enzymerna. Enzymerna inhandlades från Boehringer-Mannheim och New England Biologics.

De syntestiska oligodeoxynukleotiderna som kodar för den STa- relaterade decapeptiden och angränsande aminosyror beställdes som komplementära individuella strängar från Institutionen för immunologi (dr Lena Samuelsson), BMC, Uppsala. After parning vid rumstemperatur under samma betingelser som beskrevs i exempel 1, innehöll den syntetiska dubbelstrângade oligodeoxy- 10 15 20 25 iß 462 285 nukleotíden enkelstrângade ändar kompatibla med §_a_ç_I i 5'-åndan respektive mal i 3'-ândan. - e a tid CTB fus'o - Bakterieceller bestående av E_.__gg1_i 101 eller V. chglgrge JS1569 innehållande pJSS plasmiden odlades antingen över natten eller tills de vuxit till den önskade tätheten (OD 600 1111): odlingen skedde under kontinuerlig skakning vid 37°C för Lcoli eller vid 30°C för V. ggglergg i flytande LB-medium inne- hållande IDO pg/ml ampicillin och/eller 50 pg/ml rifampycin på lämpligt sätt. Induktion av expression från tacP promotorn genom isopropyl-ß-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ástadkoms antingen genom att tillsätta IPTG vid odlingens början (0.4 mM slutkoncentration) eller genom att först odla stammarna till 00600 = 0.5 i frånvaro av IPTG och sedan tillsätta IPTG och fortsätta odlingen under ytterligare 4 timmar innan kulturen slutligen skördades. Efter odlingen separerades bakterieceller och odlingssupernatanter genom centrifugering under 5 min (i en Eppendorf mikrocentrífug) . Cellsedimenten resuspenderades i kall fosfatbuffrad koksalt-lösning (pH 7.2) och spräcktes sedan med tvâ 30 sekunders ultraljudsbehandlingar med en "Branson sonifier". Påvisning av STa respektive CTB antigener i supernatanter och cellsonikat skedde med hjälp av GMl-ELISA såsom beskrivts tidigare och med användning av monoklonala antikroppar riktade mot nativt STa respektive CTB (J Sanchez et al, FEBS Letters 208:194-198, 1986). 10 15 20 25 if 462 285 Hybridproteinet mellan den STa-relaterade decapeptiden och CTB som kodas av pJS8 pávisades initialt i transformerade Lili lül-celler som odlats i närvaro av IPTG som beskrivits i det föregående . pJSS-plasmiden överfördes därefter genom konjugering från en hjälpar-L__r:_9_l_i-stam (S17-1) till Wgholerae JSl569 (samma procedurer användes som beskrives i exempel 1). Expressionen av den hybrida genen i denna organism studerades sedan efter odling med tillsats av olika koncentra- tioner av IPTG under den logaritmiska tillväxtfasen, och den cellulära lokalisationen av decapeptid-CTB hybrid-proteinet bestämdes också på ett likartat sätt som beskrivits för CTB ensamt i exempel 1. Resultaten i figur 7 visar att produktionen av hybridproteinet var klart IPTG-beroende och att proteinet helt utsöndrades till den extracellulära miljön. Denna lokalisation av decapeptid-CTB-proteinet tillät reningen av detsamma genom lyso-GMl affinitetskromatografi på samma sätt som beskrivits för rekombinant CTB' ensamt i exempel 4.

För att studera egenskaperna hos decapeptid-CTB-hybridproteinet renades detta protein från odlingssupernat från stam JS1569 innehållande plasmiden pJS8; reningen skedde med enstegs affinitetskromastografi i enlighet med metod- beskrivningen av JL Tayot et al, Eur J Biochem 113:249-258, 1981.

