JP2002503461A - 遺伝子ワクチンベクター工学 - Google Patents

遺伝子ワクチンベクター工学

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＤＮＡシャッフリングの使用によってワクチンを得る方法を提供する。特許請求の範囲の方法の使用を通じて、遺伝子ワクチンとしての使用について効力の増強を示すベクターを入手し得る。この方法を使用することによって得られるベクターは、例えば、抗原の発現の増強、細胞中への取り込みの増加、細胞中での安定性の増加、免疫応答を変更する能力などを有し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願に対する相互参照） 本出願は、米国仮出願第６０／７４，２９４号（１９９８年２月１１日に出願
）の特典を主張し、この米国仮出願は、全ての目的のために、本明細書中におい
て参考として援用される。
【０００２】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、遺伝子ワクチンの分野に関する。特に、本発明は、特定のワクチン
接種の目的のために最適化された成分を含む、多成分の遺伝子ワクチンを提供す
る。
【０００３】 （背景） 遺伝子免疫は、保護的な体液性免疫および細胞性免疫を誘導する新規な機構を
示す。遺伝子ワクチン接種のためのベクターは、一般に、プロモーター／エンハ
ンサー配列、目的の遺伝子およびポリアデニル化／転写終結配列を含むＤＮＡか
らなる。筋肉内または皮内注射の後、目的の遺伝子は、発現され、続いて生じた
タンパク質は、免疫系細胞により認識される。遺伝子免疫は、病原体が十分に特
徴付けされないか、あるいは実験室環境で単離され得ないかまたは培養され得な
い場合の状況でさえも、保護的な免疫を誘導するための手段を提供する。
【０００４】 遺伝子ワクチンによる所望のインビボ応答の誘発は、一般に、複合配列におけ
る多数の細胞プロセスを必要とする。遺伝子ワクチンが哺乳動物の免疫系でその
効果を発揮し得る、いくつかの可能性のある経路が存在する。１つの経路では、
この遺伝子ワクチンベクターは、ワクチンを受ける組織における主な細胞型であ
る細胞（例えば、筋細胞または上皮細胞）に侵入する。これらの細胞は、ベクタ
ーによりコードされる抗原を発現し、そして放出する。ワクチンベクターは、生
存しているトランスフェクトされた細胞からインタクトなタンパク質として放出
される（すなわち、分泌プロセスを通じて）か、またはこれらの細胞の表面上の
膜結合型に指向する抗原を有するように操作され得る。抗原はまた、これらの細
胞が死ぬ場合、このような細胞の細胞内区画から放出され得る。これらの状況の
いずれかに由来する細胞外抗原は、細胞表面に結合し（具体的には、ＩｇＭレセ
プターを通じてかまたは他の非免疫グロブリンレセプターを通じて）、そして続
いて外膜のエンドサイトーシスによってか、あるいは液体相の微小ピノサイトー
シスによって（ここで抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、エンドサイトーシスの区画内
に細胞外液体およびその含有物を内部移行する）のいずれかでＡＰＣと相互作用
する。ＡＰＣとの相互作用は、細胞外環境における部分的なタンパク質分解性切
断の前後に生じ得る。いずれの場合でも、この組織における主な細胞型中でのワ
クチンベクターの内部移行に由来する抗原および抗原の発現は、ＡＰＣ内で終了
する。次いで、ＡＰＣは、ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞（ＴH１および／またはＴH２ ）の活性化および強く特異的な免疫応答の発達に不可欠な工程である、ＭＨＣ１
クラスＩおよびまたはＭＨＣクラスＩＩを内部的に開始するように、抗原をプロ
セスする。
【０００５】 対応する経路では、この遺伝子ワクチンプラスミドは、ＡＰＣ（またはこの組
織における主な細胞型）に侵入し、そして細胞外輸送を指向するプラスミド発現
に由来する抗原の代わりに、抗原は、細胞の細胞質中でタンパク質分解的（プロ
テアソーム依存性または非依存性プロセスで）に切断される。しばしば、このよ
うな細胞中の細胞内プロセシングは、プロテアソーム分解を通じてペプチド中で
生じ、このペプチドは、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２タンパク質により認識され
、そして粗面小胞体（ＲＥＲ）の内腔中に輸送される。このペプチドフラグメン
トは、ＭＨＣクラスＩと共にＲＥＲ複合体中に輸送される。次いで、このような
抗原フラグメントは、クラスＩと会合して細胞表面上に発現される。次いで、Ｃ
Ｄ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）保有特異的Ｔ細胞レセプターは、この複 合体を認識し、そして適切なさらなるシグナルの存在下で、機能的ＣＴＬに分化
し得る。
【０００６】 さらに、十分に特徴付けされていない経路（一般に、優性ではない）は、生成
したペプチドをエンドソーム区画に細胞質輸送するためにＡＰＣに存在し、ここ
でこのペプチドは、最後にはＭＨＣクラスＩＩと複合体化し、それによって抗原
ペプチドをＣＤ４+ＴH１細胞およびＴH２細胞に提示するように作用し得る。活 性化、増殖、分化およびＢリンパ球による免疫グロブリンアイソタイプ転換は、
ＣＤ４+Ｔ細胞の補助を必要とするので、ＭＨＣクラスＩＩ分子の状況における 抗原提示は、抗原特異的抗体の誘導に重要である。この経路によって、遺伝子ワ
クチンベクターは、上記の優性ＣＤ８+ＣＴＬ活性化プロセスに加えて、ＣＤ４+ Ｔ細胞の刺激を導き得る。しかし、この代替的な経路は、ＭＨＣクラスＩＩ発現
のレベルが非常に低いかまたは発現していない筋細胞ではほとんど重要ではない 遺伝子ワクチンはまた、ＤＮＡに結合、またはＤＮＡを吸収する細胞からのサ
イトカイン放出を誘発し得る。いわゆるＤＮＡの免疫刺激性またはアジュバント
特性は、ＤＮＡを内部移行する細胞とのその相互作用に由来する。サイトカイン
は、遺伝子転写の非存在下で、ＤＮＡを結合および／または内部移行する細胞か
ら放出され得る。別々に、ＡＰＣとの抗原の相互作用、次いで提示および特異的
認識はまた、これらの細胞および他の免疫細胞に陽性フィードバック効果を有す
るサイトカインの放出を刺激する。これらの効果の中で主要なものは、優先的に
ＴH１またはＴH２表現型への分化／増殖にＣＤ４+ＴH細胞を指向することである
。さらに、ＤＮＡワクチン接種の部位で放出されるサイトカインは、それらの放
出の機構に関わらず、すぐ近くの位置の領域およびより離れた部位（例えば、排
出性リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ））からの他の免疫細
胞の漸増に貢献する。強力な免疫応答誘発におけるサイトカインの重要性の認識
において、いくつかの調査物は、免疫のための標的抗原と共にＤＮＡワクチンプ
ラスミド中に１つ以上のサイトカインについての遺伝子を含んでいる。この場合
、サイトカインは、細胞とのＤＮＡの相互作用、または抗原に対する特異的細胞
応答に固有のプロセスのみではなく、ワクチンプラスミドにより指向される合成
を通じるプロセスに由来する。
【０００７】 免疫細胞は、離れた部位からまたは血流から免疫部位に補充される。次いで、
特異的および非特異的な免疫応答は、大きく増幅される。免疫細胞（ＭＨＣ分子
に複合体化された抗原フラグメントを保有するか、またはプラスミドの取り込み
由来の抗原を発現さえするＡＰＣを含む）はまた、免疫部位から他の部位（血液
、それ故全ての組織；リンパ節；脾臓）に移動し、ここでさらなる免疫の漸増な
らびに免疫応答の質的発達および量的発達が続いて起こる。
【０００８】 これらの経路は、しばしば、競合するが、以前に利用可能であった遺伝子ワク
チンは、各々の経路に影響するための全ての成分を単一ポリヌクレオチド分子中
に組み込んでいる。別々の細胞型は、遺伝子ワクチンベクターの強力な免疫応答
に必要とされる複雑な相互作用に関するので、相互に適合性がない結果は、単一
ベクター分子中に組み込まれた遺伝子ワクチンの投与から生じ得る。現在の遺伝
子ワクチンベクターは、抗原の正確な細胞内の運命または抗原発現の免疫学的結
果を制御する任意の設計エレメントをほとんど有さない場合、所望の抗原の発現
のための単純な方法を使用する。従って、遺伝子ワクチンは、ワクチン研究およ
び開発に大きな見込みを示すが、これらの技術の主要な改良の必要性およびいく
つかの深刻な制限は明らかである。
【０００９】 適切な実験室モデルがないことに大きく起因して、存在する遺伝子ワクチンベ
クターは、ヒト組織に対して最適化されていない。この存在する遺伝子ワクチン
ベクターは、代表的には、目的の抗原の低くかつ短期間の発現を提供し、大量の
ＤＮＡさえも、保護的免疫応答を誘導するために十分な高い発現レベルをいつも
生じるとは限らない。細胞中へのベクターの侵入および核内への移入の機構は十
分に理解されていないので、実質的にこれらの重要な特性を改良するために試み
はなされていない。同様に、ベクター機能（遺伝子発現を含む）の維持を調節す
る機構については、ほとんど公知ではない。さらに、特定の配列がＤＮＡの免疫
刺激特性を変更することを示すデータの量が増加しているが、合理的な操作は、
この情報を使用して改良された免疫調節特性を有するベクター骨格を生成する場
合、非常に面倒かつ時間を浪費するアプローチである。
【００１０】 さらに、現在利用可能な遺伝子ワクチンベクターは、さらなるワクチン投与の
ないブースター免疫を送達し得るワクチンについての所望を満足するためにイン
ビボでの十分な安定性、誘導性または発現レベルを提供しない。ブースター免疫
は、代表的には、現存する遺伝子ワクチンでの最初の注射後、３〜４週間を必要
とされる。
【００１１】 従って、改良された遺伝子ワクチンベクターおよび処方物、ならびにこのよう
なベクターの開発のための方法についての必要性が存在する。本発明は、これら
および他の必要性を満たす。
【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、少なくとも１つ、および好ましくは２つ以上の遺伝子ワクチン成分
を含む多成分の遺伝子ワクチンを提供し、これらの成分は、このワクチンに、ワ
クチン接種に対する最適な応答を達成するように免疫応答を指向する能力を付与
する。例えば、この遺伝子ワクチンは、最適な抗原放出を提供する成分；細胞傷
害性Ｔリンパ球の最適な産生を提供する成分；免疫モジュレーターの放出を指向
する成分；ケモカインの放出を指向する成分；および／あるいは所望の標的細胞
型への結合、または侵入を促進する成分を含み得る。例えば、成分は、標的細胞
（例えば、抗原発現細胞または抗原提示細胞）への遺伝子ワクチンの結合、およ
び取り込みを改良する改良されたものを付与し得る。
【００１３】 さらなる成分は、細胞中への抗原の取り込みに由来する抗原ペプチドを、クラ
スＩ分子またはクラスＩＩ分子上のいずれかへの提示に指向する成分を含む。例
えば、クラスＩ分子上への提示に抗原ペプチドを指向する成分を含み得、そして
クラスＩＩ分子上での提示に抗原ペプチドを指向するタンパク質（例えば、タプ
シン、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２）および／または成分をコードするポリヌク
レオチドを含み、そしてエンドソームプロテアーゼまたはリソソームプロテアー
ゼのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１４】 いくつかの実施態様において、１つ以上の遺伝子ワクチン成分は、以下の工程
を含む方法により得られる：（１）組換え核酸のライブラリーを産生するために
、遺伝子ワクチンに所望の特性を付与し得る少なくとも第１型および第２型の核
酸を組換えする工程であって、ここでこの第１型および第２型が２つ以上のヌク
レオチドにおいて互いに異なる、工程；ならびに（２）遺伝子ワクチンに所望の
特性を付与する能力の増強を示す少なくとも１つの最適化された組換え成分を同
定するためにライブラリーをスクリーニングする工程。この成分のさらなる最適
化が所望される場合、以下のさらなる工程を実行し得る：（３）組換え核酸のさ
らなるライブラリーを産生するために、さらなる型の核酸と少なくとも１つの最
適化された組換え成分を組換える工程であって、この核酸は、第１型および第２
型と同じかまたは異なる型である工程；（４）遺伝子ワクチンに所望の特性を付
与する能力の増強を示す少なくとも１つのさらなる最適化された組換え成分を同
定するためにさらなるライブラリーをスクリーニングする工程；ならびに（５）
必要な場合、さらなる最適化された組換え成分が、遺伝子ワクチンに所望の特性
を付与する能力の増強を示すまで、（３）および（４）を繰り返す工程。
【００１５】 本発明のいくつかの実施態様において、第１型の核酸は、遺伝子ファミリーの
第１のメンバーであり、そして第２型の核酸が遺伝子ファミリーの第２のメンバ
ーを含む。さらなる型のモジュール核酸はまた、遺伝子ファミリーのメンバーで
あり得る。例として、この遺伝子ファミリーの第１のメンバーは、生物の第１の
種から得られ得、そしてこの遺伝子ファミリーの第２のメンバーは、生物の第２
の種から得られ得る。所望される場合、本発明の方法により得られる最適化され
た組換え遺伝子ワクチン成分は、例えば、組換え遺伝子ワクチン成分のさらなる
ライブラリーを産生するために、最適化された組換え遺伝子ワクチン成分を、１
モル濃度過剰の第１型および第２型の基質核酸の一方または両方と組換える工程
ならびに免疫応答を調節する成分を含む遺伝子ワクチンベクターの能力をさらに
増強する、少なくとも１つの最適化された組換え遺伝子ワクチン成分を同定する
ためにさらなるライブラリーをスクリーニングする工程、によって戻し交雑され
得る。
【００１６】 本発明のさらなる実施態様は、宿主細胞において遺伝子ワクチンベクターに複
製能力の増強を付与する遺伝子ワクチン成分を得る方法を提供する。これらの方
法は、以下の工程を含む：ポリヌクレオチドを含むベクターにエピソーム様複製
を付与し得る、少なくとも２つの型のポリヌクレオチドの組換えに供することに
より組換え核酸のライブラリーを作製する工程；宿主細胞の集団中にベクターの
ライブラリーを導入する工程であって、各ベクターが細胞表面抗原をコードする
組換え核酸およびポリヌクレオチドのライブラリーのメンバーを含む、工程；多
数の世代について宿主細胞の集団を増殖させる工程；ならびに細胞の表面上に細
胞表面抗原を提示する細胞を同定する工程であって、ここで細胞表面抗原を提示
する細胞が、エピソーム様に複製するベクターの能力を増強する組換えベクター
モジュールを含むベクターを有するようである工程。
【００１７】 宿主細胞中で複製能力の増強をベクターに付与する遺伝子ワクチン成分はまた
、以下の工程により入手され得る：ポリヌクレオチドを含むベクターにエピソー
ム様複製を付与し得るヒトパピローマウイルス由来の少なくとも２つの型のポリ
ヌクレオチドを組換えに供することにより組換え核酸のライブラリーを作製する
工程；ベクターのライブラリー（この各々が組換え核酸のライブラリーのメンバ
ーを含む）を宿主細胞の集団中に導入する工程；複数の世代について宿主細胞を
増殖させる工程；ならびにこのベクターを含む細胞を同定する工程。
【００１８】 さらなる実施態様において、本発明は、以下の工程によって、ヒト宿主細胞中
での増強した複製能力をベクターに付与する遺伝子ワクチン成分を得る方法を提
供する：ポリヌクレオチドを含むベクターにエピソーム様複製を付与し得る、少
なくとも２つの型のポリヌクレオチドを組換えに供することにより組換え核酸の
ライブラリーを作製する工程；遺伝子ワクチンベクターのライブラリー（この各
々が組換え核酸のライブラリーのメンバーを含む）を、ヒト免疫応答を模倣する
試験系に導入する工程；ならびにこの遺伝子ワクチンベクターが、試験系におい
て複製するかまたは免疫応答を誘導するかどうかを決定する工程。適切な試験系
は、例えば、免疫無防備状態の非ヒト宿主動物、または機能的なヒト免疫系を含
む非ヒト哺乳動物の皮膚において異物移植として提示されるヒト皮膚細胞を含み
得る。これらの系における複製は、この動物が抗原に対して免疫応答を示すか否
かを決定することにより検出され得る。
【００１９】 本発明はまた、抗原提示細胞に侵入する能力の増強を遺伝子ワクチンに付与す
る遺伝子ワクチン成分を得るための方法を提供する。これらの方法は、以下の工
程を含む；ポリヌクレオチドを含むベクターにエピソーム様複製を付与し得る、
少なくとも２つの型のポリヌクレオチドを組換えに供することにより組換え核酸
のライブラリーを作製する工程；遺伝子ワクチンベクターのライブラリー（この
各々は、組換え核酸のライブラリーのメンバーを含む）を、抗原提示細胞または
抗原プロセシング細胞の集団中に導入する工程；ならびに集団においてこの核酸
ベクターを含む細胞の百分率を決定する工程。目的の抗原提示細胞または抗原プ
ロセシング細胞は、例えば、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、ランゲ
ルハンス細胞、ケラチノサイト、および筋細胞を含む。
【００２０】 さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物において所望の免疫応答を誘
導する能力の増強を遺伝子ワクチンに付与する組換え遺伝子ワクチン成分を得る
方法を提供する。これらの方法は、以下の工程を含む：（１）組換え遺伝子ワク
チンベクターのライブラリーを産生するために、遺伝子ワクチンベクターを含む
、少なくとも第１型および第２型の核酸を組換える工程であって、ここで第１型
および第２型が２つ以上のヌクレオチドで互いに異なる、工程；（２）組換えワ
クチンベクターのライブラリーを、末梢血Ｔ細胞、Ｔ細胞クローン、新たに単離
された単球／マクロファージおよび樹状細胞からなる群から選択される哺乳動物
細胞の集団中にトランスフェクトする工程；（３）１つ以上のサイトカインの存
在についてこの細胞を染色する工程および所望の免疫応答を示すサイトカイン染
色パターンを示す細胞を同定する工程；ならびに（４）所望のサイトカイン染色
パターンを示す細胞から組換えワクチンベクター核酸配列を得る工程。
【００２１】 本発明はまた、以下の工程により免疫応答を調節する遺伝子ワクチンベクター
の能力を改良する方法を提供する：（１）組換え遺伝子ワクチンベクターのライ
ブラリーを産生するために、遺伝子ワクチンベクターを含む、少なくとも第１型
および第２型の核酸を組換える工程であって、ここでこの第１型および第２型が
２つ以上のヌクレオチドで互いに異なる、工程；（２）組換え遺伝子ワクチンベ
クターのライブラリーを、抗原提示細胞の集団中にトランスフェクトする工程；
ならびに（３）所望の免疫応答を調節する能力の増強を示す組換え遺伝子ワクチ
ンベクターを最適化した細胞から単離する工程。
【００２２】 本発明の別の実施態様は、哺乳動物の皮膚への投与での哺乳動物における所望
の免疫応答を誘導する能力の増強を有する組換え遺伝子ワクチンベクターを得る
方法を提供する。これらの方法は、以下の工程を含む：（１）組換え遺伝子ワク
チンベクターのライブラリーの産生のために、遺伝子ワクチンベクターを含む、
少なくとも第１型および第２型の核酸を組換えする工程であって、ここでこの第
１型および第２型が２つ以上のヌクレオチドで互いに異なる、工程；（２）哺乳
動物の皮膚に組換え遺伝子ワクチンベクターのライブラリーを局所的に適用する
工程；（３）免疫応答を誘導するベクターを同定する工程；ならびに（４）皮膚
細胞から免疫応答を誘導するベクターを含む遺伝子ワクチンベクターを回収する
工程。
【００２３】 本発明はまた、遺伝子ワクチンベクターを哺乳動物の皮膚に局所的に適用する
ことにより哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここでこの遺伝
子ワクチンベクターは、ＤＮＡシャッフリングの使用を通じて局所的な適用のた
めに最適化される。いくつかの実施態様において、この遺伝子ワクチンは、経皮
パッチ、クリーム、裸のＤＮＡ、ＤＮＡの混合物およびトランスフェクション増
強剤からなる群から選択される処方物として投与される。適切なトランスフェク
ション増強剤は、脂質、リポソーム、プロテアーゼ、およびリパーゼからなる群
から選択される１つ以上の薬剤を含む。あるいは、またはさらに、遺伝子ワクチ
ンは、剥離または毛の除去による皮膚の前処置後に投与され得る。
【００２４】 別の実施態様において、本発明は、ワクチンが導入される細胞のアポトーシス
を誘導するかまたは阻害する能力の増加を、この成分を含む遺伝子ワクチンに付
与する、最適化された遺伝子ワクチン成分を得る方法を提供する。これらの方法
は、以下の工程を含む：（１）組換え核酸のライブラリーを産生するために、ア
ポトーシス調節性ポリペプチドをコードする核酸を含む、少なくとも第１型およ
び第２型の核酸を組換える工程であって、ここでこの第１型および第２型が２つ
以上のヌクレオチドで互いに異なる、工程；（２）組換え核酸のライブラリーを
、哺乳動物細胞の集団中にトランスフェクトする工程；（３）アポトーシス開始
を示す細胞膜変化の存在について細胞を染色する工程；ならびに（４）所望のア
ポトーシス性膜変化を示す細胞から組換えアポトーシス調節性遺伝子ワクチン成
分を得る工程。
【００２５】 本発明の他の実施態様は、宿主哺乳動物中のＣＴＬ免疫応答の感受性の低下を
遺伝子ワクチンに付与する遺伝子ワクチン成分を得る方法を提供する。これらの
方法は、以下の工程を含み得る：（１）組換えＣＴＬインヒビター核酸のライブ
ラリーを産生するために、ＣＴＬ免疫応答のインヒビターをコードする遺伝子を
含む、少なくとも第１型および第２型の核酸を組換えする工程であって、ここで
この第１型および第２型が、２つ以上のヌクレオチドで互いに異なる、工程；（
２）組換えＣＴＬインヒビター核酸のライブラリーを含む遺伝子ワクチンベクタ
ーを複数のヒト細胞に導入する工程；（３）ＭＨＣクラスＩ分子発現の低下を示
す細胞を選択する工程；ならびに（４）選択された細胞から最適化された組換え
ＣＴＬインヒビター核酸を得る工程。
【００２６】 本発明はまた、宿主哺乳動物中のＣＴＬ免疫応答に対する感受性の低下を遺伝
子ワクチンに付与する遺伝子ワクチン成分を得る方法を提供する。これらの方法
は、以下の工程を含む：（１）組換えＣＴＬインヒビター核酸のライブラリーを
産生するために、ＣＴＬ免疫応答のインヒビターをコードする遺伝子を含む、少
なくとも第１型および第２型の核酸を組換えする工程であって、ここでこの第１
型および第２型が、２つ以上のヌクレオチドで互いに異なる、工程；（２）組換
えＣＴＬインヒビター核酸のライブラリーを含むウイルスベクターを、哺乳動物
細胞中に導入する工程；（３）導入後の所定の時間後に、ウイルスベクターに含
まれるマーカー遺伝子を発現する哺乳動物細胞を同定する工程であって、ここで
この同定された細胞は、ＣＴＬ応答に抵抗性である、工程；ならびに（４）同定
された細胞からの組換えＣＴＬインヒビター核酸を、遺伝子ワクチン成分として
回収する工程。
【００２７】 （詳細な説明） （定義） 用語「スクリーニング」は、一般的に、最適な抗原を同定するプロセスを記載
する。抗原のいくつかの特徴が、選別およびスクリーニングにおいて使用され得
る。この特徴としては、抗原発現、折りたたみ、安定性、免疫原性、およびいく
つかの関連する抗原由来のエピトープの存在などが含まれる。選別は、いくつか
の遺伝的環境において、マーカーを発現する細胞は生存可能であるが、他の細胞
は死滅する（または、逆も同じである）という選別マーカーの発現によって、同
定および物理的分離が同時に達成されるスクリーニングの形態である。スクリー
ニングマーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、お
よび緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選別マーカーとしては、薬物および毒素
耐性遺伝子などが挙げられる。インビトロで一次免疫応答を研究する際の限界の
ため、インビボでの研究は特に有用なスクリーニング方法である。これらの研究
において、抗原はまず試験動物に導入される。そして防御免疫応答を分析するこ
とによって、または免疫化された動物由来のリンパ系細胞を使用して、誘導され
た免疫応答の性質または強度を研究することによって、引き続きその免疫応答を
研究する。自発的な選別は自然の進化の中で生じ得、そして実際に生じるが、本
方法において選別はヒトによって実施される。
【００２８】 「外因性ＤＮＡセグメント」、「異種配列」または「異種核酸」は、本明細書
中で用いられる場合、特定の宿主細胞に対して外来である供給源から発生するも
のであるか、または同じ供給源由来の場合には、その本来の形態から改変された
ものである。従って、宿主細胞における異種遺伝子は、その特定の宿主細胞に対
して内因性であるが改変された遺伝子を含む。本明細書に記載される本出願の異
種配列の改変は、代表的には、ＤＮＡシャッフリングの使用を通して生じる。従
って、この用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるＤＮＡセグメントか、
または細胞に対して相同であるが宿主細胞核酸内の位置においてそのエレメント
が通常は見出されないＤＮＡセグメントをいう。外来性ＤＮＡセグメントを発現
し、外来性ポリペプチドを産生する。
【００２９】 用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連する任意のＤＮＡセグメントをいうた
めに、広範に使用される。従って、遺伝子は、コード配列および／またはそれら
の発現に必要とされる調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質
のための認識配列を形成する、発現されないＤＮＡセグメントを含む。遺伝子は
、目的の供給源からのクローニング、または公知のまたは推定された配列情報か
らの合成を含む種々の供給源から入手され得、そして所望のパラメータを有する
ように設計された配列を含み得る。
【００３０】 用語「単離された」は、核酸またはタンパク質に対して適用される場合、天然
の状態で付随する他の細胞成分を本質的に含まない核酸またはタンパク質を意味
する。それは、好ましくは同質な状態であるが、乾燥または水溶液のいずれかで
あり得る。純度および均質性は、代表的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動ま
たは高速液体クロマトグラフィーのような分析用化学的技術を使用して決定され
る。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質を実質的に精製する。特に、
単離された遺伝子は、遺伝子に隣接しかつ目的の遺伝子以外のタンパク質をコー
ドするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」は、
電気泳動ゲルにおいて、本質的に１つのバンドを生じる核酸またはタンパク質を
意味する。特に、これは核酸またはタンパク質が少なくとも約５０％純粋、より
好ましくは少なくとも約８５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％
純粋であることを意味する。
【００３１】 用語「天然に生じる」は、ヒトによって人工的に生成されることから区別する
場合、天然において見出され得るものを記載するために使用される。例えば、天
然の供給源から単離され得る生物体（ウイルス、細菌、原生生物、昆虫、植物ま
たは哺乳動物組織を含む）において存在するポリペプチド配列またはポリヌクレ
オチド配列、および実験室においてヒトによって意図的に改変されていないポリ
ペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
【００３２】 用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にあるデオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーをいう。特に限定
されない限り、この用語は、参照の核酸と類似の結合特性を有する天然のヌクレ
オチドの公知のアナログ、および天然に生じるヌクレオチドと類似の様式におい
て代謝される天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を含む。他に示さ
れない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例え
ば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明らかに示された配列を暗に包
含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）
コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換
された配列を産生することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９
８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌら
（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂ
ｅｓ ８：９１−９８）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によっ
てコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００３３】 「遺伝子由来の核酸」は、それらの合成に対して、遺伝子（またはそれらの部
分配列）が、テンプレートとして根本的に使用されている核酸をいう。従って、
ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ
、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなど
は、この遺伝子に全て由来し、そしてそのような由来産物の検出は、サンプルに
おける本来の遺伝子および／または遺伝子転写物の存在および／または数度の指
標である。
【００３４】 別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、核酸は「作動可能に連結され
る」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を
増加する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結される
とは、連結されているＤＮＡ配列が代表的には隣接し、そして２つのタンパク質
コード領域を結合することが必要である場合、隣接し、かつリーディングフレー
ム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーはプロモーターから数キロベ
ース程離れる場合でも一般的に機能し、そしてイントロン配列は種々の長さであ
り得るため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、隣接してはいないが作
動可能に連結され得る。
【００３５】 ２つの分子（例えば、リガンドとレセプター）の間の特異的結合親和力は、分
子の混合物の中で１つの分子が別の分子と優先的に結合することを意味する。分
子の結合は、その結合親和力が約１×１０4Ｍ-1〜約１×１０6Ｍ-1（またはそれ
以上である）場合に、特異的であると考えられ得る。
【００３６】 細胞に関して用いられる場合に、用語「組換え」は、細胞が異種核酸を複製す
るか、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現
することを示す。組換え細胞は、その細胞の天然の（非組換え）形態において見
出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、その細胞の天然の形態におい
て見出される遺伝子（ここで、この遺伝子は人為的な手段によって改変され、そ
して細胞中に再導入される遺伝子である）を含み得る。この用語はまた、細胞か
ら核酸を取り出すことなく改変された、細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を
包含する；そのような改変体としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および関
連技術によって得られるものが含まれる。
【００３７】 「組換え発現カセット」または単純に「発現カセット」は、そのような配列に
適合性である宿主において構造遺伝子の発現をもたらし得る核酸エレメントを有
する、組換え的にまたは合成的に生成された核酸構築物である。発現カセットは
、少なくともプロモーター、および必要に応じて転写終結シグナルを含む。代表
的には、組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプ
チドをコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現をもたらす際に必要な
または有益なさらなる因子はまた、本明細書中に記載されるように使用され得る
。例えば、発現カセットはまた、発現されたタンパク質の宿主細胞からの分泌を
方向付けるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シ
グナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列もまた、発現
カセットに含められ得る。
【００３８】 「多価抗原性ポリペプチド」または「組換え多価抗原性ポリペプチド」は、天
然には生じないポリペプチドであり、これは１つ以上の供給源ポリペプチド由来
のアミノ酸配列を含む。この供給源ポリペプチドは、代表的には天然に生じるポ
リペプチドである。異なるアミノ酸配列の少なくともいくつかの領域はエピトー
プを構成し、このエピトープは、供給源ポリペプチドを注射された哺乳動物にお
いて見出される抗体によって認識される。異なるエピトープが由来する供給源ポ
リペプチドは、通常は相同であり（すなわち、同じもしくは類似の構造および／
または機能を有する）、そしてしばしば、例えば、生物体の異なる単離体、血清
型、菌株、種由来、または異なる疾患状態由来である。
【００３９】 ２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一な」また
はパーセント「同一性」は、１つの以下の配列比較アルゴリズムの使用または視
覚的検査によって測定される場合、最大の一致に対して比較および整列される場
合に、同一であるかまたは特定の割合で同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレ
オチドを有する２つ以上の配列あるいは部分配列をいう。
【００４０】 ２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、句「実質的に同一な」は、１
つの以下の配列比較アルゴリズムの使用または視覚的検査によって測定される場
合、最大の一致に対して比較および整列される場合に、少なくとも６０％、好ま
しくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドもしくはアミノ酸残
基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的な
同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ましく
は少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして最も好ましくは配列
は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。いくつかの実施態
様において、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００４１】 配列比較について、代表的には一方の配列は、試験配列が比較される場合、参
照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および
参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を設計し、必要であれば、配
列アルゴリズムプログラムパラメータを設計する。次いで、配列比較アルゴリズ
ムは、設計されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列
についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００４２】 比較についての配列の最適な整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍ
ａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性ア
ルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａ
ｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての検索によって、これら
アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄ
ｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピューターでの実行によって、または視覚
的検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら、後述を参照のこと）によって、実施さ
れ得る。
【００４３】 パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズム
の１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される）。
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔ
ｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可
能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列において長さＷの短いワードを
同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）（これは、データベース配列中
の同じ長さのワードと整列される場合に、整合するか、またはいくつかの正数閾
値スコアＴを満たすかのいずれかである）をまず同定することを含む。Ｔは、付
近のワードスコア閾値として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これら
の初期の付近のワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための探
