CN100493617C - 用于治疗和预防ⅰ型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗和预防I型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途。更具体地，本发明的重组腺相关病毒包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码谷氨酸脱羧酶肽或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白或谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白的核酸序列。本发明还涉及包含所述重组DNA分子或融合蛋白的药物组合物。

Description

用于治疗和预防Ⅰ型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途

技术领域 本发明涉及一种用于治疗和预防I型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途。更具体地，本发明的重组腺相关病毒中包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码谷氨酸脱羧酶肽(GAD肽)、或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽(GADt肽)、或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白(GADt-IgG)、或编码谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白(GAD-IgG)的核酸序列。本发明还涉及包含所述重组DNA分子或融合蛋白的药物组合物。

技术背景 机体发育和生命维持过程中，免疫系统的自我识别功能是对自身组织器官保护的重要因素。当自身耐受遭受攻击时，免疫系统对自身抗原产生免疫应答，机体产生自身抗体并出现自身反应性T细胞等免疫系统改变时可导致自身免疫。当自身免疫发展到一定程度，对自身组织器官产生破坏并引起临床症状时便可引起自身免疫病^[1-3]。在抗移植排斥、I型超敏反应中，也存在着类似的免疫系统紊乱。如何诱导机体产生对自身或目的抗原的耐受是临床有效治疗的关键，也是免疫学研究所亟待解决的问题^[4-6]。自身免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化症、全身性红癍狼疮等是一类严重危害人类健康的疾病。大量研究结果证实免疫细胞功能异常是这类疾病发生的主要原因，临床对这类疾病的治疗主要是药物性对症处理，如用于IDDM治疗的胰岛素和甲氨蝶呤、环孢霉素-A、激素等免疫抑制类药物；如果能诱导机体对致病原产生特异性免疫耐受，将可能为这类自身免疫性疾病的治疗提供有效的手段。

I型糖尿病(IDDM)是机体免疫系统中T淋巴细胞对自身胰岛β细胞的识别障碍，导致胰岛组织破坏的一类自身免疫性疾病^[7]。如何纠正T淋巴细胞对自身抗原的识别障碍并诱导机体产生免疫耐受，阻断这类细胞对胰岛组织破坏，是对IDDM治疗成功所亟待解决的问题。

诱导耐受的免疫原通常是抗原，它受抗原的理化性质、剂量、进入途径及机体遗传背景等的影响^[1-3]。许多抗原分子上存在着与T细胞相关的表位肽——抗原肽，它们通过抗原呈递细胞(APC)将抗原肽/MHC复合物呈递给T细胞，诱导免疫耐受效应。协同刺激信号的缺失、CTLA-4上调及Th1/Th2平衡改变等均参与特异性耐受的诱导，但作用机制尚不十分清楚^[8-13]。

I型糖尿病患者的血清中可以检出多种针对胰岛β细胞及其成分的自身抗体，如胰岛β细胞抗体(ICA)、胰岛素抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、酪氨酸磷酸酶(IA-2A)、热休克蛋白抗体^[7]。国外I型糖尿病中GAD抗体阳性率为60.9-78.8％，国外II型糖尿病中GAD抗体阳性率为5.0-38.2％，国内II型糖尿病中GAD抗体阳性率为14.8-38.2％。1990年Baekkeskov等[14]证明自身胰岛β细胞抗原GAD是IDDM的关键始动靶抗原。对人类I型糖尿病研究的理想动物模型NOD小鼠[15]研究发现在第5周其对GAD耐受缺失。如何纠正T淋巴细胞对自身抗原GAD的识别障碍并诱导机体产生特异性针对GAD免疫耐受，进而阻断这类细胞对胰岛组织破坏，是对IDDM治疗成功所亟待解决的问题^[16-18]。