Fem pg av det renade proteinet eller referens-CTB användes sedan i elektroforeskörning pà 13.5%-iga SDS-polyakrylamidgeler 10 15 20 25 / 28 462 285 i frånvaro av ß-merkaptoetanol. Proteinproven antingen kokades eller hölls vid rumstemperatur i separationsbufferten före elektroforesen för att möjliggöra analyser av proteinerna i deras pentamera respektive monomera former (se TR Hirst & J Holmgren, Proc Natl Acad Sci USA 84;74l8-7422, 1987). Efter elektroforesen elektroöverfördes de separerade proteinerna till nitrocellulosa för efterföljande reaktion med anti-S'I'a eller anti-CTB monoklonala antikroppar följt av inkubering med anti- mus IgG kopplat till peroxidas (Jackson Biologicals). Immuno- reaktiva proteinband framkallades slutligen genom tillsats av a-kloronaftolsubstrat. Resultaten visas i figur 8. Reaktionen med anti-CTB identifierade band belägna på de förväntade ställena för de pentamera formerna av kontroll-CTB respektive STa-relaterad decapeptid-CTB hybridprotein. Inkubering av de kokta respektive okokta proven med anti-STa monoklonal antikropp framkallade band som motsvarade de pentamera och monomera formerna av decapeptid-CTB hybridproteinet men gav en negativ reaktion med såväl de pentamera som monomera formerna av kontroll-GTS. Den monomera formen av CTB reagerade inte med anti-CTB under det att en mindre reaktion av den monomera formen av decapeptid-CTB hybridproteinet med denna antikropp observerades .

Decapeptid-CTB-proteinet uppvisade ingen toxisk aktivitet när det testades i mängder upp till 10 ug i en toxicitetsassay baserad på injektion av testmaterialet in i magsäcken på nyföda möss; testen utfördes som beskrivits av A-M Svennerholm et al, FEHS Microbiol Letters, 55:23-28, 1988. Samtidigt testat, renat nativt STa-toxin (erhållet från dr A-M Svennerholm) gav positiv 10 15 20 25 3,9 ' 462 285 reaktion i nyfödd-mus-testen i mängder ner till 1 ng, dvs en 10,000-faldigt lägre dos. Det STa-relaterade decapeptid-CTB hybridproteinet kunde effektivt binda anti-STa monoklonala antikroppar både i undersökningar med GMl-ELISA och i sk immunoblot-analyser; se figurerna 7 och 8. Hybridproteinet uppvisade dessutom ett antal egenskaper karakteristiska för dess CTB-komponent, t ex förmågan att pantamerisera, att binda till GM1-receptorn och att utsöndras av y;__ggg1g;gg; dessa egenskaper undersöktes med samma metoder som de som beskrevs i exempel 4 för det rekombinanta CTB-proteinet ensamt.

När det renade proteinet användes för att immunisera kaniner gav de upphov till antikroppar som korsreagerade med nativt STa. Anti-STa-titern, bestämd med ELISA-metodik med användning av syntestisk STa bunden till plast som solid-fas antigen steg från en icke pàvisbar nivå i serum taget före immunisering till en titer av 1:2000 efter tre subkutana immuniseringar. Denna senare titer av specifika antikroppar stod sig väl vid jämförelse med de titrar som uppnåddes genom immunisering av kaniner med ett kemiskt deriverat hybridprotein innehållande nativt STa. Immunogeniciteten hos det STa-relaterade decapeptid-CTB hybridproteinet och dess förmåga att känna igen GMI-receptor i tarmen tillsammans med avsaknaden av toxicitet gör hybridproteinet till en kandidat som toxoid för peroral immunisering mot STa-associerad E, coli-diarré hos djur och människor . '10 462 285 Tabell 1. Överexpression av CTB från tag? promotorn i ylcnglerae Stam Fenotyp CTB (ug/ml) Uttryck av CTB från tacP promotor JBK70 (pJS162 El Tor Inaba 75 CTA- CTB- Js1ss9** (pJs1s2) klassisk Inaba 75 CTA- CTB+ JSl395 (pJS162) klassisk Ogawa 54 CTA- CTB+ Uttryck av CT eller CTB från egen promotor 569B klassisk Inaba 1.28 CTA+ CTB+ CVD103 klassisk Inaba 0.88 (569 derivat) CTA- CTB+ Alla stammar odlades lika länge vid 30°C. Stammar som innehöll pJS162 odlades till A600 1.0 före tillsats av IPTG till en koncentrtion av 100 ug/ml varefter inkuberingen fortsattes under ytterligare 4 timmar.