索を開始するための核として作用する。次いで、このワードヒットは、累積され
た整列スコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコ
アは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（整合する残基の対について
の応報（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびパラメータＮ（不整
合残基についてのペナルティースコア；常に０未満）を使用して計算される。ア
ミノ酸配列については、スコアマトリックスを累積スコアを計算するために使用
する。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積整
列スコアが、最大に達した値からＸ量だけ低下する；累積スコアが、１つ以上の
ネガティブスコア残基整列の蓄積に起因して、０以下になる；または、いずれか
の配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔお
よびＸは、整列の感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌ
クレオチド配列について）、初期設定としてワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）
（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）が１００、Ｍ
＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬ
ＡＳＴＰプログラムは、初期設定としてワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１
０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
およびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。
【００４４】 パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはま
た、２つの配列間の類似性についての統計学的解析を実行する（例えば、Ｋａｒ
ｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴ
リズムによって提供される類似性の１つの測定は、最少合計確率（ｓｍａｌｌｅ
ｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つの
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間での整合が偶然に生じる確率の指標を提
供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最少合計確率が約０
．１未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、そして最も好
ましくは約０．００１未満である場合、核酸配列は参照配列に類似であると考え
られる。
【００４５】 ２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つ分子がストリン
ジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。句「〜に特異的にハ
イブリダイズする」は、複合混合物（例えば、全細胞性の）ＤＮＡまたはＲＮＡ
中にその配列が存在する場合に、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオ
チド配列のみに対する分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズをいう。
「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダ
イゼーションをいい、そして標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成する
ために、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることに
よって適応され得る少数の不整合を含む。
【００４６】 サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのよう
な核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗
浄条件」は、配列依存的であり、そして異なる環境パラメータの下で異なる。よ
り長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダ
イゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔ
ｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ 第２章「Ｏｖｅ
ｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒ
ｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．に見出される。
一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件と
しては、規定されたイオン強度およびｐＨでの特異的配列に対する熱融点（Ｔm ）よりも、約５℃低いものが選択される。代表的に、「ストリンジェントな条件
」下で、プローブはその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハ
イブリダイズしない。
【００４７】 Ｔmは、完全に整合したプローブに対して、標的配列の５０％がハイブリダイ ズする温度である（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）。非常にストリン
ジェントな条件は、特定プローブについてのＴmに対して等しいものが選択され る。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上での、１００を超える
相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについてのストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを有する５０％
ホルムアミドで４２℃にて一晩ハイブリダイゼーションを実施することである。
高ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌで７２℃にて約１
５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて１５分間の０．
２×ＳＳＣでの洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
、後述、を参照のこと）。バックグラウンドのプローブのシグナルを除去するた
めに、しばしば、高ストリンジェンシーな洗浄の前に、低ストリンジェンシーな
洗浄が先立つ。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二重鎖についての中程度
なストリンジェンシーの洗浄の例は、１×ＳＳＣで４５℃にて１５分間である。
例えば、１００を超えるヌクレオチドの二重鎖についての低ストリンジェンシー
な洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣで４０℃にて１５分間である。短いプローブにつ
いて（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）、代表的なストリンジェント条件は
、約１．０Ｍ未満のＮａ+イオンの塩濃度、代表的にはｐＨ７．０〜８．３にて 約０．０１〜１．０ＭのＮａ+イオン濃度（または他の塩）を含み、そして温度 は、代表的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェント条件はまた、ホル
ムアミドのような不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の添
加で達成され得る。一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおい
て無関係のプローブについて観察されるより２倍（または、それよりも大きい）
の、ノイズに対するシグナルの比率が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を
示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それら
がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、なお実質的に同一で
ある。このことは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重を使
用して核酸のコピーが作製される場合に生じる。
【００４８】 ２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標
は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコー
ドされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるか、または特異的に結合す
ることである。従って、例えば、２つのポリペプチドが保存的置換によってのみ
異なる場合に、ポリペプチドは代表的に第２のポリペプチドに実質的に同一であ
る。
【００４９】 タンパク質またはペプチドをいう場合に、句「抗体に特異的（もしくは、選択
的に）結合する」または「特異的に（もしくは、選択的に）免疫反応性である」
は、タンパク質または他の生物製剤の異種集団の存在下における、タンパク質の
存在またはタンパク質由来のエピトープの存在に関して決定的である結合反応を
いう。従って、設計された免疫アッセイ条件下で、特異的抗体は特定のタンパク
質に結合し、そしてかなりの量において、サンプル中に存在する他のタンパク質
に結合しない。多価抗原性ポリペプチドに対して惹起された抗体は、一般的に１
つ以上のエピトープが得られたタンパク質に結合する。そのような条件下での抗
体に対する特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択さ
れる抗体を必要とし得る。種々の免疫アッセイ形式が、特定のタンパク質と特異
的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩ
ＳＡ免疫アッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学が、タンパク質と
特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために、慣用的に使用
される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイ形式およ
び条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ「Ｈａｒｌｏ
ｗおよびＬａｎｅ」を参照のこと）。代表的には、特異的または選択的な反応は
、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、そしてよ
り代表的にはバックグラウンドの１０倍〜１００倍を超える。
【００５０】 特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された改変体」は、同一もしく
は本質的に同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはポリ
ヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一である配列
をいう。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定の
ポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、
ＡＧＡおよびＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、コドン
によってアルギニンが特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変
化することなく、このコドンを記載された任意の対応するコドンに改変し得る。
そのような核酸改変体は、「サイレント改変体」である（これは、「保存的に改
変された改変体」の一種である）。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載
の全てのポリヌクレオチド配列はまた、他に注記される場合を除いて、全ての可
能なサイレント改変体を記載する。当業者は、核酸における各コドン（ＡＵＧを
除く（これは通常、メチオニンの単一のコドンである））が、標準的技術によっ
て機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることを認識する。従って、
ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント改変体」は、記載された各配列
中に意味される。
【００５１】 さらに、当業者は、コード配列における単一のアミノ酸もしくは低い割合（代
表的には、５％未満、より代表的には１％未満）のアミノ酸を改変、付加または
欠失する個々の置換、欠失あるいは付加は、改変が化学的に類似のアミノ酸での
アミノ酸の置換を生じる場合には「保存的に改変された改変体」であることを認
識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野におい
て周知である。以下の５群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む
： 脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、
イソロイシン（Ｉ）； 芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）； 硫黄含有：メチオニン（Ｍ），システイン（Ｃ）； 塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）； 酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グ
ルタミン（Ｑ）。 アミノ酸のさらなるグループ化については、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙもまた参照のこ
と。さらに、コード配列において単一のアミノ酸もしくは低い割合のアミノ酸を
改変、付加または欠失する個々の置換、欠失、あるいは付加はまた、「保存的に
改変された改変体」である。
【００５２】 「部分配列」は、それぞれ核酸もしくはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の
より長い配列の一部分を含む、核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００５３】 （好ましい実施態様の説明） （Ｉ．概要） 本発明は、１つ以上の成分モジュール（これらはそれぞれ、遺伝子ワクチン接
種において有用な特性もしくは特徴の獲得または改善を伴う遺伝子ワクチンを提
供する）を含む多成分の遺伝子ワクチンを提供する。本発明は、以前に使用され
た遺伝子ワクチンを超える有意な利点を提供する。多成分のワクチンの使用を通
して、特定の適用について特に効果的である免疫応答が得られ得る。多成分の遺
伝子ワクチンは、例えば、最適な抗原発現について最適化される成分、ならびに
樹状細胞ＭＨＣクラスＩ分子上での抗原の提示を増強することによって、細胞傷
害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）の改善された活性化を付与する成分を含み得る。さ
らなる実施例は、本明細書中に記載される。
【００５４】 さらなる実施態様において、本発明は、遺伝子ワクチン（遺伝子ワクチンに所
望の免疫応答特性を付与する際により効果的である、多成分のワクチンを含む）
における使用のための成分を得る方法を提供する。本方法は、組換え核酸のライ
ブラリーを作製する工程、および遺伝子ワクチンに所望の特性を付与する能力の
増強を示すライブラリーのメンバーを同定するためにライブラリーをスクリーニ
ングする工程を包含する。改善された特性を示すこれらの組換え核酸は、遺伝子
ワクチンの成分として、ポリヌクレオチドとしてかまたは成分の核酸の発現によ
って得られるタンパク質としてのいずれかで直接的に使用され得る。
【００５５】 獲得もしくは改善されることが努められ得る特性または特徴は広範に変化し、
そしてもちろん基質の選択に依存する。遺伝子ワクチンについて、改善目標とし
ては、より高い力価、より安定な発現、改善された安定性、より高度な特異的な
標的化、より高いかもしくはより低い頻度の組込み、ベクターもしくはそれらの
発現産物の免疫原性の減退、抗原の免疫原性の増加、遺伝子産物のより高い発現
などが挙げられる。最適化が所望される他の特性としては、特定の適用について
最も効果的である免疫応答の調整が挙げられる。遺伝子ワクチン成分の例を、図
１に示す。２つ以上の成分を単一のベクター分子中に含み得る。または各成分を
別々の分子として遺伝子ワクチン処方物中に存在させ得る。
【００５６】 本発明の方法において、核酸の少なくとも２つの改変体型を組み換えて、組換
え核酸のライブラリーを作製する。次いでこれをスクリーニングして、特定のワ
クチン特性について最適化される少なくとも１つの組換え成分を同定する。以下
にさらに詳細に記載されるように、配列組換えは、多くの異なる形式および形式
の変更において達成され得る。これらの形式は、いくつかの共通の原則を共有す
る。互いにいくらかの配列同一性を有するが、変異の存在下で異なる核酸分子の
ファミリーが、組換えの基質として代表的に使用される。任意の所定のサイクル
において、インビボもしくはインビトロで、細胞内でまたは細胞外で、組換えが
生じ得る。さらに、組換えから生じる多様性は、組換えの基質または産物のいず
れかに対して突然変異誘発の先行の方法（例えば、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐ
ｒｏｎｅ）ＰＣＲまたはカセット式変異誘発）を適用することによって、任意の
サイクルにおいて増強され得る。いくつかの場合において、新たなもしくは改善
された特性または特徴は、生物体の中の異なる個体または菌株由来の相同体とし
て、または同じ生物体由来の関連配列を対立遺伝子改変体として、異なる改変型
の配列を使用する場合に、単サイクルのみのインビボまたはインビトロ組換えの
後に達成され得る。しかし、反復的な配列組換え（これは、連続したサイクルの
組換えを引き起こす）は、さらに改善を産生し得る。
【００５７】 現在の好ましい実施態様において、ＤＮＡシャッフリングは、組換え核酸のラ
イブラリーを得るために使用される。このＤＮＡシャッフリングは、図２に図解
され、特定の特性が媒介される機構についての詳細な理解がない場合でさえも、
所望の特性の最適化を生じ得る。この改変（すなわち、進化）についての基質は
、獲得されるかまたは改善されるように努められる特性が変化するように、異な
る適用において変化する。特性の獲得または特性における改善についての候補基
質の例としては、遺伝子ワクチンにおいて使用されるウイルスベクターまたは非
ウイルスベクター、ならびに免疫応答の特定の局面を媒介することに関与する核
酸が挙げられる。本方法は、開始基質の少なくとも２つの改変体を必要とする。
候補成分の改変型は、互いに類似した実質的な配列または二次構造を有し得るが
、それらはまた、少なくとも２つの位置において異なるべきである。型の間の最
初の多様性は、例えば、異なる改変形態（ホモログ）が、生物体の異なる個体も
しくは菌株から得られる（組織的配列（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ）改変体を含む；
「ファミリーシャッフリング」と呼ばれる）か、または同じ生物体由来の関連配
列（例えば、対立遺伝子改変体）を構成するように、天然の改変の結果であり得
る。あるいは、最初の多様性は、例えば、第２の改変型が、第１の改変型の誤り
がちな転写（例えば、誤りがちなＰＣＲ）、またはプルーフリーディング活性を
欠損したポリメラーゼの使用（Ｌｉａｏ（１９９０）Ｇｅｎｅ ８８：１０７−
１１１を参照のこと））によってか、またはミューテーター菌株（ミューテータ
ー宿主細胞は、以下にさらに詳細に議論される）における第１の型の複製によっ
て作製され得るように、誘導され得る。
【００５８】 組換えサイクルは通常、所望の特性もしくは特徴を有する分子の少なくとも１
サイクルのスクリーニングまたは選別に先立つ。組換えサイクルがインビトロで
実施される場合、組換えの産物（すなわち、組換えセグメント）は、時折、スク
リーニング工程の前に細胞内に導入される。組換えセグメントはまた、スクリー
ニングの前に適切なベクターまたは他の調節配列に連結され得る。あるいは、イ
ンビトロで作製された組換えの産物は、時折、スクリーニングの前にウイルスと
してパッケージングされる。組換えがインビボで実施される場合、組換え産物は
、時折、組換えが生じた細胞内でスクリーニングされ得る。他の適用において、
組換えセグメントは、細胞から抽出され、そして必要に応じてスクリーニングの
前に、ウイルスとしてパッケージングされる。
【００５９】 スクリーニングまたは選別の性質は、いかなる特性もしくは特徴が獲得される
べきか、または改善が努められる特性もしくは特徴に依存する。そして多くの例
が以下に議論される。開始基質に関して、組換えの特定の産物（組換えセグメン
ト）が、新たに獲得したか、もしくは改善した特性または特徴についての分子的
な基礎を理解することは通常必要ない。例えば、遺伝子ワクチンベクターは、各
々が異なる意図された役割を有する多くの成分配列（例えば、コード配列、調節
配列、標的化配列、安定性付与配列、免疫モジュレーター配列、抗原提示に作用
する配列、および組込みに作用する配列）を有し得る。これらの成分の配列の各
々を、同時に変化し得そして組換えし得る。次いで、例えば、ベクターの個々の
成分配列のいずれにもそのような改善を寄与する必要性を伴わずに、標的細胞に
おいてエピソーム維持を増大した組換えセグメントについて、スクリーニング／
選別が実施され得る。
【００６０】 所望の特性について使用される特定のスクリーニング手順に依存して、スクリ
ーニングの初回は、時折、高トランスフェクション効率および培養の簡便性のた
め細菌細胞において実施され得る。後の回、および細菌細胞におけるスクリーニ
ングを受け入れられない他のスクリーニングの型は、一般的に、それらの意図さ
れる使用の環境に近い環境における使用に対して組換えセグメントを最適化する
ために、哺乳動物細胞において実施される。スクリーニングの最終回は、意図さ
れる使用の正確な細胞型（例えば、ヒト抗原提示細胞）において実施され得る。
いくつかの場合において、例えば、患者における免疫原性の問題を最小化する問
題を考慮して、この細胞を、処置されるべき患者から入手し得る。いくつかの方
法において、処置における遺伝子ワクチンベクターの使用は、それ自体がスクリ
ーニングの回として使用され得る。つまり、１患者において意図される標的細胞
によって、連続的に取り込みおよび／または発現される遺伝子ワクチンベクター
をそれらの標的細胞から回収し、そして別の患者を処置するために使用する。１
患者における意図された標的細胞から回収される遺伝子ワクチンベクターは、進
化した（すなわち、特異的取り込み、免疫原性、安定性などについて改善された
かもしくは新たな特性または特徴に対して、反復的な組換えによって改変した）
ベクターに富む。
【００６１】 スクリーニング工程または選別工程は、遺伝子ワクチンにおいて有用な、新た
なもしくは改善された所望の特性または特徴の獲得に対して進化した組換えセグ
メントの亜集団を同定する。スクリーニングに依存して、組換えセグメントは細
胞の成分として、ウイルスベクターもしくは他のベクターの成分として、または
自由な型においてスクリーニングされ得る。スクリーニングまたは選択の１以上
の回を、組換えの各々の回の後に実行し得る。
【００６２】 特性におけるさらなる改善が所望される場合、少なくとも１回そして通常、初
回のスクリーニング／選別で残存した組換えセグメントの回収物を、組換えのさ
らなる回に供する。これらの組換えセグメントを、互いにか、または本来の基質
を提示する外因性セグメントもしくはそれらのさらなる改変体と組換えし得る。
再度、組換えをインビトロまたはインビボで進行し得る。先のスクリーニング工
程が、細胞の成分として所望の組換えセグメントを同定する場合、この成分をイ
ンビボでのさらなる組換えに供し得るか、もしくはインビトロでのさらなる組換
えに供し得るか、またはインビトロでの組換えの回を実施する前に単離し得る。
逆に、先のスクリーニング工程が、裸の型においてか、またはウイルスベクター
もしくは他のベクターの成分として所望の組換えセグメントを同定する場合、こ
れらのセグメントは、インビボでの組換えの回を実施するために細胞内に導入さ
れ得る。どのように実施するかに関係なく、２回目の組換えは、前回から生じる
組換えセグメントと比較してさらなる多様性を包含するさらなる組換えセグメン
トを生成する。
【００６３】 ２回目の組換えは、初回について上記で議論された原則に従って、さらなる回
のスクリーニング／選別に先立ち得る。スクリーニング／選別のストリンジェン
シーを、回の間で増大し得る。また、１つ以上の特性が所望される場合または１
つ以上の新たな特性を獲得することが所望される場合、スクリーニングの性質お
よびスクリーニングされている特性は、回の間に変化し得る。次いで、組換えお
よびスクリーニングのさらなる回は、組換えセグメントが、所望される新たなも
しくは改善された特性または機能を獲得するよう十分に進化するまで、実施され
得る。
【００６４】 （ＩＩ．組換えの形式） スクリーニングのための組換え核酸のライブラリーを作製し得る、多くの異な
る形式が利用可能である。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、個々
の遺伝子、プラスミド全体もしくはウイルス全体、多重遺伝子クラスター、また
はゲノム全体でさえも「進化させる」ための組換え（「シャッフリング」）およ
びスクリーニングあるいは選別を実施することを必然的に伴う（Ｓｔｅｍｍｅｒ
（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５４９−５５３）。組換え
およびスクリーニング／選別の反復の回を、目的の核酸をさらに進化させるため
に実施され得る。そのような技術は、ポリペプチドを操作するための従来の方法
で必要とされた、広範な分析および計算を必要としない。シャッフリングは、従
来の対になる組換え事象（例えば、有性的な複製の間に生じるような）とは対照
的に、最小限の選別サイクルにおいて多数の変異の組換えを可能にする。従って
、本明細書中に記載の配列組換え技術は、任意または全ての変異の間での組換え
を提供し、それによって異なる変異の組み合わせが所望の結果に作用し得る様式
を探索する非常に早い方法を提供するという、特定の利点を提供する。しかし、
いくつかの場合において、構造的および／または機能的な情報は、配列組換えの
ために必要ではないが、この技術の改変の機会を提供するのに利用可能である。
【００６５】 ＤＮＡシャッフリング方法は、免疫原性を改善するためならびに特異性を広げ
るための少なくとも４つの異なるアプローチのうちの１つ以上を含み得る。第１
に、ＤＮＡシャッフリングは、単一の遺伝子において実施され得る。第２に、公
知の相同性遺伝子との配列比較によって、いくつかの高度に相同性の遺伝子を同
定し得る。これらの遺伝子は、所望の活性を有する組換え体を選別するために、
合成され、そしてホモログのファミリーとしてシャッフルされ得る。シャッフル
された遺伝子を、適切な宿主細胞中に導入し得る。この適切な宿主細胞としては
、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、および動物細胞など、な
らびに本明細書中に記載される方法によって同定され得る所望の特性を有する細
胞が挙げられ得る。第３に、遺伝子ワクチンに所望の特性を付与し得る遺伝子（
他のゲノム核酸と共に）をシャッフルするために、ゲノム全体のシャッフリング
が実施され得る。ゲノム全体のシャッフリングアプローチのために、どの遺伝子
がシャッフルされているかを同定する必要すらない。代わりに、例えば、組換え
核酸を獲得するために細菌細胞またはウイルスゲノムを組み合わせ、そしてシャ
ッフルする。この組換え核酸は、それ自体またはポリペプチドをコードすること
を通して、本明細書中に記載の任意のアッセイで測定されるような免疫応答を誘
導する増強した能力を有する。第４に、ポリペプチドコード遺伝子は、天然に生
じる任意の遺伝子に存在しない変異多様性を入手するために改変されたコドンで
あり得る。
【００６６】 時折、ＤＮＡシャッフリング、進化、または分子交配といわれる配列組換えに
ついての例示的な形式および例は、以下に記載の同時係争中の特許出願において
、本発明者らおよび共同研究者によって記載される：米国特許出願番号第０８／
１９８，４３１号（１９９４年２月１７日出願）、出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５
／０２１２６号（１９９５年２月１７日出願）、米国特許出願番号第０８／４２
５，６８４号（１９９５年４月１８日出願）、米国特許出願番号第０８／５３７
，８７４号（１９９５年１０月３０日出願）、米国特許出願番号第０８／５６４
，９５５号（１９９５年１１月３０日出願）、米国特許出願番号第０８／６２１
，８５９号（１９９６年３月２５日出願）、米国特許番号第０８／６２１，４３
０号（１９９６年３月２５日出願）、出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５４８０
号（１９９６年４月１８日出願）、米国特許出願番号第０８／６５０，４００号
（１９９６年５月２０日出願）、米国特許出願番号第０８／６７５，５０２号（
１９９６年７月３日出願）、米国特許出願第０８／７２１，８２４号（１９９６
年９月２７日出願）、出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１７３００号（１９９７年
９月２６日出願）、および出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２４２３９号（１９９
７年１２月１７日出願）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１５１０
（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３（１９９５）
；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５４９−５５３（
１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ
．Ａ．９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｔ
ｕｒｅ ３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１）：１−３（１９９６）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３１５−３１９（１９９６）
、これらの各々は、全ての目的のために、その全体が参考として援用される。
【００６７】 組換えポリヌクレオチドのライブラリーを得るため、および／またはシャッフ
リングについての基質として使用される核酸における多様性を得るための他の方
法としては、例えば、相同組換え（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５２２３；公開番号Ｗ
Ｏ９８／４２７２７）；オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（総説として、
Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）
）；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９
３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−
７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ、「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、
Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｃｋｓ
ｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉ
ｎ（１９８７）を参照のこと）が挙げられる。これらの方法の中に含められるの
は、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）、お
よびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８
７））、ホスホチオエートを改変したＤＮＡ突然変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙ
ｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８
５）；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４（１９８８））、ウラシル含有
テンプレートを使用する突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）およびＫｕｎｋ
ｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２））
；ギャップのある二重鎖ＤＮＡを使用する突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍ
ｅｒおよびＦｒｉｎｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５
０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
６：７２０７（１９８８））；ならびにＦｒｉｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８））がある。さらなる適切な方法
としては、点ミスマッチの修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８
８７（１９８４））、修復欠損宿主菌株を使用する突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；
Ｃａｒｔｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０
３（１９８７））、欠失突然変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅ
ｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６））
、制限処理選別および制限処理精製（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ
．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ ３１７：４１５−４２３（１９８６））、遺伝子全体
の合成による突然変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２
９９−１３０１（１９８４）；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら
、Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒｏ
ｅｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５
）が挙げられる。突然変異誘発のためのキットは、市販されている（例えば、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｎｇｌｉａ
ｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００６８】 交配手順は、互いに実質的な配列同一性（すなわち、少なくとも、約３０％、
５０％、約７０％、約８０％、または約９０％の配列同一性）を一般的に示すが
、特定の位置で互いに異なる少なくとも２つの基質で開始する。この差異は、任
意の型の変異（例えば、置換、挿入、および欠失）であり得る。しばしば、異な
るセグメントは、約５−２０の位置で互いに異なる。開始材料と比較して増加し
た多様性を作製するための組換えのために、開始材料は、少なくとも２つのヌク
レオチド位置において互いに異ならなければならない。すなわち、２つの基質し
か存在しない場合、これらは少なくとも２つの互いに異なる位置にあるべきであ
る。３つの基質が存在する場合、例えば、１つの基質は単一の位置にある第２の
基質と異なり得、そして第２の基質は、異なる単一の位置にある第３の基質と異
なり得る。開始のＤＮＡセグメントは、互いの天然の改変体、例えば、対立遺伝
子改変体または種改変体であり得る。このセグメントはまた、幾分の構造的およ
び通常機能的な関連性を示す非対立遺伝子由来であり得る（例えば、スーパーフ
ァミリー内の異なる遺伝子（例えば、ＹｅｒｓｉｎｉａのＶ−抗原のファミリー
のような））。開始のＤＮＡセグメントはまた、互いの誘導された改変体であり
得る。例えば、一方のＤＮＡセグメントは、他方（この核酸は、化学薬品または
他の突然変異原で処置され得る）の誤りがちなＰＣＲ複製によってか、または突
然変異原性カセットの置換によって産生され得る。誘導された変異はまた、突然
変異原性菌株においてセグメントの一方（または両方）を増殖することによって
か、または細胞において誤りがちな修復系を誘導することによって調製され得る
。これらの置換において、厳密にいうと、第２のＤＮＡセグメントは単一セグメ
ントではないが、関連セグメントの大きなファミリーである。開始材料を形成す