耐受载体IgG可为具有T细胞表位的抗原肽提供运载系统^[19-24]研究已有30多年历史，T.Scott等^[22.24]把λcI免疫显性表位序列p12-26的基因构建在IgG的重链N端，经B细胞呈递诱导出特异性免疫耐受，这提供抗原肽抗体诱导特异性免疫耐受的可行性。Rajeev等^[25]构建了葡萄膜炎相关抗原肽IRBP/IgG抗原肽抗体，利用逆转录病毒途径对葡萄膜炎小鼠进行基因治疗，证实抗原肽抗体诱导特异性耐受的可行性。免疫球蛋白作为抗原肽融合蛋白骨架的研究结果提示它在诱导免疫耐受中具有以下优点：(1)可以系统用药，(2)进入体内后可迅速分布于全身，(3)半寿期较长，可与各类抗原呈递细胞充分接触。(4)通过APC细胞上FcRII介导的负调控信号转导途径诱导免疫耐受的产生。

随后，Moustapha El-Aminem等^[26-34]采用把耐受原基因GAD片段移植在免疫球蛋白N端的融合子——GAD抗原肽抗体通过逆转录病毒对NOD小鼠进行基因治疗，GAD抗原肽抗体通过逆转录病毒感染脾脏B细胞后尾静脉回输NOD小鼠体内进行基因治疗，可诱导NOD小鼠产生特异性免疫耐受反应。Moustapha El-Aminem等认为B细胞抗原呈递是耐受诱导所必需的，研究认为获得特异性耐受的APC是静止的B细胞，而静止的B细胞的是缺少共刺激信号，因而，抗原肽抗体被B细胞提呈给Th细胞时，由于缺少B细胞共刺激信号的，导致特异性Th细胞的耐受。

载体的选择直接影响到基因治疗的安全性^[35-36]，所选的载体需要具备安全性好、对人体不致病、宿主范围广、理化性质优越、便于实验操作等特性。本发明选用的载体AAV为有以下特点^[35-36]：安全性好，迄今尚未见到野生型AAV对人体致病的报道，去除96％的野生型AAV基因组的重组AAV，可进一步保证使用安全性；宿主范围广，对处于分裂期和静止期细胞均有较好的转染效率；野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置；AAV-2基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作；物理性质稳定，在60℃下短时间内不能被灭活、能抗氯仿；重组AAV可长期稳定地表达外源基因。

本发明通过腺相关病毒载体(AAV)介导GAD、GAD-IgG、GADt或GADt-IgG，诱导机体淋巴细胞对自身GAD产生免疫耐受，达到对糖尿病进行有效治疗的目的。并且，它将为细胞免疫紊乱所致自身免疫性疾病的治疗提供新的手段，并有着广泛的临床应用前景。

目前国外应用致病抗原肽抗体的基因疗法治疗自身免疫性疾病正处于实验室研究阶段，我国尚未见到有关研究报导；而用GAD-IgG进行糖尿病的基因治疗在国内外尚未见到应用研究报导和专利。

发明内容 本发明提供了一种新的重组腺相关病毒及其用途。更具体地，本发明的重组腺相关病毒包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码谷氨酸脱羧酶肽(SEQ ID NO.2)或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白或编码谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白的核酸序列。

本发明的另一个方面是提供一种重组DNA分子，它含有编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽的基因(碱基序列见SEQ ID NO.2，氨基酸序列见碱基序列见SEQ ID NO.7)或者编码一种谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白的基因(碱基序列见SEQ IDNO.1，氨基酸序列见碱基序列见SEQ ID NO.8)，该融合蛋白和谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽都能够诱导机体产生免疫耐受。

本发明的又一个方面是提供一种包含本发明的重组DNA分子的重组病毒载体，该重组病毒载体中所包含的重组DNA分子核酸序列编码了能够诱导机体产生免疫耐受的谷氨酸脱羧酶肽或谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽或谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白或谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白，该重组病毒载体用于将所述重组DNA分子导入机体细胞。适合的病毒载体包括腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、新培斯病毒或鸡痘病毒。

本发明的另一方面是提供一种用于治疗和预防I型糖尿病的新的药物组合物。该药物组合物包含一种融合蛋白质，该蛋白质由谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白或由谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白组成，在一些药物组合物中该融合蛋白质可以是重组DNA分子在原核细胞中表达产物，也可以是真核细胞如酵母的表达产物。

本发明还提供了含编码融合蛋白(谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白或谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白)的本发明的重组DNA分子及合适的基因转运载体的药物组合物。

