JPH05503420A

JPH05503420A - キメラタンパク質

Info

Publication number: JPH05503420A
Application number: JP3501085A
Authority: JP
Inventors: ダーツボー，マーク　ティー．; マクリナ，フランシス　エル．
Original assignee: センター　フォー　イノベイティブ　テクノロジー
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1993-06-10
Also published as: IL96475A0; EP0502099A4; CA2069106A1; EP0502099A1; WO1991007979A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】キメラタンパク質腸及び口腔の粘膜表層は、病原性の細菌、菌類、ウィルス及び原生動物を含む多数の生物に常にさらされている。多数の０れらの病原体は宿主への主たる入口としてこの粘膜を利用し、これに基づいて全身性免疫がこの因子を排除する。その他の病原体は病原性となりつるためにこの粘膜に侵入する必要はなく、そして全身性免疫はこのようなケースにおいては有効とならない。粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）はおそらくこの宿主の外表面を保護するために必要な応答において発生するのであろう。一般の粘膜免疫系の概念は比較的新しい（ＭｃＧｈｅｅ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈａｌｅｋ、　１９８１）　ｏこれらの部位での免疫性の主な形は二量体の分泌型Ｉ　ｇＡ　（ｓ　Ｉ　ｇＡ）である。

背景技術分泌型ＩｇＡは粘膜への病原体の吸着の防止、ウィルスの中和及び毒素の不活性化が可能である（Ｔｏｍａｓｉ、　１９８４）。腸における免疫応答の誘発は離れている粘膜の部位、例えば肺、口腔及び泌尿生殖器管に分泌型免疫を授ける。

抗原−刺激リンパ球はリンパ液によって腸からこれらの部位へと分散され、ここでそれらは機能的なエフェクター細胞へと成熟する（ＭｃＧｈｅｅ　ａｎｄ　１Ｊｉｃｈａｌｅｋ、１９８１）　。

経口免疫によるＭＡＬＴの刺激の試みは限られた効果を有していた。これはある程度寛容誘導に、即ち、抗原への暴露に基づいて発生する特異的な免疫の非応答性の状態に起因する。寛容の発生は抗原、投与量、暴露の長さ、免疫化のルート及び宿主の遺伝的な背景に基づ＜　（Ｗｅｂｂ　ａｎｄ　Ｗｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ。

１９８４）。

経口寛容の状態はＭＡＴＬに提供される多数の抗原を発生せしめる（Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ　ａｎｄ　Ｔｏｍａｓｉ、　１９８０　；　Ｎａ５ｓａｌ、　１９８３）。

この現象は日常暴露される食品および通常の微生物植物由来の無害な抗原の大量負荷に対する応答に由来する、免疫系の阻止のための自然なメカニズムであると考えられている。

ｓ１ｇＡ応答は全身性免疫の非存在下において起こるものとはじめ考えられており、そしてこれは一定の抗原により観察される　（Ｓｕｚｕｋｉら、１９８６）。しかしながら、近年の研究は全身寛容を引き起こす抗原、キーホール　リンペット　ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　：　Ｋ　Ｌ　Ｈ）も分泌型因子において寛容性を誘発することが示された（Ｅｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｅａｌｄｉｎｇ、　１９８４ｂ）。その他のデーターは、ｓｌｇＡ及びＩｇＧ応答が同格の遺伝的コントコール下にあり、そしてバイアー（ｐｅｙｅｒ）斑はＩｇＧ及びＩｇＡ両者を生産するＢ細胞を含むことを示す（Ｅｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｅａｌｄｉｎｇ、　１９８４ａ）。従って、経口投与されるほとんどの抗原はおそらく分泌型及び全身性免疫因子の両者における寛容性をもたらすであろう。経口寛容の発生はサプレッサー及び反サプレッサー細胞の制御コントロール下にあると考えられる（Ｇｒｅｅｎら、１９８２　；　Ｒ４ｃｈｍａｎら、１９７８）。

このようなケースにおいてはほとんどの抗原は寛容性を誘発せしめるが、病原体、例えばポリオウィルス（Ｔｏｍａｓｉ、　１９８４）及びビブリオコレラ（Ｌｙｃｋｅ　ａｎｄ　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、　１９８７）ｉ：対する単独免疫を授ける経口免疫の例もある。

一定の不備康状態は治療を必要とするか、又は分泌型免疫応答による補助を必要とするであろう。しかしながら経口サブユニットワクチンの作成の試みは限界を有する有効性を有し、これは主としてこのルートにより提供される多数のタンパク質抗原の適切な抗体応答の刺激の不成功に基づ＜　（Ｃｈａｆｆａｃｏｍｂｅ　ａｎｄ　Ｔｏｍａｓｉ、１９８０　；　Ｃｒａｂｂｅら、　１９６９　；　Ｐｉｅｒｃｅ　ａｎｄＧｏｗａｎ、　１９７５）。コレラ毒素（ＣＴ）は特別であり、その理由はこれは経口的に付与される場合に強い免疫応答を誘発せしめる少数のタンパク質のうちの１つであるからである（Ｐｉｅｒｃｅａｎｄ　Ｇｏｗａｎ、　１９７５）。−緒に供給せしめる場合、ＣＴはその他のタンパク質であって経口投与した場合に通常免疫原とならないもハンめのアジュバントとして働くことが示されている。

（Ｌｙｃｋｅ　ａｎｄ　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、１９８６．　Ｌｉａｎｇら、１９８８　；　Ｎｅｄｒｕｄら、１９８７）。実際、ＥｌｓｏｎとＥａｌｄｉｎｇ（１９８４ｂ）は、キーホール　リンペット　ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に対する寛容性を除去することが、ＣＴと混合せしめたこの抗原を与えたマウスにおいて可能であった。このことはこの抗原に対するｓＩｇＡ及び血清１ｇＧ両者の生産をもたらした。これらのケースにおけるＣＴの役割は、はとんどのキャリアータンパク質のように単にその免疫原量を高めることよりも優れているようであるが、この作用のメカニズムはよく分っていない。

ＣＴは腸内病原体ビブリオ　コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　Ｃｈｏｌｅｒａｅ）　ニより生産され、そしてこれは２個のサブユニットより成る。

毒素原Ａサブユニットは真核細胞アデニレート　シクラーゼのＡＤＰ−リボシル化に重要である。この改質はｃＡＭＰ活性を高め、コレラを有す患者において見られる下痢及び体液のロスをもたらす（Ｂｅｔｌｅｙら、１９８６）。コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）は１１．６　ｋＤａｌの５個の同一のサブユニットが非共有結合において一緒に結合し合っているものより成る（Ｇｉｌ！、　１９７６）。このＣＴＢ　Ｓ量体はモノシアロガングリオシドＧ　Ｍ　（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、　１９７３）に結合し、これはこのタンパク質の天然のリガンドとなりうるものであろう。このガングリオシドは腸内上皮細胞の表層上に豊富に見られ、そしてこれはおそらくこのｍ胞へのＡサブユニットの侵入を促進せしめるものであろう。

ＣＴＢは無毒であるにもかかわらず、これは経口投与された場合に免疫原となる（Ｌｙｃｋｅ　ａｎｄ　ＨｏＩｍｇｒｅｎ、　１９８７）。これは化学的に作製される粘膜ワクチンのためのキャリアーとして、ホロトキシンの代りにＣＴＢを利用する試みを助成する。Ｂｅ５ｓｅｎとＦｉｓｃｈｅｔｔｉ（１９８８）は、ＣＴＢとコンジュゲートせしめたストレプトコッカスＭタンパク質由来のエピトープより経鼻内的に免疫化したマウスにおける予防的免疫を誘発せしめている。

いくつかの研究は、ＣＴＢが抗原のための単なるキャリアー以上に働くことができることを示唆している（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ　ａｎｄ　Ｈａｌｓｅｙ、　１９８４　：　Ｔａｍｕｒａら、１９８８）　、更にこれをＣＴＢとコンジュゲートせしめることにより抗原の免疫性を更に高めることが可能でありうる。ＭｃｋｅｎｚｉｅとＨａｌｓｅｙ（１９８４）による研究において、経口寛容原西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にＣＴＢを共育結合せしめるためにグルタルアルデヒドを用いている。このコンジュゲートをマウスに付与せしめた場合、この２種類のタンパク質を混合物として付与せしめることにより見い出せるよりも有意に高いレベルにて、ｓｒｇＡはこの両者の抗原に対して存在していた。ところで、これは他者により報告される結果（Ｌｙｃｋｅ　ａｎｄ　ＨｏＩｍｇｒｅｎ、　１９８６）×と対立している。Ｌｌａｎｇら（１９８８）は、センダイウィルスとコンジュゲートせしめた場合のＣＴＢについてのアジュバント効果を実証することができなかった。

化学コンジュゲーシヨンに対する選択方法として、遺伝子融合の利用の試みが報告されている。このような報告において、つ食原性（ｃａｒｉｏｇｅｎｉｃ）細菌、ストレプトコッカス　ミュータンズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）により生産されるグルコシルトランスフェラーゼＢ酵素（Ｇ　ｔ　ｆ　Ｂ）の大部分及びＣＴＢを含むキメラタンパク質を製造する遺伝子融合ベクターが報告されている。（Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ　ａｎｄ　Ｍａｃｒｉｎａ、　１９８７）。しかしなから、このキメラはＣＴＢの構造か変化しており、その理由は、粘膜のモノシアロガングリオシドＧ　Ｍ　＋へのＣＴＢの結合能力は悪い影響を及ぼすからである。従って、この作製体はワクチンとしての利用に適さない。

歯のカリエスは一般にスクロースを食事の一部として取る人々において発生する。歯のカリエスの発生率は一般の人々において減少しているにもかかわらず、これは未だ人類の間に広がっている疾患である。例えば米国において１９８４年に２４０億ドル以上がカリエス部の治療のために使われた（Ｌｏｅｓｃｈｅ、　１９８６）。より良い口腔衛生は疾患の程度を下げるか、しかし口腔衛生単独ではこの疾患をなくすことはできない。歯の表面の構造は溝を有し、ここでＳ、ミュータンズはよい衛生状態によっても堆積し易く、そしてカリエスを生じせしめる。更に歯の適切な機械的壊死組織除去は大変であり、その結果多くの人々は彼らの歯を適切に清浄化していない。

一般に、歯のカリエスの問題に対する唯一の頼みはその損傷をそれが生じた後に治療することである。より魅力的な手法はカリエス部の発生を予防することである。これを成し遂げる方法はＳ、ミュータンズによる歯の表面でのコロニー形成の予防である。

歯の表面のコロニー形成の予防のための１つの方法はＳ。

ている。初期のワクチンは完全細胞より成り、そしてこれはいくつかのケースにおいてコロニー形成及びカリエス形成を引き下げることを見い出している（Ｇｒｅｇｏｒｙ　ａｎｄ　Ｆｉｌｌｅｒ、　１９８７　；　Ｍｉｃｈａｌｅｋら、１９８３　；　Ｒｕ５ｓｅｌｌら、１９８０）　、しかしながら、Ｓ、ミュータンズの表層抗原はヒトの心臓組織と交差反応することがわかり、そしてこのことは安全性の理由によりこの完全細胞ワクチンの利用をはばんだＣＡＶａｋａＷａら、１９８５　；　Ａｙａｋａｗａら、１９８８　：　Ｈｕｇｈｅｓら、１９８０）　、この理由により、近年の仕事はＳ、ミュータンズの精製成分を利用するサブユニットワクチンの開発に向けられている。

現在、Ｓ、ミュータンズの２種類の成分がサブユニットワされ、そしてそれぞれ抗原Ｉ　／　ＩＩ　（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ａｎｄ　Ｌｅｈｎｅｒ、　１９７８）又はＳ　ｐ　ａ　Ａ　（Ｈｏｌｔら、１９８２）と称されている。この精製タンパク質によるワクチン化はサルにおいてコロニー形成及び歯のカリエスを引き下げることが示され（Ｌｅｈｎｅｒら、１９８０　；Ｌｅｈｎｅｒら、１９８１）　、そしてこれは心臓の交差反応性抗体を誘発せしめないことがわかっている（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｈｎｅｒ、　１９８３）。この抗体応答誘発は主に歯茎の裂目の流体の中への漏出を介して口腔に到達する血清１ｇＧであると報告されている。ところで、免疫化はヒトへの利用に実用的でないアジュバントを用いて行われる。更に、抗原Ｉ／Ｉｎによる非経口免疫化はこれらの動物において有意なｓＩｇＡ応答を誘発せしめなかった。これは驚くべきことであり、分泌型免疫は発生のために局部刺激を必要とすることが考えられる。サブユニットワクチンにおける利用のために評価されているその他タンパク質のグループはグルコシルトランスフェラーゼである。

これらの酵素はスクロースからのグルカンの形成を触媒し、そしてこのようなポリマーはＳ、ミュータンズの歯の表層への吸着を中介する。げ歯頚を免疫化せしめるための酵素調製品が経口的（Ｓｍｉｔｈら、１９８７　；　Ｓｍ１ｔｈら、１９７９）及び非経口的（Ｂａｈｎら、１９７７）の両方で用いられている。これらのタンパク質によるワクチン化はこれらの動物におけるコロニー形成及び歯のカリエス形成も予防した。経口免疫の利点はこれらの研究により実証されており、その理由はｓＩｇＡ及び血清ＩｇＧの両者ともグルコシルトランスフェラーゼを誘発せしめたからである。このワクチン化ルートは全身性及び分泌型の抗体の両者を授け、この両者はＳ、ミュータンズに対する宿主の防御に役立つことができる。しかしながら、これらの研究はＳ、ミュータンズに対する経口ワクチンによる一般的な問題、特に高いレベルの抗体を誘発且つ維持するため、これらの動物は長期間にわたり繰り返し免疫化される必要があ　。

ることを示している。

一般に、これらの実験は、Ｓ、ミュータンズの可溶性抗原による経口ワクチン化がコロニー形成及びカリエス形成の有効な予防方法であることを示した。しかしながら、分泌型免疫系の固有なる性質に基づき、抗体の予防的なレベルを維持するために利用するワクチンはブースター免疫化の繰り返しを必要とする。経ロアシュバントの利用はこのようなワクチン成分の免疫応答を改善せしめつる。