* Indikerar en icke-funktionell (CTA-) eller funktionell (CTA+) CTA gen och/eller en icke-funktionell (CTB-) eller funktionell (CTB+) CTB gen. stammarna hade preparerats genom gendeletion.

** Stammarna JSl569 och JSl395 är Rifampycin-resistenta derivat av stam CVD103 respektive stam CVD101 (0395 CTA- derivat). Nivàerna av CTB som producerades av de senare stammarna i frånvaro av IPTG understeg 0.5 ug/ml och bidrog därför inte signifikant till de värden som erhölls i närvaro av inducerarsubstansen IPTG.

“TH 462 285 Tabell 2 Affinitet hos rekombinant CTB för CTA Mängd subenhet i holotoxin enligt bestämning med GMl-ELISA Association av CTA med CTA ug/ml CTB ug/ml 56913 cTB 43.3 (6s%)* 114.0 (86%) Rekombinant CTB 42.0 (63%)* 109.6 (82%) Affiniteten av rekombinant respektive 569BCTB för CTA undersöktes genom att pröva deras förmåga att associera sig till CTA in vitro för bildning av kolera heltoxin. Blandningar av CTA och CTB i det molära förhållandet 1:5 surgjordes till pH 2.7 för att dissociera CTB-pentamererna. Associationsprocessen mellan CTA och det tillsatta CTB gynnades sedan genom neutralisation av lösningen med hjälp av dialys mot Tris- buffert pH 8.0. De neutraliserade proven undersöktes sedan direkt med GM1-ELISA med användning av specifika monoklonala antikroppar mot CTA respektive CTB.

* De vården som inom parentes uttrycks som procent refererar till den fraktion av respektive subenhet som återfanns som kolera heltoxin (CT) kalkylerade i relation till den maximala mängden av subenhet som teoretiskt kunde bilda sådant CT. 462 285 Figur 1A. Fuserings-"leden" mellan LTB- och CTB-generna. 31 De med öppna fyrkanter understrukna nukleotiderna indikerar DNA frán LTB-genen, de med fyllda fyrkanter understrukna representerar den syntetiska oligodeoxy- nukleotid-lânkarmen och de som är understrukna med trianglar visar på DNA hörande till CTB-genen.

Siffernumreringen över aminosyrorna refererar till dessa aminosyrors tidigare positioner med avsende på den första aminosyran (+1) i sina respektive mogna proteiner. Stjärnorna indikerar aminosyror som inte ursprungligen kodas av någon av de tvâ fuserade generna. Den syntetiska lânkarmen återställde SacI- stället och introducerade en Smal-igenkännande sekvens. Efter fuseringen erhölls en plasmid som kodar för CTB frán tagP-promotorn (se B nedan). Den sekvens som visas har konfirmerats genom dideoxy- nucleotidsekvensning.

B. Karta över plasmiden pJí162 med CTB-genen under kontroll av tagP-promotorn. Plasmiden har RSF1010 som replikationsursprung och är ungefär 10.2 kb i storlek. Den stora pilen visar positionen för tggP- promotorn. Det. stjärnmârkta segmentet. representerar den del av hybridgenen som kodar för moget CTB- protein. Det fyllda segmentet symboliserar den del av genen som kodar för ledarpeptiden (och har sitt ursprung från en LTB-gen). De ungefärliga positionerna för ampicillinresístens- respektive 1ggI9-generna i plasmiden finns ocksa indikerade.

Figur 2. 92 462 285 Nukleotidsekvensen för CTB-genen i plasmiden pJSl62.