在一优选实施方案中，用PCR的方法以GAD-Ig/BSSK、Ig/BSSK两个质粒为摸板获得目的基因GAD、Ig、GAD-IgG，以GAD-Ig/BSSK为模板获得GAD_t、GAD_t-IgG，将上述目的基因(GAD、Ig、GAD-IgG、GAD_t、GAD_t-IgG)以特定的位点插入到表达载体pSNAV中，分别构建成真核表达载体pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD_t和pSNAV-GAD_t-IgG。将上述真核表达载体(pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD_t和pSNAV-GAD_t-IgG)分别导入细胞(可选的细胞包括：Vero细胞、BHK细胞、293细胞等)中进行选择培养，获得重组AAV病毒的生产细胞株，用辅助病毒rHSV1-rc感染该细胞株，感染复数moi 0.1～10，2～5天，细胞发生完全病变后收集病变细胞和培养液，此细胞和培养液中即含有大量的重组AAV病毒。将这些重组AAV病毒分别进行纯化，纯化方法为：用1/10体积的氯仿处理上述收集的病变细胞和培养液混合液，可极为有效地灭活其中含有的重组单纯疱疹病毒rHSV1-rc的生物活性，同时使大量的非目标蛋白质变性沉淀。离心去除沉淀和氯仿，取上清进一步浓缩和纯化重组AAV病毒。用聚乙二醇(PEG8000)和氯化钠沉淀重组AAV病毒。离心去除上清。沉淀用少量PBS缓冲液重悬、溶解。再用氯仿抽提此重悬的溶液，收取上清即可分别获得纯化的重组AAV病毒rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG。

对所构建的真核表达载体pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD_t和pSNAV-GAD_t-IgG进行了功能检测：用RT-PCR方法分别检测到GAD、Ig、GAD-IgG、GAD_t.GAD_t-IgG等的mRNA水平的表达；用Western blot分别检测到转染细胞中有GAD、Ig、GAD-IgG、GAD_t、GAD_t-IgG等蛋白的表达；用双夹心ELISA法进行的检测表明转染72小时的上清中有GAD、Ig、GAD-IgG、GAD_t、GAD_t-IgG等目的蛋白的表达。证明了所构建的载体是有表达活性的，而且目的蛋白是以分泌形式表达的。

在该实施方案中，用rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG通过肌注途径对NOD小鼠进行了实验，证实了rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG通过经肌肉途径对I型非肥胖性糖尿病(IDDM)的治疗是有效的。

在本发明中，所使用的术语定义如下：

“免疫耐受原”指能导致免疫耐受的抗原。

“Ig”也可写做：IgG、IgG1。

“GAD肽”指氨酸脱羧酶肽，也写为GAD。

“GADt肽”指谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位、也写为GADt。

“GADt-IgG”指谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白。

“GAD-IgG”指谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白。

附图说明

图1中，图1A为20周未发病的NOD小鼠，图1B为20周发病的NOD小鼠；

图2示小鼠胰腺组织切片，HE染色，100×，图2A为10周未发病的NOD小鼠胰腺，图2B为10周发病的NOD小鼠胰腺；

图3为NOD小鼠糖尿病自然发病率图；

图4为GAD、IgG和GAD-IgG等的基因的PCR电泳结果图，泳道1：Ig；泳道2：GAD；泳道3：GAD-Ig；泳道4：DL2000marker；

图5为T细胞表位肽分析图，提示GAD500-585序列对T细胞应答的免疫原性最强，因此理论值预测GAD500-585(即GADt)序列应为诱导特异性免疫耐受最佳选择基因片段；

图6中，图6A为GAD_t基因的PCR鉴定结果；图6B为GAD_t基因的酶切鉴定结果；图6C为GAD_t基因和GAD_t-IgG基因的酶切鉴定结果。泳道1：GAD_t-IgG，泳道2：GAD_t；

图7为将GAD、Ig、GAD-IgG、GAD_t和GAD_t-IgG等的基因片段分别构建到AAV载体(pSNAV)上的流程图；

图8用rAAV-EGFP病毒^[37]感染BHK-21细胞效率检测图，从上至下病毒细胞比分别为1×10⁶∶1、1.5×10⁶∶1、2.5×10⁶∶1、7.25×10⁶∶1、9×10⁶∶1；