本発明者は驚くべきことに、ＣＴＢのＮ末端に融合せしめた場合のエピトープのみより成るペプチド配列は抗体応答を発明の開示内容本発明の目的は分泌型免疫及び全身性免疫応答の両者を誘発せしめ、これにより宿主がｓＩｇＡ及びＩｇＧを生産することができる経口ワクチンの提供にある。

本発明の他の目的は、組換ＤＮＡ法により作られうるメ宿主に対して無毒なキメラタンパク質の提供にある。

更に本発明の他の目的は、万能ワクチンキャリアーであって、いかなる数の抗原又はエピトープとキメラペプチドを形成するために融合することができるものの提供にあり、このキメラペプチドを宿主に経口投与せしめた場合、特異的な抗原又はエピトープに応答性の分泌型免疫を誘導せしめることができる。

更に他の目的は、有効な経口ワクチン組成物のための組換方法、ベクター及びペプチドを生産する宿主生物の提供にある。

これらの目的及びその他の目的は、コレラ毒素のＢサブユしている所望の抗原のエピトープ領域を含むキメラペプチドの提供により成し遂げられる。このエピトープ領域は所望のペプチドの抗原決定基を含む。このようなキメラペプチドはある好ましい態様に従って経口ワクチンのために利用でき、ここで該コレラ毒素のＢサブユニットに融合しているエピトープは免疫応答を発生せしめ、対象のペプチドに対して特異的な抗体を生産せしめる。キメラペプチドを生産せしめるための組換方法、並びにこのような組換方法において利用されるＤＮＡ配列、ベクター及び宿主も提供する。

本発明の好ましい一定の態様に関するその他の好都合な特徴に従い、該Ｇ、ｔ　ｆ　Ｂペプチドのエピトープを該ｃＴＢペプチドに融合せしめ、歯のカリエスの予防のための経口ワクチンを提供する。

以上の一般的な説明及び以下の詳細なる説明の両者は例示にすぎず、従って本発明の範囲を限定するものではない。添付した図面は明細書と共に本発明の種々の態様を示し、本発明の詳細な説明する。

図面の簡単な説明図１．ｃｔｘＢ融合ベクターの作製。ｃｔｘＢ遺伝子（影付領域）を含むプラスミドｐＶＡ１６６２をＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩにより切断し、この遺伝子の５′ 末端を削除せしめた。この末端に適合する合成リンカ−を挿入及びリゲートせしめ、示した融合ベクターを作り上げた。

図２．ｐＶＡ１５５５の作製。ストレプトコツカスミュータンズのｇｔ　ｆＢ遺伝子の不完全（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）領域をコードする１、９ｋｂのインサート（点刻領域）を含むプラスミドｐＨＫ７を、ｃｔｘＢ遺伝子（影付領域）の上流にＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＶＡ１５４２に挿入せしめた。

得られるプラスミド、ｐＶＡ１５５５はＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｊ）において５８ｋＤａｌのｇｔ　ｆＢご：ｃｔｘＢ融合タンパク質を発現する。

図３．ｐＶＡ１７８２の作製。プラスミドｐＶＡ１５４２は、タンパク質のリーダー配列の最初の１７個のアミノ酸をコードするＤＮＡを欠失している、ビブリオ　コレラのｃｔｘＢ遺伝子のプロモーターレスバージョン（点刻領域）を含む。ｇｔｆＢ、１をコードする合成オリゴヌクレオチド（ベタ塗り領域）をｐＶＡ１５４２の中にＥｃｏＲＩ　−Ｎｄ　ｅ　１フラグメントとして挿入せしめてｐＶＡ１５９９を作り上げた。得られるｇｔｆＢ、１：：ｃｔｘＢ遺伝子融合体は、所望するならばＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして多数の発現ベクターの中に容易に挿入せしめることができる。分泌型ベクターｐＩＮｍ　ｏｍｐＡ２は、誘発性１ａｃプロモーターのコントロール下にある、ｏｍｐＡのリーダー配列るリプレッサーによりＩ　ＰＴＧによって誘発される迄阻害される。ｇｔｆＢ、１・：ｃｔｘＢ遺伝子のこのベクターへの挿入は、Ｉ　ＰＴＧによる誘発に基づいて１４．４　ｋＤａｌのキメラタンパク質の発現をもたらす。

図４．融合ベクターのリンカ−配列。これらのオリゴヌクレオチドをｇｔｆＢとｃｔｘＢの間の翻訳ジャンクションとして用いた。各リンカ−の上の数字は、この配列を含むプラスミドベクターを示す。ボールド体の活字はこの合成リンカ− により実際にフード化される配列に相当する。重要な制限エンドヌクレアーゼ部位を各リンカ−の上に示し二アミノ酸配列は各リンカ−の下に示した。

図５．ｇｔｆＢ、１ペプチドの配列。親水性のプロットはう倉庫性細菌、ストレプトコッカスミュータンズのグルコシルトランスフェラーゼＢ酵素の領域について示す。ペプチドｇｔｆＢ、ｌに相当するアミノ酸残基３４５−３５９をコードする領域を黒色で示す。ｇｔｆＢ、ｌペプチド（濃い領域）をＥ、コリのｏｍｐＡ遺伝子に関するリーダー配列とコレラ毒素のＢサブユニット遺伝子（ｃｔｘＢ）との間に挿入した。

ｏｍｐＡのための切断部位を矢印で示す。このアミノ酸配列に関する数字は、成熟した、分泌型のキメラタンパク質の残基数に対応する。対応するＤＮＡ配列を、重要な制限部位と共に上方に記載した。ボールド字体は遺伝子融合体の作製のために用いた合成オリゴヌクレオチドによりコードされる配列である。

図６９円二色性によるＣＴＢ及び該キメラの分析。平均残基楕円率（Ｍｅａｎ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ａｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ　：　ＭＲＥ）をｄｅｇ　ｃｍ２／ｎ。

Ｉｅで表わした。このキメラのオリゴマー状態の最小値（点線）は天然のＣＴＢ　（実線）に対してシフトしており、ある程度の相違を示唆した。しかしながら、モノマーのスペクトル（破線）はこのオリゴマー及びＣＴＢの両者から有意に相違していた。

図７．該キメラの抗原性。タンパク質サンプルを１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画せしめ、そしてニトロセルロースシートに電気泳動的に移した。複製プロットをＣＴＢ、ＧｔｆＢ又はキメラのいづれかに対する抗血清によりプローブせしめた。矢印は対象の免疫反応性タンパク質を示す。レーンｌはＳ、ミュータングＧ５−５由来の細胞外タンパク質。

ＶＩ７９２キメラ：レーン３．ＣＴＢを示す。

図８　酵素阻害。反応速度。全グルカン合成を経時的（時間）に測定した。この酵素を反応混合物に加える前にＰＢＳ（コントロール）、正常ウサギ血清（Ｎ、Ｒ，Ｓ、）、抗−ＧｔｆＢ血清、又は抗−キメラ血清のいづれかと、ブレインキュベーションした。全てのサンプリングはトリプリケートで行った。

図９．グルカン合成の特異的阻害。ＰＢＳ　（コントロール）、抗−ＧｔｆＢ又は抗−キメラ血清のいづれかとブレインキュベートせしめたタンパク質サンプルを特異的グルカン合成についてアッセイした。反応は活性を測定する前に３７° Ｃで８時間行った。このサンプルを全グルカン及び水不溶性グルカンの両者についてトリプリケートにおいてアッセイした。全グルカンはメタノールで沈殿せしめた。水不溶性グルカンは脱イオン水で沈殿せしめた。生産される水溶性グルカンの量は、全グルカンから不溶性のグルカンを差し引くことにより測定された。

各アッセイにおけるサンプルの活性はコントロールと対比して測定した。コントロールの活性を１００％に標準化せしめた。

図１０．フルクタン合成の阻害。Ｓ、ミュータングＧ５−５由来の細胞外タンパク質をＰＢＳ　（コントロール）、正常ウサギ血清（Ｎ、Ｒ，Ｓ、）、抗−Ｇｔ　ｆＢ血清又は抗−キメラ血清のいづれかと、３７°Ｃで１時間ブレインキュベートした。このサンプルを、”Ｃ−（ｆｒｕ）−スクロースを含む基質中において３７°Ｃで８時間インキュベートした。全フルクタン合成を、メタノール中においてポリマーを沈殿せしめることにより測定した。

発明の実施のための最良方法本発明の好ましい態様を、本発明の詳細な説明するために提供する以降の実施例と一緒に詳しく説明する。本明細書に用いるアミノ酸の略語は一般的であり、そして例えば５ｔｒｙｅｒ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　第２版、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９８１）に定義されている。本発明に包含されるワクチンはあらゆる生体のために用いることができ、そして「対象体」なる語はヒト又はヒト以外のあらゆる動物を定義するために用いる。

本明細書に記載する全ての参照文献は本明細書に参照文献として組入れている。

本発明は、組換ＤＮＡ技術を利用することによって宿主の中にトラＡ　エクトせしめることができるプラスミドを作製し、モしてＣＴＢのＮ末端に融合している対象のペプチドのエピトープを含む免疫学的に活性なキメラペプチドを発現せしめることを示す。ＣＴＨに融合している比較的サイズの小さいエピトープアミノ酸配列は、ＣＴＢの構造又は機能が変化しつる機会を引き下げる。ＣＴＢに融合する比較的大きいペプチドは粘膜組織に対するＣＴＢの結合性に悪影響を及ぼす傾向にある。このような変化は、分泌型免疫応答の誘発のためのキメラＣＴＢペプチドの能力に悪影響を及ぼす。本発明者は驚くべきことに、ＣＴＢに融合しているエピトープと同じぐらいの小さいペプチドは所望の免疫応答を誘発せしめることを示した。

本発明における定義として、エピトープは以下の特徴を有すべきである。エピトープは抗原決定基、又はイムノグロブリン分子の抗原結合部位と分子相補によって相互作用する抗原分子の領域として定義する。エピトープは免疫応答を誘発することかできる抗原分子全体の個々の部分である。本発明における定義として、該エピトープはそれ自体によって免疫応答を事実上誘発せしめる必要はなく、しかしながら０のエピトープかＣＴＢと融合している際に抗原に対する抗体を発生せしめるための適切な相互作用をもたらす抗原の特定領域を含むべきである。更に、本発明に関するエピトープは、こるべきである。本発明に関するエピトープがＣＴＢ相互作用を妨害しないことを確実にするため、このエピトープは１゜０個分のアミノ酸の長さ以上でなく、且つサイズにおいて１１　ｋＤａｌＪ２／上でないべきである。一定の好ましい態様に従い、本発明に関するエピトープは約１０〜３０個分のアミノ酸の長さ又は１５〜２０個分のアミノ酸の長さの範囲にある。

当業者がどのようにして抗原分子のエピトープを探すかの標準的な方法は存在している。タンパク質のエピトープ又は抗体結合部位は、親水性領域（Ｈｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ、　１９８１　；　Ｌｅｒｎ覗ｅｒ、　１９８２；及びＴａｍｕｒａ、　１９８３）、並びに部分移動性の高い領域又はランダムコイル領域（Ｇｅｙｓｅｎら、１９８７　；及びＷｅｓｔｈｏｆつｆ、　１９８４）に関連する。高い部分移動性はペプチドの二次構造の高い構成率の欠如により特徴付けられる。このような特性「　を有するドメインはタンパク質の表面側におそらく位置し、ど　ここでそれらは抗体と接することができ、そして順応性の高し　い二次構造を有するであろう。これによってそれらは予め存在している抗体特異性か授けられている。エピトープはこれＪ　らの予測の特徴を有する。

これらの特性を有するタンパク質のドメインに対応するオリゴヌクレオチドを合成することによって抗体結合部位又はエピトープは同定されることができる。有用なアルゴリズム、例えばＢＥＣＭＡＮ　ｒＮｓＴＲＵＭＥＮＴｓ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａがらのＭＩＣＲＯＧＥＮＩＥとして知られるソフトウェア−プログラムに含まれているものは、エピトープ領域の探究に役立つであろう。

第１に、タンパク質の親水性領域はＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ　（１９８３）のアルゴリズムを用いて決定できる。この領域の二次構造予測も、Ｇａｒｎｉｅら（１９７８）のアルゴリズムを用いることによりできる。

高い部分移動性及び親水性の両者を有するものとして同定されるドメインは、これらが抗原決定基又はエピトープを含んで成る領域であることを確実とするためにスクリーンされつる。本発明の方法に従うことにより、このような領域はタンパク質をペプチドへと分断せしめ、対象の推定のエピトープを含むペプチドを単離せしめ、そして対象のタンパク質に対する抗血清とのその反応性を調べることによってスクリーンされつる。他方、ＣＴＢに融合すべきスクリーンせしめた領域を含むキメラペプチドを生産する発現ベクターを作り、そしてこのようなペプチドが対象のタンパク質に対して特異的な抗体を発生せしめるかどうかを調べるためにこのキメラペプチドを試験することができる。

以下は経口ワクチンとして利用するため、ＣＴＢと融合するために利用できる一定のペプチドの一部のリストである。

リストしたペプチドは関連の疾患の症状を引き下げる及び／又はなくす免疫応答を誘発せしめるものとして知られる。

このようなペプチドは、経口ワクチンを形成するために本明細書に詳細の通りにＣＴＢと融合することができる。

ウィルスコートタンく々り質Ｉ（ＶＰＩ）の１４１−１５８及び２００−２１３の残基は、家畜の疾患の原因である、足及び口の疾患ウィルスのカウフビューレン（Ｋａｕｆｂｅｕｒｅｎ）株に由来する（ＤｊＭａｒｃｈｉ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３２　；　６３９−６４１１９８６）。

咽頭炎の原因であるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のグループＡのＭタンパク質の保存領域（残基２１６−２３５．２４８−２６９゜２７５ −２８４）（Ｂｅｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５６：２６６６−２６７２、１９８８）。マラリアの原因因子である、プラスモジウムフフルシパルムＣＰＩａｓｒｎｏｄｊｕｔｎ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の外周のスポ。

ゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質。保存テトラペプチド領域（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）　ＣＱｕｅら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｎ＋ｍｕｎ、５６：２６４５−２６９４、１９８８）。抗受精ワクチン（ａｎｔｉ− ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｖａｃｃｉｎｅ）として利用するゴナドトロピンのサブユニット　（Ａｌａｍら、ｖａｃｃｉｎｅ　７：１２９−１３１．１９８９）。Ｂ型肝炎ウィルスの表層タンパク質のｐｒｅＳ２領域全体をコードする合成ペプチド（Ｅｍｉｎｉら、Ｊ。

Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　２８ニア−１２，１９８９）　、リフトバレー（Ｒｉｆｔ　Ｖａ！ＩＢ）フィーバ−ウィルスのＭゲノムセグメント　（Ｓｃｈｍａ　ｌ　ｊｏｈｎら、Ｖｉｒｏｌ、　１７０：１８４−１９２）　、ヘモフィルス　インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ）のピリンサブユニット（Ｂｒｉｎｔｏｎら、Ｐｅｄｉａｔｒｃ、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　８：　（補）　５５１−６１）　。新生小林におけるエンテロトキシン大腸菌の線毛（ｆｉｍｂｒｉａｌ）サブユニット（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ　６：３８９−３９２．１９８８）。シュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡの活性部位残基（Ｌｕｋａｃら、Ｉｎｆｅｃｔ、　（ｍｍｕｎ、　５６：３０９５−３０９８゜１９８８）。抗体の中和を誘発するロータウィルスのＶＰ３タンパク質の切断領域に相当するペプチド（Ｓｔｒｅｃｋｅｒｔら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｆ、　６２：４２６５−４２６９．１９８８）。

下記のその他の一部のリストは、経口ワクチンを提供するためにＣＴＢと融合できるエピトープを含む抗原を更に含んでいる。下記のリストのエピトープは特徴付けしていないが、当業者は本明細書に詳細の方法を用いてこれらの領域を決定することができるであろう。この方法は、親水であり且つ高い部分的移動性を有す領域を探すためのアルゴリズムの利用、本発明に従うプラスミドによるキメラタンパク質の製造及びそれらのキメラタンパク質に関する免疫応答を誘発せしめる能力についてのスクリーニングを含むが、それらに限定されない。他方、アルゴリズム法により同定されるペプチドフラグメントは、本キメラペプチド、経口ワクチンに利用するための適切なエピトープに関するスクリーニングのため、対象のタンパク質に対する抗血清との交差反応について試験するット）及び／又はＢ（結合性サブユニット）　（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｄら、Ｐｒｏｃ、、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０：６８５３−６８５７　（１９８３））。百日咳の原因である、ボーデテラ　パーツシス　（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓ旦す由来の百日咳毒素サブユニットＡ（毒性サブユニット）及び／又はＢ（結合性サブユニット）。Ｂｌａｃｋら、５ｃｉｅｎｃｅ２４０：６５６−６５９　（１９８８）。歯のカリエスの原因因子である、ストレプトコッカス　ミュータンズ由来の表層タンパク質抗原５ｐａＡｏ歯のカリエスの原因因子である、ストレプトコッカス　ミュータンズにより生産されるグリコジルトランスフェラーゼＣ酵素、ｇｔｆＣ，歯のカリエスの原因因子である、ストレプトコッカス　ミュータンズにより生産されるフルクトシルトランスフェラーゼ酵素、ｆｔｆ０歯周炎に関連する形成の初期段階において含まれる細菌、ストレプトコッヵスサンギス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ）の線毛サブユニット■ 型（吸着性タンパク質）。破傷風の原因因子であるクロストある、インフルエンザ　ウィルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原（Ｔａｍｕｒａら、Ｖａｃｃｉｎｅ　６：４０９−４１３　（１９８８）。ヒツジの踵間腐らん（ｆｏｏｔ　ｒｏｔ）の原因因子であるバクテロイデス　ノドサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｎｏｄｏｓｕｓ）のピリンサブユニット。性器のいぼの原因因子であるヒト乳頭腫（パピローマ）ウィルスの表層抗原。ヘルペス単純ウィルスのエンベロープタンパク質。黒色腫及び腫瘍における腫瘍関連抗原。淋病の原因因子であるナイセリア　ゴルア（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）の血清及びピリン混濁タンパク質。人類における下痢の原因因子であるジアリダ　ランプリア　（Ｇｉａｒｉｄａ　ｌａｍｂｌｉａ）の表層タンパク質。デング熱■ウィルス構造タンパク質（Ｂｒａｙら、Ｖｉｒｏｌ、　６３：２８５３−２８５８　（１９８８）。牛皮ウィルスのＦタンパク質（Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｖｉｒｏｌ　１７０：１８４− １９２　（１９８９）。シスチソマ　マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｉｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ）のＰ２Ｂ抗原（Ｎｏ　Ｉｏｗａｚｕｋら、Ｊ、　Ｉｍｍｔ＋ｒ＋ｏｆ、１４２：１３４２−１３５０　（１９８９）。鳥類インフルエンザ　ウィルス血球凝集素抗原。ニワトリにおけるコクシジウム症の原因因子である、エイメリア　アセルブリナ（Ｂｉｍｅｒｉａ　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）のメロゾイト抗原（Ｋｉｍら、Ｉｎｆｅｃｔ−１ｍｍｕｎ、　５７：２４３４−４０　（１９８９）。

キメラペプチドを作るための融合ベクターの有用性は、ＣＴＢ及びＳ、ミュータンズ由来のＧＴＦタンパク質の一部を含むＶ１５５５キメラタンパク質の、本発明に従う作製により実証される。合成オリゴヌクレオチドリンカーを利用するＣＴＢ融合ベクターの作製は、ワクチンとして利用するためのキメラタンパク質の製造の実用的な方法であるとここで示される。合成リンカ−の利用は、任意の長さ、耐久性及び組成のスペーサーをこのキメラの２つのドメインの間に挿入する好適な方法を提供する。以降の実施例はＳ、ミュータンズ由来のＤＮＡ配列を用いる遺伝子融合の作製のためのベクターの利用を示す。しかしながら、このベクターは同様にその他のＤＮＡに対する融合体を作るためにも利用できる。

抗原又はエピトープをコードするＤＮＡ配列がわかったなら、免疫学的に重要なドメインを特定するオリゴヌクレオチドを合成しそしてこのベクターの中に挿入する。このようなペプチド配列の利用は免疫応答の特異性を高め、そしてその免疫性に影響を及ぼすことがありうるＣＴＢにおける構造変化を最小にする。

理想的な融合ベクターは誘発プロモーター及びリポソーム結合部位、それに続くポリリンカークローニング部位及びＣｔｘＢ遺伝子を含むであろう。この作製体はほとんど全てのＤＮＡ配列がその中に挿入され、そしてＣＴＢ融合タンパク質を発現せしめることを可能とするであろう。

ＶＩ５５５キメラタンパク質はＣＴＢとの遺伝子融合体の作製を可能とするが、このタンパク質の有用性に影響を及ぼすいくつかの問題かある。第１に、ノムノブロツティング分析は５８および７２ｋＤａｌの２つの主たる物質の存在を、ヌクレオチド配列データーにより予測される５８ｋＤａｌのタンパク質の代りに示した。十分なるＤＮＡか、このようなサイズのタンパク質をコードするために、ｇｔｆＢについての開始コドンの上流に見い出せる。Ｅ、コリにより認識される、不完全ｇｔｆＢ遺伝子をコードするＤＮＡの中に更なる翻訳開始部位が存在するのであろう。このことか５８ｋＤａｌのキメラと同一の配列を分ち合う大きめのタンパク質の翻訳をもたらしたのであろう。この７２ｋＤａｌのタンパク質が両方の抗血清と交差反応する事実はこの仮説を裏付けし、なぜならこれは５８ｋＤａｌタンパク質と同一のエピトープを分かち合っているからである。更に、Ｖｌ　６１９の細胞リゼートも更なる免疫反応性ポリペプチドであって、ヌクレオチド配列データー（図５）から予測される４６ｋＤａｌのタンパク質より大きいものを含んでいた。Ｖ１６１９は、ｐＨＫ７を含み、且つ融合において利用した不完全ｇｔｆＢ遺伝子を発現するＥ、コリ株である。第２に、ｇｔｆＢのリーダー配列はＥ９　コリにおいて認識されず、このことは細胞質内にトラップされているタンパク質をもたらした。これはタンパク質の抽出を困難とし、そして除去しなくてはならない更なる夾雑物の原因となる。

第３に、このタンパク質は細胞質から輸送されないため、これは細胞内プロテアーゼによって分解される。得られる分解生成物はＧ　Ｍ　ｒアフィニティーカラムにおいて一緒に溶出され、従ってタンパク質の不均一な混合物であって互いから容易に分けることのできないものを提供する。第４に、４６ｋＤａ１のＧｔ　ｆＢ酸成分ＣＴＢへの付加は、ＧＭ、に関するＶ１５５５キメラの低められた親和性に基づき、タンパク質の構造に影響すると考えられ。これは驚くべきことではなく、その理由はＧｔｆＢ成分はＣＴＢの３倍の大きさであるからである。このような大きなタンパク質のＣＴＢへの遺伝子的融合はその機能を妨害する、即ち、ＣＴＢの予測のアジュバント特性に影響を及ぼしつるであろう。これらの理由により、Ｖ１５５５キメラはワクチン研究に関して理想的なモデル系ではないものと考えられる。

以上の欠点を解消するため、本発明者はＶ１７８２キメラを作製した。本発明者は、Ｖ１５５５作製体より発現するものよりも小さいペプチドのＣＴＢへの融合は、タンパク質の構造及び機能においてそれらが有する作用をおそらく最小にするであろうと考えた。更に、Ｇｔ　ｆＢ酵素の予測の抗体結合部位がＶ１５５５キメラの分解の結果として本発明者により同定された（実施例ＩＩ　（Ｄ）を参照のこと）。しかしながら、この部位の正確な位置は不明であり、そしてこれは分解生成物全体に対応するオリゴヌクレオチドを合成するには大きすぎた。

ＨｏｏｐとＷｏｏｄｓのアルゴリズム及びＧａｒｎｉｅｒのアルゴリズムを含む本明細書に詳細の方法に従い、親水性であり、且つ高い部分的移動性を有すタンパク質の領域が見い出せた。このエピトープは予測の特徴を有すことが確認できた。

このような特性を有すＧｔ　ｆＢのドメインに対応するオリゴヌクレオチドを合成することにより、エピトープ（抗体結合部位）は同定される。ＣＴＢへのこのペプチドの遺伝子的融合は、ＧｔｆＢに対する抗血清によって非常によく認識されるキメラタンパク質の発現をもたらす。この技術は、その他の手段によって見い出すことのできないその他の大きめのペプチドフラグメントの抗原ドメインの同定に役立つことができる。

Ｖ１７８２キメラを作るために用いる分泌型ベクター系はＣＴＢに融合している小さなペプチドの作製及び発現の好都合な方法を提供する。これは誘発１ａｃプロモーター及びこの融合タンパク質をＥ、コリのペリプラズムの中に分泌せしめるシグナルペプチド配列を用いることにより初めの系を改ｒｅｎ、　１９８９）。キメラの誘発プロモーター、例えばｌａｃのフントロール下への配置は、Ｉ　ＰＴＧによる誘発に基づくタンパク質の過剰生産を可能とする。キメラをｏｍｐＡのペプチドリーダー配列に融合せしめることにより、このタンパク質はより容易に単離且つ精製されるペリプラズムへ移送されることができる。Ｎ−末端配列データーにより確認される通り、このｏｍｐＡリーダーはＥ、コリにより、たとえそれが異種のタンパク質と融合していても適切に認識される。ｏｍｐＡリーダーを用いる異種タンパク質の分泌は既に述べられている（Ｇｈｒａｙｅｂら、１９８４）　。ｏｍｐＡリーダーをキメラと融合せしめる手段のため、２個の付加アミノ酸がＥ、コリによるプロセッシングに基づいてＮ末端にて残される。このような付加残基はオリゴヌクレオチド位置特異的誘発により除去することかできるが（Ｇｈｒａｙｅｂら、１９８４）　、それらはキメラの抗原性又は構造に干渉することはないようであり、従ってそれらは完全に残した。

ｏｍｐＡベクターを用いる又は用いずに、ｐＶＡ１５４２゜ｐＶＡ１５４３又はｐＶＡ１５４４において作製される、キメラペプチド融合体を発現せしめるために用いることができるその他のベクターは、ｐ　Ｋ　Ｋ　２２３−３　（Ｊ、　Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｇｅｎｅ２７：１５１−１６０．１９８４）及びｐＥＴ翻訳ベクターを含む。この例は限定のつもりでなく、そしていかなる数のベクターもこのキメラペプチドの発現のために利用できる。

本発明はタンパク質の構造に最小の影響を及ぼすことを伴う、ＣＴＨに融合することができるペプチドを示す。更に、各成分の抗原性を保持しているキメラが作製でき、このことはサブユニットワクチンとしてのこれらタンパク質の利用において重要である。オリゴマー化及びＧＭ、に結合する能力は、このタンパク質が腸内環境から選択されそしてバイアー環における免疫応答を誘発せしめることができる可能性を示す。Ｖ１７８２キメラはこのような特性を、ＣＴＢの天然構造と同程度に保持する。

まとめると、遺伝子融合によるＣＴＢキメラの作製、発現及び精製のための完全なシステムを提供する。このシステムを利用することにより、Ｓ、ミュータンズのＧｔｆＢ酵素の抗原性セグメントが同定され、そしてこれをＣＴＢのＮ−末端に遺伝子的に融合せしめる。このキメラタンパク質の構造は広範囲にわたり特徴付けられ、そして１５個のアミノ酸とＣＴＢのＮ−末端に、このタンパク質の構造又は生物活性に最小の効果を伴って付加することができることを示す。このキメラタンパク質に対して発生せしめた抗血清は天然のＧｔｆＢ酵素及びＣＴＢを認識する。更に、この抗血清はＳ　ミ血清かＳ、ミュータンズにおける酵素活性を阻害せしめることを示すことは初めてのケースであり、そしてこれは歯のカリエスに対するサブユニットワクチンのための有用な手法でありうることが考えられる。