る異なるセグメントはしばしば、同じ長さまたは実質的に同じ長さである。しか
し、これは例えば、１つのセグメントが別の部分集団であり得る場合には必要で
ない。セグメントは、より大きな分子（例えば、ベクター）の一部分として存在
し得るか、または単離された形態であり得る。
【００６９】 開始のＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡセグメントの多様性ライブラリーを
生成するために本明細書中に提供される任意の配列組換え形式によって組換えら
れる。そのようなライブラリーは、１０未満のメンバーを有するものから、１０ 5 、１０9、１０12またはそれよりも大きいメンバーを有するものまでサイズが広
範に変化し得る。いくつかの実施態様において、開始セグメントおよび産生され
た組換えライブラリーは、全長コード配列および任意の発現に必要とされる必須
の調節配列（例えば、プロモーター配列およびポリアデニル化配列）を含む。他
の実施態様において、ライブラリーにおける組換えＤＮＡセグメントは、一般的
なベクター中に挿入されて、スクリーニング／選別を実施する前の発現に必要と
される配列を提供し得る。
【００７０】 核酸配列における変異を組換えるためのさらなる技術は、「再アセンブリＰＣ
Ｒ」を利用する。この方法は、全長の核酸テンプレート（例えば、遺伝子）に別
々に進化してきた複数のセグメントをアセンブルするために使用され得る。この
技術は、有利な変異のプールが以前の研究から公知である場合、または有利な変
異のプールが、当該分野において公知の突然変異技術（例えば、ＰＣＲ突然変異
誘発、カセット突然変異誘発、ドープで処理された（ｄｏｐｅｄ）オリゴ突然変
異誘発、化学的突然変異誘発、またはミューテーター菌株におけるインビボでの
ＤＮＡテンプレートの増殖）によって作製され得たスクリーニング変異によって
同定されてる場合に実施される。目的の核酸配列のセグメントを規定する境界は
、好ましくは遺伝子間領域、イントロン、または目的の変異を有していないよう
である遺伝子の領域に存在する。好ましくは、目的の核酸配列のセグメントのＰ
ＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドの配列が２つのセグメントの連結を重複
するように、オリゴヌクレオチドプライマー（ｏｌｉｇｏｓ）が合成される。重
複領域は、代表的には約１０〜１００ヌクレオチド長である。各セグメントは、
そのようなプライマーのセットを用いて増幅される。次いでこのＰＣＲ産物は、
無作為にフラグメント化された遺伝子をアセンブルするために本明細書中で議論
されるプロトコールのようなアセンブルプロトコールに従って、「再アセンブル
」される。簡潔には、アセンブリプロトコールにおいて、ＰＣＲ産物はまず、例
えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、プライマー
から精製される。精製された産物を、共に混合し、そして約１〜１０サイクルの
変性に供し、再アニーリングし、そしてポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシ
ド三リン酸（ｄＮＴＰ）ならびにさらなるプライマーを欠いた適切な緩衝塩の存
在下において伸長する（「自己プライマー化」）。引き続いて、この遺伝子に隣
接するプライマーでＰＣＲを使用して、完全に再アセンブルされた遺伝子および
シャッフルされた遺伝子の産物を増幅する。
【００７１】 さらなる実施態様において、目的の核酸配列のセグメント増幅のためのＰＣＲ
プライマーが使用されて、以下のように目的の遺伝子中に改変を導入する。核酸
配列の目的の位置での変異は、スクリーニングまたは選別によって、核酸配列の
相同体の配列決定などによって同定される。次いで、オリゴヌクレオチドＰＣＲ
プライマーが合成される。これは、目的の位置で野生型または変異型の情報をコ
ードする。次いで、設計された位置での、野生型および変異型の情報の変更をコ
ードする全長遺伝子のライブラリーを生成するために、これらのプライマーをＰ
ＣＲ突然変異誘発において使用する。この技術は、目的の変異の遺伝子の配列決
定をするコストおよび突然変異原性オリゴヌクレオチドを合成するコストと比較
して、スクリーニングまたは選別のプロセスが高価であり、厄介であり、または
現実的でない場合に、代表的に有利である。
【００７２】 （ＩＩＩ．遺伝子ワクチン接種において使用されるベクター） 本発明は、多成分の遺伝子ワクチンおよび核酸媒介免疫調節における使用のた
めの遺伝子ワクチンの能力を改善する遺伝子ワクチン成分を得る方法を提供する
。ＤＮＡシャッフリングによる遺伝子ワクチンおよび成分の進化のための一般的
アプローチは、図３に概略的に示される。概して、遺伝子ワクチンベクターは、
それが移行された哺乳動物細胞および生物体に対する医療的に有用な表現型効果
を生じる外因性のポリヌクレオチドである。ベクターは、複製起点を有してもよ
いし、有さなくてもよい。例えば、患者への投与前に十分量のベクターを得るた
めにベクターの増殖を可能にする様に、ベクター中に複製起点を含むことは、有
用である。このベクターが、宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれるか、または宿主
ｍＲＮＡもしくはＤＮＡと結合するように設計される場合、あるいはさもなけれ
ば、宿主における複製が所望されない場合、この複製起点は、投与前に除去され
得、またはベクター生成のために使用される細胞中で機能するが、標的細胞では
機能しない起点が使用され得る。しかし、本明細書中で議論されるいくつかの状
況を含む、特定の状況において、遺伝的ワクチンベクターは、適切な宿主細胞に
おいて複製し得ることが所望される。
【００７３】 遺伝子ワクチン接種において使用されるベクターは、ウイルス性または非ウイ
ルス性であり得る。ウイルスベクターは、通常、ウイルスの成分として患者に導
入される。本発明のＤＮＡシャッフリング方法によって改変される核酸を組み込
み得る例示的なウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスに基づいたベク
ター（Ｃａｎｔｗｅｌｌ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８８：４６７６−４６８３；
Ｏｈａｓｈｉ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ
９４：１２８７−１２９２）、エプスタイン−バーウイルスに基づいたベクター
（Ｍａｚｄａ（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４：１４
３−１５１）、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、シンドビスウイルスベク
ター（Ｓｔｒｏｎｇ（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：６２４−６２７）、
単純ヘルペスウイルスベクター（Ｋｅｎｎｅｄｙ（１９９７）Ｂｒａｉｎ １２
０：１２４５−１２５９）およびレトロウイルスベクター（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ（
１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６：６５６−６６２）が挙げられる。
【００７４】 非ウイルスベクター（代表的にはｄｓＤＮＡ）は、裸のＤＮＡとしてまたは伝
達増強ビヒクルＤＮＡ（例えば、レセプター認識タンパク質、リポソーム、リポ
アミン、または陽イオン性脂質）随伴して伝達され得る。このＤＮＡは、当該分
野で周知の様々な技術を使用して細胞中に伝達され得る。例えば、裸のＤＮＡは
、細胞膜と融合するか、またはエンドサイトシスされるリポソームの使用によっ
て（すなわち、リポソームに付着するリガンドまたはＤＮＡに直接付着するリガ
ンドを使用することによって）送達され得、これは、エンドサイトシスを生じる
細胞の表面膜タンパク質レセプターと結合する。あるいは、この細胞は、宿主細
胞を傷つけることなく、細胞中へのＤＮＡの輸送を増強するために透過化処理さ
れ得る。ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、細胞中へＤＮＡを伝達することが公知
のＨＢＧＦ−１）を使用し得る。さらに、ＤＮＡは、機械的手段（例えば、圧力
）によって送達されるＤＮＡで被覆された金粒子または他の粒子による皮膚のボ
ンバートメントによって送達され得る。細胞へ裸のＤＮＡを送達するためのこれ
らの手順は、インビボで有用である。例えば、特にリポソーム表面が標的細胞に
特異的なリガンドを保持するか、またはさもなければ特定の器官に優先的に指向
される場合、このリポソームを使用することによって、インビボで標的細胞／器
官内へのＤＮＡの導入を提供し得る。
【００７５】 （Ａ．ウイルスベクター） 種々のウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルスおよびヘルペスウイルス）は、一般に遺伝子ワクチン接種に使用さ
れる。これらは、しばしば２つの構成成分（改変されたウイルスゲノムおよびそ
れの周囲の被覆構造物）から調製されるが（一般に、Ｓｍｉｔｈ（１９９５）Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９、８０７−８３８を参照のこと）、
時々ウイルスベクターは、裸の形態で導入され、またはウイルスタンパク質以外
のタンパク質で被覆される。現在の大半のウイルスベクターは、野生型ウイルス
と類似の被覆構造物を有する。この構造物は、ウイルス核酸をパッケージおよび
保護し、そして標的細胞と結合し、そして侵入する手段を提供する。対照的に、
遺伝子ワクチン接種のために設計されたベクター中のウイルス核酸は、多くの方
法で変更され得る。これらの変更の目的は、例えば、利用可能なパッケージング
細胞またはヘルパー細胞中でベクター形態で増殖する能力を維持しながら、標的
細胞中のウイルスの複製を増強または減少すること、目的の遺伝子の適切な発現
をコードし、そして可能にする新しい配列（例えば、抗原コード遺伝子）を組み
こむこと、ならびにウイルスベクター自体の免疫原性を変化させることであり得
る。ウイルスベクター核酸は、一般に以下の２つの構成成分を含む：ヘルパー株
中で複製およびパッケージングするための必須ｃｉｓ作用ウイルス配列、ならび
に外因性遺伝子の転写ユニット。他のウイルスの機能は、特定のパッケージング
細胞株またはヘルパー細胞株においてトランスで発現され得る。
【００７６】 （（１）アデノウイルス） アデノウイルスは、直鎖状二本鎖ＤＮＡを含む、大きなクラスの非外被性ウイ
ルスを含む。ウイルスの正常な生活周期は、分裂細胞を必要とせず、多量のウイ
ルスが蓄積する間の許容性細胞中の増殖性感染を含む。この増殖性感染周期は、
細胞培養物中で約３２〜３６時間起こり、そして２つの期（ウイルスＤＮＡ合成
前の初期ならびに構造タンパク質およびウイルスＤＮＡが合成され、そしてビリ
オンにアセンブルされる間の後期）を含む。一般に、アデノウイルス感染は、ヒ
トにおける温和な疾患に関連する。
【００７７】 アデノウイルスベクターは、レトロウイルスまたはＡＡＶベクターよりやや大
きくそしてより複雑である。この原因の一部は、ウイルスゲノムの小画分のみが
現在の大半のベクターから除去されるからである。さらなる遺伝子が除去される
場合、これらは、ベクターを生成するためにトランスで提供され、このベクター
は、従来証明された困難性を有する。代わりに、２つの一般的な型のアデノウイ
ルスに基づいたベクター（Ｅ３欠失ベクターおよびＥ１欠失ベクター）が研究さ
れている。野生型の実験株におけるいくつかのウイルスは、Ｅ３領域を欠き、そ
してヘルパーの非存在下で増殖し得る。この能力は、このＥ３遺伝子産物が野生
型において必要でないということを意味せず、培養細胞における複製がそれらを
要求しないということのみを意味する。このＥ３領域の欠失は、外因性のＤＮＡ
配列の挿入が、増殖性感染および比較的多量のコードされたタンパク質の一過性
の合成の可能なベクターを生じることを可能にする。
【００７８】 このＥ１領域の欠失は、このアデノウイルスを無力化するが、このようなベク
ターは、依然として増殖され得る。なぜならば、Ａｄ５のＥ１領域を含み、そし
てこのＥ１タンパク質を構成的に発現する確立されたヒト細胞株（「２９３」と
呼ばれる）が存在するからである。最近のアデノウイルスを含む遺伝子治療適用
は、２９３細胞中で増殖されるＥ１置換ベクターを利用している。
【００７９】 アデノウイルスベクターの主要な利点は、それらが広範な範囲の細胞および組
織において効果的なエピソーム遺伝子伝達し得、そして多量で増殖することが容
易であることである。アデノウイルスに基づいたベクターもまた使用され、皮膚
上への局所適用後に抗原を送達し得、そして抗原特異的免疫応答の導入が皮膚へ
の送達後に観察され得る（Ｔａｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８：７２
９−７３０）。主要な欠点は、このウイルスに対する宿主応答が発現の持続期間
および少なくとも高用量の第一の生成ベクターを用いた投与を繰り返す能力を限
定するようであることである。
【００８０】 １つの実施態様において、本発明の組換え方法は、１０キロベースを超えるサ
イズのＤＮＡ挿入物をパッケージし得る、新規なアデノウイルスファージミドを
構築するために使用される。本発明の方法を使用するプラスミドにおけるファー
ジｆ１起点の組み込みもまた、ウイルスの全ゲノムを進化し得る、新規のインビ
ボのシャッフリング形式（例えば、ヒトアデノウイルスの３６ｋｂファミリー）
を生成する。広範に使用されるヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）は、３６ｋｂ
のゲノムサイズを有する。高いパーセントの非生存の組換え改変体のを生じ得る
過大な数の変化を作製することなくインビトロでこの大きなゲノムをシャッフリ
ングすることは難しい。この問題を最小化し、そしてＡｄ５の全ゲノムシャッフ
リングを達成するために、アデノウイルスファージミドが構築される。このＡｄ
ファージミドは、１５および２４キロベースほどの大きさの挿入物を許容し、そ
してそのサイズのｓｓＤＮＡを有効に生成することが実証されている。さらなる
実施例において、５０〜１００ｋｂほどの大きさのより大きなＤＮＡ挿入物がこ
れらのより大きな挿入物に対応する、全長ｓｓＤＮＡの生成を伴って、本発明の
Ａｄファージミドに挿入される。このような大きなｓｓＤＮＡフラグメントの生
成は、全ウイルスゲノムを進化する（すなわち、本発明の再帰的な組換え方法に
よって改変する）ための手段を提供する。従って、本発明は、はじめに大きなＤ
ＮＡ挿入物（１０ＫＢより大きい）をクローニングし得、そしてこれらの大きな
挿入物に対応するｓｓＤＮＡをインビトロおよびインビボで生成し得る固有のフ
ァージミド系を提供する。
【００８１】 ヒトアデノウイルスの関連した血清型のゲノムは、国際出願第ＰＣＴ/ＵＳ９ ７/１７３０２号（公開番号ＷＯ９８/１３４８５）に記載されるような、この固
有のファージミド系を使用して、インビボでシャッフリングされる。このゲノム
ＤＮＡは、最初にファージミドベクターにクローニングされ、そして「Ａｄｍｉ
ｄ」と名付けられた、生じたプラスミドは、ヘルパーＭ１３ファージを使用する
ことによって一本鎖（ｓｓ）Ａｄｍｉｄファージを生成するために使用され得る
。インビボでの組換えを達成するために、相同性のヒトアデノウイルスのゲノム
を含むｓｓＡｄｍｉｄファージが使用され、Ｆ+ ｍｕｔＳ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞 で高い多重性の感染（ＭＯＩ）を行う。このｓｓＤＮＡは、ＲｅｃＡのような組
換え酵素のより良い基質である。高いＭＯＩは、感染ｓｓＡｄｍｉｄ ＤＮＡの
コピー間で複数の交差を有する確率が高いことを保証する。このシャッフリング
されたアデノウイルスゲノムは、感染細胞由来の二本鎖Ａｄｍｉｄ ＤＮＡの精
製によって生成され、アデノウイルスライブラリーを生成するために許容性ヒト
細胞株中に導入される。このゲノムシャッフリング戦略は、多くの遺伝子におけ
る変化を伴う組換えアデノウイルス改変体の作製に有用である。このことは、複
数の遺伝子における改変の組み合わせから生じる組換え改変体の表現型のスクリ
ーニングまたは選択を可能にする。
【００８２】 （（２）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）） ＡＡＶは、直鎖状の一本鎖ＤＮＡを含む、小さい、単純な非自律性ウイルスで
ある。Ｍｕｚｙｃｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８、９７−１２９（１９９２）を参照のこと。このウイル
スは、複製するためにアデノウイルスまたは特定の他のウイルスとの同時感染を
必要とする。ＡＡＶは、ウイルスに対する抗体によって証明されるように、ヒト
集団に広く行きわたっているが、それは、いずれの公知の疾患とも関連しない。
ＡＡＶゲノム構成は、単純であり、以下の２つの遺伝子のみを含む：ｒｅｐおよ
びｃａｐ。このゲノムの末端は、約１４５ヌクレオチドの末端反復（ＩＴＲ）配
列を含む。
【００８３】 ＡＡＶに基づいたベクターは、代表的には、目的の転写ユニットに隣接するＩ
ＴＲ配列のみを含む。このベクターＤＮＡの長さは、４６８０ヌクレオチドのウ
イルスゲノム長を大きく超え得ない。現在、ＡＡＶベクターの増殖は、煩雑であ
り、そして宿主細胞中にこのベクター自体だけでなくヘルパー機能を提供するた
めのｒｅｐおよびｃａｐをコードするプラスミドもまた導入する工程を包含する
。 このヘルパープラスミドは、ＩＴＲを欠き、そして引き続く複製およびパッケー
ジングを行い得ない。さらに、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）が
しばしば必要とされる。ＡＡＶベクターの潜在的な利点は、ウイルスＤＮＡが組
み込まれるので、おそらく必要でないが、非分裂細胞において長期間発現し得る
ようであることである。このベクターは、構造的に単純であり、従ってアデノウ
イルスより宿主−細胞応答をほとんど誘起し得ない。
【００８４】 （（３）パピローマウイルス） パピローマウイルスは、扁平上皮細胞の核で複製する小さく、非外被性の、正
十二面体のＤＮＡウイルスである。パピローマウイルスは、７２個のカプソマー
の球状タンパク質被覆内で約８，０００ｂｐの大きさの二本鎖環状ＤＮＡの単一
分子からなる。このようなパピローマウイルスは、それらが感染する種（例えば
、ウシ、ヒト、ウサギ）によって、および種内の型によって分類される。５０を
超える別のヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）が記載されている。例えば、
Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版、Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃ
ｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）を参照のこと。パ
ピローマウイルスベクターは、同時係争中の、共有に係る米国特許出願第０８/ ９５８８２２号（１９９７年１０月２８日出願）に詳細に記載されており、これ
は、すべての目的のために本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００８５】 パピローマウイルスは、著しい程度の上皮細胞の細胞向性を提示する。特定の
ウイルス型は、皮膚上皮細胞または粘膜上皮細胞のいずれかの嗜好性を有する。
すべてのパピローマウイルスは、細胞増殖を誘導する能力を有する。増殖の最も
一般的な臨床的兆候は、良性のいぼの生成である。しかし、多くのパピローマウ
イルスは、いくつかの個体において発癌性である能力を有し、そしていくつかの
パピローマウイルスは、高い発癌性である。関連の病変の病態に基づいて、ほと
んどのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、４つの主要群（良性、低危険性、
中危険性および高危険性）の中の１つに分類され得る（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、（Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ、第３版、１９９６）；ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ
：Ｐａｐｉｌｌｏｍａ（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）第１巻、５２０−５３１頁）。例えば、ＨＰＶ−１
、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−３、ＨＰＶ−４、およびＨＰＶ−２７ウイルスは、良性
の皮膚病変と関連する。ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１ウイルスは、外陰部いぼ
、陰茎部いぼおよび咽頭部いぼに関連し、そして浸潤癌とまれに関連するので、
低危険性ウイルスと考えられる。ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、
およびＨＰＶ−４５ウイルスは、頸部のアデノ癌腫および扁平上皮癌腫と高い頻
度で関連するので、高危険性ウイルスと考えられる。ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−
８ウイルスは、多因子性疾患であるゆうぜい状表皮発育異常症（ＥＶ）における
良性の皮膚病変と関連する。しかし、このような病変は、扁平上皮癌に進行し得
る。これらのウイルスは、４つの主要危険群の１つの分類に入らない。新しく発
見されたＨＰＶは、危険性に関してすでに分類されているＨＰＶの頻度と比較し
た癌性病変の頻度に基づいた危険性について分類され得る。
【００８６】 ＨＰＶベクターは、改良された特性を有するベクターを得るために、組換えお
よびスクリーニング（すなわち、シャフリング）の反復性周期に供され得る。改
良された特性には、組織特異性の増加、組織特異性の改変、発現レベルの増加、
発現の延長、エピソームコピー数の増加、染色体組み込みの能力の増加および減
少、取り込み能力の増加、ならびに本明細書中で議論されるような他の特性が挙
げられる。シャフリングのための出発物質は、代表的には異なった系統のヒトパ
ピローマウイルス、あるいは、例えば、誤りがちなＰＣＲもしくはカセット変異
誘発によってそのように生成されるセグメントまたは改変体から構築された上記
の種類のベクターである。ヒトパピローマウイルスまたは少なくともそれらのＥ
１およびＥ２コード領域は、好ましくはヒト皮膚パピローマウイルスである。
【００８７】 （（４）レトロウイルス） レトロウイルスは、ウイルスゲノムとして一本鎖ＲＮＡを含む、大きなクラス
の外被性ウイルスを含む。正常なウイルス生活周期中で、ウイルスＲＮＡは、宿
主ゲノムに組み込まれ、そして延長された期間にわたって発現される、二本鎖Ｄ
ＮＡを生じるために逆転写される。結果として、感染細胞は、宿主細胞に対して
明らかな害なく連続的にウイルスを放出する。このウイルスゲノムは、小さく（
約１０ｋｂ）、そしてその原型の機構は非常に単純で、ｇａｇ（群特異的抗原ま
たはコアタンパク質）；ｐｏｌ（逆転写酵素）；およびｅｎｖ（ウイルス外被タ
ンパク質）をコードする３つの遺伝子を含む。ＲＮＡゲノムの末端は、長末端反
復（ＬＴＲ）と呼ばれ、そしてプロモーター活性およびエンハンサー活性、なら
びに組み込みに関連する配列を含む。このゲノムもまた、ウイルスＲＮＡをパッ
ケージングするために必要な配列およびスプライスアクセプター、ならびに個々
の外被ｍＲＮＡの生成のためのドナー部位を含む。大半のレトロウイルスは、複
製細胞中のみに組み込まれ得るが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、例外で
あるようである。
【００８８】 レトロウイルスベクターは、比較的単純で、５’および３’ＬＴＲ、パッケー
ジング配列および目的の遺伝子（単数または複数）から構成される転写ユニット
を含み、これは、代表的な発現カセットである。このようなベクターを増殖させ
るために、１つは、いわゆるパッケージング細胞株を使用して、トランスで欠失
するウイルス機能を提供しなければならない。このような細胞は、ｇａｇ、ｐｏ
ｌおよびｅｎｖの組み込まれたコピーを含むが、ヘルパーウイルス配列がキャプ
シド形成しないように、パッケージングシグナルを欠くよう操作される。さらな
る特徴がベクターに加えられるか、またはベクターから取り除かれ、そしてパッ
ケージング細胞株は、ベクターをより効果的にさせるか、またはヘルパーウイル
スの混入の可能性を減少させる試みを反映する。
【００８９】 いくつかの遺伝子ワクチン適用のために、レトロウイルスベクターは、染色体
中に組み込まれ得、従って、長期間の発現を潜在的に行い得る利点を有する。こ
れらは、比較的多量で増殖され得るが、ヘルパーウイルスの非存在を保証するた
めに注意が必要とされる。
【００９０】 （Ｂ．非ウイルス遺伝子ワクチンベクター） 遺伝子ワクチン接種に使用される非ウイルス核酸ベクターとしては、プラスミ
ド、ＲＮＡ、ポリアミド核酸および酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる
。このようなベクターは、代表的には免疫応答が誘導されるポリペプチドを発現
するための発現カセットを含む。このような発現カセットにおけるプロモーター
は、構成的、細胞型特異的、ステージ特異的、および/または調節可能（例えば 、テトラサイクリン摂取；テトラサイクリン応答性プロモーターによって）であ
り得る。転写を、ベクター中へエンハンサー配列を挿入することによって増加し
得る。エンハンサーは、代表的には１０〜３００塩基対長間のシス作用配列であ
り、これは、プロモーターによって転写を増加する。エンハンサーは、転写ユニ
ットに対して５’または３’のいずれかである場合、転写を有効に増加し得る。
エンハンサーもまた、イントロン内またはコード配列自体の中に位置する場合、
有効である。代表的には、ウイルスエンハンサーが使用され、これはＳＶ４０エ
ンハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、お
よびアデノウイルスエンハンサーを含む。哺乳動物系由来のエンハンサー配列（
例えば、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサー）もまた、一般に使用される。
【００９１】 遺伝子治療に有用な産物をコードする非ウイルスベクターは、リポフェクショ
ン、微粒子銃（ｂｉｏｉｓｔｉｃ）、ヴィロソーム、リポソーム、免疫リポソー
ム、ポリカチオン：核酸結合体、裸のＤＮＡ注入、人工ビリオン、薬剤増強され
たＤＮＡの取り込み、エキソビボ形質導入のような手段によって動物中に導入さ
れ得る。リポフェクションは、例えば米国特許第５,０４９,３８６号、同第４, ９４６，７８７号；および同第４，８９７,３５５号に記載され、そしてリポフ ェクション試薬は、市販される（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍTMおよびＬｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎTM）。ポリヌクレオチドの有効なレセプター認識リポフェクシ
ョンに適切な、陽イオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／
１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質を含む。裸のＤＮＡ遺伝子ワクチンは
、例えば、米国特許第５，５８９，４８６号に記載される。
【００９２】 （ＩＶ．多成分遺伝子ワクチン） 本発明は、哺乳動物に対する投与に際して最適な免疫応答を得るように設計さ
れた多成分遺伝子ワクチンを提供する。これらのワクチンにおいて、２つ以上の
個々の遺伝子ワクチン成分が免疫化のために、好ましくは同じ処方で使用される
。各成分は、ある細胞で生じ、そして他の細胞では生じない特定の機能について
最適化され得、従って、異なった細胞型における分化した応答を誘発するための
手段を提供する。相互に非適合性の結果が１つのプラスミドの使用から得られる
場合、これらの活性は、インビボで異なった運命および効果を有する異なったベ
クターに分離される。遺伝子ワクチンは、１つの調製物中へのいくつかの生物学
的に活性な実体の処方のために理想的である。このベクターは、好ましくは、こ
の性質の非適合性が存在しないように全て同じ化学型であり、そして同じ化学的
および／または生物学的プロセスによって全て製造され得る。このワクチン調製
物は、正確におよび繰り返して処方され得る、規定されたモル比の別々のベクタ
ー成分からなり得る。
【００９３】 多成分の遺伝子ワクチン成分として使用され得る、いくつかの遺伝子ワクチン
ベクター成分が以下に記載される。本発明の方法は、このようなベクター成分の
開発を多いに単純化する。なぜならば、特定の性質が制御される機構、および改
変される場合に、この性質を増強する分子の特性は、公知である必要はないから
である。このような知識の非存在下でさえ、本発明の組換えおよびスクリーニン
グ方法を実施することによって、列挙された各特性について改良されるベクター
成分を入手し得る。
【００９４】 （Ａ．最適な抗原放出を提供するために設計されるベクター「ＡＲ」） 遺伝子ワクチンベクター成分「ＡＲ」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって認
識され、そして効果的な細胞内プロセシングおよびＴヘルパー（ＴH）細胞に対 する提示のためこれらの細胞によって取り込まれる形態で最適な抗原の放出を提
供するように設計される。ＡＲプラスミドでトランスフェクトされた細胞は、Ａ
ＰＣの抗原工場とみなされ得る。ＡＲプラスミドは、代表的には、以下の、１以
上の特性を有し、これらの各々は、以下の本発明のＤＮＡシャッフリング法を使
用して最適化され得る。
【００９５】 （ａ）この選択された抗原発現細胞（例えば、筋肉内の免疫化のための筋細胞
または粘膜の免疫化のための上皮細胞）に対する最適なプラスミド結合および取
り込み。これは、多成分のＤＮＡワクチンにおける他のベクター成分からＡＲを
区別する重要な性質である。この標的細胞に結合する最適なベクターは、非常に
親和力の強い結合および後の標的細胞中へのインターナリゼーションの概念だけ
でなく、他の細胞に結合し、そして侵入する相対的無能性をも含む。所望されな
い結合に対する所望された結合のこの割合の最適化は、トランスフェクトされた
標的細胞の数を有意に増加させる。この特性は、本明細書中に記載されるように
、本発明に従ったＤＮＡシャッフリングを使用して最適化され得る。例えば、Ｄ
ＮＡシャッフリング、ベクター成分の無作為配列アセンブリ、無作為オリゴヌク
レオチド配列の挿入などによって得られる変異体ベクター成分配列は、標的細胞
に結合する配列について最初に選択され得、この後、この細胞の集団は、他の細
胞に結合する配列を枯渇する。特定の細胞型に遺伝子ワクチンベクターを標的化
するためのベクター成分、および改良された標的化を得る方法は、同時係争中の
、同一人に譲渡された米国特許出願第 号（１９９９年、２月１０日、ＴＴＣ
代理人整理番号第１８０９７−０３０２００号ＵＳとして出願され、これは、「
ワクチンベクターの標的化」という表題をつけられる）において記載される。
【００９６】 （ｂ）核に対するベクターＤＮＡの最適輸送。再度、本発明は、このような特
性に最適な遺伝子ワクチン成分を入手し得る方法を提供する。
【００９７】 （ｃ）抗原遺伝子（単数または複数）の最適な転写。これは、例えば最適化さ
れたプロモーター、エンハンサー、イントロンなどの使用に関し得る。好ましい
実施態様において、ベクターが標的細胞型の核内に存在する場合、遺伝子の転写
のみ可能にする細胞特異的プロモーターが使用される。この場合、特異性は、標
的細胞中への選択的なベクターの侵入のみに由来するのではない。
【００９８】 （ｄ）細胞質へのｍＲＮＡの最適な輸送および細胞質におけるｍＲＮＡの最適
な寿命。この特性を達成するために、本発明の方法が使用され、ｍＲＮＡの最適
な３’および５’非翻訳領域を得る。
【００９９】 （ｅ）ｍＲＮＡの最適な翻訳。再度、このＤＮＡシャッフリング法を使用して
、最適なリボゾーム結合ならびに翻訳装置および最適なコドン使用頻度（ｐｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ）のアセンブリを示す、最適化された組換え配列を得る。
【０１００】 （ｆ）ＡＰＣによって効果的に取り込むための最適な抗原構造。細胞外抗原は
、少なくとも５つの非排他的な機構によって、ＡＰＣにより吸収される。１つの
機構は、小胞のミクロピノサイトシスおよびインターナリゼーションによる外部
液相のサンプリングである。最初の機構は、現在知られている限り、液相におけ
る抗原の非構造的要求性を有さず、従って、抗原構造を設計する考慮に関連しな
い。第２の機構は、ＡＰＣ表面上のレセプターへの抗原の結合を含む；このよう
な結合は、現在研究されているにすぎない規則に従って生じる（これらのレセプ
ターは、免疫グロブリンファミリーのメンバーでなく、そして異なったクラスの
細胞外タンパク質／糖タンパク質を結合し得る、いくつかのファミリーのタンパ
ク質および糖タンパク質を提示するようである）。この型の結合は、小胞中でも
また、レセプター媒介のインターナリゼーションへと続く。この機構は、現在ほ
とんど理解されていないので、抗原エレメントの設計は、合理的な設計プロセス
に組み込まれ得ない。しかし、遺伝子シャッフリングの適用（ＡＰＣ中への侵入
において最も首尾良い、変異体ＤＮＡ分子の選択の経験的プロセス）は、この機
構を通じて改良される変異体について選択し得る。
【０１０１】 他の３つの機構は、すべて細胞外抗原の特異的抗体認識に関する。第一の機構
は、細胞表面上のＦｃレセプターに結合するＩｇＧを介した特異的抗原の免疫グ
ロブリン媒介認識に関する。ＡＰＣ（例えば、単球、マクロファージおよび樹状
細胞）は、多様な特異性の表面膜ＩｇＧで修飾され得る。一次応答において、こ
の機構は、作動しない。以前免疫化された動物において、ＡＰＣ表面上のＩｇＧ
は、細胞外抗原と特異的に結合し得、そして細胞内のエンドソーム区画中へのこ
の結合抗原の取り込みを媒介する。別の機構は、各Ｂ細胞上に存在する、クロー
ンに由来する表面膜免疫グロブリンへの結合に関する（この動物がこの抗原に以
前、曝露されている場合、初代Ｂ細胞の場合のＩｇＭおよびＩｇＧ）。Ｂ細胞は
、効果的なＡＰＣである。細胞外抗原は、表面のＩｇと特異的に結合し得、そし
てインターナライズされ得、そしてＢ細胞表面上の提示のための膜区画において
プロセスされ得る。結局、細胞外抗原は、可溶性の特異的な免疫グロブリンによ
って認識され得る（以前免疫化された動物における一次免疫の場合のＩｇＭおよ
びＩｇＧ）。Ｉｇで複合体化することは、ＡＰＣの表面への結合（ＩｇＧの場合
のＦｃレセプター認識を介して）およびインターナリゼーションを誘発する。
【０１０２】 後者の、これらの３つの機構の各々において、抗原の立体配置が予め存在する
抗体の認識特異性と同じである範囲は、抗原提示のプロセスの効率に対して重要
である。抗体は、直線状タンパク質エピトープ、ならびにタンパク質抗原の３次
元構造によって決定される立体配置エピトープを認識し得る。細胞外のウイルス
または細菌性病原体を認識し、そしてその表面への結合によって感染を予防し、
またはその免疫破壊（相補体媒介溶解、免疫複合体形成および食作用）を媒介す
る保護的抗体はほとんど、この病原体の表面に示される天然の構造物を有するタ
ンパク質上の立体配置決定基に対して排他的に生成される。それゆえ、これらの
天然のＢ細胞を有することは、宿主保護的な体液性免疫の生成のために不可避で
あり、このＢ細胞は、抗原の細胞内プロセスおよびＭＨＣ クラスＩＩと関連す
る分解ペプチドの提示後に、Ｔヘルパー細胞との直接的な接触によって刺激され
る、病原体上に存在する立体配置エピトープに特異的な抗体を有する。このＴヘ
ルパー（ｈｅｌｐ）は、結果として生じる抗体の変異を有する関連Ｂ細胞の選択
的増殖、および増加した特異性を有する抗体についての抗原駆動選択、ならびに
抗体クラスの変換を可能にする。
【０１０３】 要約すると、体液性免疫、ならびに特異的ＣＤ４+細胞傷害性Ｔ細胞を誘発す るためのＡＰＣによる抗原の最適な取り込みは、この抗原が天然のタンパク質立
体配置で存在し（天然の感染に際して、後に免疫系に提示されるように）そして
適切な膜抗体を有する、天然のＢ細胞によって認識されることを要求する。天然
のタンパク質立体配置は、適切なタンパク質折りたたみ、グリコシル化およびＡ
ＰＣ上のレセプター（免疫グロブリンおよびおそらく非免疫グロブリン）を有す
る、最適な反応性に必要な、任意の他の翻訳後修飾を含む。特異的抗体による認
識に必要とされる、発現された抗原の３次元構造および必要とされる免疫応答の
誘発に加えて、この構造物（および配列）は、ＡＰＣを含む免疫細胞によって認
識される時間まで、発現細胞の外側でタンパク質の安定性の増加について最適化
され得る。本発明の組換えおよびスクリーニング方法は、ＡＰＣによる取り込み
後の引き続くプロセシングのための抗原構造（および配列）を最適化するために
使用され得、その結果、細胞内のプロセシングは、ＡＰＣのクラスＩまたはクラ
スＩＩの提示のために必要とされるペプチドフラグメントおよび所望の免疫応答
の誘導を生じる。
【０１０４】 （ｇ）所望の細胞区画または区画中への発生期の抗原の最適な分配。これは、
抗原配列において具体化されるシグナルおよび輸送シグナルによって指向され得
る。全ての抗原がこれらの細胞から分泌されることが所望され得る；あるいは、
この抗原の全てまたは一部がこれらのファクトリー細胞（ｆａｃｔｏｒｙ ｃｅ
ｌｌ）の細胞表面で発現されるために指向され得る。グリコシル化を含む、翻訳
後修飾の他の細胞下分画に対する抗原を含む小胞を指向するシグナルは、抗原配
列において具体化され得る。
【０１０５】 （ｈ）細胞表面上の抗原の最適な提示または細胞からの抗原の最適な放出。項
目（ｆ）および（ｇ）において変異は、ファクトリー細胞の細胞質内で抗原の発
現、次いで可溶性の抗原を放出するためのこの細胞の溶解を設計することである
。細胞死は、アポトーシスを誘発する細胞内タンパク質の、同じ遺伝子ワクチン
ベクター上での発現によって操作され得る。この場合、細胞死の時期は、細胞が
抗原を産生する必要性、ならびに所望のプロセスにおいていくつかの細胞を殺傷
する、潜在的な有害効果で平衡される。
【０１０６】 組み合わせにおいて、項目（ａ）〜（ｈ）は、抗原発現の寿命および程度を最
適化するための種々のシナリオを導く。この抗原は、最も高いレベルで、最も長
時間発現されることが常に所望されるとは限らない。特定の臨床的な適用におい