图9为rAAV病毒制备流程图；

图10为用RT-PCR检测BHK细胞中mRNA水平上GAD、IgG、GAD-IgG、GAD_t、GAD_t-Ig转染细胞后的表达的电泳图。泳道1：未转染，泳道2：转染了rAAV/GAD，泳道3：转染了rAAV/GAD-IgG，IgG基因片段扩增结果，泳道4：未转染，泳道5：转染了rAAV/IgG，泳道6：转染了rAAV/GAD-IgG，GAD_t基因片段扩增结果，泳道7：未转染rAAV/GAD_t，泳道8：转染了rAAV/GAD_t，泳道9：转染了rAAV/GAD_t-IgG；

图11为Western Blot分析的结果：图11A中泳道2：羊抗小鼠IgG抗体可检测到GAD-IgG/AAV-BHK中的110KDa GAD-IgG融合蛋白，泳道1：未转染BHK未检测到；图11B中泳道2：抗GAD抗体可检测到GAD-IgG/AAV-BHK中的110KDa的GAD-IgG融合蛋白，泳道1：未转染BHK未检测到；图11C中泳道2：羊抗小鼠抗IgG抗体可检测到IgG/AAV-BHK中的50KDa的IgG蛋白，泳道1：未转染BHK未检测到；图11D中泳道2：抗GAD抗体可检测到GAD/AAV-BHK中的60KDaGAD蛋白，泳道1：未转染BHK未检测到；图11E中泳道2和泳道3：羊抗小鼠IgG抗体可检测到GAD_t-IgG/AAV-BHK中的50KDa的IgG蛋白，泳道1：未转染BHK未检测到；图11F中泳道2：抗GAD抗体可检测到GAD_t/AAV-BHK中的9.35KDaGAD_t蛋白，泳道1：未转染BHK未检测到。

图12为利用抗GAD抗体和羊抗小鼠IgG-HRP抗体进行的双夹芯ELISA方法，测定rAAV/IgG、rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG感染BHK细胞后48小时的上清的结果，与对照BHK细胞的结果相比，rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG感染组相应的GAD和GAD-IgG的表达量在48小时均明显增加，与对照相比差异显著，P值分别为：P<0.01和P<0.05。

图13为不同治疗组的脾淋巴细胞对GAD_t蛋白刺激的应答反应(^**：P<0.05)，肌肉注射rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG后4周，取脾淋巴细胞用GAD刺激，与对照组和单独使用rAAV/IgG组比较，对GAD刺激应答的刺激指数性明显降低，rAAV/GAD组和rAAV/GAD-IgG组的淋巴细胞已产生对GAD的特异性免疫耐受；

图14为不同治疗组的脾淋巴细胞对GADt蛋白刺激的应答反应(^*p<0.1)，rAAV/GAD(1 x 10¹¹v.g/只)和rAAV/GAD-IgG(1 x 10¹¹v.g/只)对7周龄的NOD小鼠臀部肌肉注射，在治疗第8周取NOD小鼠脾淋巴细胞，体外用GAD_t蛋白刺激，AAV组、rAAV/IgG组、rAAV/GAD组、rAAV/GAD-IgG组的刺激率；

图15为用rAAV/GAD和rAAV/GAD-IgG治疗28周的胰腺组织的病理学分析结果，图15A：正常胰腺；图15B：rAAV/Ig组胰腺；图15C：rAAV/GAD-Ig组胰腺；

图16为不同治疗组的脾淋巴细胞对GAD_t蛋白刺激的应答反应：rAAV/GAD_t和rAAV/GAD_t-IgG对7周龄的NOD小鼠臀部肌肉注射，在治疗第8周取NOD小鼠脾淋巴细胞，体外用GAD_t蛋白刺激，以刺激率判断各治疗组对二次应答的免疫耐受程度，结果表明与对照组比较治疗第8周rAAV/GAD_t和rAAV/GAD_t-IgG组的免疫应答反应均明显下降，提示经rAAV/GAD_t和rAAV/GAD_t-IgG治疗8周后，NOD小鼠体内的淋巴细胞已对GAD_t产生特异性免疫耐受。组1：AAV组，组2：rAAV/IgG组，组3：rAAV/GAD_t组，组4：rAAV/GAD_t-IgG组。