本実施例はＧｔ　ｆＢの一部とＣＴＢの融合に関するが、本明細書に記載のＣＴＢベクターは有効な経口ワクチンの製造のために、いかなる数の適切なエピトープ領域をＣＴＢに融合させるために利用できる。更に、Ｖ１７８２により発現されるキメラペプチドに含まれるＧｔ　ｆＢの特定の１５個のアミノ酸配列は限定の実例ではない。この１５個のアミノ酸配列のいづれかの末端での伸長化又はＧｔ　ｆＢ配列におけるこのような配列のスパンのシフト化も含まれる。ワクチン養生法に関し、抗原の異なる領域を含む異なるキメラペプチドの組合せを投与することも考えられる。

実施例 ■、材料と方法Ａ、酵素及び試薬制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４リガーゼ（４００ユニット／ｍｌ）をＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）より購入した。

酵素反応はその製造者の仕様書に従って行った。５′末端標識キツトをＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）より購入した。ＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウフラグメント）及びｄＮＴＰ混合物をＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ　（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　ＣＴ）より購入した。〔ガンマ−３２Ｐ）　ｄＡＴＰ　（４２８６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び１４ｃｍスクロースをＮｅｗ　ＥｎｇＩａｎｄ　ＮｕｃＩｅａｒ　（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）より入手した。イソプロピル−ベーター−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ＣＴＢ及びＧ　Ｍ　＋ガングリオシドをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）より購入した。ＤＥＡＥ−デキストラン、Ｔ、。デキストラン及び（？７７デツク、１．Ｇ−１００をＰｈａｒｍａｃｉａ　（Ｐｌｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）より購入した。スフエロシル（Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ）　Ｘ　ＯＣ− ００５を５ｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、　ＰＡ）より購入した。ヤギ抗−ＣＴＢをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）より購入した。

ホスファターゼ標識第２抗体及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質をＫｉｒｋｅｇｏａｒｄ　ａｎｄ　Ｆｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）より購入した。

正常ウサギプール血清をＦｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＭｃＣｌｅａｎ　ＶＡ）より購入した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　；　Ｒｏｃｋｆ。

ｒｄ、ＩＬ）を全タンパク質の定量のために用いた。銀染色キットをＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）より購入し、そしてその製造者の指示の通りに用いた。

Ｂ、細菌及びプラスミド本明細書に用いた細菌株及びプラスミドを表■に挙げる。

ビブリオ　コレラのＥＩ　Ｔａｒ株由来のｃｔｘＢ遺伝子のプロモーターレスバージョンを含むプラスミドｐＪＢＫ３０を、Ｊ。

Ｂ、　Ｋａｐｅｒ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｒｙｌａｎｄ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　ＭＤ　（Ｋａｐｅｒら、１９８４）より入手した。プラスミドｐＨＫ７は、Ｈ，Ｋ、　Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ、　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、より提供された。このプラスミドはＳ、ミュータンズＧ５−５のｇｔｆ遺伝子のアミノ末端側の１／３をコードする　（Ａｏｋｉら、１９８７）　、プラスミドＤＮＡはＳＤＳ高塩溶塩溶解ｕｅｒｒｙら、１９７３）　、その後の色素−平衡密度遠心（Ｗｅ　ｌｃｈら、１９７９）により調製した。Ｅ、コリＨＢ　１０１をＣａＣｌ２−加熱ショック方法によってプラスミドＤＮＡにより形質転換せしめた（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　１９７７）。この細胞を、１０ｍｇ／ｍｌのカスアミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／ｍＩのロイシンとプロリン、及び２ｍｇ／ｍｌのチアミンの添加されているＭ−９培地（Ｍｉｌｌｅｒ、　１９７２）中において３７°Ｃで増殖させた。

Ｖ１５５５をＯ，Ｄ、６６０＝０．６迄増殖させ、リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐＨ７，３）中で２回洗浄し、その後フレンチプレッシャーセル（Ｓ　ＬＭ　Ａｍ１ｎｃｏ　；　Ｕｒｂａｎａ、ｉＬ）の中で溶解せしめた。利用する前にこのリゼート品を遠心により清浄化せしめた。Ｖ１７８２の発酵スケール（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　５ｃａｌｅ）増殖のため、ｌａｃプロモーターの誘発のためのＩｍＭのＩＰＴＧの添加前に、細胞をＯ，Ｄ、６６０＝０．６迄増殖せしめた。浸透圧ショックによるペリプラズム含有物の回収迄（Ｎｅｕａｎｄ　Ｈｅｐｐａｌ、　１９６５）この培養物を３７°Ｃで更に２時間増殖させた。細胞を緩衝化食塩水（３０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，３）中で２５ °Ｃにて２回洗浄し、次１．：０．１容量の高張溶液（１５％のスクロース、５０ｍＭのＥＤＴＡ。

５０ｍＭのトリス、ｐＨ８，０＞中で１０分間再懸濁せしめた。この細胞をペレット状にし、そして１．０容量の冷い脱イオン水中で１０分間懸濁せしめた。このショック液を遠心により細胞を透明化し、その後１０倍濃度の洗浄緩衝液（１０ｍＭのＮａＰＯ，，２００ｍＭのＮａＣ１，０，０２％のＮ　ａ　Ｎ　ｓ　、ｐＨ６゜８）０．１容量を用いてｐＨ６，８に調整した。

Ｃ９酵素調製品Ｓ、ミュータンズの細胞外タンパク質を以下の通りに得た。

Ｇ５−５株（ＢｒａｔｔｈａｌセロタイプＣ）を３１のトッド−へウィツト（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）培地の中で、非好気性条件のもとでＯｌＤ、６６０＝０．６迄増殖させた。この細胞を遠心により除去し、そして硫酸アンモニウムを６０％飽和迄加えた。細胞外タンパク質を含む沈殿物を遠心により集め、３００ｍ１のＰＢＳ（ｐＨ７，３）に再懸濁し、そしてＰＢＳに対して３回透析した。この材料約３０ｍ１を小分けし、そして−７０°Ｃで保存した。この材料を全ての酵素アッセイのために用いた。残っているサンプルをＰＢＳ＋６Ｍの尿素において希釈し、モしてＹＭ−１００限外濾過Ｍ（Ａｍｉｃｏｎ　；　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）を通して限外濾過にかけた。透明状のサンプルを限外濾過により２０ｍ１迄濃縮し、その後尿素を除去するためにＰＢＳ（ｐＨ７，３）中で透析した。このサンプルを小分けし、そして−７０’Ｃで保存した。この調製品をイムノブロッティングアッセイのコントロールとして利用した。

Ｄ、抗血清Ｓ、ミュータンズのグルコシルトランスフェラーゼＢ酵素に対するウサギ抗血清をＨ，Ｋ、　Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ、　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬより入手した。精製された、Ｖ１７８２キメラタンパク質のモノマー型に対する抗血清を雌のニューシーラント白ウサギにおいて発生させた。１ｍｇのタンパク質を完全フロインドアジュバント中に乳化せしめ、そして動物の後肢に皮下注射した。３週間後、このウサギを不完全フロインドアジュバント中に乳化せしめたタンパク質によりブーストにかけた。次に１週間後、このウサギを採血した。

血清を集め、小分けし、そして−２０°Ｃで保存した。

Ｅ、オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド及びその相補鎖をアプライド　バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌａｓｙｓｔｅｖｒｓ）　３８０シンセサイザーにおいて合成した。このリンカ−はキーセルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）　６０Ｆ２，４シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ　；　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｗ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、１−プロパツール、水酸化アンモニウム、及び水（５５：３５・１０）の中での薄層クロマトグラフィーにより単離した。このＤＮＡバンドを携＊　Ｕ　Ｖライトにより識別化せしめ、そしてこのプレートからかき落とした。このシリカゲルを水で３回洗浄することによりＤＮＡを抽出し、その後この水性相が乾燥する迄エバポレートすることにより濃縮せしめた。大きめのオリゴヌクレオチドは８Ｍの尿素を含む２０％のポリアクリルアミドゲルを用いることにより分離せしめた。ＤＮＡを含むゲルフラグメントをミンチし、そして等容量の抽出緩衝液（０，５Ｍの酢酸アンモニウム、１１１１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）により３回抽出せしめた。このオリゴヌクレオチドを使用前にネンソーブ（Ｎｅｎｓｏｒｂ）アフィニティーカラム（Ｄｕｐｏｎｔ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｅｏｎ、　ＤＥ）を用いて精製した。このリゲーション反応の効率性を高めるため、Ｔ４キナーゼの前向き反応をオリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化させるために用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）　、一体化されなかったｄＡＴＰを、ネンソーブ力ラムによるオリゴヌクレオチドの精製により除去した。ｉｐｍｏ＋の精製ベクターを各相補リンカ−２１ｐｍｏｌとアニール用緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７，５，１０ｍＭのＭｇＣ１ｘ、５０ｍＭのＮａＣ１，ＩｍＭのジチオスレイトール）中において混ぜた。このサンプルを９０℃で１０分間加熱し、その後このＤＮＡの再アニール化のために４２°Ｃで１夜インキユベートした。リゲーシ３ンに干渉しつる一体化されていないオリゴヌクレオチドをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　３０限外濾過ユニツト（Ａｍｉｃｏｎ　；　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）を用いてアニール用緩衝液においてこのサンプルを洗浄することにより除去した１残っているものをＴ４リガーゼ（４００ユニツト）を有するリゲーション緩衝液に２５°Ｃで６時間懸濁させた。　。

Ｆ、融合ベクターの作製リンカ−の挿入のため、プロモーターレスｃｔｘＢ遺伝子を含むプラスミドｐＪＢＫ３０を、その置換によって障害となりつる２つの制限部位を除去することにより準備した。このプラスミドの複製起点付近にあるＮｄｅ１部位及びｃｔｘＢの３′末端に位置するＥｃｏＲ１部位を両方共このプラスミドから除去した（図１）。プラスミドｐＪＢＫ３０を制限酵素により部分消化せしめ、そしてこの直鎖状ＤＮＡをアガロースゲルからの電気溶出により単離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。この５′末端をＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウフラグメント）を用いて補完し、そしてこれらのプラント末端を適当な反応条件を用いて互いにリゲートせしめた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。この２つの削除された制限部位を含むプラスミドをｐＶＡ１６６２と称した。プラスミドｐＶＡ１６６２を２種類のフラグメントのうちの大きい方をアガロースゲルからの電気溶出により単離せしめた。このリンカ−を実施例Ｉ（Ｅ）において詳細の通りにこのフラグメントの中に挿入せしめた（図４も参照のこと）。このプラスミドをＥ、コリＨＢ１０１の中に形質転換せしめ、そしてテトラサイクリン（Ｔｃ）−及びアンピシリン（Ａｐ）−耐性であるクローンを制限地図化により、リンカ−の挿入のために選別及びスクリーンせしめた。それぞれのリンカ−を含むプラスミドを単離し、そしてｐＶＡ１５４２．ｐＶＡ１５４３及びｐＶＡ１５４９と称した。

これらのベクターはｃｔｘＢ遺伝子の不完全バージョンを含み、ここでこの遺伝子の５′末端例はリポソーム結合部位及びこのタンパク質のリーダー配列ヲコード。

するＤＮＡを除去するために削除されている。

Ｇ、遺伝子融合Ｖ１５５５を図２に示す通りに作製した。プラスミドｐＨｅ　Ｃ）（Ｈａｍａｄａ　ａｎｄ　５ｌａｄｅ、１９８０））由来の１．９ｋｂのＰｓｔＴ−しめた。

Ｔｃ−耐性且つＡｐ−感受性であるＥ、コリ形質転換体を、ＣＴＢに対する抗血清により認識されるタンパク質の発現性のためにスクリーンした。ｐＶＡ１５４２由来のプラスミドを含むクローンを選別し、そしてＶ１５５５と称しＶ１７８２を作製するのに用いる手法を図３に示す。オリゴヌクレオチドを融合ベクターｐＶＡ１５４２の中に、段落Ｉ　（Ｅ）において既に詳細の通りにｃｔｘＢの５ ′末端にて挿入せしめた。ｐＶＡ１５４２の中へのこのオリゴヌクレオチドの適切な挿入は、ミニリゼート（ｍｉｎｉｌｙｓａｔｅｓ）から調製したプラスミドＤＮＡの制限酵素消化によりモニターした（Ｍａｃｒｉｎａら、１９８２）。翻訳融合タンパク質を発現するため、このキメラｃｔｘＢ遺伝子を分泌型ベクターｐＩＮＩＩｏｍｐＡ２にトランスファーせしめた。

Ｈ，スクリーニングプラスミドＤＮＡを迅速なミニリシス（ｍｉｎｉｌｙｓｉｓ）方法により細胞から取り出した（Ｍａｃｒｉｎａら、１９８２）　、このＤＮＡをそのプラスミド含有について、アガロースゲル電気泳動及びにより調製した。分泌型ベクターを含む細胞をそのキメラタンパク質の発現性について、まずそれらを１　ｍＭのＩ　ＰＴＧを含むＭ−９培地上で培養することによりスクリーンした。リゾチームにおける消化の後、この細胞を０．５ｍｌの低張溶液（１０ｍＭのトリス、３０ｍＭのＮａＣ１，Ｉ）Ｈ７，３）に懸濁せしめ、その後迅速な凍結融解にかけた。遠心によって不溶性の材料を除去し、そしてこのリゼート品をそのキメラタンパク質の発現性について、酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であって、固相としてＧＭ、ガングリオシド被覆マイクロタイターウェル、及び第１抗体としてＣＴＨに対する抗血清を泪いるアッセイによりアッセイした（Ｓａｃｋ　５．１９８０）。

■、精製ＧＭ、ガングリオシド　アフィニティーカラムを用意して、Ｔａｙｏｔら（１９８１）の方法に従いＣＴＢキメラ体の精製に利用した。Ｌｙｓｏ−ＧＭを５０ｍｇのＧＭ、より調製し、その後ＤＥＡＥ−デキストラン被覆スフエロシル１５ｇに共有結合させた。このサンプルをこのカラムに４°Ｃで２４時間にわたり１．５ｍｌ／ｍｉｎの線状流速にて循環させた。このカラムを１０容量の洗浄緩衝液（１０ｍＭのＮａ　Ｐ　０４　、　２００ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ６，８）で洗浄し、その後このキメラを溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸、２００ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ１Ｏ）を用いて遊離させた。この溶出物をｐＨ７，３に調整し、その後ＹＭ、。