て、短時間の低い発現、短時間の高い発現、長時間の低い発現、長時間の高い発
現または有る場合には、中間である抗原発現を有することが重要である。
【０１０７】 プラスミドＡＲは、単一の抗原遺伝子の１以上の改変体、または免疫のための
いくつかの全く異なった標的を発現するように設計され得る。遺伝子ワクチンに
おける使用のために最適化された抗原を得る方法は、同時係争中の同一人に譲渡
された米国特許出願第 号（１９９９年２月１０日、ＴＣＣ代理人整理番号第
１８０９７−０２８７１０ＵＳとして出願、これは、「抗原ライブラリー免疫」
という表題を付けられる）に記載される。複数の抗原は、ベクターのモノシスト
ロニック形態またはマルチシストロニック形態から発現され得る。
【０１０８】 （Ｂ．ＣＴＬの最適な産生のために設計されるベクター成分「ＣＴＬ−ＤＣ」
、「ＣＴＬ−ＬＣ」、および「ＣＴＬ−ＭＭ」） 遺伝子ベクター成分「ＣＴＬ−ＤＣ」、「ＣＴＬ−ＬＣ」、および「ＣＴＬ−
ＭＭ」は、樹状細胞（ＣＴＬ−ＤＣ）、ランゲルハンス細胞（ＣＴＬ−ＬＣ）、
ならびに単球およびマクロファージ（ＣＴＬ−ＭＭ）による細胞傷害性ＣＤ８+ リンパ球（ＣＴＬ）の最適な産生を指向するように設計される。これらのベクタ
ー成分は、ＭＨＣクラスＩに関連して最適な抗原フラグメントの提示を指向し、
それによって、最大の細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を保証する。ＣＴＬベクター成
分でトランスフェクトされた細胞は、ウイルス性疾患に対する保護のために通常
、極めて重要な特異的免疫のこのアームの直接的なアクチベーターとみなされ得
る。 ＣＴＬベクター成分は、代表的には、以下の、１以上の特性を有するよう
に設計され、この成分の各々は、本発明のＤＮＡシャッフリング方法を使用して
最適化され得る。
【０１０９】 （ａ）この選択された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球／マクロファー
ジ、ランゲルハンス細胞）と結合する最適なベクター、およびこの抗原提示細胞
によって取り込まれる最適なベクター。これは、多成分のＤＮＡワクチンにおけ
る他のベクター由来のＣＴＬ系列のベクターを区別する重大な特性である。ＣＴ
Ｌ系列のベクターは、好ましくは、ＡＲベクターを介した細胞外抗原発現宿主で
あるように選択された細胞と結合しないか、または侵入しない。この機能の分離
は、抗原発現細胞からの放出後、免疫細胞の刺激について運命付けられた抗原の
細胞内運命および輸送が、ＭＨＣクラスＩと関連して細胞表面上に存在すること
が運命付けられた抗原の運命とは全く異なるので、重要である。前者の場合、抗
原は、粗面小胞体（ＲＥＲ）の内腔へ、インタクトに送達されるべきシグナル分
泌配列を介して指向され、次いで分泌される。後者の場合、抗原は、細胞質に残
存するように指向され、そしてこれらは、プロテアソーム系によってペプチドフ
ラグメントに分解され、次いでＭＨＣクラスＩとの会合のためにＲＥＲの内腔に
送達される。次いで、ペプチドおよびＭＨＣクラスＩのこれらの複合体は、ＣＤ
８+細胞傷害性Ｔ細胞との特異的相互作用のため細胞表面に送達される。ベクタ ー成分および最適化されたベクター成分を得るための方法（これは、所望の細胞
型に標的化するために最適化される）は、同時係争中の、同一人に譲渡された米
国特許出願第 号（１９９９年２月１０日、ＴＴＣ代理人整理番号第１８０９
７−０３０２００ＵＳとして出願、これは「遺伝子ワクチンベクターの標的化」
と表題を付けられる）において記載される。
【０１１０】 （ｂ）抗原遺伝子の最適な転写。これは、本明細書中で議論されるように、最
適化したプロモーター、エンハンサー、イントロンなどによって達成され得る。
細胞特異的プロモーターは、さらなるレベルの選択性として、このようなベクタ
ー中で価値がある。
【０１１１】 （ｃ）このｍＲＮＡの最適な寿命。このｍＲＮＡの最適な３’および５’非翻
訳領域は、本発明の方法を使用して入手され得る。
【０１１２】 （ｄ）このｍＲＮＡの最適な翻訳。再度、本発明のＤＮＡシャッフリング方法
および選択方法は、翻訳機構の最適なリボゾーム結合およびアセンブリ、ならび
に最適なコドン使用頻度のためのポリヌクレオチド配列を得るために使用され得
る。
【０１１３】 （ｅ）最適なタンパク質の立体配置。この場合、最適なタンパク質立体配置は
、特異的抗体またはＡＰＣの表面上の他のレセプターと相互作用する立体配置よ
りむしろ適切な細胞質タンパク質分解およびＭＨＣクラスＩ上での提示のための
正しいペプチドの産生、ならびに所望の特異的なＣＴＬ応答の誘発を生じる。
【０１１４】 （ｆ）正しいペプチドを生成するための最適なタンパク質分解。特異的なタン
パク質分解切断の理法は、細胞質中か、またはプロテアソーム中のいずれかでタ
ンパク質の折りたたみの性質およびプロテアーゼの性質に依存する。
【０１１５】 （ｇ）ＲＥＲ内腔に送達されるべき小胞体膜を横切った、抗原ペプチドの最適
な輸送。これは、ＴＡＰタンパク質による、または他の膜輸送体によるペプチド
の認識によって媒介され得る。
【０１１６】 （ｈ）クラスＩ−β２ミクログロブリン複合体とこのペプチドの最適な会合お
よび分泌経路を介した細胞表面への輸送。
【０１１７】 （ｉ）特異的ＣＴＬによる認識のための随伴（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）アクセ
サリー分子とＭＨＣペプチド複合体の最適な提示。
【０１１８】 ベクターＣＴＬは、単一の抗原遺伝子の１以上の改変体または免疫化のための
いくつかの異なった標的を発現するように設計され得る。複数の最適化された抗
原がベクターのモノシストロニックまたはマルチシストロニックな形態から発現
され得る。
【０１１９】 （Ｃ．免疫モジュレーターの最適な放出のために設計された、ベクター「Ｍ」
） ベクター「Ｍ」は、標的細胞からの免疫モジュレーター（例えば、サイトカイ
ンおよび他の増殖因子）の最適な放出を指向するように設計される。標的細胞は
、免疫化された組織または免疫細胞（例えば、樹状細胞（Ｍ−ＤＣ）、ランゲル
ハンス細胞（Ｍ−ＬＣ）、単球およびマクロファージ（Ｍ−ＭＭ））におけるい
ずれかの優勢な細胞型であり得る。これらのベクターは、この免疫反応が所望の
型であるか、または型の組み合わせであり、そして所望のレベルであるように、
いくつかの免疫細胞「モジュレーター」（サイトカイン、増殖因子など）の最適
なレベルの同時発現を指向する。Ｍベクターでトランスフェクトされた細胞は、
ワクチン免疫反応（ＣＴＬ対ＴH１対ＴH２対ＮＫ細胞など）およびその強度の性
質のディレクターとみなされ得る。これらのベクターの特性は、このベクターが
作動するように設計される細胞の性質を反映する。例えば、このベクターは、所
望の細胞型に結合および侵入するように設計され、そして／または所望の細胞型
において転写を駆動する細胞特異的調節プロモーターを有し得る。このベクター
はまた、所望の比率で標的細胞由来の細胞調節タンパク質の最大の合成および放
出を指向するように操作され得る。
【０１２０】 「Ｍ」遺伝子ワクチンベクターは代表的に、以下の１以上の特性を有するよう
に設計され、この各々は、本発明のＤＮＡシャッフリング法を使用して最適化さ
れ得る。
【０１２１】 （ａ）選択されたモジュレーター発現細胞による最適なベクター結合および取
り込み。適切な発現細胞は、例えば、標的組織における筋肉細胞、上皮細胞また
は他の優性な（数による）細胞型、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球／マ
クロファージ、ランゲルハンス細胞）を含む。このことは、他の細胞に結合およ
び他の細胞に侵入するように設計されたベクターからＭ系列のベクターを区別す
る重要な特性である。
【０１２２】 （ｂ）免疫モジュレーター遺伝子の最適な転写。再度、プロモーター、エンハ
ンサー、イントロンなどは、本発明の方法に従って最適化され得る。細胞特異的
プロモーターは、さらなるレベルの選択性として、ここで大変価値がある。
【０１２３】 （ｃ）ｍＲＮＡの最適な寿命。ｍＲＮＡの最適な３’および５’非翻訳領域を
本発明の方法を使用して入手し得る。
【０１２４】 （ｄ）ｍＲＮＡの最適な翻訳。再度、本発明のＤＮＡシャッフリング方法およ
び選択方法は、最適なリボゾーム結合および翻訳機構のアセンブリ、ならびに最
適なコドン使用頻度のためのポリヌクレオチド配列を得るために使用され得る。
【０１２５】 （ｅ）ＲＥＲの内腔へのモジュレーターの最適な輸送（シグナル分泌配列を介
して）。免疫応答の調節のための代替の戦略は、可溶性モジュレーターの分泌よ
りむしろ膜固定モジュレーターを使用する。固定されたモジュレーターは、例え
ば、疎水性テールおよびホスホイノシトールグリカン連結によって、合成細胞の
表面上に保持され得る。
【０１２６】 （ｆ）各モジュレーターの最適なタンパク質立体配置。この場合、最適なタン
パク質立体配置は、細胞外モジュレーターおよび／または細胞膜固定モジュレー
ターが関連のレセプターと相互作用することを可能にする立体配置である。
【０１２７】 （ｇ）モジュレーターおよびこの型の割合は、経験的に決定され得る。例えば
、ＴH１応答（例えば、ＩＬ−２および／またはＩＦＮγの産生）またはＴH２応
答（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の方向において免疫応答を指向
することに一致して作用することが公知のモジュレーターのセットを試験する。
【０１２８】 ベクターＭは、１以上のモジュレーターを発現するように設計され得る。最適
化された免疫モジュレーターおよび最適化された免疫モジュレーター（ｉｍｍｏ
ｄｕｌａｔｏｒ）を得るための方法は、同時係争中の、同一人に譲渡された米国
特許第 号（１９９９年２月１０日、ＴＣＣ 代理人整理番号第１８９０７−
０３０３ＵＳとして出願され、これは、「免疫調節分子の最適化」として表題が
付けられている）に記載される。これらの最適化された免疫調節配列は、本発明
の多成分の遺伝子ワクチンの成分としての使用のために特に適切である。複数の
モジュレーターは、このベクターのモノシストロニック形態またはマルチシスト
ロニック形態から発現され得る。
【０１２９】 （Ｄ．ケモカインの放出を指向するように設計されたベクター「ＣＫ」） 「ＣＫ」と名付けられた遺伝子ワクチンベクターは、標的細胞に由来するケモ
カインの最適な放出を指向するように設計される。標的細胞は、免疫化された組
織中で優勢な細胞型であり得るか、または免疫細胞（例えば、樹状細胞（ＣＫ−
ＤＣ）、ランゲルハンス細胞（ＣＫ−ＬＣ）または単球およびマクロファージ（
ＣＫ−ＭＭ）であり得るかのいずれかであり得る。これらのベクターは、代表的
には、免疫細胞の免疫部位に対する補充が最適であるように、いくつかのケモカ
インの最適なレベルの同時発現を指向する。ＣＫベクターでトランスフェクトさ
れた細胞は、交通警官とみなされ得、ワクチン免疫応答に重要な免疫細胞を調節
する。これらのベクターの特性は、このベクターが作動するように設計される細
胞の性質を反映する。例えば、このベクターは、所望の細胞型に結合および侵入
するように設計され、そして／または所望の細胞型において転写を駆動する細胞
特異的調節プロモーターを有し得る。このベクターもまた、所望の割合で標的細
胞からのケモカインの最大の合成および放出を指向するように操作される。遺伝
子ワクチン成分およびケモカインの最適な放出を提供する成分を得るための方法
は、同一人に譲渡された、同時係争中の米国特許出願第 号（１９９９年２月
１０日、ＴＣＣ 代理人整理番号第１８０９７−０３０３ＵＳとして出願され、
これは、「免疫調節分子の最適化」と表題を付けられた）に記載される。
【０１３０】 ＣＫベクターは、代表的には以下の１つ以上の特性を有するように設計され、
この各々は、本発明のＤＮＡシャッフリング方法を使用して最適化され得る。
【０１３１】 （ａ）選択されたケモカイン発現細胞と結合する最適なベクターおよび発現細
胞によって取り込まれるベクター。適切な細胞は、例えば筋肉細胞、上皮細胞、
または目的の特定の組織において優勢な（数によって）細胞型を含む。抗原提示
細胞（例えば、樹状細胞、単球およびマクロファージ、ランゲルハンス細胞）も
また、適切である。このことは、他の細胞と結合し、そして侵入するよう設計さ
れるベクターからＣＫ系列ベクターを区別する重要な特性である。
【０１３２】 （ｂ）ケモカイン遺伝子の最適な転写。再度、プロモーター、エンハンサー、
イントロンなどは本発明の方法に従って最適化され得る。細胞特異的プロモータ
ーは、さらなるレベルの選択性として、ここで大変価値がある。
【０１３３】 （ｃ）このｍＲＮＡの最適な寿命。このｍＲＮＡの最適な３’および５’非翻
訳領域を本発明の方法を使用して入手し得る。
【０１３４】 （ｄ）このｍＲＮＡの最適な翻訳。再度、本発明のＤＮＡシャッフリングおよ
び選択方法は、翻訳機構の最適なリボゾーム結合およびアセンブリ、ならびに最
適なコドン使用頻度のためのポリヌクレオチド配列を得るために使用され得る。
【０１３５】 （ｅ）ＲＥＲの内腔中へのケモカインの最適な輸送（シグナル分泌配列を介し
て）。細胞の補充を介した免疫応答の調節のための代替の戦略は、可溶性のケモ
カインの分泌よりむしろ膜固定化ケモカインを使用する。固定化されたケモカイ
ンは、疎水性テイルおよびホスホイノシトールグリカン連結によって合成細胞の
表面に保持される。
【０１３６】 （ｆ）各ケモカインの最適なタンパク質立体配置。この場合、この最適なタン
パク質立体配置は、細胞外ケモカイン／細胞膜固定化ケモカインが関連のレセプ
ターと相互作用することを可能にする立体配置である。
【０１３７】 （ｇ）多様なケモカインの割合は、経験的に決定され得る。適切な場合、ＣＴ
Ｌ、ＴH細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、好酸球および／または好中球の 直接的な補充と一致して作用することが公知であるケモカインのセットを試験し
得る。
【０１３８】 ベクターＣＫは、１つ以上のケモカインを発現するように設計され得る。複数
のケモカインは、このベクターのモノシストロニックまたはマルチシストロニッ
ク形態から発現され得る。
【０１３９】 （Ｅ．他のベクター） １つ以上のさらなる成分ベクター部分を含む遺伝子ワクチンもまた、本発明に
よって提供される。例えば、この遺伝子ワクチンは、樹状細胞およびランゲルハ
ンス細胞に特異的に侵入するように設計されるベクターを含み得、そして排出リ
ンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）に移動する。このベクタ
ーは、標的抗原（単数および複数）、ならびにこの節において、所望の免疫応答
の誘発と関連するサイトカインおよびケモカインのカクテルの発現について提供
するように設計される。抗原の臨床的目的および性質に依存して、このベクター
は、免疫系の刺激がこの節で延長されるように、標的抗原の比較的永続した発現
について最適化され得る。別の例は、Ｂ細胞中のＭＨＣ発現を特異的に調節する
ベクターである。このようなベクターは、Ｂ細胞（注入部位に常在性の細胞か、
またはこの部位に付着した細胞のいずれか）に特異的に結合および侵入するよう
に設計される。Ｂ細胞中において、このベクターは、クラスＩまたはクラスＩＩ
のいずれかと関連する、細胞のエンドサイトシス分画中への抗原の特異的取り込
みに由来する抗原ペプチドの会合を指向し、それゆえ、ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞 またはＣＤ８+細胞傷害性リンパ球を介した特異的免疫の誘発を指向する。多数 の手段が、本明細書中で議論されるプロセスされたペプチドの運命のこの細胞内
指向のために存在する。クラスＩ提示を指向する分子の例は、タパシン（ｔａｐ
ａｓｉｎ）、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２（Ｋｏｏｐｍａｎら、（１９９７）Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：８０−８８）を含み、そしてクラスＩ
Ｉ提示に影響する分子は、例えば、エンドソーム／リソソームプロテアーゼ（Ｐ
ｅｔｅｒｓ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：８９−９６
）を含む。遺伝子ワクチン成分および最適化されたクラスＩ提示を提供する成分
を得る方法は、同一人に譲渡された、同時係争中の米国特許出願第 号（１９
９９年２月１０日、ＴＴＣ 代理人整理番号第１８０９７−０３０３ＵＳとして
出願され、これは、「免疫調節分子の最適化」と表題が付けられた）において記
載される。
【０１４０】 最適なＤＮＡワクチンは、例えば、ＡＲベクター（抗原放出）、ＣＴＬ−ＤＣ
ベクター（ＭＨＣクラスＩ上の抗原ペプチドの樹状細胞提示を介したＣＴＬ活性
化）、常在性組織マクロファージ由来のＩＬ−１２およびＩＦＮｇの放出のため
のＭ−ＭＭベクターならびに免疫部位中へのＴH細胞の補充のためのＣＫベクタ ーを組み合わせ得る。
【０１４１】 ＤＮＡのワクチン接種は、とりわけ、以下を含み得る多様な目標のために使用
され得る： ・遠い将来のある時間に進入する細菌またはウイルス病原体に対して、迅速か
つ攻撃的に反応しそうなＣＴＬ応答および／または体液性応答の刺激 ・アレルゲンに対する不適当な応答を妨げるための、連続するが非攻撃的な応
答 ・自己免疫疾患における自己抗原に対して連続して非攻撃的な免疫性および免
疫性の寛容化 ・腫瘍細胞抗原に対して可能な限り迅速で、攻撃的なＣＴＬ応答の誘発 ・病原体を明白にするため、および／または病状を予防するために所望される
応答の指向において、進行中の慢性感染に対する、強力であるが不適当な免疫応
答から離れた免疫応答の再指向（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）。
【０１４２】 これらの目標は、単一のベクターＤＮＡワクチンの形式によって常には満たし
得ない。特に、ここで競合する目標は、１つのＤＮＡ配列内に統合される。多成
分形式は、ＤＮＡワクチンベクターのポートフォリオの生成を可能にし、多成分
形式のいくつかは、各々の場合（例えば、抗原を含むこれらのベクター）に再構
成されるが、他の多成分形式は、多くの異なる臨床的適用のために十分に特徴付
けられ、そして理解される試薬として使用される（例えば、同じケモカイン発現
ベクターは、異なる状況において使用され得る）。
【０１４３】 （ＩＶ．最適化された遺伝子ワクチンベクターモジュールについてのスクリ
ーニングアッセイ） 本明細書中に記載される方法によって得られる組換え核酸ライブラリーは、遺
伝子ワクチン接種について所望される特性を有するＤＮＡセグメントを同定する
ためにスクリーニングされる。使用される特定のスクリーニングアッセイを、以
下に記載されるように、改良が探求される特定の特性に依存するように変化させ
る。代表的に、シャッフルされた核酸ライブラリーは、スクリーニングの前に細
胞へ導入される。使用されるＤＮＡシャッフリング形式がインビボ形式である場
合、生成される組換えＤＮＡセグメントのライブラリーは、すでに細胞中に存在
する。配列の組換えがインビトロで実行される場合、組換えライブラリーは、好
ましくは、スクリーニング／選択の前に所望の細胞型に導入される。組換えライ
ブラリーのメンバーは、導入の前にエピソームもしくはウイルスに結合され得る
か、または直接導入され得る。
【０１４４】 広範な種々の細胞型は、進化する遺伝子のレシピエントとして使用され得る。
特定の目的の細胞は、ワクチンまたはワクチン抗原（Ｃｏｕｒｖａｌｉｎら（１
９９５）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ １８：１２０７〜１２）、グラム
陰性およびグラム陽性（例えば、サルモネラ属（Ａｔｔｒｉｄｇｅら（１９９７
）Ｖａｃｃｉｎｅ １５：１５５〜６２）、クロストリジウム属（Ｆｏｘら（１
９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１７３〜８）、乳酸杆菌属、赤痢菌属（Ｓｉ
ｚｅｍｏｒｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９〜３０２）、Ｅ．
ｃｏｌｉ、連鎖球菌属（ＯｇｇｉｏｎｉおよびＰｏｚｚｉ（１９９６）Ｇｅｎｅ １６９：８５〜９０））、ならびに哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）を送達す
るために使用される、多くの細菌細胞型を含む。本発明のいくつかの実施態様に
おいて、このライブラリーは、第１の宿主において増幅され、次いで、その宿主
から取り出され、そして発現、選択、もしくはスクリーニング、または任意の他
の所望のパラメーターにより従順な第２の宿主に導入される。このライブラリー
が細胞型に導入される様式は、細胞型のＤＮＡ取り込みの特徴（例えば、ウイル
スレセプターを有している、結合能を有する、または天然にコンピテントである
）に依存する。この細胞型が、天然および化学的に誘導された能力に対して非感
受性であるであるがエレクトロポレーションに対しては感受性の場合、通常エレ
クトロポレーションが使用される。この細胞型がエレクトロポレーションに対し
ても非感受性である場合、微粒子銃が使用され得る。微粒子銃ＰＤＳ−１０００ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）は、標的細胞に
向かって、ＤＮＡで被膜された金またはタングステンのマイクロキャリアを加速
するためにヘリウム圧を使用する。このプロセスは、植物、細菌、真菌、藻類、
インタクトな動物組織、組織培養細胞、および動物の胚を含む広範囲の組織に適
用可能である。本質的に、動物および患者の生組織のための穏やかなエレクトロ
ポレーション形式である電気パルス送達が使用され得る（Ｚｈａｏ、Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７：２５７〜２６２
（１９９５））。細胞をコンピテントにするための新規な方法は、国際特許出願
ＰＣＴ／ＵＳ９７／０４４９４（公開番号ＷＯ９７／３５９５７）に記載される
。組換えＤＮＡ遺伝子のライブラリーの導入後、細胞を、遺伝子の発現が生じる
ことを可能にするために必要に応じて増殖する。
【０１４５】 多くのアッセイにおいて、特定のベクターを含む細胞を同定するための手段が
必要である。全ての種類の遺伝子ワクチンベクターは、選択マーカー遺伝子を含
み得る。選択条件下において、選択マーカーを発現する細胞のみが生存する。適
切なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターセ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チ
ミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐性を与える原核生物遺伝子、ｇｐ
ｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、これはミコフェ
ノール酸と共に選択され得る）；ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ。これは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはプロマイシンと共に選択され
得る）；およびＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ。これは、メトトレキサー
トと共に選択され得る）が挙げられる（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ（１９
８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２；Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ
．１：３２７）。
【０１４６】 選択マーカーに対する代替として、または選択マーカーに加えて、遺伝子ワク
チンベクターは、スクリーニングマーカーを含み得る。このマーカーが発現され
る場合、ベクターを含む細胞に、容易に同定し得る表現型を与える。例えば、宿
主細胞上に通常は存在しない細胞表面抗原をコードする遺伝子が、適切である。
この検出手段は、例えば、抗体または細胞表面抗原に特異的に結合する他のリガ
ンドであり得る。適切な細胞表面抗原の例としては、宿主特異的抗体によって認
識されない宿主細胞の種以外の種由来の任意のＣＤ（分化のクラスター）抗原（
ＣＤ１〜ＣＤ１６３）が挙げられる。他の例としては、緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ、例えば、Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２
〜８０５；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．１４：３１５〜３１９；Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９５）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．
Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６２：６５１〜６５６；Ｏｌｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：６３９〜６５０）および関連する抗原が挙げられ、
これらのいくつかは、市販されている。
【０１４７】 （Ａ．所望の組織に対するベクターの寿命または転座についてのスクリーニ
ング） 特定の適用に関して、ＤＮＡとして最も長い寿命を有するベクターを同定する
こと、または注入部位から離れた組織において終わるベクターを同定することが
所望される。これは、組換え遺伝子ワクチンベクターの集団を、選択された投与
経路で動物へ投与することよって達成され得る。その後、種々の時間で、標的組
織を取り出し、そして標準的な分子生物学手順によってベクターを組織から回収
する。回収されたベクター分子を、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび/またはインビ トロでのＰＣＲによって増幅し得る。ＰＣＲ増幅は、さらなる遺伝子シャッフリ
ングを含み得、その後、得られた選択集団を、動物への再投与、およびさらなる
ベクターの改良に使用する。この手順の数回後、選択されたベクターを、ベクタ
ーがインビボで選択された場合と同じ条件下で、正確な高次構造で抗原を発現す
るための能力について試験し得る。
【０１４８】 抗原の発現は上記の選択またはスクリーニングプロセスの部分ではないので、
得られたベクターは、所望の抗原を発現する能力を全く有さない。この欠点を克
服するために、本発明は、インビボにおけるＤＮＡ整合性の所望の組織の局在化
および寿命のみならず、最大の抗原発現（またはサイトカイン、ケモカイン、細
胞表面アクセサリー分子、ＭＨＣなどのような他の遺伝子の発現）の保持を提示
する遺伝子ワクチン集団中のベクターを同定する方法を提供する。この方法は、
インビトロにおける細胞の同定を含む。この細胞は、非常に少ない数の細胞の回
収、および所望されるような異なるレベルの抗原発現を有する細胞の定量的選択
を可能にする条件下で、選択した組織から精製された細胞を使用して、所望の分
子を発現する。
【０１４９】 本発明の２つの実施態様は、これらの各々が出発位置として遺伝子ワクチンベ
クターのライブラリーを使用することを記載する。各々の方法の目標は、インビ
ボにおいて所望の生物学的特性を提示するベクターを同定することである。組換
えライブラリーは、公知の方法において異なるベクターの集団を示す（例えば、
異なる機能的モジュールのコンビナトリアルベクターライブラリー）か、または
ランダムなヌクレオチドストレッチの挿入によるか、もしくはベクターの全ても
しくは一部にわたって低レベルの変異を導入するための、インビトロにおけるシ
ャッフリングのいずれかにおいて生じるランダムに生成された多様性を有する。
【０１５０】 （（１）細胞表面に局在化した抗原の発現についての選択） 第１の実施態様において、本発明の方法は、細胞表面に局在化する抗原の発現
についての選択を含む。この抗原遺伝子は、細胞膜に対して標的されるアミノ酸
の領域を有するように、ワクチンベクターライブラリーにおいて操作される。例
えば、この領域は、Ｃ末端アミノ酸の疎水性ストレッチをコードし得る。このＣ
末端アミノ酸は、発現したタンパク質上のホスホイノシトール−グリカン（ＰＩ
Ｇ）末端の付着を表示し、そしてトランスフェクトされた細胞の表面上に発現さ
れるようにタンパク質を指向させる。天然に可溶性タンパク質である抗原を用い
ると、この方法は、新しいＣ末端を有するこの操作された融合においてタンパク
質の３次元の折畳みに影響を及ばさないようである。天然に膜貫通タンパク質（
例えば、病原性ウイルス、細菌、原生動物または腫瘍細胞上の膜表面タンパク質
）である抗原を用いると、少なくとも２つの可能性が存在する。第１に、細胞外
ドメインは、シグナル伝達ＰＩＧ結合のためにＣ末端配列と融合するように操作
され得る。第２に、このタンパク質は、細胞表面に対して効率的にそれを指向す
る宿主細胞のシグナル伝達に完全に依存して発現され得る。少数の場合において
、発現についての抗原は、内因性のＰＩＧ末端結合を有する（例えば、病原性原
生動物のいくつかの抗原）。
【０１５１】 このベクターライブラリーを、インビボにおいて送達して、適切な時間の後、
動物における種々の標的部位由来の組織および／または細胞を回収する。細胞を
、標準的な細胞生物学的手順（親和性試薬としての、細胞特異的な表面反応性モ
ノクローナル抗体の使用を含む）を使用して組織から精製し得る。上皮が接種さ
れ得る粘膜部位、または筋肉由来の筋芽細胞に由来する、上皮細胞を単離して精
製することは、比較的容易である。いくつかの実施態様において、最小の物理的
な精製を、分析の前に実行する。脾臓、肝臓、骨髄、リンパ節、および血液のよ
うな種々の組織由来の特定の細胞集団を同定および分離することが、時に所望さ
れる。血液細胞を、ＦＡＣＳによって容易に分取し、種々の蛍光性モノクローナ
ル抗体試薬を使用して、Ｂ細胞、ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞、樹状細胞、ラン
ゲルハンス細胞、単球などを分離し得る。
【０１５２】 抗原を発現するこれらの細胞を、表面抗原のＰＩＧ結合形式に関してＣ末端配
列について特異的な蛍光性モノクローナル抗体を用いて同定し得る。ＦＡＣＳ分
析は、細胞集団上の抗原の正確な形態の発現レベルの定量的な評価を可能にする
。最大レベルの抗原を発現する細胞を分取し、そして標準的な分子生物学的方法
を使用して、この反応性を与えるプラスミドＤＮＡワクチンベクターを回収する
。抗原を発現するこれら全ての細胞の精製を可能にする（そして、抗原を発現す
る細胞が非常に小さな少数集団であり得るので、これはセルソーター上にロード
する前に有用であり得る）代替手順は、表面抗原を発現する細胞をロゼットする
方法か、または総精製（ｐａｎ−ｐｕｒｉｆｙ）する方法である。ロゼットは、
抗原を発現する細胞と関連する抗原に対して共有結合的に結合する抗体を保有す
る赤血球との間に形成され得る。これらは、単位重力沈澱（ｕｎｉｔ ｇｒａｖ
ｉｔｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって容易に精製され得る。関連する
抗原に特異的な固定化されたモノクローナル抗体を保有する、ペトリ皿上にある
細胞集団のパニングはまた、不必要な細胞を取り除くために使用され得る。
【０１５３】 必要な高次構造の標的抗原を発現する細胞を、標的病原体上に発現されるもの
と同じ構造と特異的に反応することが公知である、特定の高次構造依存性モノク
ローナル抗体を使用して同定し得る。１つのモノクローナル抗体は、標的抗原の
正確な折り畳みの全ての局面を規定し得ないので、診断用の抗体に高い親和性で
反応するが、抗原が標的病原体の表面上に見出されることによって規定されるよ
うに、または標的病原体から分泌されるように、正確な高次構造を生じない抗原
の可能性を最小化し得る。この可能性を最小化するための方法は、いくつかのモ
ノクローナル抗体を使用することであり、この抗体は、選択プロセスにおいて、
正確に折り畳まれたタンパク質において異なる構造的エピトープと各々反応する
ことが公知である。これは、例えば、二次ＦＡＣＳソーティングによって達成さ
れ得る。
【０１５４】 次いで、所望の時間の間に正確な身体部位において十分に首尾良く抗原を発現
する、豊富なプラスミド集団を、別の選択の回のための出発集団として使用して
、これを、多様性を拡大するために遺伝子シャッフリングと組み合わせる。この
様式において、ＤＮＡワクチン免疫化動物において組織由来のプラスミドによっ
てコードされる所望の生物学的活性を、回復する。
【０１５５】 この方法はまた、ＤＮＡワクチン構築物中に組み込まれることを望まれ得る免
疫アクセサリー分子を発現する選択されたベクターを、インビボで最善に提供し
得る。例えば、（Ｔ細胞に対する抗原の首尾良い提示を促進するための）抗原提
示細胞（ＡＰＣ）中のアクセサリータンパク質Ｂ７．１またはＢ７．２を発現す
ることが所望される場合、機能的なＢ７タンパク質を認識する市販のモノクロー
ナル抗体を使用して、異なる組織から単離されるＡＰＣを分取し得る。
【０１５６】 （（２）分泌される抗原／サイトカイン／ケモカインの発現についての選択
） 本発明はまた、可溶性タンパク質の分泌において最適である遺伝子ワクチンベ
クター集団においてプラスミドを同定するための方法を提供し、これは、誘発さ
れた免疫応答の定性的および定量的性質に影響を及ぼし得る。例えば、この方法
は、特定のサイトカイン、成長因子およびケモカインの分泌について最適である
ベクターを選択するために有用である。この選択の目標は、異なるプロモーター
、エンハンサー、ポリＡ路（ｐｏｌｙＡ ｔｒａｃｔ）、イントロンなどを組み
合わせることにおいて、サイトカイン、ケモカインおよび成長因子のどの特定の
組み合せが必要な免疫応答を誘発するかを決定することである。
【０１５７】 目的の可溶性タンパク質についての遺伝子の組合せは、ベクター中に存在し得
る；転写が単一のプロモーターからであり得るか、またはこの遺伝子が複数のシ
ストロンの配列に配置され得るかのいずれかである。代表的に、このポリペプチ
ドをコードする遺伝子は、発現したタンパク質が細胞から分泌されるように、最
適なシグナル分泌配列と結合して、ワクチンベクターライブラリー中に存在する
。
【０１５８】 これらの方法の第１の工程は、インビトロにおいて可溶性因子の高い（または
、いくつかの場合において低い）レベルの異なる組合せを分泌し得、そして所望
されるような短い、または長い時間の間、これらの因子を発現するベクターを生
成することである。この方法は、プラスミドの目録を選択および保持することを
可能にし、これは、公知の時間の間に公知の組織において発現される可溶性タン
パク質の公知のパターンによって特徴付けられ得る。次いで、これらのベクター
は、適切な発現構築物において遺伝子ワクチン抗原と結合して配置された後に、
インビボでの効率について個々に試験され得る。
【０１５９】 このベクターライブラリーを試験動物に対して送達し、そして選択された時間
の後、この動物の種々の部位由来の組織および／または細胞を回収する。細胞を
、標準的な細胞生物学的手順を使用して組織から精製する。この手順としては、
親和性試薬として、細胞特異的な表面反応性モノクローナル抗体の使用がしばし
ば挙げられる。上記の細胞表面抗原に関する場合のように、別個の細胞集団の物
理学的精製を、所望のタンパク質を発現する細胞を同定する前に実行し得る。こ
れらの研究に関して、サイトカインの発現のための標的細胞は、最も通常には、
筋肉細胞または上皮細胞よりも、むしろＡＰＣ、またはＢ細胞もしくはＴ細胞で
ある。このような場合において、確立された方法によるＦＡＣＳソーティングは
、異なる細胞型を分離するために好ましい。上記の異なる細胞型はまた、ネズミ
免疫細胞の表面膜の表現型を規定する公知のモノクローナル抗体が存在するパネ
ルを用いるアフィニティーパニング、ロゼッティングまたは磁気ビーズ分離を使
用して、比較的純粋な画分中に分離され得る。
【０１６０】 精製した細胞を、細胞の生存を維持する条件下で寒天ゲル上に置く。標的抗原
に必要とされる高次構造を発現する細胞を、高次構造依存性モノクローナル抗体
を使用して同定する。この抗体は、標的病原体上に発現されるのと同じ構造と特
異的に反応することが公知である。細胞からの関連する可溶性タンパク質の放出
を、モノクローナル抗体、続いて、肉眼で見えるシグナル（金の析出、着色、蛍
光、発光）を与える二次的な試薬と共にインキュベートすることによって検出す
る。最大レベルの抗原を発現する細胞を、視覚的な検査によって同定し得、細胞
または細胞コロニーを採集し、そして標準的な分子生物学的方法を使用してこれ
に反応性を与えるプラスミドＤＮＡワクチンベクターを回収する。あるいは、フ
ローサイトメトリーを使用して、高レベルの遺伝子発現を誘導するプラスミドを
保有する細胞を同定および選択し得る。次いで、所望の時間の間に正確な身体部
位において十分な可溶性因子を首尾良く発現する、富化したプラスミド集団を、
別の選択の回の出発集団として使用し、さらに改良が所望される場合、多様性を
拡張するために遺伝子シャッフリングを組み込む。この様式において、ＤＮＡワ
クチン免疫化動物の組織由来のプラスミドによってコードされる、所望の生物学
的活性を回復する。
【０１６１】 正確に折り畳まれたサイトカイン、ケモカイン、または成長因子において、異
なる高次構造エピトープと反応することが各々公知であるいくつかのモノクロー
ナル抗体を使用して、いくつかの高次構造エピトープがプローブされる場合に、
１つのモノクローナル抗体試薬を用いるスクリーニングからの最初の結果をなお
保持していることを確認する。いくつかの場合において、寒天中の細胞／細胞コ
ロニーから放出される機能的なサイトカインについての第１のプローブは、同起
源のレセプターの可溶性ドメインであり得る。
【０１６２】 （Ｂ．フローサイトメトリー） フローサイトメトリーは、数百万の個々の細胞の機能的特性を効率的に分析す
るための手段を提供する。細胞を照明領域に通過させ、ここでこの細胞は、レー
ザービームによって衝撃を受ける；散乱光および蛍光を、コンピュータに連結さ
れた検出器によって分析する。フローサイトメトリーは、細胞集団の分析の他の
方法を超える、いくつかの利点を提供する。１秒あたり数千の細胞を、高度な精
度および感度で分析し得る。細胞集団のゲートは、各サンプルの複数のパラメー
ターの分析を可能にする。細胞の大きさ、生存度、および形態学を、染色する必
要なく分析し得る。色素および標識された抗体を使用する場合、ＤＮＡ含量、細
胞表面、および細胞質内タンパク質を分析し得、そして細胞型、活性化状態、細
胞周期段階を同定し得、そしてアポトーシスを検出し得る。４つの色（従って、
異なる蛍光標識を用いて染色された４つの別個の抗体）まで、そして光散乱によ
る特徴を、同時に分析し得る（４つの色は、２つのレーザーを備える（ｔｗｏ−