图17为GAD-Ig/BSSK、Ig/BSSK的构建过程图；

图18为基因重组DNA分子中编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白的DNA序列，共含有1671个核苷酸组成。

图19表示基因重组DNA分子中编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽的DNA序列，共含有339个核苷酸组成。

图20表示基因重组DNA分子表达产物—谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白的氨基酸序列，由556个氨基酸残基组成。

图21表示基因重组DNA分子表达产物—谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽的氨基酸序列，由112个氨基酸残基组成。

具体实施方式 通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。

实施例1.载体pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD_t和pSNAV-GAD_t-IgG的构建

GAD(引物见引物7、8)和Ig的cDNA(引物见引物7、8)通过RT-PCR方法分别从小鼠胰腺细胞和B淋巴细胞中钓取，然后在BSSK质粒(GENE BANK：L08787)基础上构建GAD-Ig/BSSK、Ig/BSSK。

引物7(上游)：5/CGG GCGGCCGCGGCTCTGCTCTATGGAGACTCC3(SEQ ID NO.15)

                   NotI

引物8(下游)：5 CCG CTCGAG TAA TCT TGT CCG AGG CGT T3/(SEQ ID NO.16)

                   XhoI

引物9(上游)：5/CGG GCGGCCGCGCGGCGGC CTCGAG ATG GGA TGG AGC TGT AT3/(SEQ ID NO.17)

                    NotI            XhoI

引物10(下游)：5 CCG GAA TTC GGA TCA TTT ACC AGG3/(SEQ ID NO.18)

                    EcoRI

所获得的Ig的cDNA与GAD分别和BSSK载体通过NotI和EcoRI双酶切构建成GAD/BSSK和Ig/BSSK；然后Ig/BSSK与IgG1的重链信号肽(序列为：5/GGTACCGCGGCCGC3，序列表SEQ I2 NO.19，通过化学合成)通过KpnI和NotI双酶切后构建成带IgG1的重链信号肽的Ig/BSSK(在文中所提到的Ig/BSSK都指带IgG1的重链信号肽的Ig/BSSK)，把GAD的cDNA通过NotI和EcoRI插入到带IgG1的重链信号肽的Ig/BSSK中构建成GAD-Ig/BSSK；

以GAD-Ig/BSSK为模板通过PCR扩增出两种GAD_t：其中一个末尾带终止密码子用于构建GAD_t/BSSK(用引物11和12)；另一个末尾不带终止密码子的GAD_t插入到IgG1的信号肽序列与IgG1的重链N端构建成GAD_t-Ig/BSSK(用引物13和14)，所用引物为：

引物11上游5‘ATAAGAATGCGGCCGCCACAAATGTCTGCTTC 3’，(SEQ ID NO.3)

引物12下游5‘CCCAAGCTTGTCGACTTACAAATCTTGTCCGAGG 3’(SEQ ID NO.4)

引物13：上游5‘ATAAGAATGCGGCCGCCACAAATGTCTGCTTC3’(SEQ ID NO.5)

引物14：下游5‘CCGCTCGAGCAAATCTTGTCCGAGG 3’(SEQ ID NO.6)

GAD_t-Ig/BSSK的构建：将不带终止密码子的GAD_t用上述方法(与构建GAD-Ig/BSSK的方法和步骤相同)构建成GAD_t-Ig/BSSK。

将通用型AAV质粒载体pSNAV(中国专利申请号：99119038.6，发明名称：系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途)，以Kpn I和EcoRI双酶切后，回收大片段，得到含有粘性末端的pSNAV载体片段。将GAD/BSSK，Ig/BSSK，GAD-Ig/BSSK，，GADt/BSSKGAD_t-Ig/BSSK，分别以Kpn I和EcoRI双酶切后，回收小片段，将酶切后的pSNAV载体片段与以上所得的5个小片段分别连接成pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD_t和pSNAV-GAD_t-IgG。然后进行连接产物的转化、小量提取纯化质粒DNA。