限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ　；　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）を用いてＰＢＳ（１０ｍＭのＮａＰＯａ　、１４０ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ７，３）中で限外濾過することにより濃縮した。この残留物をその全タンパク質及びＥＬＩＳＡにおける反応性について定量した。天然のＣＴＢをＥＬ　Ｉ　ＳＡの対照標準品として利用した。１．６　Ｘ　２００ｃｍのセファデックスＧ−１００カラムを準備し、そしてＶ１７８２キメラのモノマーとオリゴマー画分を分離するために用いた。５ｍｇのサンプルをこのカラムに載せ、そしてＰＢＳ（ｐＨ７，３）で、線状流速０．１３　ｍｌ／　ｍｊｎにて溶出させた。

画分を２ｎ＋ｌ容量において集め、そして全タンパク質及び免疫反応性について分析した。

Ｊ、タンパク質分析モノマータンパク質（４０ｇ）のＮ−末端配列を、インーラインＰＴＨアミノ酸分析の付いた、アプライド　バイオシステム４７０Ａ型シーケンサ−を用いて調べた。ＧｒｏｓｓとＷｌｔｋｏｐ　（１９６２）の方法を、シアン化臭素による処理によってタンパク質を分解せしめるために用いた。このタンパク質を７０％のギ酸２００１に溶解させ、そして窒素を吹き込むことにより空気を除去した。

次にメチオニンに対して１００倍過剰量のシアン化臭素を加えた。反応は暗室において室温にて、密栓チューブ内で１３時時間待させた。反応はセーバントスピードバック濃縮機（Ｓａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）において試薬を除去することにより停止させた。

シアン化臭素分解により生成されるペプチドをＣ−１８逆相カラム（Ｖａｒｉａｎ）において高性能液体クロマトグラフィーにより、水中で０，１％のトリフルオロ酢酸と５０％のアセトニトリル中で０．１％のトリフルオロ酢酸との線状勾配を利用して分離した。１ｍｌ／ｍｉｎの流速及び総時間６０分を利用した。

溶出液を２１５ｎｍでモニターした。ピーク部を集め、そしてアミノ酸分析によって分析した。

タンパク質又はペプチドのサンプルを、密栓した、排気したチューブ中で、１１０℃にて２４時間にわたりＨＣＩの定常煮沸により加水分解した。アミノ酸分析を、検出試薬として０−フタルデヒドを用いるダラム（Ｄｕｒｒｕｍ）Ｍ　Ｂ　Ｆアミノ酸アナライザーによって行った。あるケースにおいて、このサンプルを加水分解前にヨード酢酸によりアルキル処理せしめた。各サンプルを５０ｕ＋Ｍのトリス（ｐＨ＆０）中のヨード酢酸（１モルのサンプル／１０モルのヨード酢酸）と２５°Ｃで１時間反応させた。

このモノマー、オリゴマー及びＣＴＢを円二色性により分析した。サンプルをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　３０　（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、ＰＢＳ（ｐ）１７．３）に対して十分に透析した。この濾液をブランク緩衝液として用いるために保存した。各タンパク質のサンプル１．５　ｍｌ　（０，１５ｍｇ／　ｍｌ）をセルに載せ、そしてＪａｓｃｏ　Ｊ−５００Ｃスペクトロボラリメーターで分析した。

分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、１５％のポリアクリルアミドゲルの付属しているバイオラッドスラブゲル装置によって行った。４％のスタッキングゲルを用いた。このゲル及び緩衝液組成はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ　（１９７５）のそれとし、あるケースにおいてはこのゲル及びサンプル緩衝液に８Ｍの尿素を含ませるよう改良した。

Ｋ、イムノブロッティング分析タンパク質サンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後ニトロセルロースシートに電気泳動的に移した（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９）。抗体の非特異的結合を、このシートをトリス緩衝液食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣ１゜ｐＨ７，５）中の５％のニワトリ血清溶液により２５℃にて１時間ブロックせしめることにより防いだ。このシートを、５％のニワトリ血清を有するＴＢＳにおいて１：１０００に希釈せしめた第１抗血清中で６時間インキュベートせしめた。このシートを０．０５％のツイーン２０を有すＴＢＳ　（ＴＴＢＳ）において１０分間にわたり３回洗浄し、次いで酵素標識化第２抗体中で２時間インキュベートした。再びＴＴＢＳで３回洗浄後、このシートを基質により発色させた。

Ｌ、酵素アッセイグリコジルトランスフェラーゼ活性は、特定の標識化スクロース由来の、グルカンポリマーへと変換した１４Ｃ−グルコースの量を測定することにより調べられる。フルクトシルトランスフェラーゼ活性は類似の方法ではあるか、但しフルクトース成分中における１４Ｃにより標識化されているスクロースを基質として利用する方法により測定した。この反応混合物を３７°Ｃでインキュベートし、そしてこれは、１０μｌの酵素、５μｍのＴ　ｔｏデキストラン（５ｍｇ／＋ｎｌ）　、５　μＩの標識化基質（２６１ｍ　Ｃｉ／ｍｍｏ１．　２０　Ｃｉ／ｍｌ）及び８０μｌの基質緩衝液（１、ＯｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのスクロース、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐ）１６．５）より成る。この反応混合物のサンプル１００μＩを２．４　ｃｍのガラスファイバーフィルター　（Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦＡ　；　Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）にピペットせしめた。全てのサンプルをトリプリケートで行った。全ポリマーをメタノール中での沈殿により、このフィルター上に集めた。このフィルターをメタノールにより、真空マニホールド装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　；　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を用いて６回洗浄した。

このフィルターを脱イオン水で４回洗浄することにより水不溶性ポリマーを集め、その後メタノールで２回洗浄した。このフィルターを風乾し、５ｍｌのシンチレーションカクテル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＯＣ３；　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）を含むバイアルに入れ、その後シンチレーションカウンター（ＢｅｃｋｍａｎＬ３−１８００）で２分間カウントした。各サンプルの１分間当りの平均カウント（ＣＰＭ）を、酵素を含まないバックグランドコントロールから差し引いた。阻害アッセイのため、酵素は反応混合物に加える前に等容量の血清と３７’Ｃで１時間にわたりブレインキュベートせしめた。必要な場合において、血清をＰＢＣで希釈した。

Ｍ、動物試験利用するプロトコールは、Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｅｅにより認められている。雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｊｖｅｒ　（Ｗｉ　１ｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）より入手した。マウスは生後６−８週目のものを用い、そしてタンパク質を供給する前に一夜絶食させた。腸内供給針（ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ　ｆｅｅｄｉｎｇ　ｎｅｅｄｌｅ）　ＣＧ、Ｔｉｅｍａｎｎ　＆　５ｏｎｓ、　Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）を用いて該キメラを投与せしめた。該ＧＭ、精製化キメラを０．２ＭのＮａ２ＨＣＯｓに希釈し、そして０．５ｍｌの容量において供給した。コントロール動物は食塩水溶液が与えられた。

比較のため、この抗原を数匹の動物に腹膜腔内注射せしめた。

この抗原をＭＡＡＬＯＸに希釈せしめた後、これをＯ，１ｍｌの容量において注射せしめた。マウスをＯ８目及び１４日ロー免疫化せしめた。２１日口重血清及び腸内分泌物を集め、そして特異的な抗体についてアッセイした。マイクロタイターウェルはＣＴＢ、又は該キメラにおいて見い出せるのと同一の１５個のアミノ酸配列より成る合成ペプチドのいづれかで被覆せしめた。腸内におけるペプチド特異性抗体の検出のためのアッセイで、洗浄は０．０１　ｎｇ／ｍｌのペプチド特異性抗体が検出されるほど十分な感度とするべきである。

本発明に従う、歯のカリエスを予防するためのキメラペプチドワクチンの有効性を試験するプロトコールはＭｏｒｉｓａｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　４０　：　５７７−５９１　（１９８３年５月）に記載されている。

■、結果Ａ、融合ベクタークローニングベクターのセットを、Ｅ、コリにおいてｃｔｘＢ遺伝子融合体を作製且つ発現せしめるために作った。プラスミドｐＪＢＫ３０を該融合ベクターの作製の基礎として利用し、その理由はこれはプロモーターレスＪｃｔｘＢ遺伝子を含み、従ってＥ、コリにおいてこのタンパク質を発現しないからである。ＣＴＢをこのキメラのＣ末端とすることにより、ＥＬＩＳＡが有用な融合体を検出するために利用でき、その理由は、この遺伝子はその上流に位置する配列と翻訳枠内にある場合にのみ発現されるからである。ｃｔｘＢのＥｃｏＲＩとＮｄｅ１部位の間に位置するこの領域は、成熟タンパク質には存在していない予測の疎水性リーダーをコードする　（Ｌｏｃｋｍａｎ　ａｎｄ　Ｋａｐｅｒ、　１９８３）。この領域をこの融合ベクターから削除することにより、キメラタンパク質の異常なる切断及び折りたたみの機会は最小となる。該リンカ−は、Ｅｃザインしである（図４）。このリンカ−の３′末端はｃｔｘＢの解読枠内にあるＮｄｅＩ部位と適合する配列をコードする。各リンカ−において１つの解読枠のみがｃｔｘＢの翻訳が行なわれることを可能とする。たとえ異なる解読枠においてＥｃｏＲＩ部位に関連する翻訳が起きても、このリンカ−の長さは最後のコドンがＮｄｅＩ部位のジャンクション部で終止するように調整されている。配列データーは、このジャンクションかｃｔｘＢ内における翻訳されるコドンを分割していることを示した（Ｌｏｃｋｍａｎ　ａｎｄ　Ｋａｐｅｒ、　１９８３）ｏ　７−カーとして働くために各リンカ−の中に固有のＩＩＪ限部位をコード化させた。これらはベクターの中に挿入されているリンカ−を調べるために非常に有用である（図４）。このリンカ−はＥ、コリにおいて発現される遺伝子以外の翻訳されるコドンを含む。小さい、極性中性アミノ酸は、タンパク質における構造変化を最小にすることが可能である限りコードされる。

必要ならばキメラの翻訳後分解を可能とするため、各リンカ−にアスパルチル− プロリルアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含ませる。この配列はタンパク質にまれに見い出され、そして酸加水分解に感受性なペプチド結合を含む（Ｌａｎｄｏｎ。

１９７７）。

Ｂ、Ｖ１５５５（７）作製Ｓ、ミュータンズＧ５−５　（ブラッサルセロタイプＣ）のグリコジルトランスフェラーゼＢ遺伝子（ｇｔｆＢ）をコードする１、９ｋｂの７ラグメントをｃｔｘＢとの融合体の作製のために用いた。このフラグメントはｐＨＫ７に含まれ（図２）、ＧｔｆＢに対する抗血清と交差反応する酵素的に不活性な４８　ｋＤａｌの不完全ポリペプチドを本質的に発現する。この■１５５５キメラペプチドのイムノブロッティング分析を、ＧＭ。

ガングリオシドアフィニティークロマトグラフィーによる該ペプチドの°精製により行った。旦、三ユ株Ｖ１５５５由来の透明な完全細胞リゼート品をカラムに載せた（リゼート）。

結合物質をｐＨの逐次低下（ｐＨ４，ｐＨ３）によりカラムから溶出させた。このカラムを０．１　ＭのＮａＯＨで洗浄することにより清浄化せしめた。デュプリゲートのプロットを、グリコジルトランスフェラーゼＢに対する抗血清（抗− ＧＴＦ）又はコレラ毒素のＢサブユニットに対する抗血清（抗−ＣＴＢ）のいづれかとプローブせしめた。精製ＣＴＢ及びＶ１６１９のリゼート品を抗血清の陽性コントロールとして利用した。

Ｅ、コリ株Ｖ１６１９は４６ｋＤａｌの不完全ＧＴＦタンパク質を発現するプラスミドｐＨＫ７を含む。このフラグメントを３種の全ての融合ベクターに挿入したが、しかし免疫陽性クローンはｐＶＡ１５４２のみから単離され、ｇｔｆＢの解読枠かこのプラスミドに含まれているリンカ−と適合することを示唆した。この結果はｇｆｔＢに関するヌクレオチド配列データーにより証明される（Ｓｈｉｒｏｚａら、１９８７）。１ツノクローンを選び、モしてＶ１５５５と称した。

このクローン由来のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析により地図化し、この遺伝子融合体の構造を確認した（図２）。この結果が示すには、この融合ベクターはＣＴＢキメラを作製するために有効に利用できることである。

Ｃ，Ｖ１５５５キメラの精製Ｖ１５５５の分析は、このキメラタンパク質がＥ、ｒｌＪの細胞質にトラップされていることを示す。Ｇｔ　ｆＢに関するリーダー配列はこの宿主により、たとえこのタンパク質が旦。

ミュータンズにより通常分泌されるものであるにしても認識されなかった。この現象は呈、１旦において発現されるその他の細胞外ストレプトコッカスタンパク質にも観察された（Ａｏｋｉら、１９８６）。宿主から該タンパク質を遊離させるため、この細胞はフレンチプレッシャーセル内で溶解されることを必要とする。細胞か溶解したら、このタンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製される。

ＣＴＢはＧＭ、ガングリオシドに対して高い親和性を有する（Ｓｉｌｌｅｒｕｄら、１９８０）　、　ＧＭＩガングリオシドアフィニティーカラムの利用はコレラ毒素の迅速且つ効率の良い方法であるとして既に示されているＣＴａｙｏｔら、１９８１）。ＧＭＩアフィニティカラムへのＶ１５５５キメラの結合を最大にするため、このリゼート品をこのカラムに４℃で一夜循環させる。