ｌａｓｅｒ）機器を必要とする；１つのレーザーを備える機器は３つの色を分析
し得る）。いくつかの遺伝子の発現レベルを同時に分析し得、そして重要には、
フローサイトメトリーに基づくセルソーティング（「ＦＡＣＳソーティング」）
が、所望の表現型を有する細胞の選択を可能にする。ほとんどのベクターモジュ
ールライブラリー（プロモーター、エンハンサー、イントロン、エピソーム様複
製起源、抗原の発現レベル局面、細菌起源、および細菌マーカーを含む）をフロ
ーサイトメトリーによってアッセイして、個々のヒト組織培養細胞を選択し得る
。このヒト組織培養細胞は、所望の特性において最大の改良を有する組換え核酸
配列を含む。代表的には、この選択は、図４に図示されるように、表面抗原また
は代理のマーカータンパク質の高い発現レベルについてである。最善の個々の配
列のプールを、フローサイトメトリーに基づくソーティングによって選択される
細胞から回収する。このアプローチの利点は、非常に大きな数（１０7以上）が 、１つのバイアル実験において評価され得ることである。
【０１６３】 （Ｃ．インビトロでのスクリーニング方法） 遺伝子ワクチンベクターおよびベクターモジュールを、改良されたワクチン接
種の特性について、当業者に公知である種々のインビトロ試験方法を使用してス
クリーニングし得る。例えば、最適化された遺伝子ワクチンを、目的の特定のリ
ンパ球型（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞コロニー）の増殖
を誘導する効果について試験し得る。改良されたアジュバント活性および免役刺
激特性について、このスクリーニング型を、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞
を使用して実行し得る。
【０１６４】 遺伝子ワクチンベクターのライブラリー（サイトカイン、同時刺激分子などを
コードする遺伝子を保有するランダムＤＮＡかまたはベクターのいずれかでのシ
ャッフリングから得られる）を、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、ヒト
全ＰＢＭＣ、または（希釈した）全血によって、サイトカイン産生についてスク
リーニングし得る（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−
１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）。サイ
トカインを、ＥＬＩＳＡ、または、および、細胞質サイトカイン染色、およびフ
ローサイトメトリー（単一細胞の分析）によって測定し得る。サイトカイン産生
のプロフィールに基づいて、ＴH１／ＴH２分化を指向するベクターの能力の変更
についてスクリーニングし得る（例えば、ＩＬ−４／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４／Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−５／ＩＮＦ−γ、ＩＬ−５／ＩＬ−２、ＩＬ−１３／ＩＦＮ−γ
、ＩＬ−１３／ＩＬ−２の比における変化によって証明されるように）。
【０１６５】 ＡＰＣ活性化の誘導は、活性化抗原（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−
２（ＣＤ８６）、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１４、ＣＤ２３
、およびＦｃレセプターなど）の表面発現レベルにおける変化に基づいて検出さ
れ得る。
【０１６６】 いくつかの実施態様において、遺伝子ワクチンベクターを、Ｔ細胞活性化を誘
導するこれらの能力について分析する。より詳細には、注射したマウス由来の脾
臓細胞を単離し得、そして細胞傷害性Ｔリンパ球が、感染した自己標的細胞を溶
解する能力を研究する。この脾臓細胞は、インビトロにおいて特定の抗原で再活
性化される。さらに、ヘルパーＴ細胞の分化を、ＥＬＩＳＡによってＴH１（Ｉ Ｌ−２およびＩＦＮ−γ）サイトカインならびにＴH２（ＩＬ−４およびＩＬ− ５）サイトカインの増殖または産生を測定することによって、ならびにＣＤ４+ Ｔ細胞における細胞質サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによって直
接的に分析する。
【０１６７】 遺伝子ワクチンおよびワクチン成分はまた、例えば、目的の抗原に特異的な抗
体のＢ細胞産生の誘導によって証明されるように、体液性の免疫応答を誘導する
能力について試験され得る。これらのアッセイを、例えば、免役された個体由来
の末梢性Ｂリンパ球を使用して実行し得る。このようなアッセイ法は、当業者に
公知である。他のアッセイは、標的細胞による抗原発現の検出を含む。例えば、
ＦＡＣＳ選択は、細胞表面上の所望の抗原を産生する細胞を同定する、最も効率
的な方法を提供する。ＦＡＣＳ選択の別の利点は、異なるレベルの発現について
分取し得ることである；時には、より低い発現が所望され得る。別の方法は、プ
レート上のモノクローナル抗体を使用するパニングを含む。この方法は、多数の
細胞を短い時間内で処理し得るが、この方法は、最も高い発現レベルのみを選択
する。モノクローナル抗体で被覆された磁気ビーズによる捕獲は、特定の抗原を
発現する細胞を同定する別の方法を提供する。
【０１６８】 癌細胞に対する遺伝子ワクチンおよびワクチン成分を、インビトロにおいて、
腫瘍細胞株の増殖を阻害するための能力についてスクリーニングし得る。このよ
うなアッセイは、当該分野で公知である。
【０１６９】 例えば、癌または自己免疫障害に対する遺伝子ワクチンの効力の指標は、ベク
ターが患者または試験動物の皮膚に注射される場合の、皮膚の炎症の程度である
。強力な炎症は、抗原特異的Ｔ細胞の強力な活性化に相関している。腫瘍特異的
Ｔ細胞の改良された活性化は、腫瘍の殺傷の増強を誘導し得る。自己抗原の場合
において、ＴH２に対する応答を歪める免疫モジュレーターを添加し得る。皮膚 生検は、各々の注射の部位に生じる免疫応答の型の詳細な研究を可能にし得る（
マウスにおいて、多数の注射／ベクターが分析され得る）。
【０１７０】 他の適切なスクリーニング方法は、遺伝子ワクチンベクターのライブラリーに
よるチャレンジの際の細胞による、サイトカイン、ケモカイン、アクセサリー分
子などの発現における変化の検出を含み得る。
【０１７１】 （Ｄ．保護性免疫の最適な誘導についてのスクリーニング） 効率的な保護性免疫を提供する遺伝子ワクチンベクターを選択するために、試
験哺乳動物において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏ
ｎｄｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ、Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅ
ｘ、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ型ウイルス）、および
水疱性口内炎ウイルスのような致命的な感染モデルを使用して、ベクターライブ
ラリーをスクリーニングし得る。遺伝子ワクチンベクターまたは個々のベクター
のプールを、動物において、皮膚内に、筋内に、静脈内に、気管内に、肛門に、
膣に、口腔に、または腹腔内に導入し、そして疾患を妨げ得るベクターを、シャ
ッフリングおよび選択のさらなる回のために選択する。
【０１７２】 例として、最適化されたベクターを、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ寄生
体で感染させたマウスにおいてスクリーニングし得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスの足
蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）に注射する場合、これらの寄生体は、進行性の感染の後に
、致命的な結果を伴う播種性の疾患を生じる。この疾患は、抗ＩＬ−４ｍＡｂｓ
または組換えＩＬ−１２によって防止され得る（Ｃｈａｔｅｌａｉｎら（１９９
２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１８２〜１１８７）。プラスミドのプール
を、これらのマウスの静脈内に、腹腔内に、または足蹠に注射し得、そしてこの
疾患を防止し得るこれらのプールをさらなる分析のために選択し、そして存在す
る感染を治療し得るベクターについてスクリーニングする。足蹠の腫脹の大きさ
は、単純でなお正確な疾患の進行のモニタリングを視覚的に提供することに従い
得る。マウスは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを用いて気管内
に感染させて、致命的な肺炎を生じ得る。この肺炎を、組換えＩＬ−１２によっ
て防止し得る（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５７：３００６〜３０１２）。このモデルの利点は、肺を介して生じる感染であ
り、これはヒト病原体の浸潤の共通の経路である。これらのベクターを、病原体
と共に肺に与え得るか、またはこれらを、症状が確立された感染を治療し得るベ
クターをスクリーニングするために、症状が明白となる後に投与し得る。
【０１７３】 別の例において、遺伝子ワクチンは、インフルエンザＡ型ウイルスについて、
マウスのワクチン接種モデルである。インフルエンザは、遺伝子ワクチンの効力
が実証された最初のモデルのウイルスである（Ｕｌｍｅｒら（１９９３）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５９：１７４５〜１７４９）。いくつかのインフルエンザ菌株は、
遺伝子ワクチンの効力についてスクリーニングする容易な手段を提供するマウス
において、致命的である。例えば、インフルエンザウイルス菌株Ａ／ＰＲ／８／
３４（これは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ ＶＲ−９
５）を介して利用可能である）は、致命的な感染を生じるが、マウスがインフル
エンザ赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子ワクチンで免疫化される場合、１００％の生
存が得られ得る（Ｄｉｃｋら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５：７１〜７８）
。このモデルは、非常に低いＤＮＡ量、および／または高いウイルス濃度におい
て保護を提供するベクターについてスクリーニングする方法を提供し、そしてこ
れはまた、インビボで誘導される抗原特異的ＡｂｓおよびＣＴＬのレベルを分析
することを可能にする。
【０１７４】 遺伝子ワクチンベクターはまた、ヒト型結核菌による感染に対する保護を提供
するこれらの能力について分析され得る。これは、遺伝子ワクチンが部分的な保
護を提供する状況、および主な改良が要求される状況の例である。
【０１７５】 一旦、多くの候補ベクターが同定されると、これらのベクターは、さらなるモ
デルにおいて、より詳細な分析に供され得る。他の感染性疾患モデル（例えば、
ＨＳＶ、マイコプラズマ肺、ＲＳＶ、および／またはロタウイルス）における試
験は、各感染性疾患において最適なベクターの同定を可能にする。
【０１７６】 各々の場合において、最初のスクリーニングの回由来の最適なプラスミドは、
次の回のシャッフリング、アセンブリ、および選択のための出発物質として使用
され得る。動物モデルにおいて首尾良いベクターを配列決定し、そして対応する
ヒト遺伝子を遺伝子ワクチンベクターにクローニングする。次いで、これらのベ
クターを、ＴH１／ＴH２細胞の分化、ＴH細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球および単 球／マクロファージの活性化、または他の所望の性質を誘導する能力について、
インビトロで特徴付ける。最終的に、最も可能性のあるベクターを、マウスにお
けるインビボデータ、ならびに匹敵する、マウスおよびヒトにおけるインビトロ
研究に基づき、ヒトのトライアルのために選択し、そして種々のヒトの感染性疾
患を弱めるこれらの能力を調査する。
【０１７７】 ベクターのプールが保護的な免疫性を提供するか否かを決定することに加えて
、保護的な免疫性に関連する免疫パラメーター（例えば、特異的抗体（特に、Ｉ
ｇＧ）の誘導および特異的ＣＴＬ応答の誘導）を測定し得る。脾臓細胞を、ワク
チン接種されたマウスから単離し、そして抗原特異的Ｔ細胞の存在およびＴH１ サイトカイン合成プロフィールの誘導について測定し得る。ＥＬＩＳＡおよび細
胞質サイトカイン染色を、フローサイトメトリーと組み合わせて、このような情
報を単一細胞のレベルで提供し得る。
【０１７８】 （Ｅ．ヒト抗原特異的リンパ球応答を活性化する遺伝子ワクチンベクターの
スクリーニング） ヒト免疫系について最適化された免疫刺激特性を有するベクターをスクリーニ
ングするために、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または精製された専門的な抗原
提示細胞（ＡＰＣ）を、以前にワクチン接種もしくは感染した個体、または目的
の病原体との急性感染を伴う患者から単離し得る。これらの個体が循環において
病原体特異的Ｔ細胞の漸増する頻度を有するので、これらの個体のＰＢＭＣまた
は精製されたＡＰＣにおいて発現される抗原は、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞およ びＣＤ８+Ｔ細胞による増殖およびサイトカイン産生を誘導する。従って、個々 が特異的Ｔ細胞を有する抗原をコードする遺伝子ワクチンベクターを、個体のＰ
ＢＭＣにトランスフェクトし得、その後Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン合成の
誘導を測定し得る。あるいは、ＡＰＣへの遺伝子ワクチンベクターの自発性侵入
についてスクリーニングし得る。従って、改良されたトランスフェクション効率
、抗原の改良された発現、および特異的Ｔ細胞の活性化の改良された誘導につい
て同時にスクリーニングする手段を提供する。最も潜在的な免疫刺激特性を有す
るベクターを、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン合成を誘導するこれらの能力に
基づいてスクリーニングし得る。０．５リットルの血液から、１０4個のＰＢＭ ＣまでのＰＢＭＣリンパ球を含む血液ドナー由来の１つの軟膜を得て、１つのド
ナーからのＴ細胞を使用して大量のスクリーニング実験を可能にし得る。
【０１７９】 健常な、ワクチン接種された個体（研究室のボランティア）を研究する場合、
これらの個体からＥＢＶ−形質転換されたＢ細胞株を作製し得る。これらの細胞
株を、同じドナーからの血液を使用する引き続く実験において、抗原提示細胞と
して使用し得る；これは、アッセイ間およびドナー間の変化を減少する。さらに
、抗原特異的Ｔ細胞クローンを作製し得、その後、この遺伝子ワクチンを、ＥＢ
Ｖで形質転換されたＢ細胞にトランスフェクトする。次いで、形質転換されたＢ
細胞が特定のＴ細胞クローンの増殖を誘導する効率を、研究する。特定のＴ細胞
クローンで研究する場合、増殖応答およびサイトカイン合成応答は、全ＰＢＭＣ
を使用する場合よりも有意により高い。なぜなら、ＰＢＭＣにおける抗原特異的
Ｔ細胞の頻度が、非常に低いからである。
【０１８０】 クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）表面の糖タンパク質が広範に発
現されるので、ＣＴＬエピトープはほとんどの細胞型によって提示され得る。従
って、適切な発現ベクターにおいてシャッフルされたＤＮＡ配列のライブラリー
による培養物中の細胞のトランスフェクションは、クラスＩエピトープ提示を誘
導し得る。所定のエピトープに指向される特定のＣＴＬが個体から単離された場
合、次いでトランスフェクトされた提示細胞およびＣＴＬの同時培養物は、この
エピトープが提示される場合に、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ
、またはＴＮＦα）のＣＴＬによる放出を誘導し得る。より高い量の放出された
ＴＮＦαは、シャッフリングされて進化した配列からの、より効率的なプロセシ
ングおよびクラスＩエピトープの提示に対応する。
【０１８１】 最適化されたＣＴＬエピトープを同定するための第２の方法は、エピトープと
共に反応するＣＴＬの単離を必要とする。このアプローチにおいて、クラスＩ
ＭＨＣ表面の糖タンパク質を発現する細胞を、上記の進化した配列のライブラリ
ーでトランスフェクトする。プロセシングおよび提示を可能にする適切なインキ
ュベーションの後、界面活性剤に可溶性の抽出物を各々の細胞培養物から調製し
、そしてＭＨＣ−エピトープ複合体の部分的な精製の後（おそらく必要であれば
）、この生成物を質量分析に供する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（１９９３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０２７５〜１０２７９）
。この配列は、エピトープの提示が増加することが公知であるので、このペプチ
ドを同定するために質量分析を較正する。さらに、細胞性タンパク質を、定量的
な結果を得るために内部較正に使用し得る；内部較正に使用される細胞性タンパ
ク質は、ＭＨＣ分子自身であり得る。従って、結合されるペプチドエピトープの
量を、ＭＨＣ分子の割合として測定し得る。
【０１８２】 （Ｆ．ワクチン接種研究のためのＳＣＩＤ−ヒト皮膚モデル） 首尾良い遺伝子ワクチン接種は、ベクターの注射、所望の抗原の発現、抗原提
示細胞における抗原のプロセシング、ＭＨＣ分子の状況における抗原性ペプチド
の提示、Ｔ細胞レセプターによるペプチド／ＭＨＣ複合体の認識、Ｔ細胞のＢ細
胞および専門的ＡＰＣとの相互作用、ならびに特定のＴ細胞およびＢ細胞応答の
誘導の後の標的細胞のトランスフェクションを必要とする。全てのこれらの事象
は、マウスおよびヒトにおいて差次的に調節され得る。ワクチン研究におけるマ
ウスモデルの限界は、マウスおよびヒトのＭＨＣ分子は実質的に異なるという事
実である。従って、マウスにおいて保護的な免疫応答を有効に誘導するタンパク
質およびペプチドは、ヒトにおいて必要な機能ではない。
【０１８３】 これらの限定を克服するために、マウスモデルを使用して、インビボで、マウ
スにおけるヒト組織を研究し得る。ヒト皮膚の生体片を、免疫不全マウス（例え
ば、ＳＣＩＤマウス）の背中上に異物移植して、インビボで、ヒト細胞の最適化
された特性についてのベクターライブラリーのスクリーニングを可能にする。エ
ピソームベクターの再帰的な選択は、エピソームを残すベクターに強力な選択圧
力を提供し、なお高いレベルの遺伝子発現を提供する。これらのマウスは、トラ
ンスフェクション効率、転移配列および遺伝子発現のレベルに関する研究のため
に優れたモデルを提供する。さらに、これらのマウス由来の抗原提示細胞（ＡＰ
Ｃ）もまた使用して、専門的なＡＰＣに送達される抗原のレベルを評価し得、そ
してこれらの細胞の抗原提示する能力、ならびにインビトロでの抗原特異的ＣＤ
４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の活性化の誘導する能力を研究し得る。有意に、
ＳＣＩＤマウスは、厳格に不完全なＴ細胞成分およびＢ細胞成分を有するが、抗
原提示細胞（樹状細胞および単球）は、これらのマウスにおいて比較的正常であ
る。
【０１８４】 このモデル系の１つの実施態様において、免疫コンピテントマウスは、ヒト組
織の移植を可能にするために免疫不全を与えられる。例えば、ＣＤ２８およびＣ
Ｄ４０経路のブロッキングは、マウスにおいて同種異系の皮膚移植片の長期間の
生存を促進する（Ｌａｒｓｅｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４３４）
。インビボにおいて免疫抑制が一過性であるので、このモデルはまた、遺伝学的
に正常な免疫系を有するマウスに異物移植されたヒト皮膚において、ワクチン研
究を可能にする。ＣＤ２８−Ｂ７相互作用およびＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相
互作用をブロックするいくつかの方法は、当業者に公知であり、例えば、中和抗
Ｂ７−１およびＢ７−２抗体、可溶性ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４の細胞外部分
の可溶性形態、ＣＴＬＡ−４およびＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む融合タンパク質
、ならびに中和抗ＣＤ−４０または抗ＣＤ４０リガンド抗体の投与が挙げられる
。一過性の免疫抑制を改良し得るさらなる方法は、１つ以上の以下の試薬の投与
を含む：シクロスポリンＡ、抗ＩＬ−２レセプターα鎖Ａｂ、可溶性ＩＬ−２レ
セプター、ＩＬ−１０、およびこれらの組合せ。
【０１８５】 ヒト皮膚を移植されたＳＣＩＤマウスがＨＬＡ適合化ＰＢＭＣで注射されるよ
うなモデルを使用して、インビボで長く持続する発現を提供するベクターを分析
し得る。このモデルにおいて、ベクターを、ヒト皮膚に注射するか、または局所
的に適用する。その後、ＨＬＡ適合化ＰＢＭＣを、これらのマウスに注射する。
ＰＢＭＣがベクターに特異的なリンパ球を含む場合、トランスフェクトされた細
胞が認識され、そして最終的には、これらのベクター特異的リンパ球によって破
壊される。従って、このモデルは、免役細胞による破壊を効果的に避けるベクタ
ーについてスクリーニングする可能性を提供する。ヒト皮膚移植を伴うマウスに
注射したヒトＲＢＬは、器官を拒絶することが示されており、このことはＣＴＬ
がこのモデルの皮膚に到達することを示す。ＨＬＡ適合皮膚および血液を得るこ
とが可能である（例えば、悪性腫瘍に起因する皮膚切除を受ける患者からの血液
サンプルおよび皮膚移植、または同じ乳児からの血液および包皮）。
【０１８６】 本明細書中に記載されるようなスクリーニングに適切なさらなるモデルは、改
変されたＳＣＩＤｈｕマウスモデルであり、このモデルにおいて、ヒト胎児胸腺
、肝臓および骨髄の移植片は、マウスにおける機能的なヒト免疫系を提供するＳ
ＣＩＤマウスに移植される（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．８：２０７）。機能的なヒトＢ細胞およびＴ細胞、ならびにＡＰ
Ｃを、これらのマウスにおいて観察し得る。さらなるヒト皮膚を移植する場合、
皮膚への注射に続く遺伝子ワクチンベクターの効力についての研究が可能なよう
である。皮膚の同時移植は、専門的なＡＰＣのさらなる供給源を提供するので、
このモデルを改良するようである。
【０１８７】 （Ｇ．ヒト筋肉細胞のトランスフェクトおよびインビボにおけるヒト免疫応
答の誘導における遺伝子ワクチンの効率を研究するためのマウスモデル） 適切なインビボモデルの欠如は、ヒト筋肉細胞での抗原発現の誘導において、
および特定のヒト免疫応答の誘導において、遺伝子ワクチンの効率の研究を妨害
している。筋肉細胞をトランスフェクトする遺伝子ワクチンの能力、およびイン
ビボにおいて特定の免疫応答を誘導する遺伝子ワクチンの能力に関する膨大な数
の研究は、マウスモデルを使用している。しかし、遺伝子ワクチン接種後に生じ
る事象の複雑性のために、マウスモデルで得られた結果がヒトにおいて同様のワ
クチン接種の克服を確かに予測するものであるか否かを予測することは、時に困
難である。首尾良い遺伝子ワクチン接種に必要な事象は、プラスミドの送達後の
細胞のトランスフェクション、所望の抗原の発現、抗原提示細胞における抗原の
プロセシング、ＭＨＣ分子の状況における抗原性ペプチドの提示、Ｔ細胞レセプ
ターによるペプチド／ＭＨＣ複合体の認識、Ｔ細胞のＢ細胞および専門的抗原提
示細胞との相互作用、ならびに最終的に特定のＴ細胞およびＢ細胞応答の誘導を
含む。全てのこれらの事象は、マウスおよびヒトにおいて、いくぶん差次的に調
節されるようである。
【０１８８】 本発明は、ヒト筋肉細胞のトランスフェクションに関して、インビボにおける
モデルを提供する。このモデル系は、特に有益である。なぜなら、正常の筋肉細
胞について利用可能なインビトロの培養系が存在しないからである。例えば、死
体から得られる筋肉組織を、免疫不全マウスに対して皮下に移植する。免疫不全
マウスは、拒絶反応を伴わずに他の種からの組織を移植され得る。異物移植に適
切なマウスとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＣＩＤマウ
ス、ヌードマウス、およびＲＡＧ１遺伝子またはＲＡＧ２遺伝子をコードするこ
れらの遺伝子を不完全に与えられるマウス。ＳＣＩＤマウスおよびＲＡＧ欠損マ
ウスは、機能的なＴ細胞およびＢ細胞を欠失し、従って厳格に免疫無防備状態で
あり、そして移植された器官を拒絶し得ない。以前の研究は、これらのマウスが
ヒト組織（例えば、皮膚、脾臓、肝臓、胸腺、または骨）に、拒絶反応を伴わず
に移植され得ることを示す（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．８：２０７）。ＳＣＩＤマウスへのヒト胎児リンパ組織の移植の
後、機能的なヒト免疫系は、これらのマウスにおいて実証され得、モデルは一般
的にＳＣＩＤ−ｈｕマウスとして言及される。ヒト筋肉組織がＳＣＩＤ−ｈｕマ
ウスへ移植される場合、所望の抗原のトランスフェクション効率および発現を研
究し得るのみならず、インビボにおいて遺伝子ワクチンによって誘導される特定
のヒト免疫応答の誘導をも研究し得る。この場合において、同じドナーからの筋
肉器官およびリンパ系器官が使用される。胎児筋肉もまた、対宿主性移植片反応
の可能性を減少するドナー由来の、ほとんど成熟していないリンパ球を含む点で
利点を有する。
【０１８９】 一旦ヒト筋肉組織がマウスにおいて樹立されると、遺伝子ワクチンベクターは
、目的の抗原の発現を研究するためにヒト筋肉組織へ導入される。トランスフェ
クション効率のみが研究される場合、ＲＡＧ欠損マウスが好ましい。なぜなら、
これらのマウスは、決して循環中に成熟Ｂ細胞または成熟Ｔ細胞を有さないから
である。これに対し、ＳＣＩＤ表現型の「漏れ（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）」は、実
証されており、これは移植効率において変化を生じ得る。
【０１９０】 マウスにおけるヒト筋肉組織の生存は、免疫無防備状態マウスにおいてさえも
限定されるようである。しかし、発現の研究が１日または２日以内に実施され得
るので、このモデルは、インビボにおいてヒト筋肉細胞における遺伝発現を研究
する効率的な手段を提供する。これらのマウスに移植されたヒト筋肉を有する改
変されたＳＣＩＤ−ｈｕマウスモデルを使用して、インビボでのマウスにおける
ヒト免疫応答を研究し得る。
【０１９１】 （Ｈ．ワクチンの改良された送達のためのスクリーニング） 特定の適用に関して、特定の様式（例えば、経口で、または皮膚を介して）で
投与され得る遺伝子ワクチンベクターを同定することが所望される。以下のスク
リーニング方法は、適切なアッセイを提供する；さらなるアッセイはまた、アッ
セイが特に適切である特定の遺伝子ワクチン特性と組み合わせて、本明細書中に
記載される。
【０１９２】 経口送達のためのスクリーニングは、インビトロかまたはインビボのいずれか
で実施され得る。インビトロ方法の例は、組織培養において増殖されるＣａｃｏ
−２（ヒト結腸腺癌）細胞に基づく。半透性フィルター上で増殖される場合、こ
れらの細胞は、構造的および機能的の両方においてヒト小腸上皮に類似する細胞
へ、自発的に分化される。遺伝子ワクチンライブラリーおよび／またはベクター
を、Ｃａｃｏ−２細胞層の一方の側に配置し得、そしてこの細胞層を介して運動
し得るベクターを、この層の反対側上で検出し得る。
【０１９３】 ライブラリーをまた、インビボにおける経口送達に対する従順性についてスク
リーニングし得る。例えば、ベクターのライブラリーを、経口的に投与し得、そ
の後標的組織をベクターの存在についてアッセイする。腸の上皮、肝臓、および
血流は、ライブラリーメンバーの存在について試験され得る組織の例である。標
的組織に達することにおいて首尾良いベクターは、回収され得、そしてさらに改
良が所望される場合、次の回のシャッフリングおよび選択において使用される。
【０１９４】 皮膚または筋肉への注射の際のトランスフェクト細胞に対する能力について、
遺伝子ワクチンベクターのライブラリーをスクリーニングするために、本発明は
、大量のベクターを効率的にスクリーニングさせる装置を提供する。この装置（
図５）は、９６ウェル形式に基づき、そしてマイクロタイタープレートから研究
室の動物（例えば、マウスおよびラット）の皮膚または筋肉に、少量（２〜５μ
ｌ）を移動するために設計される。さらに、免疫不全マウスへ移植されたヒト筋
肉または皮膚が、注射され得る。
【０１９５】 この装置は、チップがマイクロタイタープレートに合うように移動するよう設
計される。目的の試薬がこのプレートから得られた後、このチップの互いからの
距離は、２〜３ｍｍに減少し、１．６ｃｍ×２．４ｃｍ〜２．４ｃｍ×３．６ｃ
ｍの領域に９６の試薬を移し得る。移された各サンプルの容量は、電気制御され
る。各試薬をマーカー剤または色素と混合し、組織における注射部位の認識を可
能にする。例えば、異なる大きさおよび形状の金粒子を目的の試薬と混合し、そ
して顕微鏡および免疫組織化学を使用して、各々の注射部位を同定し、および各
試薬によって誘導される反応を研究する。筋肉組織が注射される場合、この注射
部位は、まず手術によって現れる。
【０１９６】 この装置を使用して、インビボにおいて大量の薬剤の効果を研究し得る。例え
ば、この装置を使用して、大量の異なるＤＮＡワクチンベクターの免疫不全マウ
スへ移植されるヒト皮膚細胞または筋肉細胞をトランスフェクトする効率をスク
リーニングし得る。
【０１９７】 （Ｖ．遺伝子ワクチン成分の最適化） 多くの因子が、免疫応答を調節する際の遺伝子ワクチンの有効性に影響し得る
。例えば、ベクターが細胞に入る能力は、そのベクターが免疫応答を調節する能
力に対して有意な効果を有する。免疫応答の強さはまた、遺伝子ワクチンベクタ
ーにより発現される抗原の免疫原性、およびその抗原が発現されるレベルにより
媒介される。この遺伝子ワクチンベクターにより生成される同時刺激性分子が存
在するかまたは存在しないかは、このベクターが哺乳動物に導入されることによ
り生じる免疫応答の強さだけでなく、免疫応答の型にも影響し得る。生物中でベ
クターの持続性が増加することにより、免疫調節の時間を長くし得、そしてまた
、長く続く保護を達成するために複数回の投与を必要としない便利な自動ブース
トベクターを作製する。本発明は、これらの多くの特性を最適化し、これにより
哺乳動物の免疫系に対して所望の効果を誘発する改良された能力を示す遺伝子ワ
クチンベクターを生じる、方法を提供する。
【０１９８】 遺伝子ワクチンは、種々の機能的成分を含み得、その好ましい配列は、ＤＮＡ
シャッフリングにより最も良く決定され、その経験に基づく配列の進化が、本明
細書中に詳細に記載される。本発明の方法は、一般に、複数の相同な開始配列の
ＤＮＡシャッフリングか、または組換え体の集団を作製する他の方法により、主
要なベクター成分の各々についての別々のライブラリーを構築し、キメラ配列の
複合混合物を生じる工程を含む。最良の配列は、以下に記載の高速処理アッセイ
を使用して、これらのライブラリーから選択される。各単一モジュールライブラ
リーからの１サイクル以上の選択の後、異なるモジュールの最良の配列のプール
が、この選別法が適用可能な限り、シャッフリングにより混合され得る。プロモ
ーター、エンハンサー、イントロン、転移配列、哺乳動物性ｏｒｉ、細菌性ｏｒ
ｉ、および細菌性マーカーなどについての選別法は、結局組み合わされて、各配
列の状況を同時に最適化し得る。これらの実験において重要な局面は、循環的サ
イクルのシャッフリングを使用して大きなライブラリーから選択し、合理的には
アプローチし得ない、偶発的であるが複雑な機構（例えば、細胞へのＤＮＡ転移
）全てに最大限アクセスすることである。
【０１９９】 異なるベクターのライブラリーは、プロモーター、サイトカイン、サイトカイ
ンアンタゴニスト、ケモカイン、免疫刺激性配列、および同時刺激性分子を提供
するベクターモジュールを、アセンブリーＰＣＲおよびコンビナトリアル分子生
物学を使用してアセンブリーすることにより作製され得る。アセンブリーＰＣＲ
は、長いＤＮＡ配列（例えば、遺伝子、およびプラスミドのフラグメント）のア
センブリーのための方法である。ＰＣＲと対照的に、プライマーとテンプレート
との間の区別がない。なぜなら、アセンブルされるフラグメントが互いにプライ
ムするからである。本明細書中に記載のようにして得られるベクターモジュール
のライブラリーは、プロモーターと融合され得、これは、本発明のＤＮＡシャッ
フリング法により、それ自体が最適化され得る。生じた遺伝子は、ＤＮＡワクチ
ンベクターに組合せ的にアセンブルされ、各遺伝子は、異なるプロモーター（例
えば、シャッフルされたＣＭＶプロモーターのライブラリー由来のプロモーター
）のもとで発現される。そして、このベクターライブラリーは、免疫系に対して
所望の効果を示すベクターを同定するために、本明細書中に記載のようにスクリ
ーニングされる。
【０２００】 本発明の方法は、ワクチンの効力または望ましさに影響する多くの特性のうち
の１つ以上について最適化された遺伝子ワクチンを得るために有用である。これ
らの特性には、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】 （Ａ．エピソームベクターの維持） 本発明の配列組換え法を使用して最適化し得る１つの特性は、遺伝子ワクチン
ベクターが、哺乳動物細胞においてエピソームのように複製する能力である。ワ
クチンベクターのエピソーム様複製は、多くの状況において有利である。例えば
、エピソームのように複製するベクターは、複製しないベクターよりも長い期間
、細胞において維持され、これにより免疫応答調節の長さの増加、または治療的
に有用なタンパク質の送達の増加を生じる。エピソーム様複製はまた、従来のワ
クチンと異なり、複数回のワクチン投与を必要としない、自動ブーストワクチン
の開発を可能にする。例えば、自動ブーストワクチンベクターは、抗原発現、お
よび特定の刺激に応答した、対応する免疫応答の誘導を可能にする誘導性制御エ
レメントの制御下にある抗原コード遺伝子を含み得る。しかし、改良された特性
を有する変異体を合理的に設計する伝統的アプローチまたは試みを使用する、エ
ピソームのような維持の増強を生じる天然に存在するベクターモジュールに関す
るスクリーニングは、多くの人年の研究を必要とする。本発明は、短い期間に、
大規模なより多くの多様性を作製およびスクリーニングする方法を提供する。
【０２０２】 遺伝子ワクチンベクターがエピソームのように複製する能力を、遺伝子ベクタ
ーに哺乳動物細胞中で自律複製する能力を付与し得る、少なくとも２つの形態の
核酸を組換えるＤＮＡシャッフリングを使用することにより最適化し得る。２つ
以上の形態のエピソーム様複製ベクターモジュールは、２つ以上のヌクレオチド
において互いに異なる。組換えエピソーム様複製ベクターモジュールのライブラ
リーを作製し、そしてこのライブラリーをスクリーニングして１つ以上の最適化
された複製ベクターモジュールを同定する。この最適化された複製ベクターモジ
ュールは、遺伝子ワクチンベクター中に配置された場合、このベクターに、最適
化されていないエピソーム様複製ベクターモジュールを含むベクターと比較して
、増強された自律複製する能力を付与する。
【０２０３】 １つの実施態様において、ＤＮＡシャッフリングプロセスは、以前の回のＤＮ
Ａシャッフリングから得られた最適化されたエピソーム様複製ベクターモジュー
ルを基質として使用して、少なくとも１回繰り返される。その前の回に得られた
最適化されたベクターモジュールは、そのベクターモジュールのさらなる形態で
組換えされる。これは、その前の回に使用された形態の１つと同じであり得るか
、またはエピソーム様複製エレメントとして機能する核酸の異なる形態であり得
る。また、組換えエピソーム様複製ベクターモジュールのライブラリーが作製さ
れ、そしてスクリーニングプロセスが繰り返されて、このモジュールを含むベク
ターに対してエピソームの維持を付与する増強された能力を示すエピソーム様複
製モジュールが同定される。
【０２０４】 エピソーム様複製能力を最適化するＤＮＡシャッフリングの使用のための基質
として有用な核酸は、ベクターに、真核生物細胞中で自律複製する能力を付与す
ることに関する任意の核酸を含む。例えば、パピローマウイルス配列Ｅ１および
Ｅ２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の複製起点など。
【０２０５】 本発明の方法を使用して最適化し得るエピソーム様複製ベクターモジュールの
例は、エピソーム様複製に関与するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来の遺
伝子である。ＨＰＶは、皮膚中でエピソームのように複製し、かつ何年もインビ
ボで安定に発現される、非腫瘍原性ウイルスである。ＢｅｒｎａｒｄおよびＡｐ
ｔ（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３０：２１０。これらのインビ
ボの特性にも関わらず、組織培養物中でＨＰＶをエピソームのように維持するこ
とは、複製が不十分のため、可能でなかった。本発明は、エピソームのような維
持に関与するＨＰＶ遺伝子を、遺伝子ワクチンベクターにおける使用のために最
適化し得る方法を提供する。エピソームのような複製に関与するＨＰＶ遺伝子は
、例えば、Ｅ１遺伝子およびＥ２遺伝子を含む。従って、本発明の１つの実施態
様に従って、ＨＰＶ Ｅ１遺伝子およびＨＰＶ Ｅ２遺伝子のいずれか、または
両方を、ＤＮＡシャッフリングに供して、核酸ワクチンベクター中に配置された
場合に、哺乳動物細胞中でのそのベクターの維持を増大させる組換えエピソーム
様複製モジュールを得る。好ましい実施態様において、異なる（しかし、密接に
関連している）良性のＨＰＶ由来のＨＰＶ Ｅ１遺伝子およびＨＰＶ Ｅ２遺伝
子を、図６に示されるように、「ファミリーシャッフリング」手順において使用
する。例えば、ＨＰＶの密接に関連している株（例えば、ＨＰＶ ２、２７、お
よび５７）由来のＨＰＶ Ｅ１遺伝子およびＨＰＶ Ｅ２遺伝子のファミリーシ
ャッフリングを使用して、組換えＥ１遺伝子および組換えＥ２遺伝子のライブラ
リーを取得し得る。このライブラリーを、次に、適切なスクリーニング方法に供
し、改良されたエピソーム維持特性を示す組換えＥ１遺伝子および組換えＥ２遺
伝子を同定する。
【０２０６】 エピソーム維持を媒介する改良された能力を示す組換えエピソーム様複製ベク
ターモジュールを同定するために、組換えベクターモジュールのライブラリーの
メンバーを、哺乳動物細胞に導入するベクターに挿入する。これらの哺乳動物細