GAD肽、IgG和GAD-IgG等的基因鉴定：将实施例1中所获得的IgG、GAD、GAD-Ig等基因进行电泳检测(见图4)。

GADt(GAD相关T细胞表位肽)和GADt-IgG与T细胞表位分析和基因鉴定，进行GAD相关T细胞表位肽分析(结果见图3)。T细胞表位肽分析提示GAD相关T细胞表位GAD500-585的序列所表达的蛋白对T细胞应答的免疫原性最强，因此理论值预测GAD500-585(GADt)序列应为诱导特异性免疫耐受最佳选择基因片段。

GADt基因的鉴定(见图5)；GADt基因的PCR鉴定、GADt的酶切鉴定、GADt和GADt-IgG的酶切鉴定(见附图6)

实施例2 rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG等重组AAV病毒的制备和获得

将上述实施例1获得的pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD_t、pSNAV-GAD_t-IgG质粒分别用于重组病毒rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG的制备和获得，其方法采用的是吴小兵等所申请的专利的方法(中国专利申请号：98120033.8，发明名称：用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的产生及其用途；中国专利申请号：99119039.4，发明名称：可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途；中国专利申请号：99123723.4，发明名称：一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途)。具体步骤如下：

步骤1.5种病毒载体细胞株的建立

用pSNAV-GAD、pSNAV-Ig、pSNAV-GAD-IgG、pSNAV-GAD和pSNAV-GAD_t-IgG载体质粒分别转染BHK细胞经选择性培养得到病毒载体细胞株BHK/pSNAV-GAD、BHK/pSNAV-Ig、BHK/pSNAV-GAD-Ig、BHK/pSNAV-GADt、BHK/pSNAV-GADt-Ig。

BHK细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液37℃培养。将上述5种质粒分别用脂质体lipofectamine(GIBCO BRL)转染BHK细胞，24hr后消化，1∶2～5传代。加G418，剂量为800μg/ml，进行选择性培养。10天后可形成明显的抗性细胞克隆。将细胞克隆挑出继续培养并进行冻存保种。

用全功能辅助病毒rHSV1-rc(中国专利申请号：98120033.8，发明名称：用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的产生及其用途)感染所获得的克隆化培养的病毒载体细胞，待细胞出毒后收获细胞及其培养液，以进行细胞株和产量能力的鉴定。

步骤2.制备重组病毒rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG

将上述获得的克隆化培养的5种病毒载体细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液继续于37℃培养至大量滚瓶培养规模，在细胞达到一定数量后，用全功能辅助病毒HSV1-rc感染扩大培养的细胞。待细胞出毒后收获细胞及其培养液，采用下述步骤进行重组病毒rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG的分离和纯化：1)氯仿破碎细胞、灭活HSV辅助病毒及使大量细胞蛋白变性沉淀；2)用DNaseI和RNase处理细胞裂解液以降解核酸；3)加NaCl促使rAAV与细胞碎片分离，离心去除细胞碎片；4)用PEG/NaCl沉淀rAAV；5)用氯仿抽提去除杂蛋白和残余的PEG；6)透析除盐；7)用密度梯度离心法或亲和层析法进一步纯化rAAV。

用RT-PCR法检测GAD、IgG和GADt的mRNA的表达：分别用rAAV/GAD、rAAV/IgG、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt、rAAV/GADt-IgG等病毒(制备过程见图9)感染BHK细胞，用RT-PCR方法检测BHK细胞中各病毒转录的的mRNA水平，GAD(其引物见引物1、2)、IgG(其引物见引物3、4)、GAD-IgG(其引物见引物1、2、3、4)、GADt(其引物见引物5、6)、GADt-IgG(其引物见引物3、4、5、6、)的表达，结果见图10。

引物1：上游：5/ATAAGAATGCGGCCGCCACTAACATGTTCACC3/(SEQ IDNO.9)

引物2：下游：5/CCCAAGCTTGTCGACTTAAATCACACTGTCTGTTC3/(SEQ IDNO.10)

引物3：上游：5/GCA AGG CTT CTG GCTA3/(SEQ IDNO.11)

引物4：下游：5/GAG AGT GGG AGA GGC T3/(SEQ IDNO.12)

引物5：上游5‘ATAAGAATGCGGCCGCCACAAATGTCTGCTTC 3’，(SEQ IDNO.13)