主な活性成分はｐＨ４にて溶出し、これはカラムから天然のコレラ毒素を溶出させるのに必要とするものよりも高かった（Ｔａｙｏｔら、１９８Ｌ）。カラム溶出物のイムノブロッティングアッセイは、Ｇｔ　ｆＢ又はＣＴＢのいづれかに対する抗血清と交差反応する２つの新しい５８　ｋＤａｌ及び７２ｋＤａｌのタンパク質の存在を示した。両遺伝子の公開されているＤＮＡ配列に基づき、このキメラはサイズにおいて５８　ｋＤａｌであると予測される。７２ｋＤａｌのタンパク質の存在は説明することかできないが、これはＧｔ　ｆＢ及びＣＴＢ両者に対する抗血清と実際に交差反応する。アフィティー力ラムへのこのＶ１５５５リゼート品の通過はＥ、コリに由来する多数の夾雑タンパク質の除去に有効である。０．１　ＭのＮａＯＨによるカラムの清浄は少量の更なる免疫反応性物質のみを溶出させ、このキメラの溶出が終了していることを示唆する。小さい免疫陽性ポリペプチドが、特にＧｔ　ｆＢに対するものがウェスタンプロ質分解は報告されており（Ｇｏｆｆら、１９８４）　、そしてこのようなフラグメントはそれらがＣＴＢのＧＭ、結合部位に保持される限り、該キメラと一緒に溶出されるであろう。このリゼート品にプロテアーゼインヒビターを加えることは５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察されるパターンを変えず、従ってこの溶解の前に宿主中で起こるものと考えられる。天然コレラ毒素よりも高いｐＨでＧＭ、カラムから該キメラを溶出せしめる能力は、このＣＴＢ成の構造が遺伝子融合により変化していることを示唆する。しかしながら、この変化の程度は調べていない。

Ｄ、Ｖ１７８２の作製旦、ミュータンズのグルコシルトランスフェラーゼＢ酵素の抗原セグメントをＶ１５５５キメラタンパク質のイムノブロッティング分析により同定した。Ｇｔ　ｆＢ又はＣＴＢのいづれかに対する抗血清と交差反応するペプチドフラグメントの１つは、それが両方のタンパク質に由来する抗原性セグメントを含むことを示している。このフラグメントの分子量はＣＴＢのそれよりも若干大きい。従って、Ｖ１５５５キメラの翻訳がＣＴＢに関する停止コドンにて終結すると仮定すると、このフラグメントは該ＣＴＢタンパク質の全長及び該ＧｔｆＢタンパク質の小さな領域であって、融合体のジャンクション付近に位置しているものを含む。

同定したなら、ｇｔｆＢ遺伝子の配列（Ｓｈｉｒｏｚａら、１９８７）を、この抗原領域の親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）プロットをＨｏｐｐとＷｏ。

ｄｓ　（１９８３）アルゴリズムに基づいて作り上げるために用いる。この領域の二次構造予測もＧａｒｎｉｅｒら（１９７８）のアルゴリズムを利用して行う。高い部分移動性及び親水性の両方を有するこの領域のいくつかのドメインを同定した。

このようなドメインの１つを図５に示す。このドメインは比較的親水性であり、そして構成率の高い二次構造が欠如している。この領域のアミノ酸配に適合できる合成オリゴヌクレオチドのセットを合成した。このｇｔｆ８．１オリゴヌクレオチドをｐＶＡ１５４２においてプロモーターレスｃｔｘＢ遺伝子に遺伝子的に融合せしめた（図３）。Ｉ）ＶＡ１５４２の中へのｇｔｆ８．１の挿入は、プロモーター及びリポソーム結合部位の欠如に基づき、ｃｔｘＢの発現をもたらさない。このことは、Ｅ、コリ　ｏｍｐＡ遺伝子（Ｇｈｒａｙｅｂら、１９８４）のリーダーペプチド配列をコードする分泌型ベクターｐｏｍｐＡ２へのｃｔｘＢ遺伝子融合体の移し入れは、完全細胞リゼート品においてＣＴＢについてのＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出されうるキメラタンパク質の発現をもたらす。

このｃｔｘＢキメラを含む分泌型ベクターをｐＶＡ１７８２と称する（図３）。

このプラスミドを含むＥ、コリ株は、ＣＴＢ又はＧｔ　ｆＢに対する抗血清と免疫反応できるキメラタンパク質を発現することかできる。Ｖ１７８２キメラのイムノブロッティング分析は、１ｍＭのＩ　ＰＴＧを含むＭ−９アガープレート上で増殖せしめた細胞から個々に単離せしめたクローンに由来するリゼート品を調製することによって行なう。

このサンプルを還元条件のもとて１５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分け、その後ニトロセルロースシートに電気泳動的に移した。グルコシルトランスフェラーゼＢに対する抗血清と反応するペプチドを矢印で示す。Ｖ１５５５リゼート品はＧｔｆＢの２種類の不完全バージョンを含み、これをコントロールとして用いた。

免疫反応性タンパク質がＶ１５５５からのリゼート品及びｇｔｆ８．１を発現するクローンから検出されたが、バッグランドコントロールとして用いたＶ１７８４からは検出されなかった。

該キメラタンパク質を過剰生産する能力はワクチンの大量生産のために所望される特徴である。プラスミドが含まれる、Ｖ１７８２キメラ又はＶ１７８４を含む細胞リゼート品は１ｍＭのＩ　ＰＴＧによる誘発の前に○、Ｄ、６６０＝０．６迄Ｍ−９培地中で増殖させである。誘発に基づき、この細胞を２時間発現させ、その後浸透圧ショックによりこのペリプラズムの含有物を回収した。コントロールとして、各株の同時平行培養物をＩＰＴＧの非存在下において増殖させた。ショック化液のサンプルを１５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分け、その後ニトロセルロースにプロット化せしめた。このプロットをＣＴＢに対する抗血清と反応させた。Ｉ　ＰＴＧの添神加は、生産されるキメラのレベルを高めた。しかしながら、Ｅ、コするために同一のプラスミド上に位置せしめた。このＩａｃｊ遺伝子はプロモーター活性を有意に低めたが、該タンパク質の発現を完全には阻害しなかった。強く制御されるわけではないが、プロモーター活性はＩ　ＰＴＧの非存在下において有意に抑制され、宿主の正常な増殖を可能にさせた。浸透圧ショック実験は、ｏｍｐＡリーダーに融合されているキメラタンパク質より構成されるほとんどのタンパク質がＥ、コリのペリプラズムの中に分泌されていることを示した。細胞外活性は検出されなかった。Ｖ１５５５キメラの従来の研究はＥ、コリの細胞質にトラップされるタンパク質をもたらしている。これはタンパク質の抽出を困難にするか、しかしＯｍｐＡの利用は浸透圧ショックにより細胞から容易に抽出されうるペリプラズム内へのタンパク質の分泌を可能にする。Ｖ１７８２に由来するこのキメラタンパク質を本明細書において以降の全ての試験に用いた。

Ｅ、Ｖ１７８２キメラの精製該キメラタンパク質を、ＧＭ、に対するＣＴＢ成分の親和性に基づき、６Ｍ１アフイニテイークロマトグラフイーにより精製した。このカラムを、浸透圧ショックに由来するキメラの濃縮のため、この液をカラムに循環せしめることにより利用した。４°Ｃでの飽和はカラムへの仕込みを開始して２４時間以内において達成された。このキメラはｐＨ３，０迄の低下に基づいてのみこのカラムから溶出した。より高いｐＨの利用は該タンパク質の溶出をもたらさなかった。表■は典型的な実験による精製データーを示す。約２３ｇのタンパク質が１回の溶出により回収されることができた。このカラムからの５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したサンプルの銀染色は、はとんどの夾雑タンパク質かこの方法により除去されたことを示した。Ｖ１５５５キメラにおいて、タンパク質のタンパク質分解は観察されなかった。

アフィニティー精製キメラのサンプルをゲル濾過カラム（セファデックスＧ１００）に載せ、そしてＰＢＳにおいて溶出させた。Ｖ１７８２キメラのゲル濾過プロフィールは以下の通りに得られた。Ｇ　Ｍ　ｒカラム精製キメラを、セファデックスＧ−１００を含む１．６　Ｘ　２０　Ｏｃｍカラムを通して分けた。カラム画分のサンプルを還元し、そして１５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分けた。タンパク質を銀染色により識別化せしめた。活性をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。これはＧＭ、−被覆ウェルに結合する該キメラの能力に基づき、モしてＣＴＢに対する抗血清により同定される、全タンパク質をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。このサンプルを２つの主なサイズのクラスに分けた、天然分子量標準品を用い、このタンパク質は５４及び１７．４　ｋＤａｌ　（ＣＴＢ＝３３ｋＤａｌ）と見込まれた。カラム画分からのサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分け、これは両方の画分の共通する二種の物質の存在（１６，４及び１７．４　ｋＤａｌ）を示した。イムノブロッティング分析は、これらの物質がＣＴＢ又はＧｔｆＢに対する抗体を用いたかに関係なく免疫学的に同一であることを示した。カラム画分の組成物及び免疫反応が同一であるため、この画分は該キメラのモノマー及びオリゴマー型を含むことが予想される。このオリゴマー画分中に高分子量タンパク質が観察され、これはイムノプロットにおいて抗血清と反応せず、モしてモノマーを含む画分に存在していなかった。ＥＬＩＳＡに基づく生物学的活性は、このほとんどの反応性物質がオリゴマーに関連することを示した。

Ｆ、Ｖ１７８２キメラの分析Ｖ１７８２キメラのモノマー型を２５周期のエドマン分解にかけた。このアミノ酸配列は、このような融合タンパク質の構造により予想されるものと同一であることが分った（図５）。このシーケンスデーターにより、ｏｍｐＡタンパク質のリーダー配列はこのタンパク質のペリプラズム型には存在していなかった。ｏｍｐＡリーダーへの該キメラタンパク質の融合はシグナル配列の認識及び分解のためのＥ、コリの能力に影響を及ぼさないと考えられる。このデーターは、該サンプル中においていかなる更なるＮ−末端配列も存在していないことを示唆した。

該キメラのモノマー及びオリゴマー型のＣ−末端のアミノ酸組成も天然ＣＴＢのそれと比較した。タンパク質サンプルをシアン化臭素による反応によって切断せしめ、そしてそのペプチドフラグメントをＨＰＬＣにより分画した。タンパク質の溶出を２１５ｎｍの吸収によりモニターした。次に得られるペプチドをその全アミノ酸組成について分析した（表■）。

解はａｌａ−ａｓｎジペプチドフラグメントを遊離せしめるであろうことを予測させる（Ｌｏｃｋｍａｎ　ａｎｄ　Ｋａｐｅｒ、　１９８３）。表■をこのペプチドＡがこの組成を有することを示す。このジペプチドは３つのサンプル全てから単離された。ペプチドＢのアミノ酸配列は該キメラＸの６１−９２の残基について予測されるのと合っていることが見い出せた。ペプチドＣは明らかに、残留シアン化臭素ペプチドの非分解混合物である。

該キメラに関し、ペプチドＡ及びＢを集め、分析し、そしてこれらか実質的に１＝１の比で存在することを示した（０．５１ｎｍｏｌｅのＡ１０゜６２　ｎｍｏｌｅのＢか回収された）。これは天然ＣＴＢから得られるそれぞれの量と実質的に同じであった（　０．９６　ｎｍｏｌａのＡ　／　１．２　ｎｍｏｌｅのＢ）。従って、このサンプルか天然ＣＴＢとキメラの混合物である可能性か除外される。測定の限界内において、該タンパク質の翻訳はｃｔｘＢについて通常認識される停止コドンにて一様に終結するものと考えられる。

Ｇ、Ｖ１７８２キメラの５ＤＳ−ＰＡＧＥＳＤＳ−ＰＡＧＥによるゲル濾過カラムから溶出液の分析は、サイズにおいて１７．４及び１６．４ｋＤａｌの、２種類の型のキメラがモノマー並びにオリゴマー画分にあることを示唆した。ＣＴＢ、モノマー及びオリゴマーのサンプルを還元し、そしてアルキル化してジスルフィド結合の形成をブロックし、その後５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。１５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥによりこのサンプルを分画してから、クマジーブルーにより染色せしめた。いくつかのサンプルはこのゲルに添加する前に２−メルカプトエタノールにより還元し、その後ヨード酢酸によりアルキル処理した。一定のサンプルを２．５％の２−メルカプトエタノール及び１％のＳＤＳを含む添加緩衝液中で５分間煮沸した。他のサンプルも同様に処理したの際のこれらのサンプルのプロフィールに何ら影響を及ぼさなかった。これらのサンプルを８Ｍの尿素を含むゲルを用いる５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画せしめた場合、１４．４　ｋＤａｌの単独物質のみが観察された。このタンパク質は該キメラのモノマー型に関するヌクレオチド配列データーにより予測されるのと同一のサイズであった。

Ｈ，ジスルフィド結合該キメラのモノマー及びオリゴマー型を、そのジスルフィド結合の存在について、ヨード酢酸によるこのタンパク質のアルキル化処理によって分析した。ヨード酢酸とのアルキル化処理の後、タンパク質１モル当り２．２モルのカルボキシメチルシスティンがこのモノマーについて見い出され、しかしながらオリゴマーにおいては検出されなかった。このことは、２伺の遊離なスルフヒドリル基を有すモノマーと一致し、従ってこのモノマー画分は適当な分子内ジスルフィド結合の欠いたキメラの還元型を含むことを示唆する。

■９円二色性モノマー、オリゴマー及びＣＴＢのサンプルを円二色性による分析にかけた。これらのサンプルのスペクトルを図６に示す。この結果は、天然ＣＴＢの最小値に比べての該オリゴれは活性における有意な相違に結びつかないであろう。他方、該モノマーの構造はＣＴＢ及びオリゴマーと極端に相違し、これは活性の低下に関連するであろう。

Ｊ、キメラの免疫反応性最初のイムノプロットは、該Ｖ１７８２キメラかＣＴＢ又はＧＴＦのいづれかに対する抗血清に対して抗原性であることを示した。しかしなから、このタンパク質か免疫原であるか、又は該キメラに対して発生する抗血清か天然のＧＴＦ酵素を認識するかは明確でない。これを調べるため、ＣＴＢ。

ＧＴＦ及びキメラを含む複製プロットを調製した。このプロットをＣＴＢ、ＧＴＦ又はキメラのいづれかに対する抗血清とプローブせしめた。結果は、このキメラがＣＴＢ及びＧＴＦと反応する抗体を誘発せしめることを示した（図７）。抗 −キメラ抗体とＧＴＦとの反応は、ＧＴＦに対する抗血清により生ずるそれよりも弱かったが、この抗−キメラ抗体は比較的小さい１５０　ｋＤａｌの酵素の領域に対して特異的であるため、このことは予測されていた。