胞を、少なくとも数世代増殖させ、その後、そのベクターを維持してきた細胞を
同定する。同定は、例えば、選択マーカーを含むベクターを使用して達成し得る
。これらのライブラリーメンバーを含む細胞を、選択マーカーについての選択が
ない条件で、少なくとも数世代増殖させ、その後、選択圧を加える。選択を生き
延びる細胞を、そのベクターがエピソームのように複製する能力を増強する組換
えベクターモジュールを含むベクターを保有する細胞について、濃縮する。ＤＮ
Ａを、それら選択した細胞から回収し、そして細菌宿主細胞に導入する。これに
より、エピソームのような、非組み込み型ベクターの回収が可能になる。
【０２０７】 本発明の別の実施態様において、組換えエピソーム様複製ベクターモジュール
のライブラリーのメンバーを、細胞表面上に存在する（発現された場合）抗原を
コードするポリヌクレオチドを含むベクター中に導入する工程により、スクリー
ニング工程を達成する。ベクターのライブラリーを哺乳動物細胞に導入し、少な
くとも数世代増殖させ、その後、細胞の表面上に細胞表面抗原を提示する細胞を
同定する。このような細胞は、ベクターが自律複製する能力を増強する遺伝子ワ
クチンベクターをおそらく保有する。エピソームのように維持されるベクターを
含む細胞の同定に基づいて、最適化された組換えエピソーム様複製ベクターモジ
ュールを得、そして遺伝子ワクチンベクターを構築するために使用する。スクリ
ーニング方法における使用に適切な細胞表面抗原を、以上に記載する。そして、
他は、当業者に公知である。好ましくは、抗原を、利用可能な便利な検出手段の
ために使用する。
【０２０８】 スクリーニング方法における使用に適切な細胞は、培養哺乳動物細胞および哺
乳動物中に存在する細胞の両方を含む。ヒトにおける使用を意図される組換えベ
クターモジュールについて選別するために、スクリーニング目的に好ましい細胞
は、ヒトの細胞である。一般に、最初のスクリーニングを細胞培養物中で行う。
細胞培養物中では、シャッフルされた物質の大ライブラリーのプロセシングが可
能である。好ましい実施態様において、細胞表面上に、ベクターにコードされた
細胞表面抗原を提示する細胞を、フローサイトメトリーに基づくセルソーティン
グ法（例えば、蛍光活性化セルソーティング）により同定する。このアプローチ
により、非常に多数（＞１０7）の細胞を１回のウイルス実験で評価し得る。
【０２０９】 細胞培養物中で自律複製し、そして強力なマーカー遺伝子の発現を生じる構築
物を、動物モデルにおけるインビボでの永続性についてさらに試験し得る。例え
ば、インビボでのマウス中のヒト組織の研究に関するマウスモデルが、同時係続
中の米国特許出願第０８／９５８，８２２号（１９９７年１０月２８日出願）に
記載される。ヒトの皮膚の生きた切片を、ＳＣＩＤマウスの背中に異物移植する
。これにより、ベクターのライブラリーを、インビボのヒト細胞中で最適な特性
についてスクリーニングすることが可能になる。エピソームベクターの反復選択
により、エピソーム性を保持し、なお高レベルの遺伝子発現を提供するベクター
について強力な選択圧が提供される。
【０２１０】 別の実施態様において、スクリーニング工程には、組換えエピソーム様複製ベ
クターモジュール、および抗原または薬学的に有用なタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを含む遺伝子ワクチンベクターを、機能的なヒト免疫系を有する
哺乳動物に導入する工程が含まれる。次いで、この動物を、この抗原に対する免
疫応答の存在について試験する。好ましい実施態様において、このようなアッセ
イに使用される哺乳動物は、機能的なヒト免疫系を有する非ヒト哺乳動物である
。例えば、機能的なヒト免疫系を、免疫欠損マウスにおいて、１つ以上のヒト胎
児組織（肝臓、胸腺、および骨髄からなる群から選択される）を導入することに
より作製し得る。（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．８：２０７）。
【０２１１】 本発明の方法を使用して得られる安定なエピソームベクターは、遺伝子ワクチ
ンとして有用なだけではなく、他のライブラリースクリーニングへの適用におい
ても有用な道具である。ランダムに組み込まれかつ一過性のベクターと対照的に
、エピソーム維持ベクターは、ＦＡＣＳ選択に対して高いシグナル対ノイズ比を
生じる。そしてエピソーム維持ベクターはまた、少数の選択された細胞からプラ
スミドを回収する可能性を有意に改良する。
【０２１２】 （Ｂ．抗原の発現に最適化されたプロモーターの進化） 別の実施態様において、本発明は、プロモーターおよび他の遺伝子発現制御シ
グナルのようなベクターモジュールを最適化する方法を提供する。通常、遺伝子
ワクチンにより送達される抗原に関するコード配列を、その発現を確実にするさ
らなる配列（例えば、調節配列）に作動可能に連結する。これらの調節配列は、
以下の１つ以上を含み得る：エンハンサー、プロモーター、シグナルペプチド配
列、イントロン、および／またはポリアデニル化配列。望ましい目標は、機能的
発現産物の発現レベルを、従来のベクターにより達成されるレベルと比較して増
加させることである。遺伝子ワクチンベクターの効率は、しばしば、そのワクチ
ンベクターによる抗原の発現レベルに依存する。最適化されたプロモーターおよ
び／または他の制御配列は、遺伝子ワクチン接種の効率の改善を生じ、防御免疫
に必要なＤＮＡの量を減少し、それによりワクチン接種のコストを減少する可能
性がある。さらに、遺伝子が発現される細胞の型、および／または抗原発現の時
期を越える制御を有することが時々望ましい。本発明の方法は、プロモーターお
よび他の制御配列により影響されるこれらおよび他の因子の最適化を提供する。
【０２１３】 選択マーカーの改良された発現を、例えば、ＤＮＡシャッフリングを行うこと
により達成し得る。発現を、種々の手段（発現産物の生成速度の増加、発現産物
の分解速度の減少、または発現産物がその意図される機能を発揮する能力の改良
を含む）により効果的に改良し得る。本方法は、ＤＮＡシャッフリングに、遺伝
子発現の制御に関するポリヌクレオチドを供する工程を含む。少なくとも、制御
配列を含む第１および第２の形態の核酸（その形態は、２つ以上のヌクレオチド
が互いに異なる）を上記のように組換える。組換え転移モジュールの得られるラ
イブラリーをスクリーニングして、増強された強度、誘導性、または特異性を示
す少なくとも１つの最適化された組換え制御配列を同定する。
【０２１４】 組換えのための基質は、全長ベクターかまたはそのフラグメントであり得、そ
れらは、コード配列および／またはコード配列がそれらに作動可能に連結される
調節配列を含む。この基質は、ベクター中に存在する任意の調節配列および／ま
たはコード配列の改変体を含み得る。組換えがフラグメントのレベルでもたらさ
れる場合、その組換えセグメントを、スクリーニング前にベクターに再挿入すべ
きである。組換えがインビトロで生じる場合、その組換えセグメントを含むベク
ターを、通常スクリーニングの前に細胞に導入する。シャッフルされたプロモー
ターおよび他の調節領域のスクリーニングにおける使用に適切なベクターの例を
、図７に示す。
【０２１５】 組換えセグメントを含む細胞を、選択マーカーにコードされる遺伝子の発現を
検出することによりスクリーニングし得る。選択および／またはスクリーニング
の目的のために、ベクターから発現された遺伝子産物は、時々実際の治療目的を
有する産物（例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｃｒａｍｅｒｉ（１９９６）Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３１５〜３１９を参照のこと）または細
胞表面タンパク質）よりもむしろ容易に検出されるマーカーである。例えば、こ
のマーカーが緑色蛍光タンパク質である場合、最も高い発現レベルを有する細胞
を、フローサイトメトリーに基づくセルソーティングにより同定し得る。このマ
ーカーが細胞表面タンパク質である場合、細胞を、そのタンパク質に対する親和
性を有する試薬（例えば、抗体）で染色し、また、フローサイトメトリーに基づ
くセルソーティングにより分析する。しかし、治療目的を有するいくつかの遺伝
子（例えば、薬剤耐性遺伝子）は、それ自体が、選択マーカーを提供し、さらな
るマーカーまたは代替マーカーを必要としない。あるいは、その遺伝子産物が、
検出マーカーおよび選択マーカーの任意の組合せを含む融合タンパク質であり得
る。内部参照マーカー遺伝子を、コピー数または挿入部位における改変について
検出および補正するためにベクター上に含み得る。
【０２１６】 マーカー遺伝子の最も高い発現を示す細胞由来の組換えセグメントを、さらな
る改良を所望する場合に、さらなる回の組換えおよびスクリーニングにおいて、
いくつかのまたは全ての基質として使用し得る。
【０２１７】 （１．構成的プロモーター） 本発明は、制御配列に作動可能に連結された目的の遺伝子の構成的発現を検出
し得るヌクレオチド配列を進化させる方法を提供する。代表的には、制御配列（
プロモーター、エンハンサーなどを含み得る）を進化させて、その結果、目的の
遺伝子を、進化していない制御配列に作動可能に連結された遺伝子よりも高いレ
ベルで発現させる。増強した強度の制御配列を選別するために、制御配列の組換
えライブラリーを細胞集団に導入し、そしてこの制御配列に作動可能に連結した
検出可能なマーカーの発現レベルを決定し得る。好ましくは、最適化されたプロ
モーターは、作動可能に連結された遺伝子を、制御プロモーター構築物よりも少
なくとも約３０％大きいレベルで発現させ得、より好ましくは、最適化されたプ
ロモーターは、制御プロモーターよりも少なくとも約５０％強く、そして最も好
ましくは、制御プロモーターよりも少なくとも約７５％以上強い。
【０２１８】 本方法で基質として使用し得るプロモーターの例は、意図する宿主細胞におい
て機能する任意の構成的プロモーターを含む。主要な前初期（ＩＥ）領域転写調
節エレメント（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサ
ー配列（プロモーター／エンハンサー領域）を含む）が、遺伝子治療に使用され
るベクターにおける転写の調節に広く使用されている。なぜなら、このエレメン
トは、広範囲の細胞型において高度に活性があるからである。抗原の発現のレベ
ルの増加を指令する最適化されたＣＭＶ転写調節エレメントを、本発明の反復組
換え法により作製し、遺伝子治療の有効性の改善を生じる。ＣＭＶプロモーター
およびエンハンサーがヒト細胞および動物細胞において活性なので、改良型ＣＭ
Ｖプロモーター／エンハンサーエレメントを使用して、動物モデルおよび臨床的
適用の両方において外来遺伝子を発現させる。本願方法における使用に従う他の
構成的プロモーターには、例えば、ＳＶ４０およびＳＲα由来のプロモーター、
ならびに当業者に公知の他のプロモーターが挙げられる。
【０２１９】 好ましい実施態様において、キメラ転写調節エレメントのライブラリーを、Ｃ
ＭＶの５つの関連株のうち２つ以上由来の野生型配列のＤＮＡシャッフリングに
より作製する。ＩＥ領域のプロモーター、エンハンサー、および第１のイントロ
ン配列を、以下のＣＭＶ株からのＰＣＲにより入手する：ヒトＶＲ−５３８ Ａ
Ｄ１６９株（Ｒｏｗｅ（１９５６）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．９２：４１８）；ヒトＶ−９７７ Ｔｏｗｎｅ株（Ｐｌｏｔｋｉｎ（１９７
５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５２１〜５２７）；アカゲザルＶＲ
−６７７ ６８−１株（Ａｓｈｅｒ（１９６９）Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｐｒｏｃ
．２６９：９１）；ベルベットモンキーＶＲ−７０６ ＣＳＧ株（Ｂｌａｃｋ（
１９６３）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１１２：６０１）；
およびリスザルＶＲ−１３９８ ＳｑＳＨＶ株（Ｒａｎｇａｎ（１９８０）Ｌａ
ｂ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ．３０：５３２）。ヒトＣＭＶ株のプロモーター／エ
ンハンサー配列は９５％相同性であり、サルの単離物の配列と７０％相同性を共
有し、それにより、ファミリーシャッフリングの使用によりライブラリーに大き
な多様性を作製することが可能である。シャッフリングに続き、ライブラリーを
プラスミド骨格にクローニングし、哺乳動物細胞におけるマーカー遺伝子の転写
を指令するために使用する。ネイティブプロモーターの制御下の内部マーカーは
、代表的には、プラスミドベクター中に含まれ、これにより同数のベクターを保
有する細胞の分析および選別を可能にする。発現マーカー（例えば、緑色蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）およびＣＤ８６（Ｂ７．２としてもまた公知、Ｆｒｅｅｍａ
ｎ（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５、Ｃｈｅｎ（１９９４）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９２９参照のこと）もまた使用し得る。さらに
、ＳＶ４０ Ｔ抗原に形質転換された細胞のトランスフェクションを使用して、
ＳＶ４０の複製起点を含むベクターを増幅し得る。トランスフェクトされた細胞
を、ＦＡＣＳソーティングにより選別し、細胞当たりのベクターのコピー数の差
を考慮するための内部マーカーに対して標準化した、高レベルのマーカー遺伝子
を発現する細胞を同定する。所望ならば、最適の、反復性組換えプロモーターを
保有するベクターを回収し、そしてさらなるサイクルのシャッフリングおよび選
択に供する。
【０２２０】 （２．細胞特異的プロモーター） 遺伝子ワクチンに関連する安全性の心配の１つは、宿主細胞への外来抗原の導
入後の、自己免疫障害の可能性であった。この危険を、病原体抗原を、適切な同
時刺激性分子を発現する専門的ＡＰＣ中で特異的に発現させる場合に、減少させ
得る。どの細胞が遺伝子ワクチン接種後に病原体抗原を発現する最も重要な細胞
であるかは、多少検出可能であるが、専門的ＡＰＣは関係がありそうである。血
液単球が、遺伝子ワクチンベクターの筋肉内注射後に、抗原を発現し、そしてワ
クチン接種された動物のリンパ節由来の樹状細胞が、抗原特異的Ｔ細胞活性化を
効率的に誘導したことが示されている（Ｃ．Ｂｏｎａ、Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｇ
ｏｒｄｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＮＨ、Ｊｕｌｙ ２１、１９９７）。これらのデータは
、抗原または抗原性ペプチドを発現する少数の樹状細胞が抗原特異的Ｔ細胞の活
性化を誘導するのに十分であることを示す以前の研究（ＴｈｏｍａｓおよびＬｉ
ｐｓｋｙ、Ｓｔｅｒｍ Ｃｅｌｌｓ １４：１９６、１９９６）とともに、専門
的ＡＰＣにおいて特異的に発現される遺伝子ワクチン（例えば、樹状細胞および
マクロファージ）が、防御免疫の有効な誘導を提供し、有害な効果の機会を最少
にしそうであるという結論を支持する。
【０２２１】 本発明は、専門的ＡＰＣにおいて特異的に高発現レベルを誘導するプロモータ
ーおよびエンハンサーを得る方法を提供する。以前に存在したＡＰＣ特異的ベク
ターは、遺伝子ワクチン接種後に、十分な発現レベルを提供しなかった。本方法
は、ＡＰＣ特異的プロモーターまたは他の制御シグナルを含む異なる形態の核酸
を基質として使用して、上記のようにＤＮＡシャッフリングを行う工程を包含す
る。適切なプロモーターには、例えば、ＭＨＣクラスＩＩプロモーター、および
ＣＤ１１ｂプロモーター、ＣＤ１１ｃプロモーター、ならびにＣＤ４０プロモー
ターが挙げられる。プロモーターの本来の多様性を、ＤＮＡシャッフリングのた
めの基質の高度に適切な供給源として活用し得る。例えば、サル、ブタ，イヌ、
ウシ、ネコ、ウサギ、ラット、およびマウス由来のゲノムＤＮＡを入手し、そし
て公知の配列情報に基づく最も保存的領域に特異的な複数のＰＣＲプライマーを
使用して、適切な配列を入手し得る。適切なプロモーターの選択を、単球または
Ｂ細胞株（例えば、Ｕ９３７、ＨＬ６０、またはＪｉｊｏｙｅ）において、ＦＡ
ＣＳ選別を使用してなし得る。さらに、ＳＶ４０+細胞株（例えば、ＣＯＳ−１ およびＣＯＳ−７）を使用して、プラスミドの回収を改良し得る。さらなる分析
を、記載のようにＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で末梢血単球を培養する
ことにより得たヒト樹状細胞において行い得る（Ｃｈａｐｕｉｓら（１９９７）
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：４３１）。
【０２２２】 （３．誘導性プロモーター） 遺伝子ワクチンの特定の望ましい特性は、無害の経口薬物を摂取することによ
り簡単にプロモーターが制御するトランスジーン発現を誘導し、免疫応答のブー
ストを生じる能力である。誘導性プロモーターに基本的に必要なものは、低い基
底発現および強力な誘導能力である。強いインビトロ調節を有するいくつかのプ
ロモーターが存在するが、各々の発現レベルおよび誘導能力は、あまりにも低く
インビボで使用不可能である。本発明は、誘導性制御配列として機能する２つ以
上の核酸の改変体を基質として使用するＤＮＡシャッフリングによりこれらの問
題を克服する。安定な基質には、例えば、テトラサイクリンおよびホルモン誘導
性発現系などが挙げられる。遺伝子発現を調節するために使用されてきたホルモ
ンには、例えば、エストロゲン、タモキシフェン（ｔｏｍｏｘｉｆｅｎ）、トレ
ミフェンおよびエクジソンが挙げられる（ＲａｍｋｕｍａｒおよびＡｄｌｅｒ（
１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：５３６〜５４２）。組換え誘
導性プロモーターのライブラリーを、上記のように、インデューサーの存在下お
よび非存在下で選別する。
【０２２３】 最も一般的に使用される誘導性遺伝子発現プロトコルは、テトラサイクリン応
答性系であり、これは、遺伝子発現の誘導および停止の両方を行う可能性を提供
する（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７；Ｇｏｓｓｅｎら（１９９５）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６８：１７７６）。リプレッサー遺伝子が、プラスミド上に位置し
、そしてプロモーター中のオペレーターに結合する。テトラサイクリンまたはド
キシサイクリンは、リプレッサーの結合能力を調節する。興味深いことに、４つ
のアミノ酸変化により、リプレッサーがアクチベーターへと変換される。テトラ
サイクリン応答系に加えて、誘導性プロモーターの進化のための他の候補には、
エクジソン応答性エレメントが挙げられる（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３３４６、１９９７）。
【０２２４】 本発明の方法を使用して得られるプロモーターのような誘導性プロモーターは
、自動ブーストワクチンに有用である。特に、上記のように得られる安定に維持
されるエピソームベクターと組合せる場合、誘導性プロモーターは、ワクチン用
量を、誘導性プロモーターの誘導を引き起こす試薬の摂取により、簡単に最初の
投与に続けて投与し得る手段を提供する。図８は、誘導性プロモーターの最適化
に適切なフローサイトメトリーに基づくスクリーニングプロトコルを示す。
【０２２５】 自動ブーストワクチンの機能性を、上記のようなマウスモデルにおいて試験し
得る。遺伝子ワクチンベクターを、ＳＣＩＤ−ヒト皮膚マウスの正常マウスの皮
膚およびヒトの皮膚に注射する。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）または他の表
面抗原をコードする遺伝子を、産生される抗原のレベルの直接の測定を可能にす
るこれらのベクターに組み込む。なぜなら、ＨＢｓＡｇレベルを、細胞培養上清
中およびマウスの循環中で測定し得るからである。抗原の発現を誘導する薬物を
、１、２、４、および６週間後に与え、そしてＨＢｓＡの発現レベルを研究する
。さらに、抗ＨＢｓＡｇ抗体のレベルを測定する。このマウスにまた、ＥＬＩに
より発見される病原体抗原を含むベクターで注射し、続けて特異的免疫応答を行
う。 ＳＣＩＤ−ヒト皮膚モデルを従来のＳＣＩＤ−ヒトマウスモデル（Ｒｏｎ
ｃａｒｏｌｏら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２０７、１９９６）と組合
せることにより、インビボでのヒト免疫系における自動ブースト遺伝子ワクチン
の機能性を評価することが可能になり、そしてまた、インビボでのヒトＡｂ応答
の測定も可能になる。このモデルを使用して、ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子を
保有する新規な遺伝子ワクチンベクターの経口ブーストの後、ＨＢｓＡｇの産生
を評価し得る。
【０２２６】 （Ｃ．ワクチン接種効率の増加およびワクチン接種の容易さのための遺伝子ワ
クチンベクターの進化） 本節は、遺伝子ワクチン接種におけるいくつかの特定の目標への本発明の適用
を議論する。これらの目標の多くは、ワクチン送達に使用されるベクターにおけ
る改良に関する。他に指示されなければ、本方法は、ウイルスベクターおよび非
ウイルスベクターの両方に適用可能である。
【０２２７】 （１．遺伝子ワクチンベクターの局所適用） 本発明は、遺伝子ワクチンベクターが、このベクターの局所適用後に所望の応
答を誘導する能力を改良する方法を提供する。裸の皮膚に局所的に適用されるア
デノウイルスベクターが、ワクチン抗原送達ビヒクルとして作用し得ることが示
されている（Ｔａｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８：７２９〜７３０）
。癌胎児抗原（ＣＡ）をコードするアデノウイルスベクターが、皮膚への適用後
に、ＣＡに特異的な抗体を誘導することが示された。しかし、局所適用の効率は
、一般にかなり低い。そして、防御免疫応答は、局所適用後に示されていない。
【０２２８】 本発明は、局所的に適用された場合に、改良された効率を示すベクターを得る
方法を提供する。いくつかの因子が局所適用効率に影響し得、その各々を、本発
明の方法を使用して最適化し得る。例えば、本発明は、皮膚細胞に対するベクタ
ー親和性の改良方法、皮膚細胞トランスフェクション効率の改良、皮膚細胞にお
けるベクターの持続の改良（複製の改良、または免疫細胞による破壊の回避の両
方を通じて）、および皮膚細胞における抗原発現の改良、および免疫応答の誘導
の改良を提供する。
【０２２９】 本方法は、基質としてプラスミド、裸のＤＮＡベクターまたはウイルスベクタ
ー核酸（例えば、アデノウイルスベクターを含む）を使用してＤＮＡシャッフリ
ングを行う工程を含む。シャッフルされた核酸のライブラリーをスクリーニング
して、局所適用の際に免疫応答を誘導する能力の増強をベクターに付与する核酸
を同定する。スクリーニングを、例えば、シャッフルされたベクターのライブラ
リーの、皮膚（免疫欠損マウスへ移植されたマウスの皮膚、サルの皮膚、または
ヒトの皮膚のいずれか）あるいはインビボの正常なヒトの皮膚への局所適用によ
り行い得る。マーカー遺伝子の有効かつ長く続く発現を持続および／または提供
するベクターを、皮膚サンプルから回収する。好ましい実施態様において、所望
の細胞を、セルソーティング、磁気ビーズ、またはパニングにより最初に選択す
る。例えば、回収を、マーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の発現、およびトラン
スフェクトされた細胞の、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーを使用して
の検出を通じて果たし得る。マーカー遺伝子を発現する細胞を、フローサイトメ
トリーに基づくセルソーティングを使用して単離し得る。スクリーニングはまた
、試験哺乳動物への投与の際に最も特異性の高い抗体またはＣＴＬ応答を誘導す
るベクターの選択、または増強された防御免疫応答を提供して対応する病原体を
攻撃するベクターの同定を含む。次いで、シャッフルされたポリヌクレオチドを
、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により回収するか、またはベクター全体を、こ
れらの選択された細胞から精製し得る。所望ならば、局所適用効率のさらなる最
適化を、この回収したシャッフルされたポリヌクレオチドを新たな回のシャッフ
リングおよび選択に供することにより、得ることができる。
【０２３０】 局所適用に最適化された遺伝子ワクチンベクターを、皮膚へ、あるいは筋肉内
、静脈内、皮内、経口、肛門、または膣送達により、局所適用し得る。ベクター
を、当業者に公知の任意の適切な形態（例えば、パッチ、クリーム、裸のＤＮＡ
として、またはＤＮＡと１つ以上のトランスフェクション増強剤（例えば、リポ
ソームおよび／または脂質）との混合物として）で送達し得る。好ましい実施態
様において、例えば、機械的剥離、毛髪の除去（例えば、ＮａｉｒTM、Ｎｅｅｔ TM などの市販の製品での処置による）によって、皮膚または他の標的をベクター
の取り込みをより感受性にした後に、遺伝子ワクチンベクターを適用する。１つ
の実施態様において、皮膚を、プロテアーゼまたはリパーゼで前処理して、ＤＮ
Ａ送達に対してより感受性にする。さらに、このＤＮＡをプロテアーゼまたはリ
パーゼと混合して遺伝子転移を増強する。あるいは、ベクターおよび（もしある
とすれば）他のワクチン成分を含む小滴を、皮膚に簡単に投与し得る。
【０２３１】 （２．宿主免疫系から免れる能力の増強） 免疫原性は、ウイルスベクターに特有の問題である。なぜなら、宿主免疫応答
は、ウイルスがその意図された標的に到達するのを、特に反復投与において妨げ
得るからである。遺伝子ワクチン接種および遺伝子送達のために使用されるいく
つかのウイルスベクターの有効性は、そのウイルスベクターに対する宿主免疫応
答により制限される。例えば、ほとんどの個体は、アデノウイルスに対する先住
する抗体を有する。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターを保有
する細胞を破壊し得るか、またはアデノウイルスベクターを標的細胞に侵入する
前にすら宿主から除去し得る強力な免疫応答を時々誘導し得る。細胞免疫応答は
また、裸の形態で、またはリポソームのような被膜で覆われて投与される非ウイ
ルスベクターに対して誘導され得る。
【０２３２】 本発明は、そうしなければ所望の効果を得ることに有害となる、免疫応答から
逃れ得る遺伝子ワクチンベクターを作製する方法を提供する。本方法は、遺伝子
ワクチンベクターによる、病原体抗原または薬学的に有用なタンパク質の発現お
よび分泌を延長させるのに有用である。遺伝子ワクチンベクターが体液性（Ａｂ
）免疫応答および細胞性（ＣＴＬ）免疫応答を回避する能力を改良し得る、いく
つかのストラテジーを提供する。これらのストラテジーを組合せて使用し、高度
に免疫原性なベクター（例えば、アデノウイルス）に必要であり得るような最適
の回避を得ることができる。
【０２３３】 １つの実施態様において、本発明は、宿主のＣＴＬ免疫応答から逃れ得るウイ
ルスベクターを得る方法を提供する。本方法を、体液性応答を逃れ得る遺伝子ワ
クチンベクターを得る方法と組合せて使用し得る；アプローチの組合せはしばし
ば望ましい。なぜなら、異なるウイルスの血清型が、しばしば共通のＣＴＬエピ
トープを有しており、このことは、抗体に認識されないウイルス改変体が、なお
ＣＴＬにより認識される可能性があることを示唆するからである。本発明のこの
実施態様は、遺伝子ワクチンに、ペプチド輸送および／またはＭＨＣクラスＩ発
現を阻害する１つ以上の成分を組み込む工程を含む。細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃ
ＴＬ）応答の活性化に必須の要素は、ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターと抗原提示細
胞上の抗原性ペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子複合体との間の相互作用である。胸
腺細胞および抗原提示細胞上でのＭＨＣクラスＩ分子の発現は、抗原特異的ＣＤ
８+Ｔリンパ球の変異および活性化のための必要条件である。従って、ＭＨＣク ラスＩ媒介抗原提示のインヒビターをコードする遺伝子を、本明細書中に記載の
ようにシャッフルし、そしてウイルスベクター中に配置して、標的細胞中で存在
する場合に、免疫系の細胞による標的細胞の破壊を誘導しないベクターを入手し
得る。これにより、遺伝子ワクチンベクター（病原体抗原を発現するものを含む
）、および薬学的に有用なタンパク質を発現するベクターを保有する細胞の生存
を延長し得る。遺伝子ワクチンの場合において、ＭＨＣクラスＩ分子の発現の減
少により、病原体抗原の分泌が可能になり、これは、次いで、専門的抗原提示細
胞に他の場所で提示される。薬学的タンパク質をコードするベクターの場合、Ｍ
ＨＣクラスＩ分子の発現の減少により、免疫系による認識が妨げられ、この遺伝
子を発現する細胞の生存が延長される。
【０２３４】 ＭＨＣクラスＩ分子発現および抗原提示に関するタンパク質の中に、ＴＡＰ遺
伝子にコードされるタンパク質（抗原プロセシングに関するトランスポーター）
が存在し、以上に記載されている。本発明の１つの実施態様において、ＴＡＰ活
性のインヒビターをコードする遺伝子をシャッフルして、最適化されたＴＡＰイ
ンヒビターをコードする遺伝子を得る。これらの方法のための基質には、例えば
、ＭＨＣクラスＩ分子の発現レベルを調節することが公知の１つ以上のウイルス
遺伝子が挙げられ得る。ＴＡＰ１遺伝子発現およびＴＡＰ２遺伝子発現は、アデ
ノウイルス１２に形質転換された細胞において、それぞれ５〜１０倍および１０
０倍減少する。これによりクラスＩ発現の減少が生じ、これによりウイルス特異
的細胞傷害性Ｔリンパ球応答の減少が導かれる。同様に、ＴＡＰ遺伝子発現は、
ＨＰＶ−１６+頚部癌の４９％において下方調節される（Ｓｅｌｉｇｅｒら（１ ９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２９２）。従って、アデノウイル
スおよびＨＰＶウイルスの核酸は、本発明の方法を実行するために適切な基質の
例を提供する。本発明のこの実施態様に適切なＤＮＡシャッフリング基質のさら
なる例には、遺伝子ＵＳ２、ＵＳ３、およびＵＳ１１にコードされるヒトサイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられ、これはＭＨＣクラスＩ発現を下方調節し
得る（Ｗｉｅｒｔｚら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：４３２およびＣｅｌ
ｌ（１９９６）８４：７６９；Ａｈｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０９９０）。ＴＡＰ依存性ペプチドトランス
ロケーションのインヒビターをコードする別のヒトＣＭＶ遺伝子は、ＵＳ６であ
る（Ｌｅｈｎｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９４：６９０４〜９）。ＵＳ６でトランスフェクトされた細胞は、その表
面上でのＭＨＣクラスＩ分子の発現の減少、および細胞傷害性Ｔリンパ球を活性
化する能力の減少を有した。従って、１つの実施態様において、本発明は、ＭＨ
ＣクラスＩ分子の発現の阻害において最も強力な配列を同定するための、この遺
伝子クラスター（約７ｋｂ）の、またはそのフラグメントのＤＮＡシャッフリン
グを含む。このような最適化されたＴＡＰインヒビターポリヌクレオチド配列は
、ＣＴＬ免疫応答から逃れ得るベクターの構築における使用のためだけではなく
、通常は、その免疫原性のために実験室動物において除去されるヒトウイルスを
用いての使用のための動物モデルの作製のためにも有用である。ＴＡＰインヒビ
ターの所望の発現レベルおよび機能的特性は、遺伝子ワクチンベクター、遺伝子
治療ベクター、または動物モデルが進化されるかどうかに依存して変化し得る。
【０２３５】 本発明の代替的実施態様には、ＭＨＣクラスＩ分子の発現の下方調節および／
または抗原提示に関する他の遺伝子のＤＮＡシャッフリングを含む。他の可能な
標的遺伝子の例には、アデノウイルスＥ３タンパク質、単純ヘルペスＩＣＰ４７
タンパク質およびタパシンアンタゴニストをコードする遺伝子が挙げられる（Ｓ
ｅｌｉｇｅｒら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２９２〜２９
９；Ｇａｌｏｎｃｈａら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１５６５〜
１５７２；Ｌｉら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９４：８７０８〜８７１３；Ｏｒｔｍａｎｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１３０６〜１３０９）。
【０２３６】 細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子の発現の減少は、ＮＫ細胞の刺激物として
作用し得るので、ＮＫ細胞機能を阻害するがＴリンパ球に抗原を提示し得ないＭ
ＨＣ様分子をコードする遺伝子を遺伝子ワクチンベクター中に含むことは、有用
であり得る。このような分子の例は、サイトメガロウイルスにコードされるＭＨ
ＣクラスＩホモログである（Ｆａｒｒｅｌｌら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８
６：５１０〜５１４）。
【０２３７】 本発明はまた、ＣＤ４+Ｔリンパ球による攻撃を避ける能力の増強を示すウイ ルスベクターを得る方法を提供する。このようなベクターは、標的細胞がＭＨＣ
クラスＩＩ分子を発現し得る状況（例えば、免疫系の細胞に標的化されたワクチ
ン接種および遺伝子治療の場合において）で特に有用である。ＤＮＡシャッフリ
ングのための基質には、ＭＨＣクラスＩＩ分子のインヒビター（例えば、ＩＬ−
１０、およびＩＦＮ−γのアンタゴニスト（例えば、可溶性ＩＮＦ−γレセプタ
ー））をコードする遺伝子が挙げられる。
【０２３８】 宿主免疫系から逃れる最も優れた能力を有するベクターは、代表的には、ＭＨ
ＣクラスＩ発現およびＭＨＣクラスＩＩ発現の阻害を生じるＤＮＡ配列、ならび
にＭＨＣクラスＩ分子のホモログをコードするさらなる配列が挙げられる。これ
ら全ての特性を、本発明の方法に従うＤＮＡシャッフリングによりさらに改良し
得る。
【０２３９】 一旦、シャッフルされたＤＮＡ分子のライブラリーを得ると、ウイルスベクタ
ー中（または動物モデル中）に存在する場合に宿主免疫応答に対する所望の効果
を示すポリヌクレオチドを、ライブラリーをスクリーニングして同定するために
、任意のいくつかの方法が利用可能である。例えば、ＭＨＣクラスＩ発現および
／または抗原提示を阻害するシャッフルされたポリヌクレオチドを得るために、
シャッフルされた遺伝子のライブラリーを遺伝子ワクチンまたは遺伝子治療ベク
ターに組み込み、そしてヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ｕ９３７、またはＪｉ
ｊｏｙｅ）に、１回の試験管トランスフェクションでトランスフェクトし得る。
初代ヒト単球、またはヒト臍帯血球または単球をＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの
存在下で培養することにより生成された樹状細胞もまた、適切である。最初のス
クリーニングを、ＦＡＣＳソーティングを使用して行い得る。最も低いレベルの
ＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞を選択し、ＭＨＣインヒビターをコードする
ポリヌクレオチド、またはこの配列を含むプラスミド全体を回収する。所望なら
ば、選択した配列を、新しい回のシャッフリングおよび選択に供し得る。最も低
いレベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞は、ＣＴＬ応答を誘導する能力が
最も低いと予期される。
【０２４０】 別のスクリーニング方法は、ＭＨＣクラスＩ発現のインヒビターをコードする
シャッフルされたポリヌクレオチドのライブラリーをヒトパピローマウイルス（
ＨＰＶ）ベクターに組み込む工程を含む。このライブラリーを、マウスの皮膚に
注射する。通常、ＨＰＶを発現するマウス細胞は、宿主免疫系に破壊される。し
かし、ペプチドトランスポーテーションおよび／またはＭＨＣクラス発現の強力
なインヒビターを発現する細胞は、この免疫応答から逃れ得る。延長された時間
、ベクター上に存在するマーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を発現する細胞を選
択し、その配列またはプラスミド全体を回収し、そしてさらなる最適化を所望す
るならば、選択した配列を新しい回のシャッフリングおよび選択に供する。マウ
スにおけるＨＰＶの長く続く持続により、マウスにおけるＨＰＶの高度な免疫原
性が原因で今日まで不可能であった薬物スクリーニングおよびワクチン研究が可
能になる。
【０２４１】 別の実施態様において、ＭＨＣクラスＩ発現のインヒビターをコードするシャ
ッフルされたポリヌクレオチドのライブラリーを、ヒトアデノウイルスベクター
に組み込む。このライブラリーを、ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞）にトラ
ンスフェクトし、そして最も低いレベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞を
、上記のように選択する。最も低いレベルのＭＨＣクラスＩ発現を提供する配列
を、進化されたＭＨＣクラスＩ発現のインヒビターを保有するアデノウイルスで
トランスフェクトされた抗原提示細胞が、特異的Ｔ細胞株またはクローンを活性
化する能力を分析することによりさらに試験する。これらのインヒビターは、免
疫原性ペプチドの有効な提示をブロックし、従って、抗原特異的ＣＴＬの活性化
を強力に下方調節して、インビボでの長く続くトランスジーン発現を可能にする
。
【０２４２】 ＭＨＣクラスＩＩ発現の改良されたインヒビターについてスクリーニングする
ための方法は、蛍光標識特異的モノクローナル抗体、蛍光顕微鏡法、およびフロ
ーサイトメトリーによる、標的細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子の検出を含
む。さらに、このインヒビターを、このインヒビターがＭＨＣクラスＩＩ拘束さ