Endast den sk anti-sense-strängen visas, och de kodade aminosyrorna presenteras över sina respektive oligonukleotidkoder. Den Thr-rest som betecknas +1 är den första aminosyran (as) som normalt påvisats i moget CTB medan Ala-resten i position -7 (eller +1) är den första as :i moget LTB. Aminosyror som inte ursprungligen fanns i nágot av de tvâ proteinerna (LTB eller CTB) finns indikerade med stjärnor. Ett potentiellt ribosom-bindande ställe (Shine-Dalgarno- sekvens) finns understruken (SD). De vertikala pilarna indikerar peptidbindningar som klyvs för att frisätta det mogna rekombinanta CTB-proteinet. De aminosyror i den beskrivna sekvensen för CTB-protein från stam 569B som inte överensstämmer med de as som predikteras av vår DNA-sekvens för CTB finns utsatta inom parentes, medan as i CTB frán El Tor- stammar som skiljer sig fràn vara predikterade rester och fràn dem i klassiskt 569B CTB-protein finns utsatta i fetstil inom parentes. 462 285 Figur 3. 79 Induktion av CTB-expression med hjälp av IPTG i V.cholerae JBK70 (pJSl62). De erhållna nivåerna av CTB (se ordinatan), uttryckta som ekvivalenter till renat 569B CTB-protein, bestämdes genom GM1-ELISA- metodik med användning av en specifik monoklonal antikropp. De faktiska koncentrationerna i cellsedimenten var tiofaldigt lägre än som framställs i diagrammet (celler x 10).

I) Figur 4. :sr 462 285 Polyakrylamidgel-elektrofores (PAGE) av kokta respektive okokta prov av CTB. Lika mängder av rekombinant CTB-protein (rad 1 och 2) eller referens- 569B-CTB (rad 3 och 4) elektroforesades i en l3.5% polyakrylamid NaDodSO4-gel efter behandling i provbuffert under 5 minuter vid l00°C (rad 1 och 3) eller vid rumstemperatur (rad 2 och 4).En molekylviktsmarkör (Bio-Rad) med de ungefärliga storlekarna av de ingáende proteinstandards (uttryckta i kDa) visas i den rad som betecknas MW.

En lángsasmmare vandring av rekombinant CTB jämfört med 569B CTB kan endast skönjas när proteinerna undersökts som monomerer (Bm) men är mera uppenbar för proteinernas oligomera (pentamera) former (BP).

'JÅ 462 285 Figur 5. Dubbel-diffusion-i-gel-analys enligt Ouchterlony av '569B CTB (bassängerna B och F) respektive rekombinant CTB (bassängerna G och D) reagerade med kaninantisera (bassängerna A och E innehållande anti-rekombínant CTB och bassäng C anti-5695 CTB) .

Figur 6. ql 462 285 Fusering av STa-relaterad dekapeptid till CTB. En syntetisk oligodeoxynukleotid (indikerad med stora bokstäver i fetstil) med enkelsträngade utskott som är kompatibla med ëggl respektive 3maI-restriktions- ändar insattes vid den DNA-region i plasmid JSl62 som kodar för aminoändan av CTB. Insättningen av den syntetiska oligonukleotiden skedde sá att det gick att. bevara den ursprungliga avläsningsramen i CTB- genen och resulterade i en hybridgen som kodar för ett fusionsprotein innehållande en peptidextension i form av den STa-relaterade peptiden (indikerad med stjärnor) vid aminoändan av CTB (vars första aminosyra indikeras av siffran +1). De aminosyror som med (+) är sådana som kodas av den indikerade oligonukleotiden och som inte betraktas betecknas utgöra del av den STa-relaterade dekapeptiden.