Ｋ、酵素活性の阻害該キメラに対する抗血清を、インビトロでグルコシルトランスフェラーゼ活性を阻害せしめるその能力について評価した。このアッセイの特異性はこの阻害試験を行う前に確認した。Ｓ、ミュータンズ　Ｇ５−５の細胞外タンパク質を、グルカンポリマーへの”Ｃ−（ｇ　ｌ　ｕ）−スクロースの一体化を測定することにより、グルコシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。ポリマー全てをメタノール中で沈殿させ、そしてガラスファイバーフィルター上で集めた。この酵素活性が実際に測定されているかを調べるため、このアッセイを２通りの方法で確めた：　（Ａ）グルカン合成は２０時間のインキュベーションにわたり直線的に増加することが示された：　（Ｂ）合成されるグルカンの量は利用するタンパク質の量と反比例する。サンプリングはトリプリケートで行った。各サンプルについての１分間当りの平均カウント値を、ＰＢＳを含むバックグランドコントロールから差し引いた。

このアッセイは経時的に直線状に増大し、そしてこの酵素の希釈はポリマー形成の低下をもたらすことが示された。

酵素調製品をＰＢＳ　（コントロール）又は正常ウサギプール血清（Ｎ、Ｒ，Ｓ）　、ウサギ抗Ｇｔ　ｆＢ血清又はウサギ抗−キメラ血清のいづれかに１＝２で希釈した。次にこのサンプルをアッセイを行う前に３７°Ｃで１時間ブレインキュベートした。反応を３７°Ｃで１８時間進行させた後、全グルカンを測定した。全てのサンプルをトリプリケートで行った。該キメラ又はＧｔ　ｆＢのいづれかに対する未希釈抗血清における酵素のブレインキュベーションは、コントロールに比べての全グルカン合成における低下をもたらした。正常ウサギプール血清（ＮＲ３）は酵素活性を阻害しなかった。この阻害の反応速度を評価するため、酵素活性を経時的に測定した。

結果は、Ｇｔ　ｆＢに対する抗血清は全グルカン合成（水溶性＋水不溶性）の速度を低めるが、グルカンの合成を阻害しないことを示した（図８）。このことは、この阻害がおそらく酵素の活性部位の破壊ではなく、立体障害に基づくことを示唆する。

抗血清を、希釈によるそれらの阻害のレベルについて比較した。Ｇｔ　ｆＢ又はキメラのいづれかに対する抗血清を、酵素とのブレインキュベーションの前にＰＢＳに希釈した。全グルカンの合成を、この反応を３７°Ｃで８時間進行させた後に測定した。サンプリングはトリプリケートで行った。結果は、活性を阻害するこの抗−キメラ抗血清の能力は、抗−ＧＴＦ抗血清のそれの約半分であることを示した。これも驚くべきことではなく、その理由は該キメラに対する抗血清の限られた特異性に基づくからである。水不溶液グルカンは、水溶性ポリマーよりも、歯の表面に対するＳ、ミュータンズの堆積において大きな役割を有すると考えられる。この抗血清が、形成されるグルカンポリマーのタイプに何らかの効果を有するかどうかを調べるため、水不溶性ア・ソセイを行った（図９）。結果は、水不溶性グルカンの合成における劇的な効果を明白に示した。水溶性グルカンは合成されるほとんどの全ポリマーを占め、そしてＧｔｆＢに対する抗血清はこの酵素の活性を約５０％阻害した。しかしながら、水不溶性グルカンの形成はこの抗血清により９０％以上阻害された。フルクタン合成におけるこの抗血清の効果も同、様に調べた（図１０）。結果は、この抗血清も全フルクタン合成を阻害できるが、グルカンはどではないことを示した。この結果は予測していなかったが、しかしｇｔｆＢ、１とフルクトシルトランスフェラーゼについての配列データーの比較に基づき、両方のペプチドに共通する２組のトリペプチド（ｐｈｅ− ａｓｐ−ａｓｐ　；ａｌａ−ｔｒｐ−ａｓｎ）が示された。該キメラに対する抗血清はこれらの配列を部分的に認識し、従ってフルクタンの合成を妨害する。このデーターは、ＧＴＦのペプチドに対する抗血清がグルカン合成を阻害できることを示し、従ってこれらの抗−ペプチド抗体は歯の表面のコロニー形成のための旦、ミュータンズの能力に損傷を与えることができることを示唆する。

■、結果の考察Ｖ１７８２キメラの精製は二つの要因により大いに簡略化される。第１に、Ｅ、コリのペリプラズムへの該キメラの分泌により、このペリプラズムの内容物は細胞の中から容易に放出され、その後遠心によって分けることができる。これは主な潜在夾雑物を除去せしめる。第２に、ＧＭ、ガングリオシドに対するＣＴＢの高い親和性がアフィニティーク口マトグラフィーによる該キメラの精製に利用される。これは、該キメラから残っている主な夾雑物を迅速に除去する方法を提供する。表■は、大量のタンパク質がカラムからの単一溶出によって精製できることを示し、これはこのシステムかタンく還元型５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分けることのできないオリゴマー型のキメラであり、その理由はこれらはイムノプロットにおいて反応性でないからである。このＶ１５５５キメラはＧＭ、と結合することを既に示した。タンパク質の溶出はｐＨ４，０にて有効であり、これは天然のＣＴをこのアフィニティーカラムから溶出させるのに必要なｐＨよりも高い（Ｔａｙｏｔら、１９８１）。比較的大きめのタンパク質へのＣＴＢの融合はそのＧＭ、への親和性を変化せしめるものと予想される。

Ｖ１７８２キメラにおいて、ＣＴＢへの１５個のアミノ酸配列の融合はＧＭ、に対するそのアフィニティーを変えないものと考えられ、その理由はこれはｐＨ３，０にてのみこのカラムから溶出されつるからである。このｐＨでの溶出はタンパク質の分解ではないものと考えられる。従って、ＣＴＢのＧＭ。

結合ドメインはＣＴＢへの該ペプチド配列の融合によって変化しないものと考えられる。本発明者は、大きいペプチドフラグメントの利用はＣＴＥのＧＭ、結合ドメインの構造に影響を及ぼすことを発見した。

ＶＩ７８２キメラの一次構造を配列及び組成分析により確認した。該キメラのアミノ酸組成は、ヌクレオチド配列データーにより予想されるものと一致した。成熟型の該キメラの最初の２５個のアミノ酸の配列を調べ、モしてｏｍｐＡリーダーはＥ　コリにより通常認識される部位にて切断されることか確認された（Ｇｈｒａｙｅｂら、１９８４）。シアン化臭素分解は、該キメラのＣ末端ジペプチドフラグメントの単離及びそのＣＴＢのそれとの比較の便利な方法を提供する。予想通り、該キメラのＣ−末端はＣＴＢのそれと相違せず、従って該キメラの翻訳はＣＴＢについて通常認識される終止コドンにて終結することが確認された。

Ｇ　Ｍ　＋精製キメラのゲル濾過クロマトグラフィーはこのタンパク質を２つの画分に分けた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング分析に基づき、該キメラはそのモノマー及びオリゴマー型へと分けられるものと考えられ、その理由は同じ免疫反応性タンパク質が各画分において見られたからである。天然のＣＴＢは５個の同一サブユニットより成り、それらは非共有結合において配置化されている（Ｇｉｌｌ、　１９７６）。

各サブユニットはＣＴＢがＧＭ、に結合するのに重要な分子内ジスルフィド結合を含む（Ｌｕｄｗｉｇら、１９８５）　、　Ｇ　Ｍ　ｌ　−被覆マイクロタイターウェルに結合する該タンパク質に基っくＥＬ　Ｉ　ＳＡによる該モノマーのアッセイはほとんど活性を示さなかった。しかしながらこのモノマーはウェスタンプＯットでは免疫反応性であり、このことはＧ　Ｍ　＋結合のために必要なジスルフィド結合の欠如を示唆する。このことは、該モノマー及びオリゴマーのサンプルをヨード酢酸と反応させることにより確認した。このモノマーのみが還元型システィンを含むことが見い出せた。該モノマーをこのアフィニティーカラムから一緒に溶出させるためには、これはＧＭ、と結合しなくてはならない。ＣＴＢのサブユニットは酸処理によって可逆的に解離しくＨａｒｄｙら、１９８８）　、そしてキメラの画分はカラムからの溶出の際に解離且つ還元されるようである。このモノマーはアルカリ条件のもとて８Ｍの尿素を透析することによって再生することができる。再生はオリゴマーの形成及びＥＬＩＳＡにおける反応性をもたらす。ＣＴＢのジスルフィド架橋はその構造及び機能において強い効果を有するようであり、その利用はそれかないとＧＭ、へのキメラの結合及びオリゴマーの形成が失われるからである。キメラに関するここで報告する結果は天然ＣＴＢについて報告されているものと一致し、従ってＣＴＢのＮ末端へのペプチドの付加はそのリガンドへの結合又はオリゴマーを形成するその能力に最小の影響を有することを示唆する。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる還元条件のもとての該キメラの分子量の評価の試みは、該キメラの２つの型の存在を示した（　１６．４及び１７．４　ｋＤａｌ）。この型は両方共免疫反応性であり、そして予想よりもはるかに大きかった（　１４．４　ｋＤａｌ）。

該モノマー又はオリゴマーの還元及びアルキル化処理は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより観察されるパターンに影響を及ぼさなかった。第１に、これら結果は該キメラが２種類の異なる一次構造より成り、そしてこの大きめの物質のＮ又はＣ末端のいづれかでの更なるアミノ酸を示す。しかしながら、エドマン分解からの結果は、予想のＮ−末端配列のみが観察されることを明白に示した。同様に、このＣ−末端はもくろみの構造体より予測されるもののみであることを明白に示した。従って、ＳＤＳゲル上で見られたのは高いレベルでの構造的効果によるものであろうと考えられる。８Ｍの尿素における５ＤＳ−ＰＡＧＥによるサンプルの分画化は予測サイズの単一タンパク質について観察されるパターンを引き下げたため、このことが確認できた。その他の分子のタンパク質がオリゴマーのサンプルに見られたが、しかしこれらは未変性の多量体の型のキメラであると考えられる。従って、このキメラはＣＴＢでは見られない、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥのもとて２つの好ましい構造において存在するようである。このことは、ＣＴＢのＮ−末端への該ペプチドの付加がタンパク質の折りたたみ状態を、ＳＤＳ単独では通常用いる条件のもとて完全にほどくことのできない状態の程度に変化させることを示唆する。しかしながら、強いカオトロピック剤、例えば尿素の添加はこのタンパク質の構造を完全に変性せしめることができる。オリゴマーを形成する及びＧ　Ｍ　＋に結合する該キメラの能力は、この構造の相違がＣＴＢ成分の物理特性に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。しかしながら、これらの相違がＣＴＢのアジュバント特性に有意な作用を有するかどうかを調べる必要があるであろう。

円二色性による該タンパク質の分析はＣＴＢとオリゴマータンパク質の構造における若干の相違を示した。しかしながら、該モノマーの構造は大きく相違していた。該モノマーの構造における変化はＧＭ、結合活性及び他のサブユニットとの会合能力の低下に結びつく。これらの結果は、ＣＴＢのＮ末端への更なるアミノ酸の付加は該タンパク質の構造又はその機能にわずかな作用を有することを示した。

イムノブロッティング分析及び酵素阻害試験は、ｇｔｆＢ。

１ペプチドが免疫原であり、そして該ペプチドに対する抗血清が天然のタンパク質を認識できることを示した。このｇｔｆＢ、１ペプチドは、スクロースからの水溶性グルカンの一次形成を触媒せしめるｇｔ　ｆＢ酵素の配列に由来する。ｇｔｆＢ、ｌペプチドに対する抗血清か酵素活性を阻害するかとうかは分っている。しかしながら、ｇｔｆＢ、１に対する抗血清は水不溶性グルカンの形成のみを阻害するだけでなく、同様に可溶性グルカンの合成も阻害する。可溶性グルカンはこのｇｔｆＢ、１ペプチドか両方の遺伝子生成物の領域であって互いに有意な同一性を分は合う領域の中に位置することを示した。コントロールに比べ、可溶性グルカンの合成は若干の低下であるか、不溶性グルカン合成はほぼ完全になくなる。この相違の理由は不明であるが、しかしながらこれはこの抗血清かｇｔ　ｆＢ遺伝子生成物をその他のグルコンルトランスフエラーゼより阻害することか示唆される。これは遺伝子生成物の間のペプチドの構造における小さな相違に基つくものと思われ、これは抗体の結合性に影響する。酵素の間の有意な構造相違が示されつる。その他の酵素に比べて該ペプチドは、抗体か接するＧｔ　ｆＢの表層はより暴露されているる。どのケースにおいても抗体はその構造に影響を及ぼす。

本発明の方法及び生成物において種々の改良及び変更がなされることかできることを当業は理解するであろう。従って、本発明は、請求の範囲内において提供する本発明の改良及び変更を含むことを意図する。

ｇｔｆＢ　１５０　水不溶性Ｉ　Ａｏｋｉら、１９８６ｇｔｆＤ　１５５　水不溶性２　Ｈａｎａｄａら、１９８９２、酵素活性のためにデキストランプライマーを必要。

表■、細菌株及びプラスミドＶ１５５５　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書Ｖ１６１９　Ａｐ　本明細書Ｖ１７８２　Ａｐ本明ｍｅＶ１７８４　Ａｐ　本明細書Ｓ、ミュータンズＧ５−５　本明細書プラスミドｐＪＢＫ３０　Ａｐ、Ｔｃ　Ｋａｐｅｒら、１９８４ｐＨＫ７　Ａｐ　本明細書ｐｌＮＩ［［ｏｍｐＡ２　Ａｐ　Ｇｈｒａｙｅｂら、１９８４ｐＶＡ１５４２　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書ｐＶＡ１５４３　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書ｐＶＡ１５４４　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書１）ＶＡ１５５５　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書ｐＶＡ１５９９　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書ｐＶＡ１６６２　Ａｐ、　Ｔｃ　本明細書ｐＶＡ１７８２　Ａｐ　本明細書ｐＶＡ１７８４　Ａｐ　本明細書表’ｆｆ１．　ｎｌ１１！表：　Ｖｌ　７８２キｊ５表■、シアン化臭素処理ペプチドのアミノ酸組成ペプチド　Ａ　ペプチド　Ｂ　ペプチド　Ａ　ペプチド　８参照文献Ａｏｋｉ、　Ｈ，、５ｈｉｒｏｚａ、　Ｔ、、　Ｈａｙａｋａｗａ、　Ｍ、、　５ａｔｏ、　Ｓ、、　ａｎｄＫｕｒａｍｉｔｓｕ、　Ｈ，（１９８６）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　１ｎｓｏｌｕｂｌｅ　ｇｌｕｃａｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏ　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５３：５８７−５９４゜Ａｓｅｎ、　Ｋ、、　Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｃａｆｅ、　Ｊ、　（１９８６）　ＡＣＱｍｐａｒａｔｉＶｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ａｎｄｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃａｒｉｏｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ−ｃａｒｉｏｇｅ旧ｃＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　５ｅｒｏｔｙｐｅｓ　。