れた抗原特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球の活性化をブロックする能力を研究すること により、機能的アッセイにおいて分析し得る。例えば、このインヒビターが、Ｍ
ＨＣクラスＩＩインヒビターをコードする遺伝子を保有するか、またはこのイン
ヒビターを含む上清で処理された自己抗原提示細胞（例えば、単球、樹状細胞、
Ｂ細胞、またはＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株）に誘導されたＣＤ４+Ｔ細胞 増殖の誘導を阻害する能力を決定し得る。
【０２４３】 （３．抗ウイルス活性の増強） 本発明はまた、細胞において抗ウイルス応答を誘導する増強された能力を有す
る組換えウイルスベクターを得る方法を提供する。ＤＮＡシャッフリングを使用
して、組換えウイルスベクターのライブラリーを作製する。このライブラリーを
、哺乳動物細胞の集団にトランスフェクトし、次いで、抗ウイルス応答を誘導す
る能力について試験する。１つの適切な試験は、抗ウイルス応答を示している細
胞により産生されるＭｘタンパク質の存在について細胞を染色する工程を含む（
例えば、Ｈａｌｌｉｍｅｎら（１９９７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ４１：６４７〜６５０；Ｍｅｌｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６９：２００９〜２０１５を参照のこと）。組換えウイルスベクターを、Ｍ
ｘタンパク質について陽性を染色する細胞から単離し得る。陽性染色細胞由来の
これらの組換えウイルスベクターを、抗ウイルス応答を誘導する増強された能力
を示すベクターについて濃縮する。この方法が有用なウイルスベクターは、例え
ば、インフルエンザウイルスを含む。
【０２４４】 （４．産生細胞において増加されたコピー数を有するベクターの進化） 本発明は、遺伝子ワクチンベクター（例えば、プラスミド）に存在する場合に
、ベクターを生成するために使用される細胞中で高コピー数に複製する能力を有
するベクター成分を得る方法を提供する。プラスミドは、種々の異種ＤＮＡ配列
を組み込み得るが、しかし、所定のプラスミドベクター中のクローン化配列のサ
イズおよび性質は、そのベクターが増殖される細菌において、そのベクターがよ
り高コピー数に増殖できなくし得る。従って、すべてのエレメントをベクター中
にクローン化した後は、プラスミドコピー数を増加させる方法を有することが望
ましい。これは、そのプラスミドを大スケールで生成すべき場合に、遺伝子ワク
チンに関する場合と同様に特に重要である。
【０２４５】 本発明の方法は、このプラスミド中に、そうしなければその細菌に毒性である
タンパク質に結合する１つ以上のポリヌクレオチド配列を組み込む工程を含む。
１つの適切な毒性部分および結合部位の組合せは、転写因子ＧＡＴＡ−１および
その認識部位である。ＧＡＴＡ−１のＤＮＡ結合フラグメントの発現が細菌に毒
性であり；この毒性は、明らかに細菌性ＤＮＡ複製の阻害から生じることが示さ
れた。Ｔｒｕｄｅｌら（（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０：６８
４〜６９３）は、ＧＡＴＡ−１のＺ２Ｂ２領域をＧＳＴ融合タンパク質として発
現するプラスミド（ｐＧＡＴＡ）を記載している。このプラスミドにおけるこの
融合タンパク質の発現は、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下である。
ＧＳＴ−ＧＡＴＡ−１フラグメントはまた、マウスβ−グロビン遺伝子プロモー
ター由来の配列、およびβ−グロビン遺伝子３’エンハンサー由来のＣ−オリゴ
ヌクレオチドに強力に結合する。これらのいずれか、または両方ともが、本発明
の方法における結合部位としての使用に適切である。
【０２４６】 このプラスミドは、好ましくは、選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性（
アミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．１．９５）
）など）も含む。このプラスミドバックボーンポリヌクレオチド配列を、本明細
書に記載のようにＤＮＡシャッフリングに供し、異なるバックボーン配列および
おそらく異なるスーパーコイル密度を有するプラスミドのライブラリーを作製す
る。改良された機能を探索するのに十分な配列多様性を導入するために、ファミ
リーＤＮＡシャッフリングを実行することが好ましい。これを、シャッフリング
反応中にたった１つの形態の選択マーカーを含むことにより、本発明の状況にお
いて達成し得る。この方法で、有意な多様性をシャッフルされたライブラリー中
で達成し、その増殖特性が改良され、一方でそのプラスミドの適切な選択機能を
完全に保持するプラスミドを回収し得る。
【０２４７】 高コピー数プラスミドに関する選択を、このシャッフルされた組換えプラスミ
ドのライブラリーを所望の宿主細胞中に導入することにより実行する。この宿主
細胞はまた、毒性部分を、好ましくは誘導性であるプロモーターの制御下で発現
する。例えば、ｐＧＡＴＡプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における使用に
適切である。シャッフルされたプラスミドを、非誘導性条件下で細胞中に導入す
る。次いで、形質転換された細胞を、毒性部分の発現を誘導する条件下に置く。
例えば、ｐＧＡＴＡを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、漸増する濃度のＩＰＴＧを含む
培地上に配置し得る。細菌中で高コピー数に増殖する標的プラスミドは、ＧＡＴ
Ａ−１に関する結合配列のより高い数に対応して発現する。標的プラスミドは、
ＧＳＴ−ＧＡＴＡ−１融合タンパク質に結合し、これによりこの細菌に対する毒
性を中和する。
【０２４８】 最も高コピー数のプラスミドを、インデューサー含有増殖培地上の細菌に最も
良好な増殖を付与するプラスミドとして検出する。このようなプラスミドを回収
し、そして毒性部分をコードする遺伝子を欠く細菌中に形質転換する；これらの
プラスミドは、その高コピー数特徴を保持するはずである。さらなる回のシャッ
フリングを使用して、上記の選択手順により、高コピー数プラスミドを単離し得
る。あるいは、選択した細菌性宿主において手動でスクリーニングを行い、毒性
部分をコードするプラスミドを欠失させ、この外来プラスミドの存在に起因する
いかなる効果をも回避し得る。
【０２４９】 （ＶＩ．遺伝子ワクチン薬学的組成物および投与方法） 本発明のベクター成分および多成分遺伝子ワクチンは、種々の疾患および他の
状態を処置および／または予防するために有用である。例えば、本発明の方法に
従って得られる試薬を使用する遺伝子ワクチンは、感染性疾患（任意の細菌、真
菌、ウイルス、または哺乳動物の他の病原体により引き起こされるものを含む）
の予防および治療の両方において有用である。本発明を使用して得られる試薬を
、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、真性糖尿病、重症筋無力
症、反応性関節炎、強直性脊椎炎、および多発性硬化症を含む）の処置にもまた
使用し得る。これらおよび他の炎症性状態（ＩＢＤ、乾癬、膵臓炎、および種々
の免疫欠損を含む）を、本発明の方法を使用して得られるベクターおよび他の成
分を含む遺伝子ワクチンを使用して処置し得る。本発明の方法を使用して得られ
る遺伝子ワクチンベクターおよび他の試薬を使用して、アレルギーおよび喘息を
処置し得る。さらに、遺伝子ワクチンの使用は、癌の処置および転移の予防につ
いて大いに有望である。癌性細胞に対する免疫応答を誘導することにより、身体
の免疫系を協力させて癌を減少または除去し得る。
【０２５０】 現在の好ましい実施態様において、最適化された遺伝子ワクチン成分を、他の
最適化された遺伝子ワクチン薬剤と組合せて使用する。例えば、特定の状態に有
用な抗原を、本明細書中に記載される組換え方法およびスクリーニング方法と類
似の方法により最適化し得る（同時継続中の、同一人に譲渡された米国特許出願
シリアル番号第 号、題「Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｉｍｍｕｎｉｚａ
ｔｉｏｎ」（１９９９年２月１０日にＴＴＣ代理人整理番号第１８０９７−０２
８７１０ＵＳとして出願された）を参照のこと）。組換え抗原性ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、プロモーター（例えば、高活性プロモーターま
たは組織特異的プロモーター）の制御下に配置し得る。抗原性ポリペプチドを発
現するために使用されるプロモーター自体を、本明細書中に記載されるものに類
似の組換え方法および選択方法を使用して最適化し得る。ベクターは、免疫刺激
性配列（例えば、同時継続中の、同一人に譲渡された米国特許出願シリアル番号
第 号、題「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏ
ｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（１９９９年２月１０日にＴＴＣ代理人整理番号第
１８０９７−０３０３００ＵＳとして出願された）に記載されるような）を含み
得る。特定の標的細胞型（例えば、抗原提示細胞または抗原プロセシング細胞）
に標的化された遺伝子ワクチンを使用することは、時々有利である；適切な標的
化方法が、同時継続中の、同一人に譲渡された米国特許出願シリアル番号第 号
、題「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ」（１９９９年２月１０日にＴＴＣ代理人整理番号第１８０９７−０３０
２００ＵＳとして出願された）に記載される。
【０２５１】 遺伝子ワクチン（本明細書中に記載される多成分遺伝子ワクチンを含む）を哺
乳動物（ヒトを含む）に送達して、治療的または予防的免疫応答を誘導し得る。
ワクチン送達ビヒクルを、代表的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉
内、皮下、頭蓋内、肛門、膣内、経口、経頬経路か、またはワクチン送達ビヒク
ルを吸入し得る）によって個々の患者に投与することにより、インビボで送達し
得る。または、ワクチン送達ビヒクルを局所適用により投与し得る。あるいは、
ベクターをエキソビボの細胞（例えば、個々の患者から体外移植された細胞（例
えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検材料）または一般的なドナーの造血幹細
胞に送達し、続いて、通常、ベクターを組み込まれた細胞について選択した後、
患者中に細胞を再移植し得る。
【０２５２】 大多数の送達方法が、当業者に周知である。このような方法には、例えば、以
下が挙げられる：リポソームに基づく遺伝子送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９
９３）ＷＯ ９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒ
ｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２〜６９１；
Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３〜７４１４）、ならびにウイルス
ベクターの使用（例えば、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｎｓら（１９９５）
Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５〜１０４；Ａｌｉら（１９９４
）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３６７〜３８４；およびＨａｄｄａｄａら（１９９
５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９（第３部
）：２９７〜３０６を総評について参照のこと）、パピローマウイルス、レトロ
ウイルス（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（
５）２７３１〜２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（
５）：１６３５〜１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）
Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８〜５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．６３：２３７４〜２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２
０〜２２２４（１９９１）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５
７００、ならびにＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｐ
ａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ中のＲｏｓｅ
ｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３）ならびにその中の参考文献、ならびに
Ｙｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）前出を参照のこと）、およびア
デノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０
：３８〜４７；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９）米国特許第４，７９７，３６８号；
Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ ９３／２４６４１（１９９３）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４
）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１；Ｍｕｚｙｃｚ
ｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９４：１３５１およびＳａｍｕｌ
ｓｋｉ（前出）をＡＡＶベクターについての概要のために参照のこと；また、Ｌ
ｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（
１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：３２５１〜３２６０；Ｔ
ｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜
２０８１；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６〜６４７０；ＭｃＬａｕｇ
ｈｌｉｎら（１９８８）ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６３：３８２２〜３８２８）も参照のこと）など。
【０２５３】 遺伝子ワクチンを含む「裸の」ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、組織（例えば 、筋肉）に直接導入し得る（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照の
こと）。他の方法（例えば、「微粒子銃」すなわち粒子媒介型形質転換（例えば
、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００
６号を参照のこと）もまた、本発明に従っての哺乳動物細胞への遺伝子ワクチン
の導入に適切である。これらの方法は、哺乳動物へのインビボのＤＮＡ導入のた
めだけではなく、哺乳動物への再導入のための細胞のエキソビボ改変のためにも
有用である。遺伝子ワクチンを送達する他の方法に関して、必要があれば、ワク
チン投与を、所望のレベルの免疫調節を維持するために反復する。
【０２５４】 遺伝子ワクチンベクター（例えば、アデノウイルス、リポソーム、パピローマ
ウイルス、レトロウイルスなど）を、インビボでの細胞の形質導入のために、哺
乳動物に直接投与し得る。本発明の方法を使用して得られる遺伝子ワクチンを、
予防的および／または治療的処置のために、任意の適切な様式（非経口（例えば
、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）、局所、経口、直腸、鞘内、経頬（例え
ば、舌下）、または局所投与（例えば、エアロゾルによる、すなわち経皮的）を
含む）で投与するための薬学的組成物として処方し得る。皮膚の前処理（例えば
、脱毛剤の使用による）が、経皮送達に有用であり得る。このようなパッケージ
された核酸の投与の適切な方法が、利用可能であり、そして当業者に周知である
。１つより多い経路を使用して特定の組成物を投与し得るが、特定の経路が、し
ばしば別の経路よりも早くかつより有効な反応を提供し得る。
【０２５５】 薬学的に受容可能なキャリアを、投与される特定の組成物により、ならびにそ
の組成物を投与するために使用される特定の方法により、部分的に決定する。従
って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する。種々の水
性キャリア（例えば、緩衝化生理食塩水など）を使用し得る。これらの溶液は滅
菌してあり、そして一般的に望まない物質を含まない。これらの組成物を、従来
の、周知の滅菌技術により滅菌し得る。この組成物は、ほぼ生理的な条件に必要
とされる、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などのような薬学的に受容可能
な補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含み得る。これらの処方物中の遺伝子ワクチ
ンベクターの濃度は、広く変化し得、そして主に流体の容積、粘度、体重などに
基づいて、選択された特定の投与様式および患者の必要性に従って選択される。
【０２５６】 経口投与に適切な処方物は、以下からなり得る：（ａ）液体溶液（例えば、希
釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００）に懸濁された有効量のパ
ッケージされた核酸）；（ｂ）カプセル、小さい袋、または錠剤（各々、予定量
の活性成分を、液体、個体、顆粒、またはゼラチンとして含む）；（ｃ）適切な
液体中の懸濁物；および（ｄ）適切な乳濁液。錠剤形態には、以下の１つ以上が
挙げられ得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸
カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トラガカント、微結晶性セ
ルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロース
ナトリウム（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ ｓｏｄｉｕｍ）、タルク、ステア
リン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）
、着色料、賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤
、香料、色素、崩壊剤、および薬学的に適合可能なキャリア。口内錠形態には、
香料中の活性成分（通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）、な
らびに不活性塩基中の活性成分を含む錠剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン
またはスクロースおよびアカシア乳濁液）、ゲル、およびさらに活性成分を含む
同様のもの、当該分野で公知のキャリアが挙げられ得る。遺伝子ワクチンを、経
口投与する場合には、消化から保護しなければならないことが認識される。この
ことは、代表的に、ワクチンベクターを組成物と複合化して酸および酵素的加水
分解に抵抗性にすることか、またはベクターを適切に抵抗性キャリア（例えば、
リポソーム）でパッケージングすることのいずれかにより、達成される。ベクタ
ーを消化から保護する手段は、当該分野で周知である。薬学的組成物を、例えば
、リポソーム、または活性成分の遅い放出を提供する処方物中にカプセル化し得
る。
【０２５７】 パッケージ化された核酸を、単独で、または他の適切な成分と組合せて、エア
ロゾル処方物中（例えば、これらを「噴霧」し得る）に作製して、吸入を介して
投与し得る。エアロゾル処方物を、加圧された受容可能な推進剤（例えば、ジク
ロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置し得る。
【０２５８】 直腸投与に適切な処方物には、例えば、座剤基剤を有するパッケージ化された
核酸からなる座剤が挙げられる。適切な座剤基剤には、天然のトリグリセリドま
たは合成トリグリセリドあるいはパラフィン炭化水素が挙げられる。さらに、基
剤（例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリセロール、およびパラフィ
ン炭化水素を含む）とのパッケージ化された核酸の組合せからなるゼラチン直腸
カプセルを使用することも可能である。
【０２５９】 非経口投与（例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、お
よび皮下経路）に適切な処方物には、水性および非水性の、等張性滅菌注射溶液
が挙げられ、これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、ならびに処方物を意図される
レシピエントの血液と等張性にする溶質、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁
液（懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る）が挙げられ得
る。本発明の実施において、例えば、静脈注入、経口、局所、腹腔内、網膜内、
または鞘内に、組成物を投与し得る。非経口投与および静脈内投与が、本発明の
好ましい方法である。パッケージ化された核酸の処方物を、単位用量または多用
量のシールされた容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中に提示し得る。
【０２６０】 注射溶液および懸濁液を、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠
剤から調製し得る。パッケージ化された核酸により形質導入された細胞もまた、
静脈内かまたは非経口投与し得る。
【０２６１】 患者に投与される用量は、本発明の文脈においては、期間にわたって患者中で
有益な治療的応答をもたらすのに十分であるべきである。用量を、使用する特定
のベクターの効率、および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または血
管の表面面積により決定する。用量の大きさを、特定のベクターの投与に伴う任
意の有害な副作用の存在、性質、および程度、または特定の患者中で誘導される
細胞型によっても、決定する。
【０２６２】 感染状態または他の状態の処置あるいは予防において投与されるベクターの有
効量を決定する際、医師は、ベクターの毒性、疾患の進行、および抗ベクター抗
体の生成（もしあれば）を評価する。一般に、ベクター由来の裸の核酸と等価の
用量は、代表的な７０ｋｇの患者に対して約１μｇ〜１ｍｇであり、核酸を送達
するために使用されるベクターの用量を計算して、治療用核酸の同等量を得る。
投与を、単回用量または分割した用量により達成し得る。
【０２６３】 治療的適用において、組成物を疾患（例えば、感染性疾患または自己免疫障害
）に罹患している患者に、その疾患およびその合併症を治癒、または少なくとも
部分的に阻止するのに十分な量で投与する。これを達成するのに十分な量を、「
治療的に有効な用量」と規定する。この使用に有効な量は、疾患の重篤度および
患者の健康の全身状態に依存する。この組成物の単回または複数回投与を、患者
に必要とされ、かつ許容される用量および頻度に依存して投与し得る。任意の事
象において、この組成物は、十分な量の本発明のタンパク質を提供して患者を有
効に処置するはずである。
【０２６４】 予防的適用において、組成物をヒトまたは他の哺乳動物に投与して、感染性疾
患または他の状態の確立に対する保護を助け得る免疫応答を誘導する。
【０２６５】 本発明により提供される遺伝子ワクチンベクターの毒性および治療的有効性を
、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順を使用して決定する。
ＬＤ50（集団の５０％に対して致死性の用量）およびＥＤ50（集団の５０％にお
おいて治療的に有効な用量）を、本明細書中に提示される手順および当業者に公
知の他の方法を使用して決定し得る。
【０２６６】 静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、１患者１日につき約０．１〜１
０ｍｇである。１患者１日につき、０．１〜約１００ｍｇまでの用量を、特に、
薬物を体腔中または器官の内腔中のような、隔離された部位に投与し、血流には
投与しない。実質的により高い容量が、局所投与に際して可能である。非経口投
与可能な組成物を調製する実際の方法が、当業者に公知であるか、または明らか
であり、そして、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、
Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）のような刊行物に、より
詳細に記載されている。
【０２６７】 本発明の方法を使用して得られる遺伝子ワクチンを、遺伝子ワクチンを哺乳動
物に投与するためのパック、ディスペンサーデバイス、およびキットにパッケー
ジングし得る。例えば、１単位以上の用量形態を含むパックまたはディスペンサ
ーデバイスを提供する。代表的には、化合物の投与のための指示を、その化合物
が表示された状態の処置に適切であるというラベル上の適切な表示とともに、パ
ケージに提供する。例えば、ラベルは、パッケージ中の活性化合物が特定の感染
性疾患、自己免疫障害、腫瘍を処置するのに有用であるか、あるいは哺乳動物の
免疫応答に媒介されるかまたは潜在的に感受性である他の疾患もしくは状態を、
予防または処置するのに有用であることを提示し得る。
【０２６８】 （ＶＩＩ．遺伝子ワクチンの使用） 本発明により提供される最適化されたベクターモジュールおよび他の試薬を含
む遺伝子ワクチンは、哺乳動物の免疫系により媒介されるか、または適切な免疫
応答による処置に感受性であるかのいずれかである、多くの疾患および他の状態
を処置するのに有用である。これらの疾患の代表的例を以下に列挙する；各々に
適切な抗原が、同時継続中の、同一人に譲渡された米国特許出願シリアル番号第 号（１９９９年２月１０日にＴＴＣ代理人整理番号１８０９７−０２８７１０
ＵＳとして出願）に記載されている。
【０２６９】 （Ａ．感染性疾患） 本発明の方法に従って得られる遺伝子ワクチンベクターは、感染性疾患（任意
の細菌、真菌、ウイルス、または哺乳動物の他の病原体により引き起こされるも
のを含む）の予防および治療の両方において有用である。いくつかの実施態様に
おいて、保護を、目的の病原体の抗原（体液性抗原またはＴ細胞抗原のいずれか
、あるいは両方）を発現する遺伝子ワクチンベクターの使用により付与する。好
ましい実施態様において、この抗原を、本明細書中に記載されるような最適化さ
れた抗原を得るために、本発明の方法を使用して進化させる。ベクターは、この
抗原に対する免疫応答を誘導する。１つまたはいくつかの抗原あるいは抗原フラ
グメントを、１つの遺伝子ワクチン送達ビヒクル中に含み得る。抗原を得ること
ができる病原体および対応するポリペプチドの例には、ＨＩＶ（ｇｐ１２０、ｇ
ｐ１６０）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎（表面抗原）、狂犬病（
糖タンパク質）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ（カルパイン；Ｊａ
ｎｋｏｖｉｃ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８０６〜１４）が挙げ
られるが、これらに限定されない。遺伝子ワクチンベクターを使用して処置可能
な他の病原体感染には、例えば以下が挙げられる：帯状ヘルペス、単純ヘルペス
（１型および２型）、結核（慢性的、薬物耐性を含む）、ライム病（Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ ｂｕｒｇｏｒｆｅｒｉｉ）、梅毒、パルボウイルス、狂犬病、ヒトパピ
ローマウイルスなど。
【０２７０】 （Ｂ．炎症性疾患および自己免疫疾患） 自己免疫疾患を、自分自身の身体の組織または細胞を攻撃する免疫応答、ある
いは自分自身の組織または細胞に有害でもある病原体特異的免疫応答、あるいは
自分自身の組織または細胞に有害である非特異的免疫活性化により特徴付ける。
自己免疫疾患の例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性関節
リウマチ、ＳＬＥ、真性糖尿病、重症筋無力症、反応性関節炎、強直性脊椎炎、
および多発性硬化症。これらおよび他の炎症性状態（ＩＢＤ、乾癬、膵臓炎、お
よび種々の免疫欠損を含む）を、本発明の方法を使用して得られるベクターおよ
び他の成分を含む遺伝子ワクチンを使用して処置し得る。
【０２７１】 これらの状態を、しばしば、炎症性細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ
、および好中球）の、炎症部位での蓄積により特徴付ける。サイトカイン生成レ
ベルの変化が、しばしば観察され、サイトカイン生成のレベルが増加する。いく
つかの自己免疫疾患（糖尿病および慢性関節リウマチを含む）は、特定のＭＨＣ
ハプロタイプに関連付けられる。他の自己免疫型障害（例えば、反応性関節炎）
は、細菌（例えば、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＳｈｉｇｅｌｌａ）により誘発され
ることが示されている。そして証拠は、他のいくつかの自己免疫疾患（例えば、
糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ）が、遺伝学的に感受性の個体におい
て、ウイルス感染または細菌感染により開始され得ることを示唆する。
【０２７２】 現在の処置のストラテジーには、一般に、抗炎症性薬物（例えば、ＮＳＡＩＤ
またはシクロスポリン）および抗増殖性薬物（例えば、メトトレキサート）が挙
げられる。これらの療法は非特異的であり、その結果、より強い特異性を有する
療法に関する必要性、および自己免疫プロセスを阻害する方向への免疫応答を指
向する手段に関する必要性が存在する。
【０２７３】 本発明は、これらの必要性を満たし得るいくつかのストラテジーを提供する。
第１に、本発明は、免疫寛容を生じる抗原の改良された送達を示すワクチン、改
良された抗原性を有する抗原、遺伝子ワクチン媒介性寛容、および適切な補助分
子を含むことによる免疫応答の調節を得る方法を提供する。好ましい実施態様に
おいて、本発明に従って調製されるワクチンは、経口送達による寛容の改良され
た誘導を示す。経口寛容は、大量の抗原の経口投与後の、免疫学的寛容の誘導に
より特徴付けられる（Ｃｈｅｎら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１２３
７〜１２４０；Ｈａｑら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：７１４〜７１６
）。動物モデルにおいて、このアプローチは、自己免疫疾患を処置するために非
常に有望なアプローチであることが示されており、そして臨床的試行が、ヒト自
己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症）の処置におけるこ
のアプローチの有効性を示すために進行中である（Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６５：１２３７〜４０；Ｗｈｉｔａｃｒｅら（１９９６）Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：Ｓ３１〜９；Ｈｏｈｏ
ｌら（１９９６）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７８：２４３〜５０）
。遺伝子治療において使用されるウイルスに対する経口寛容の誘導が、遺伝子治
療ベクターの免疫原性を減少し得ることもまた、示唆されている。しかし、経口
寛容の誘導に必要とされる抗原の量は非常にはなはだしい。そして、抗原性タン
パク質の経口送達のための改良された方法は、経口寛容の誘導の効力を有意に改
良する。
【０２７４】 発現ライブラリー免疫化（Ｂａｒｒｙら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７７：
６３２）は、遺伝子ワクチンにおける使用に最適な抗原についてスクリーニング
する特に有用な方法である。例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａなど
に存在する自己抗原を同定するために、ＨＬＡ−Ｂ２７ポジティブの個体におけ
るＴ細胞応答の誘導についてスクリーニングし得る。細菌性抗原のエピトープお
よび自己免疫疾患と関連するＭＨＣ分子を含む複合体、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉ
ａ抗原と関連するＨＬＡ−Ｂ２７を、ＨＬＡ−Ｂ２７ポジティブの個体における
反応性関節炎および強直性脊椎炎の予防に使用し得る。
【０２７５】 自己免疫および炎症状態の処置は、免疫寛容を生じる抗原の投与だけではなく
、サイトカイン、同時刺激性分子などの組み合わせの使用もまた含み得る。この
ようなカクテルを、好都合の免疫応答の誘導、代表的には、自己抗原特異的寛容
の誘導のために処方する。カクテルはまた、例えば、Ｔ細胞のサブセットによる
自己抗原の認識に決定的に関与するＣＤ１（Ｐｏｒｃｅｌｌｉ（１９９５）Ａｄ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１）を含み得る。ＴH２に対する免疫応答を歪める 遺伝子ワクチンベクターおよびカクテルを、抗原特異的および抗原非特異的の両
方のベクターを用いて、自己免疫および炎症性状態の処置にしばしば使用する。
【０２７６】 遺伝子ワクチンおよび補助分子のスクリーニングを、当業者に公知の動物モデ
ルにおいて実行し得る。種々の状態に適切なモデルの例には、コラーゲン誘導性
関節炎、ヒトシェーグレン症候群のＮＦＳ／ｓｌｄマウスモデル；ヒト細胞骨格
タンパク質α−ホドリンのアナログと最近同定された１２０ｋＤの器官特異的自
己抗原（Ｈａｎｅｊｉら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：６０４）、ヒト
ＳＬＥのニュージーランド黒色／白色Ｆ１ハイブリッドマウスモデル、ＮＯＤマ
ウス、ヒト真性糖尿病のマウスモデル、ｆａｓ／ｆａｓリガンド変異体マウス（
自己免疫およびリンパ増殖性障害を自然発生させる）（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕ
ｋｕｎａｇａら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６：３１４）および実験的自己
免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ここでミエリン塩基性タンパク質は、ヒトの多発性
硬化症に類似する疾患を誘導する）が挙げられる。
【０２７７】 多発性硬化症の処置のための遺伝子ワクチンにおいて有用な自己抗原には、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：ミエリン塩基性タンパク質（Ｓｔｉ
ｎｉｓｓｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４５：５００〜５
１１）、または多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質とプロテオリピ
ドタンパク質の融合タンパク質（Ｅｌｌｉｏｔｔら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１６０２〜１６１２）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬ
Ｐ）（Ｒｏｓｅｎｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７５：２
８〜３４）、２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラー
ゼ（ＣＮＰａｓｅ）（Ｒｏｓｅｎｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎ
ｏｌ．７５：２８〜３４）、多発性硬化症におけるエプスタイン−バーウイルス
核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉ
ｍｍｕｎｏｌ．６９：９５〜１０２）、多発性硬化症におけるＨＳＰ７０（Ｓａ
ｌｖｅｔｔｉら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１４３〜５
３；Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５：３０７）。
【０２７８】 （Ｃ．アレルギーおよび喘息） 本発明の方法を使用して得られる遺伝子ワクチンベクターおよび他の試薬を使
用して、アレルギーおよび喘息を処置し得る。アレルギー性免疫応答は、Ｂ細胞
、Ｔ細胞、専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好酸球と肥満細胞との間の複合相互
作用の結果である。これらの細胞は、アレルギー性免疫応答において、どちらも
免疫応答のモジュレーターとして関与し、そしてまたアレルギー性応答の開始お
よび維持に直接関与する因子を生成することに関与する。
【０２７９】 ポリクローナルかつアレルゲン特異的ＩｇＥの合成は、Ｂ細胞、Ｔ細胞と専門
的抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の複数の相互作用を必要とする。ネイティブの