Uppströms den första aminosyran (Arg) finns en ledar- peptid för CTB som har sitt ursprung i en gen som kodade för LTB, vidare ett. ribosom-bindande ställe och tacP-promotorn för expression av (5/D) hybridgenen (see plasmid pJS162 i figur lB). 462 285 Figur 8 1%/ Sá kallad immuno-blotting analys av STa-relaterad dekapeptid-CTB hybrídprotein efter natriumdodecyl- sulfat-polyakrylamidgel-elektrofores (SDS-PAGE) följd av elektroöverföring av separerade proteiner till nitrocellulosapapper. Raderna A-D visar reaktions- mönstren för okokt renat 5693 CTB-protein (rad A), kokt CTB (rad B), okokt STa-relaterad dekapeptid-CTB (rad C) och kokt STa-relaterad dekapeptid-CTB (rad D) efter framkallning med anti-koleratoxin monokbnal antikropp Wi7:5. Raderna E-H visar reaktíonsmönstren som erhölls med, samma proteiner efter framkallning med anti-STa monoklonal antikropp 1:3. Pilar betecknar vandringspositionerna för referensproteiner med kända molekylvikter (indikerade som kilo dalton) som kördes pà samma gel.

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 462 285 PATENTKRAV

1. Förfarande för produktion av det bindande subenhets- proteinet från koleratoxin (CTB) eller derivat av detta, k ä n n e t e c k n a t av att DNA använts, som genom rekombinant-DNA-metoder har manipulerats på ett sådant sätt att expressionen av CTB-genen eller CTB-derivatgenen är under transkriptionskontroll av en främmande (icke-koleratoxin) promotor, varvid kopplingen mellan CTB-genen eller CTB- derivatgenen har företagits på ett sådant sätt att det mellan promotorn och DNA-sekvensen för det ribosombindande stället (den sk Shine-Dalgarno-sekvensen) inte finns något DNA av V. cholerae-ursprung.

2. Förfarande för produktion av CTB eller CTB-derivat enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av användningen av DNA som genetiskt manipulerats på ett sådant sätt att CTB eller CTB-derivatproteinet syntetiseras med en främmande (icke- koleratoxin) ledarpeptid.

3. Förfarande enligt krav 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t av att expressionen av genen för CTB eller CTB-derivaten har förts under kontroll av ;ggP-promotorn i antingen inducibla eller konstitutiva system.

4. Förfarande enligt krav 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t av att expressionen av genen för CTB eller CTB-derivaten har förts under kontroll av T7 RNA polymeras-beroende promotor.

5. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att användningen av syntetiska oligodeoxynukleotider för hop- koppling av genen för moget CTB-protein, dvs CTB utan sin naturliga ledarpeptid, till DNA som kodar för en främmande (icke-koleratoxin) ledarpeptid såsom t ex ledarpeptiden för LTB. #0 462 285 10 15 20 25

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av användningen av endera eller bägge oligonukleotiderna 5'-CCC GGG-3' och 5'-TAC CCG GGA GCT-3' (oavsett om dessa oligonukleotider har syntetiskt eller naturligt ursprung).

7. Genkloningsförfarande, k ä n n e t e c k n a t av att endera eller bägge av oligonukleotiderna 5'-AGA ATT CAC TGC GCT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCA TGCC-3' eller 5'-CCG GGG CAT GCA GGA TTA CAA CAC AAT TCA GCG CAG TGA ATT CTA GCT-3' används för fusering till CTB-genen.

8. Genkloningsförfarande, k ä n n e t e c k n a t av att oligonukleotidsekvenser används, vilka kodar för decapep- tiden NH2-Cys Ala Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys-COOH används för fusering till CTB-genen.

9. Förfarande, k ä n n e t e c k n a t av användningen av Vibrio cholerae eller andra Vibrionaceae-bakterier, som naturligt eller genom manipulation saknar förmågan att syntetisera koleratoxin, för produktion av CTB eller CTB- derivat kodade eller transkriptionellt kontrollerade enligt krav 1-8.

10. Vacciner, diagnostiska reagens och receptorblockerande k ä n n e t e c k n a d e av att innehålla CTB eller CTB-derivat producerade genom förfaranden enligt krav 1-9 o agens,