帽ｃｒｏｂｉｏｓ　４７：５３−６６゜Ａｙａｋａｗａ、　Ｇ、、　Ｂｌｅｉｗｅｉｓ、　Ａ、、　Ｃｒｏｗｌｅｙ、　Ｐ、、ａｎｄ　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ。

Ｍ、　（１９８８）　Ｈｅａｒｔ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｓｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　５ｈａｒｅ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉａｎｄ　ｍｙｏｓｉｎｏＪ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　１４０：２５３−２５７゜Ａｙａｋａｗａ、　Ｇ、、　Ｓｉｅｇｅｌ、　Ｊ、、　Ｃｒｏｗｌｅｙ、　Ｐ、、　ａｎｄ　Ｂｌｅｉｗｅｉｓ、　Ａ。

（１９８５）　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ＢＩＴｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ：　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｒ＋ｔｓ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４８：２８０−２８６゜Ｂａｈｎ、　Ａ、、　５ｈｋｌａｉｒ、　１．、　ａｎｄ　）Ｉａｙａｓｈｉ、　Ｊ、　（１９７７）１ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｅｘｔｒａｎｓｕｃｒａｓｅｓ、Ｉｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅｓ、　ａｎｄｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｏｒａｌ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、　ＩＩ。

ＩＩＩＩｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ。

ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ、　ａｎｄ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ　ｆｒｏｍｏｒａｌ　５ｔｒｅＤｔｏｃｏｃｃｉ　ｉｎ　ｍｏｎｋｅｙｓｏ　Ｊ、　Ｄｅｎｔ、　Ｒｅｓ、　５６：１５８６−１５９８゜Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ、Ｌ、ａｎｄ　Ｌｅｈｎｅｒ、Ｔ、（１９８３）　Ｌａｃｋ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎ　５ｅｒａ　ｏｆ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙｓｉｍｍｕｎｊｚｅｄ　ｗｉｔｈ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｗｉｔｈ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉｓｅｒａｏ　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ。

４０：１０７５−１０８２゜Ｂｅ５ｓｅｎ、Ｄ、ａｎｄ　Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ、Ｖ、（１９８８）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆｉｎｔｒａｎａｓａｌ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｏｆ　Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎｍｕｃｏｓａｌ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ。Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　５６：２６６６−２６７２　。

Ｂｅｔｌｅｙ、Ｍ、、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ、、ａｎｄ　Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、Ｊ、（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓｏ　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

４０：５７７−６０５゜Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，ａｎｄ　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、Ｄ、（１９６９）ＡｃｏｍｐＩｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｏ　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

４１：４５９−４７２゜Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｊ、（１９６７）Ａ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　０）ｕＬａｎｓａ　Ａｒｃｈ　０ｒａｌ　Ｂｉｏｌ、１２：ｌ６５７−１６５８　。

Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ、Ｓ、ａｎｄ　Ｔｏｍａｓｉ、Ｔ、（１９８０）Ｓｙｓｔｅｍｉｃｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　５ｅｃｒｅｔａｒｙ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　ｏｒａｌｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５２：１４５９−１４７２゜Ｃ１ａｒｋｅ、　Ｊ、　（１９２４）　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅａｅｔｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｄｅｎｔａｌ　ｃａｒｉｅｓ、　Ｂｒ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｐａｔｈｏｌ、５：１４１−１４７　。

Ｃｒａｂｂｅ、Ｐ、、Ｎａ５ｈ、Ｄ、、Ｂａｚ４ｎ、Ｈ，、Ｅｙｓｓｅｎ、Ｈ，、ａｎｄＨｅｒｅｍａｎｓ、Ｊ、（１９６９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｇＡ　ｔｙｐｅ　１ｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｌａｓｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｇｅｒｍｆｒｅｅ　ｍ１ｃｅ　ａｆｔｅｒ　ｏｒａｌ　ｏｒｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１３０ニア２３−７３９　。

Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、Ｐ、（１９７３）Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｈｏＩｅｒａ　ｔｏｘｒｎ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２：３５５８−６６　。

Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｒ，（１９８６）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ａｎ　ａｎｔｉｃａｒｉｅｓｖａｃｃｉｎｅ　ｏ　Ｊ、Ｄｅｎｔ、Ｒｅｓ、６５：ｌ０３４−１０４５゜Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ、Ｍ、ａｎｄ　Ｍａｃｒｉｎａ、Ｆ、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｏｒａｌ　ｍ１ｃｒｏｆｌｏｒａ。

Ｉｎ　Ｍｙｅｒｓ、Ｈ，（Ｅｄ、）　Ｎｅｗ　ＴｅｃｈｎｏＩｏｇｊｅｓ　ｊｎ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａ５ｅｌ　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）　。

Ｅｌｓｏｎ、Ｃ，ａｎｄ　Ｅａｌｄｉｎｇ、Ｗ、（１９８４ａ）　Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｄ　ｍｕｃｏｓａｌ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　：ｎ　ｒｎｉｃｅ　ａｆｔｅｒ　ｍｕｃｏｓａｌ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈ　ｃｈｏｌｅｒａ　ｔｏｘｉｎｏ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２：２７３６− ２７４ｉ　。

Ｅｌｓｏｎ、Ｃ，ａｎｄ　Ｅａｌｄｉｎｇ、Ｗ、（１９８４ｂ）　Ｃｈｏｌｅｒａ　ｔｏｘｉｎｆｅｅｄｉｎｇ　ｄｉｃｌ　ｎｏｔ　１ｎｄｕｃｅ　ｏｒａＩ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｍ１ｃｅ　ａｎｄａｂｒｏｇａｔｅｄ　ｏｒａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ａｎ　ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ｐｔｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ　ｏ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３３：２８９２−２８９７　。

Ｆｅｎｗｉｃｋ、Ｂ、ａｎｄ　０ｓｂｕｒｎ、Ｂ、（１９８６）　Ｖａｃｃｌｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆ　Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｔｅｔａｎｕｓｔｏｘｏｉｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｏ　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５４：５８３−５８６　。

Ｆｕｈｒｍａｎ、Ｊ、ａｎｄ　Ｃｅｂｒａ、Ｊ、（１９８１）Ｓｐｅｃｉａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆｔｈｅ　ｐｒｉｍｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ａ　５ｅｃｒｅｔａｒｙ　ＩｇＡ　ｒ［！５ｐＯｎＳｅｏ　Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｗｅｄ、１５３：５３４−５４４　。

Ｇａｒｎｉｅｒ、Ｊ、、Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｒｏｂｓｏｎ、Ｂ、（１９７８）Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆｇｌｏｂｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１２０：９７−１２０゜Ｇｅｙｓｅｎ、Ｈ，、Ｔａ１ｎｅｒ、Ｊ、、Ｒｏｄｄａ、Ｓ、、Ｍａｓｏｎ、Ｔ、。

Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｈ，、Ｇｅｔｚａｆｆ、Ｅ、、ａｎｄ　Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，（１９８７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ、５ｃｉｅｎｃｅ２３５：１１８４−１１９０　。

Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、、　Ｋｉｍｕｒａ、　Ｈ，、Ｔａｋａｈａｒａ、　Ｍ、、　Ｈｓｉｕｎｇ、　Ｈ，。

Ｍａｓｕｉ、Ｙ、、ａｎｄ　Ｉｎｏｕｙｅ、Ｍ、（１９８４）　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｏ　ＥＭＢｏ　３：２４３７−２４４２゜Ｇ１１ｌ、Ｄ、（１９７６）　Ｔｈｅ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　５ｕｂｕｎｉｔｓ　ｉｎ　ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ　ＯＢｉｏｃｈｅｍ、１５：１２４２−１２４８　。

Ｇｏ、Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、Ｉｌ、２７１−２８７゜１Ｖｅｌｃｈ、Ｒ，、Ｊｏｎｅｓ、Ｋ、、ａｎｄ　Ｍａｃｒｉｎａ、Ｆ、（１９７９）Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ　ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ−ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　１ｎＢａｃｔｅｒｏｊｄｅｓ　ｏ　Ｐｌａｓｍｉｄ　２：２６１−２６８　。

Ｗｅｓｔｈｏｆ、Ｅ、、Ａｌｔｓｃｈｕｈ、Ｄ、、Ｍｏｒａｓ、Ｄ、、Ｂｌｏｏｍｅｒ、Ａ、。

Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ、Ａ、、Ｋｌｕｇ、Ａ、、ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ、Ｍ、（１９８４）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｅｇｍｅｎｔａｌ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　１ｏｃａｔｉｏｎｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏ　Ｎａｔｕｒｅ　３１１：１２３−１２６　。

抗−〇ＴＢ　、　＜Ｂ−ＧｔｆＢ　を九−ＣｈｉｍｅｒａＣ，Ｐ、Ｍ、１４Ｃ− グルコース％活性Ｃ，Ｐ、Ｍ、１４Ｃ−フルクトース国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．コレラ毒素のＢサブユニットの少なくともの一部、及び該コレラ毒素のＢサブユニットのＮ末端に融合している所望の抗原のエピトープ領域を含んで成り、ここで該エピトープ領域は該所望のペプチドの抗原決定基を含んで成る、キメラペプチド。
２．前記のエピトープ領域が１００個より多くのアミノ酸を含んでいない、請求項１に記載のキメラペプチド。
３．前記のエピトープ領域が約１５〜２０個のアミノ酸を含んで成る、請求項２に記載のキメラペプチド。
４．対象体において、所望の抗原に対する免疫応答を誘発せしめるために該対象に投与せしめるためのワクチンであって、コレラ毒素のＢサブユニットの少なくとも一部、及び該コレラ毒素のＢサブユニットのＮ末端に融合している該所望の抗原のエピトープ領域（ここで該エピトープ領域は該所望のペプチドの抗原決定基を含んで成る）並びに薬学的に受け入れられている担体を有するキメラペプチドを含んで成るワクチン。
５．前記のエピトープ領域が１００個より多くのアミノ酸を含んでいない、請求項４に記載のワクチン。
６．前記のエピトープ領域が約１５〜２０個のアミノ酸を含んで成る、請求項５に記載のワクチン。
７．前記のコレラ毒素のＢサブユニットが、経口的に投与される場合に前記のエピトープ領域の免疫応答を高める、請求項４に記載のワクチン。
８．前記のワクチンが歯のカリエスの予防を助成するために投与されるものであり、且つ前記のエピトープ領域が１００個分のアミノ酸の長さより長くないグルコシルトランスフェラーゼＢタンパク質のセグメントを含む、請求項４に記載のワクチン。
９．前記のエピトープが以下のアミノ酸配列：【配列があります】、を含んで成る、請求項８に記載のワクチン。
１０．コレラ毒素のＢサブユニットの如くとも一部、及び該コレラ毒素のＢサブユニットのＮ末端に融合している所望のペプチド（ここで該エピトープ領域は該所望の抗原決定基を含んで成る）を含んで成るキメラペプチドをコードする、実質的に純粋なＤＮＡ配列。
１１．前記のエピトープ領域が前記のグルコシルトランスフェラーゼＢタンパク質の１５〜２０個のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１０に記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。
１２．請求項１０に記載のＤＮＡ配列を含むベクターであって、該ベクターが宿主生物において発現することが可能であるベクター。
１３．請求項１１に記載のＤＮＡ配列を含むベクターであって、該ベクターが宿主生物において発現することが可能であるベクター。
１４．ｐＶＡ１７８２を含んで成るベクター。
１５．ｐＶＡ１５４２，ｐＶＡ１５４３及びｐＶＡ１５４４のいづれか１つを含んで成るベクター。
１６．以下のアミノ酸配列：【配列があります】、を含んで成る、グルコシルトランスフェラーゼＢタンパク費の実質的に純粋なエピトープ領域。
１７．請求項１０に記載のベクターにより形質転換されている宿主生物。
１８．対象体をワクチン化せしめる方法であって、抗体応答を誘発せしめるのに十分な投与量において該対象体に組成物を経口的に投与せしめることにより、一定のペプチドに対して特異的な抗体をこの患体において発生させることを含んで成り、ここで該組成物はコレラ毒素のＢサブユニットの少なくとも一部、及び該コレラ毒素のＢサブユニットのＮ末端に融合している所望する抗体応答に対する該一定のペプチドのエピトープ領域（該エピトープ領域は該所望する抗体応答に対するペプチドの抗原決定基である）並びに薬学的に受け入れられる担体を含んでいる、方法。
１９．キメラペプチドの製造のための、組換ＤＮＡを中介する方法であって：（ａ）コレラ毒素のＢサブユニットの少なくとも一部及び患体において抗体応答を誘発せしめることが可能なエピトープをコードする、少なくとも１種のポータブルＤＮＡを調製し（ここで該エピトープをコードするＤＮＡは該コレラ毒素のＢサブユニットをコードするＤＮＡ部の５′末端側に位置する）；（ｂ）該ポータブルＤＮＡ配列を、宿主微生物の中に移し入れることができ且つその中で複製されることができる少なくとも１種類のベクターの中にクローン化せしめ（ここで該ベクターは該ポータブルＤＮＡ配列によりコード化される該キメラペプチドの発現のための因子を含む）；（ｃ）該ポータブルＤＮＡ配列を含む該ベクターを、該ベクターの誘導のもとで少なくとも１種類のキメラペプチドを生産せしめることができる宿主微生物の中に移し入れ；（ｄ）該ベクターの維持及び該キメラペプチドの合成のために適切な条件のもとで該宿主微生物を培養せしめ；そして（ｅ）該キメラペプチドを回収せしめること、を含んで成る方法。