、プライムされていないＢ細胞の活性化は、特定のＢ細胞が細胞表面免疫グロブ
リン（ｓＩｇ）によってアレルゲンを認識する場合に開始される。しかし、活性
化Ｔ細胞によって可溶性形態および膜結合形態の両方で発現される同時刺激性分
子は、Ｂ細胞がＩｇＥ分泌形質細胞へと分化するために必要である。Ｔヘルパー
細胞の活性化は、ＡＰＣ（例えば、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、また
はプライムされたＢ細胞）の形質膜上での、ＭＨＣクラスＩＩ分子の状況におけ
る抗原性ペプチドの認識を必要とする。専門的ＡＰＣは、抗原を効率的に捕捉し
得、そしてペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体が、ゴルジ体通過後にタンパク質
分解性の細胞内画分に形成され、続いて形質膜に搬出され、そこでこれらはＴ細
胞レセプター（ＴＣＲ）に認識される（Ｍｏｎａｃｏ（１９９５）Ｊ．Ｌｅｕｋ
．Ｂｉｏｌ．５７：５４３〜５４７）。さらに、活性化されたＢ細胞は、ＣＤ８
０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２、Ｂ７０）を発現する。これらは、Ｃ
Ｄ２８に関する対抗レセプターであり、そしてこれらは、Ｔ細胞の増殖およびサ
イトカイン合成を生じるＴ細胞活性化に関する同時刺激性シグナルを提供する（
Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：５５５〜５５９）。ア
トピー性の個体由来のアレルゲン特異的Ｔ細胞は、一般に、ＴH２細胞サブセッ トに属するので、これらの細胞の活性化は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の生成も
また導く。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、活性化Ｔヘルパー細胞により発現され
た膜結合型同時刺激性分子とともに、Ｂ細胞がＩｇＥ分泌形質細胞へと分化する
のを指向する（ｄｅ ＶｒｉｅｓおよびＰｕｎｎｏｎｅｎ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ、ＣＭ Ｓｎａｐｐｅｒ編、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ、Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ、１９５
〜２１５頁、１９９６）。
【０２８０】 肥満細胞および好酸球は、標的器官においてアレルギー症状を誘導する際の鍵
となる細胞である。肥満細胞、好塩基球、または好酸球上の高親和性ＩｇＥレセ
プターに結合されたＩｇＥによる特異的抗原の認識は、レセプターの架橋を生じ
、細胞の脱顆粒およびメディエイタ分子（例えば、ヒスタミン、プロスタグラン
ジン、およびロイコトリエン）の迅速な放出を導き、アレルギー症状を引き起こ
す。
【０２８１】 アレルギー疾患の免疫療法には、現在、患者に注射する漸増用量のアレルゲン
を使用する減感作処置（ｈｙｐｏｓｅｎｓｉｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が挙げられ
る。これらの処置は、ＴH１表現型に対する免疫応答の歪曲を生じ、アレルゲン に特異的なＩｇＧ／ＩｇＥ抗体の比を増加させる。これらの患者はアレルゲンに
特異的な循環するＩｇＥ抗体を有するので、これらの処置は、アナフィラキシー
反応の有意な危険を含む。これらの反応において、遊離の循環するアレルゲンが
、肥満細胞および好酸球上の高親和性ＩｇＥレセプターに結合されたＩｇＥ分子
により認識される。このアレルゲンの認識により、レセプターの架橋が生じ、メ
ディエータ（例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン、およびロイコトリエン
）の放出が導かれ、これによりアレルギー症状（および時々アナフィラキシー反
応）が引き起こされる。減感作処置に関連する他の問題としては、アレルゲン抽
出物を再成可能に生成する際の低い効率および困難さが挙げられる。
【０２８２】 遺伝子ワクチンは、以前に公知の減感作処置の有用性を制限してきた問題を回
避する手段を提供する。例えば、細胞（例えば、筋肉細胞）の表面上に抗原を発
現することにより、アナフィラキシー反応の危険を有意に減少させる。このこと
を、膜貫通形態のアレルゲンをコードする遺伝子ワクチンベクターを使用するこ
とにより達成し得る。アレルゲンをまた、それらが膜貫通形態で効率的に発現さ
れるような様式において改変し、アナフィラキシー反応の危険をさらに減少させ
得る。脱感作処置のための遺伝子ワクチンの使用により提供される別の利点は、
遺伝子ワクチンが、ＴH１表現型に対する免疫応答をさらに指向し、これにより 産生されるＩｇＥ抗体の量を減少させ、そして処置の有効性を増加させるサイト
カインおよび補助分子を含み得ることである。ベクターをまた進化させて、主に
ＩｇＧおよびＩｇＭ応答を、ＩｇＥ応答をほとんどまたは全く伴わずに誘導させ
得る。さらに、ＤＮＡシャッフリングを使用して、インビボで先住する特異的Ｉ
ｇＥ抗体によって認識されないが、アレルゲン特異的Ｔ細胞の有効な活性化を誘
導し得るアレルゲンを生成し得る。例えば、ファージディスプレイ選別を使用し
て、シャッフルされたアレルゲンをファージ上で発現させ得、そして特異的Ｉｇ
Ｅ抗体によって認識されないもののみを選択する。これらを、それらが特異的Ｔ
細胞の活性化を誘導する能力について、さらにスクリーニングする。有効なＴ細
胞応答は、Ｂ細胞エピトープは変化されたが、特異的抗体の結合の欠如により示
されるように、Ｔ細胞エピトープが機能的に完全であることの指標である。
【０２８３】 これらの方法において、公知のアレルゲンあるいはそれらのホモログまたはそ
れらのフラグメント（すなわち、免疫原性ペプチド）をコードするポリヌクレオ
チドをＤＮＡワクチンベクター中に挿入し、そしてそれを使用してアレルギー性
の個体および喘息の個体を免疫する。ＤＮＡシャッフリングを使用して、Ｔ細胞
を活性化するが、アナフィラキシー反応を誘導し得ない抗原を獲得し得る。処置
し得るアレルギーの例には、以下に対するアレルギーが挙げられるが、これらに
限定されない：ハウスダストダニ、イネ科草木の花粉、カバノキの花粉、ブタク
サの花粉、ハシバミの花粉、ゴキブリ、コメ、オリーブの木の花粉、真菌、カラ
シナ、ハチの毒。
【０２８４】 本発明はまた、アレルギーおよび喘息についての処置としての、遺伝子ワクチ
ン接種の別の弱点に対する解決策を提供する。遺伝子ワクチン接種は、主にＣＤ
８+Ｔ細胞応答を誘導するが、アレルゲン特異的ＩｇＥ応答の誘導は、ＣＤ４+Ｔ
細胞、およびＢ細胞に対するＣＤ４+Ｔ細胞の援助に依存する。ＴH２型細胞は、
ＩｇＥ合成を誘導する際に特に有効である。なぜなら、ＴH２型細胞は、高レベ ルのＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を分泌し、これらは、Ｉｇアイソタ
イプのＩｇＥ合成への変換を指向するからである。ＩＬ−５はまた、好酸球増加
症を誘導する。本発明の方法を使用して、ＣＤ４+Ｔ細胞応答を効率よく誘導し 、そしてＴH１表現型へのこれらの細胞の分化を指向する遺伝子ワクチンを発達 させ得る。
【０２８５】 本発明はまた、遺伝子ワクチンベクターによる抗原放出のレベルを調節する方
法を提供する。抗原用量の調節は、安全性の理由のために、脱感作処置の開始に
おいて重要である。好ましくは低い抗原レベルを最初に使用し、一旦、抗原が個
体において有害な効果を誘導しないという証拠を得たならば、抗原レベルを増加
させる。本発明のＤＮＡシャッフリング方法により、異なる（高いおよび低い）
レベルの抗原の発現を誘導する遺伝子ワクチンベクターの生成が可能になる。例
えば、２つ以上の異なる進化されたプロモーターを、抗原発現のために使用し得
る。あるいは、抗原遺伝子自体を、例えば、コドン使用頻度を変えることにより
、異なるレベルの発現のために進化させ得る。異なるレベルの抗原発現を誘導す
るベクターを、特定のモノクローナル抗体の使用、およびセルソーティング（例
えば、ＦＡＣＳ）によりスクリーニングし得る。
【０２８６】 （Ｄ．癌） 免疫療法は、癌の処置および転移の予防のために大いに有望である。癌性細胞
に対する免疫応答を誘導することにより、身体の免疫系を協力させて、癌を減少
または除去し得る。本発明の方法を使用して調製される遺伝子ワクチン、および
本明細書中に記載された補助分子は、現在利用可能な癌免疫療法と比較して、有
効性が増加した癌免疫療法を提供する。
【０２８７】 癌免疫療法への１つのアプローチは、腫瘍細胞に特異的な抗原をコードする遺
伝子ワクチンを使用するワクチン接種である。本発明の方法を、公知の腫瘍特異
的抗原に対する、免疫応答の増強のために、そしてまた、新規な保護性の抗原性
配列を探索するために使用し得る。最適化された抗原の発現、プロセシング、お
よび提示を示す遺伝子ワクチンを、本明細書中に記載するように入手し得る。本
発明の方法はまた、最適化されたサイトカイン、同時刺激性分子、および抗腫瘍
免疫応答の誘導に有効な他の補助分子を得るために、ならびに最適な組合せで存
在するこれらおよび他の成分を含む遺伝子ワクチンおよびカクテルを得るために
適切である。特定の癌各々に対して使用されるアプローチは、変化し得る。ホル
モン感受性癌（例えば、乳癌および前立腺癌）の処置のために、本発明の方法を
使用して、最適化されたホルモンアンタゴニストを入手し得る。高度に免疫原性
の腫瘍（黒色腫を含む）のために、その腫瘍に対する免疫応答を最適にブースト
する遺伝子ワクチンベクターについてスクリーニングし得る。対照的に、乳癌は
、比較的免疫原性が低く、そして遅い進行を示す。その結果、個々の処置を各患
者に対して設計し得る。転移の防止が、遺伝子ワクチンの設計における目標でも
ある。
【０２８８】 （実施例） 以下の実施例は、例証のために提供されるが、本発明を限定しない。
【０２８９】 （実施例１） （遺伝子ワクチンベクターをスクリーニングするための動物モデル） この実施例は、ヒトの皮膚において、インビボで遺伝子ワクチンベクターをス
クリーニングおよび試験するのに有用なマウスモデル系を提供する。ヒトの皮膚
片を、ＳＣＩＤマウスの背中上に異種移植する。ヒトの皮膚片を、環状切除を受
ける乳児から、例えば美容上の理由による皮膚除去手術、または例えば事故が原
因で切断を受ける患者から、入手し得る。次いで、これらの切片を、他者に記載
されたように（Ｄｅｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ １５：１３８８〜１３９１；Ｋｈａｖａｒｉら（１９９７）Ａｄｖ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｒｅｓ．１５：２７〜３５；ＣｈｏａｔｅおよびＫｈａｖａｒｉ（１９９
７）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８９５〜９０１）、Ｃ．Ｂ−
１７ ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウスの背中の上に移植する。
【０２９０】 ベクターライブラリーを、例えば、皮膚への局所適用後に選択する。しかし、
類似の様式で、免疫の最適の経路に依存して、進化したベクターを、ｉ．ｍ．、
ｉ．ｖ．、ｉ．ｄ．、経口、肛門、または膣内送達後にも、選択し得る。皮膚上
に送達されたＤＮＡは、パッチの形態で、クリームの形態で、裸のＤＮＡ、また
はＤＮＡとトランスフェクション増強剤（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ま
たは脂質／リポソーム）の混合物の形態であり得、そしてこのＤＮＡを、機械的
剥離後、毛の除去後、あるいは単に、皮膚上にＤＮＡの液滴またはＤＮＡ−脂質
／リポソーム混合物の液滴を添加することにより、適用し得る。同様の送達方法
は、小さい動物（例えば、マウスまたはラット）、大きい動物（例えば、ネコ、
イヌ、ウシ，ウマ、またはサル）およびヒトに適用する。
【０２９１】 この送達を増強する適切なプロテアーゼおよびリパーゼには、以下の個々また
は混合物が挙げられるが、これらに限定されない：αアミラーゼを伴うか、また
は伴わないプロテアーゼ（例えば、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）またはサ
ビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ））、リパーゼ（例えば、リポラーゼ（Ｌｉｐｏｌ
ａｓｅ））（Ｓａｒｌｏら（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１００：４８０〜７）。
【０２９２】 最適なベクターの回収を、例えば、ＰＣＲによるか、またはベクター全体を回
収することにより、トランスフェクトされた細胞から行い得る。ベクターが細胞
に侵入する能力に純粋に基づくか、あるいは、ヒトの皮膚を移植された正常なマ
ウス、サル、またはＳＣＩＤマウス中で、ベクターにコードされた抗原を発現す
る細胞のみを選択することによるかのいずれかで、ベクターを選択し得る。例え
ば、ＧＦＰをマーカー遺伝子として使用し、送達後に、トランスフェクトされた
細胞を、蛍光顕微鏡法かまたはフローサイトメトリーにより検出し得る。ポジテ
ィブの細胞を、例えば、フローサイトメトリーに基づくセルソーティングにより
、単離し得る。この様式により、インビボのヒト細胞中で最適に抗原を発現し、
そしてトランスフェクトするベクターの選択が可能となる。
【０２９３】 さらに、マウスにおいて、皮膚上への送達後に有効な免疫応答を誘導し得るベ
クターを選択することによりスクリーニングし得る。最も特異性の高い抗体また
はＣＴＬ応答を誘導するベクターを選択し得るか、あるいは対応する病原体によ
るチャレンジ後の、防御免疫応答の誘導に基づいて選択し得る。
【０２９４】 （実施例２） （エピソーム様に複製する核酸ワクチンベクター） この実施例は、安定な、エピソーム様に維持される遺伝子ワクチンベクターを
、ＤＮＡシャッフリングをヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子に適用する
ことにより得る手順を記載する。ＨＰＶは、長期にわたりヒトの皮膚において維
持され得る（ＢｅｒｎａｒｄおよびＡｐｔ（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔ
ｏｌ．１３０：２１０）。これらのインビボでの特性に関わらず、ＨＰＶを組織
培養中でエピソーム様に維持することは、複製不足のために不可能であった。こ
の実施例において記載される手順の主な目標は、ベクタ−構築物の安定性および
コピー数を改良することである。天然のＨＰＶ改変体についての従来のアプロー
チを使用するスクリーニング、または改良された特性を有する変異体を合理的に
設計する試みには、研究の多くの人年が必要とされる。
【０２９５】 有効な様式で改良された変異体を得るために、ファミリーシャッフリングを、
異なるが非常に近接した良性ＨＰＶ由来のＨＰＶ Ｅ１遺伝子およびＨＰＶ Ｅ
２遺伝子を使用して行う。ファミリーシャッフリングにより、従来的な変異誘発
アプローチよりも大規模なより多くの多様性を、従来的アプローチに必要とされ
るよりも大幅に短い期間で生成しスクリーニングし得る。ＨＰＶ Ｅ１遺伝子お
よびＨＰＶ Ｅ２遺伝子のライブラリーを、３つの密接に関連する皮膚ＨＰＶ株
（ＨＰＶ ２、２７、および５７）のファミリーシャッフリングを使用して作製
する。あるいは、ベクター配列の大きなライブラリーを、例えば、ヒトまたはマ
ウスゲノムＤＮＡ由来のランダムなＤＮＡ配列を遺伝子ワクチンベクター中に組
み込むことにより作製する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をマーカー遺伝子と
して使用して、優れた発現レベルを有するほとんどの安定なベクターを検出する
。何百万ものベクターのライブラリーから、最高のキメラ構築物を、フローサイ
トメトリーに基づくセルソーティングにより選択する。次いで、エピソーム様ベ
クターを回収し、非組換えベクターに対するさらなる選択圧を提供する。
【０２９６】 最初のスクリーニングを、シャッフリングされた材料の大きなライブラリーの
プロセシングが可能な細胞培養中で行う。安定なエピソーム様ベクターはまた、
他のライブラリースクリーニング適用における非常に有用な道具であると証明さ
れるようである。ランダムに組み込みかつ一過性のベクターとは対照的に、エピ
ソーム様に維持されるベクターは、ＦＡＣＳ選択において、高いシグナル対ノイ
ズ比を生じ、これらはまた、少数の選択された細胞から、プラスミドを回収する
可能性を有意に改良する。あるいは、またはさらに、このベクターを生きている
ヒトの皮膚を移植したＳＣＩＤマウスにおいて、インビボでの持続性についてス
クリーニングおよび分析する（実施例１を参照のこと）。
【０２９７】 ヒト細胞においてインビボで最適の特性について直接スクリーニングするため
に、ベクターライブラリーを、動物モデル（ＳＣＩＤマウスにヒトの皮膚を移植
する）中でスクリーニングする。このモデルにおいて、生きているヒトの皮膚を
、何の拒絶の徴候も示さないＳＣＩＤマウスの背中の上に異種移植し、遺伝子ワ
クチンベクターを、インビボのヒト組織中で直接的に最適化および進化させる可
能性を提供する。エピソーム様ベクターの反復性選択により、エピソーム性を保
持し、なお高レベルの遺伝子発現を提供するベクターについての強力な選択圧が
提供される。さらに、その免疫欠損性表現型にも関わらず、ＳＣＩＤマウスは、
正常のレベルの単球およびマクロファージを有する。従って、これらのマウス由
来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を使用して、専門的抗原提示細胞に送達された抗原
のレベルを評価し、そしてこれらの細胞が抗原を提示してインビボで抗原特異的
ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を誘導する能力を研究し得る。
【０２９８】 （実施例３） （サイトメガロウイルスの主要な前初期プロモーター／エンハンサー領域の進
化） サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主要な前初期（ＩＥ）領域プロモーター／
エンハンサーは、遺伝子の転写の調節に広範に使用される。なぜなら、これは、
広範な細胞型において高度に活性であるからである。遺伝子発現レベルの増強を
指向する最適化されたＣＭＶプロモーター（ＤＮＡシャッフリングにより作製す
る）は、遺伝子ワクチンの効率を改良し得る。ＣＭＶプロモーターがヒトおよび
動物細胞中で活性であるという事実は、これを使用して、動物モデルおよび臨床
適用に両方において外来遺伝子を発現し得ることを意味する。
【０２９９】 キメラプロモーター／エンハンサー配列のライブラリーを、４つの関連するＣ
ＭＶ株由来の野生型配列のＤＮＡシャフリングにより作製した。ＩＥ領域のプロ
モーター、エンハンサー、および第１のイントロン配列を、ＰＣＲにより、ヒト
ＣＭＶ株のＡＤ１６９およびＴｏｗｎｅ、ならびにアカゲザルおよびベルベット
モンキーＣＭＶから得る（図１２）。ヒトＣＭＶ株のプロモーター／エンハンサ
ー配列は９５％同一であり、そしてサルの単離物の配列と約７０％の同一性を共
有する。これにより、ファミリーシャッフリングを使用して、従来のシャッフリ
ング手順を使用して達成するよりも多くの多様性を有するライブラリーを作製し
得る。これらの配列のプロモーター／エンハンサー領域の整列および配列類似性
を、図１０に示す。ヒトＣＭＶ株のＴｏｗｎｅおよびＡＤ１６９由来のＰＣＲ産
物におけるイントロンＡ配列の、整列ならびに配列類似性を図１１に示す。そし
てこれらのプロモーターの増幅により得られるＰＣＲ産物の模式図を図１２に示
す。
【０３００】 以下のプライマーを使用して、ヒトＣＭＶおよびサルＣＭＶからプロモーター
配列を増幅し得る： ヒトＣＭＶ株ＴｏｗｎｅおよびＡＤ１６９中のプロモーターのためのプライマ
ー： ５’−プライマー：５’−ＡＴＡ ＴＧＡ ＧＧＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ Ａ−３’ ３’プライマー：５’−ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＡＡ−３’ アカゲザルＣＭＶプロモーターのためのプライマー： ５’−プライマー：５’−ＡＡＴ ＧＧＣ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＣＡ ＴＴ
Ｇ ＡＧＣ ＣＡＡ ＴＴ−３’ ３’プライマー：５’−ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＧＴ ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＣＡ ＣＣＣ ＴＴ−３’ ベルベットモンキーＣＭＶプロモーターのためのプライマー： ５’−プライマー：５’−ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＡ
Ｇ ＴＴＴ−３’ ３’−プライマー：５’−ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＣ
Ａ ＣＣＧ Ｔ−３’。
【０３０１】 シャッフリングの後、このライブラリーをプラスミドバックボーン中にクロー
ニングし、そしてこれを使用して、哺乳動物細胞においてマーカー遺伝子の転写
を指向させた。ネイティブプロモーターの制御下の内部マーカーをこのプラスミ
ドベクター中に保有させ、同数のベクターを発現する細胞の分析および選択を可
能にした。シャッフリングされたプロモーター配列をスクリーニングする際の使
用に適切なベクターの例を、図７に示す。
【０３０２】 トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーセルソーティングにより
スクリーニングし、最高レベルのマーカー遺伝子を発現する細胞を同定し、細胞
当たりのベクターコピー数の差を考慮するために内部マーカーに対して正規化し
た。次いで、最適なプロモーター配列を保有するベクターを回収し、そしてさら
なるサイクルのシャッフリングおよび選択に供する。図１３に示される結果は、
組換え後の蛍光活性化セルソーティングにより、プロモーターライブラリーが、
強力な活性を有するプロモーターについて濃縮されたことを実証する。図１４は
、個々に分析されたシャッフリングされた細胞の抗原発現の分布（フローサイト
メトリーにより測定された）を示す。また、ＦＡＣＳソーティングされたライブ
ラリーは、高活性プロモーターについて集団を濃縮した。
【０３０３】 ルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結された、シャッフリング
されたＣＭＶプロモーター（Ｓ１７）を含むベクターを、マウス（？？）に筋肉
内注射し、ルシフェラーゼ発現量を、注射後の種々の時点で決定した。結果を図
１５に示す。
【０３０４】 （実施例４） （オリゴ指向的Ｃｐｇノックアウトのシャッフリング） 遺伝子ワクチンベクターに関する一般的問題は、そのベクターに誘導される発
現が、プロモーター活性の下方調節が原因で、しばしば持続が短いことである。
プロモーター活性の下方調節についての１つの理由は、メチル化である（Ｒｏｂ
ｅｒｔｓｏｎおよびＡｍｂｉｎｄｅｒ（１９９７）７１：６４４５〜５４）。Ｃ
ｐＧ配列は、特にメチル化する傾向があり、この実施例は、ＤＮＡシャッフリン
グ法を使用して、全ての不用なＣｐＧ配列を削除したプロモーター配列を作製す
ることを記載する。このアプローチを、図１６に実証する。
【０３０５】 本明細書中に記載の実施例および実施態様は、例示目的のみのためであり、そ
してそれを考慮した種々の改変または変更が当業者に示唆され、本明細書の精神
および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであること
が、理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願
は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マルチモジュール遺伝子ワクチンベクターの概略的な提示を示す。代
表的な遺伝子ワクチンベクターは、示される１つ以上の成分を含み、これらの各
々は、天然であり得るか、または本明細書中に記載されるＤＮＡシャッフリング
方法を使用して最適化され得る。この成分は、同じベクター上に存在し得るか、
または別々の分子として遺伝子ワクチンに含まれ得る。
【図２】 図２は、遺伝子のインビトロでのシャッフリング、「反復性の配列組換え」に
ついての模式図を示す。
【図３】 図３は、遺伝子ワクチンの進化のためのＤＮＡシャッフリングの適用の図を示
す。公知の機能的特性（例えば、調節性、コーディングなど）を有する異なる型
の核酸をシャッフルし、そして遺伝子ワクチンとしての使用について改良された
特性を示す改変体を同定するためにスクリーニングする。
【図４】 図４は、反復性シャッフリングを使用して進化した、最適化されたプロモータ
ー配列の選択についてのフローサイトメトリーに基づくスクリーニング方法（Ｆ
ＡＣＳ）の図である。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを例示の目
的のために使用する。
【図５】 図５は、組織（例えば、皮膚および筋肉）への遺伝子ワクチンおよび他の試薬
のマイクロインジェクションに適切である装置を示す。この装置は、特に、大量
の試薬をインビボで９６ウェル形式に基づいてスクリーニングするために有用で
ある。この装置のチップは、可動であり、このチップがマイクロタイタープレー
トに適合するように調節を可能にする。目的の試薬をプレートから得た後に、こ
のチップを約２〜３ｍｍ離れた距離に調節し、約１．６ｃｍ×約２．４ｃｍ〜約
２．４×約３．６ｃｍの領域に９６の異なるサンプルを移動することを可能にす
る。所望の場合、移された各サンプルの容量を、電気的に制御し得る（代表的に
は、約２μｌ〜約５μｌの範囲の移された容量）。各試薬をマーカー剤または色
素と混合し、組織における注射部位の認識を容易にし得る。例えば、異なるサイ
ズおよび形状の金粒子を、目的の試薬と混合し得、そして鏡検および免疫組織化
学を使用し、各注射部位を同定し、そして各試薬により誘導される反応を研究す
る。筋肉組織に注射する場合、この注射部位を、手術によって初めに曝露する。
【図６】 図６は、ファミリーシャッフリングの例を示す。この例示では、４つの異なる
株のウイルスを使用するが、この技術は、任意の核酸に適用可能であり、異なる
株、種、または遺伝子ファミリーが、他の相同な核酸と比較して１つ以上のヌク
レオチド変化を有する相同な核酸を有する。この異なる改変核酸を、本明細書中
に記載されるようにシャッフルし、そして所望の特性を示すこれらの改変体を同
定するためにスクリーニングするか、または選択する。このシャッフリングおよ
びスクリーニングを、さらなる改良体を得るために１回以上繰り返し得る。
【図７】 図７は、シャッフルされたプロモーター核酸のライブラリーからの改良された
プロモーターを同定するためのスクリーニングに有用であるベクターの例を示す
。シャッフルされた推定プロモーターを、発現を容易に検出するレポーター遺伝
子のベクター上流に挿入する。多数の適用については、レポーター遺伝子の産物
は、高レベルのレポーター遺伝子を発現する細胞を、レポーター遺伝子産物を使
用するフローサイトメトリーに基づくセルソーティングを使用して選別し得るよ
うに、細胞表面タンパク質であることが望ましい。適切なレポーター遺伝子の例
は、例えば、Ｂ７−２およびｍＡｂ１７９エピトープを含む。ポリアデニル化領
域を、代表的には、レポーター遺伝子の下流に配置する（ＳＶ４０ポリＡを例示
する）。このベクターはまた、第２のレポーター遺伝子の内部コントロール（Ｇ
ＦＰ；緑色蛍光タンパク質）を含み得る；この遺伝子をプロモーター（ＳＲαP ）に連結する。このベクターはまた、代表的には、選択マーカー（カナマイシン
／ネオマイシン耐性を示す）、ならびに哺乳動物細胞中で機能的である複製起点
（ＳＶ４０ ｏｒｉ）および／または細菌細胞中で機能的である複製起点（ｐＵ
Ｃ ｏｒｉ）を含む。
【図８】 図８は、ＤＮＡシャッフリングおよびフローサイトメトリーに基づく選択を使
用して誘導性プロモーターの進化を循環させるための模式図を示す。適切なベク
ター中に存在するシャッフルされたプロモーター核酸のライブラリーを、細胞中
にトランスフェクトし、そして非誘導性の条件で増殖した場合、マーカー抗原の
最も低い発現を示す細胞を選択する。このベクターを回収し、細胞中に導入し、
そして誘導性の条件で増殖する。最も高いレベルのマーカー抗原を発現するこれ
らの細胞を選択する。
【図９】 図９は、改良された経口送達のために、遺伝子ワクチンベクターを進化させる
ための方法の模式図を提供する。
【図１０】 図１０は、２つのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）株および２匹のサルの
株の前／初期遺伝子のヌクレオチド配列の整列である。
【図１１】 図１１は、ＣＭＶ株ＴｏｗｎｅおよびＡＤ１６９由来のイントロンＡヌクレオ
チド配列の整列である。
【図１２】 図１２は、ＰＣＲ増幅による、ヒト（ＡＤ１６９およびＴｏｗｎｅ）ならびに
サル（アカゲザルおよびオナガザル）サイトメガロウイルス由来のプロモーター
／エンハンサー／イントロン配列の概略的な提示を示す。これらの増幅されたフ
ラグメントは、ファミリーシャッフリングにおける使用に適切である。
【図１３】 図１３は、シャッフルされたＣＭＶプロモーター配列を蛍光活性化セルソーテ
ィングに供することによるライブラリーの富化を示す。
【図１４】 図１４は、ＤＮＡシャッフリング、続いて蛍光活性化セルソーティングによっ
て得られる、高い活性のＣＭＶプロモーターの機能的多様性および富化を示す。
【図１５】 図１５は、コントロールＣＭＶプロモーターに対して、シャッフルされたＣＭ
Ｖプロモーターの制御下でのルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターの筋肉内注射
で得られるトランスジーンの発現レベルを示す。
【図１６】 図１６は、必要でないＣｐＧ配列を欠失するプロモーター配列を生成するため
のＤＮＡシャッフリングの使用の概略的な提示を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 37/06 37/06 37/08 37/08 Ａ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 3410 Ｃｅｎｔｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｗ ａｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａ ｌｉｆｏｒｎｉａ 95051 Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 ステマー， ウィレム ピー． シー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95030， ロス ガトス， キャシー コート 108 (72)発明者 ウォーレン， ロバート ジェラルド フランス国 エフ−75015 パリ， リュ ルクールブ， 332 (72)発明者 ハワード， ラッセル アメリカ合衆国 カリフォルニア， ロス アルトス ヒルズ， ビスケイノ ロー ド 12700 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA31 CA02 DA03 EA02 FA02 FA06 GA11 HA11 HA17 4C084 AA13 MA66 ZB022 ZB052 ZB262 4C085 AA03 AA38 BB11 CC08 EE03 GG01 4C087 AA01 AA02 BC83 MA66 ZB02 ZB05 ZB26

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 多成分の核酸ベクターであって、以下： 最適な抗原の放出を提供する成分； 細胞傷害性Ｔリンパ球の最適な産生を提供する成分； 免疫モジュレーターの放出を指向する成分； ケモカインの放出を指向する成分； 所望の標的細胞型への結合、または侵入を容易にする成分；および クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子上のいずれかの提示に、細胞中の抗原の取
    り込みに由来する抗原ペプチドを指向する成分、 からなる群から選択される２つ以上の成分を含む、核酸ベクター。
  2. 【請求項２】 各成分が別個のベクターに存在する、請求項１に記載の核酸
    ベクター。
  3. 【請求項３】 各成分が同じベクターに存在する、請求項１に記載の核酸ベ
    クター。
  4. 【請求項４】 前記ベクターが、ａ）第１の最適化された組換え成分を含む
    フラグメント、およびｂ）第２の最適化された組換え成分を含む別個のＤＮＡフ
    ラグメントを含む、鋳型ＤＮＡフラグメントとして使用するアセンブリＰＣＲに
    より構築される、請求項３に記載の核酸ベクター。
  5. 【請求項５】 抗原発現細胞を標的化するための前記核酸ベクターの、結合
    、および取り込みを改良する、最適な抗原放出のために設計された成分を含む、
    請求項１に記載の核酸ベクター。
  6. 【請求項６】 前記標的抗原発現細胞が、筋細胞および上皮細胞からなる群
    から選択される、請求項５に記載の核酸ベクター。
  7. 【請求項７】 前記成分が、標的抗原提示細胞への最適な結合、および該標
    的抗原提示細胞による取り込みを付与する、請求項１に記載の核酸ベクター。
  8. 【請求項８】 前記標的抗原提示細胞が、樹状細胞、単球／マクロファージ
    、およびランゲルハンス細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の核酸
    ベクター。
  9. 【請求項９】 前記成分が、細胞中への抗原の取り込みに由来する抗原ペプ
    チドを、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子上でのいずれかの提示に指向する、
    請求項１に記載の核酸ベクター。
  10. 【請求項１０】 前記成分が、抗原ペプチドをクラスＩ分子上での提示に指
    向し、そしてタパシン、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２からなる群から選択される
    タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の核酸ベクタ
    ー。
  11. 【請求項１１】 前記成分が、抗原ペプチドをクラスＩＩ分子上での提示に
    指向し、そしてエンドソームプロテアーゼまたはリソソームプロテアーゼをコー
    ドするポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の核酸ベクター。
  12. 【請求項１２】 前記所望される標的細胞型が樹状細胞またはランゲルハン
    ス細胞である、請求項１に記載の核酸ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の核酸ベクターであって、ここで前記ワク
    チンが以下； 最適な抗原放出のための成分； ＭＨＣクラスＩ上での抗原ペプチドの樹状細胞提示を通じてＣＴＬ活性化に最
    適化された成分； 常在性の組織マクロファージに由来するＩＬ−１２およびＩＦＮγの放出のた
    めに最適化された成分；ならびに 免疫部位へのＴH細胞の漸増のために最適化された成分、 を含む、核酸ベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の核酸ベクターであって、ここで１つ以上
    の前記成分が、以下： （１）組換え核酸のライブラリーを産生するために、遺伝子ワクチンに所望の
    特性を付与し得る少なくとも第１型および第２型の核酸を組換えする工程であっ
    て、ここで該第１型および第２型が２つ以上のヌクレオチドにおいて互いに異な
    る、工程；ならびに （２）該核酸ベクターに該所望の特性を付与する能力の増強を示す、少なくと
    も１つの最適化された組換え成分を同定するためにライブラリーをスクリーニン
    グする、工程、 を包含する方法により得られる、核酸ベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の核酸ベクターであって、ここで１つ以
    上の前記成分を得るために使用される方法が、以下： （３）組換え核酸のさらなるライブラリーを産生するために、少なくとも１つ
    のさらに最適化された組換え成分を、前記第１型および第２型と同じか、または
    異なる、さらなる型の核酸と組換えする工程； （４）該核酸ベクターに該所望の特性を付与する能力の増強を示す、少なくと
    も１つのさらに最適化された組換え成分を同定するためにさらなるライブラリー
    をスクリーニングする工程；ならびに （５）必要な場合、該さらなる最適化された組換え成分が、該核酸ベクターに
    該所望の特性を付与する能力のさらなる増強を示すまで、（３）および（４）を
    繰り返す工程、 をさらに含む、核酸ベクター。
  16. 【請求項１６】 前記第１型の前記核酸が遺伝子ファミリーの第１のメンバ
    ーを含み、そして前記第２型が該遺伝子ファミリーの第２のメンバーを含む、請
    求項１４に記載の核酸ベクター。
  17. 【請求項１７】 請求項１４に記載の核酸ベクターであって、ここで前記最
    適化された組換え成分が、以下： 組換え核酸のさらなるライブラリーを産生するために、該最適化された組換え
    成分を、１モル濃度強の前記第１型および第２型の１つまたは両方と組換えする
    、工程；ならびに 該核酸ベクターに所望の特性を付与するさらなる能力の増強を示す、少なくと
    も１つの最適化された組換え成分を同定するためにさらなるライブラリーをスク
    リーニングする、工程、 によって戻し交雑される、核酸ベクター。
  18. 【請求項１８】 前記遺伝子ファミリーの前記第１のメンバーが生物の第１
    の種から得られ、そして前記遺伝子ファミリーの前記第２のメンバーが生物の第
    ２の種から得られる、請求項１６に記載の核酸ベクター。
  19. 【請求項１９】 前記核酸ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター
    、またはプラスミドベクターを含む、請求項１４に記載の核酸ベクター。
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