引物6：下游5‘CCCAAGCTTGTCGACTTACAAATCTTGTCCGAGG3’(SEQ IDNO.14)

电泳鉴定结果1.未转染BHK，2.转染GAD/AAV-BHK，3.转染GAD-IgG/AAV-BHK，IgG基因片段扩增结果：4.未转染BHK，5.转染IgG/AAV-BHK，6.转染GAD-IgG/AAV-BHK，GADt基因片段扩增结果：7.未转染GADt/AAV-BHK，8.转染GADt/AAV-BHK，9.转染GADt-IgG/AAV-BHK。RT-PCR结果证实GAD、IgG、GAD-IgG、GADt和GADt-IgG经AAV病毒载体途径，均能在感染BHK细胞中检测到它们的mRNA水平表达。

Western Blot检测感染BHK细胞中的GAD和IgG蛋白水平的表达：Western Blot分析提示：图11-A.2：羊抗小鼠IgG抗体可检测GAD-IgG/AAV-BHK中的110KDaGAD-IgG融合蛋白，1：未转染BHK未检测到；图11-B.2：抗GAD抗体可检测到GAD-IgG/AAV-BHK中的110KDaGAD-IgG融合蛋白，1：未转染BHK未检测到；图11-C.2：羊抗小鼠抗IgG抗体可检测到IgG/AAV-BHK中的50KDa的IgG蛋白，1：未转染BHK未检测到；图11-D.2：抗GAD抗体可检测到GAD/AAV-BHK中的60KDa GAD蛋白，1：未转染BHK未检测到；图11-E.2、3：羊抗小鼠IgG抗体可检测到GADt-IgG/AAV-BHK中的50KDa的IgG蛋白，1：未转染BHK未检测到；图11-F.2：抗GAD抗体可检测到GAD t/AAV-BHK中的9.35KDaGAD t蛋白，1：未转染BHK未检测到。Western Blot结果证实经AAV途介导的GAD、GAD-IgG、IgG、GADt和GADt-IgG基因均能在细胞中通过蛋白翻译正确的表达。

ELISA检测转染细胞上清中分泌型GAD、GAD-IgG、IgG、GADt和GADt-IgG蛋白：收集IgG/AAV、GAD/AAV和GAD-IgG/AAV感染BHK细胞后48小时的上清，利用抗GAD抗体和羊抗小鼠IgG-HRP抗体双夹芯ELISA方法测定，结果如图12所示。与对照BHK细胞比较，GAD/AAV和GAD-IgG/AAV感染组的GAD和GAD-IgG量在48小时均明显增加，与对照相比P<0.01和P<0.05。说明蛋白是以分泌形式表达的。

实施例3 I型非肥胖性糖尿病小鼠(NOD)动物模型的鉴定

本发明中涉及到的非肥胖型糖尿病小鼠(nonobese diabetic，NOD小鼠)，是一类自发性自身免疫性疾病的小鼠，是研究人类I型糖尿病的理想动物模型(1，Ramiya VK，Lan MS，Wasserfall CH，et al.Immu nization therapies in the prevention of diabetes.J Autoimmun，1997，10：287-292.)。发病雌性NOD小鼠在出生第5周出现对自身GAD耐受缺失，出生第8-10周胰岛组织中可出现大量淋巴、单核细胞的浸润，出生第12周血糖持续性增高，随周龄增长糖尿病发病率可高达80％以上。

NOD小鼠来源及饲养条件：NOD/LtJ小鼠由中国医学科学院实验动物研究所购入，此为1998年从美国Jackson实验室引进的NOD小鼠品系，引进后经保种、近交、遗传检测，购入的NOD小鼠在军事医学科学院实验动物中心SPF级动物房中饲养。

NOD小鼠的表型观察：与20周未发病NOD小鼠(图1A)比较，20周发病NOD小鼠(图1B)，毛发竖起，不光滑，动作迟缓，精神差等符合糖尿病的典型特征。

NOD小鼠胰腺病理分析：NOD鼠胰腺组织病理分析结果表明：与10周未发病NOD小鼠胰腺组织(图2A)比较，发病NOD鼠胰岛(图2B)中可见到大量淋巴单核细胞的浸润。

雌性NOD小鼠自发性糖尿病模型：利用血糖检测方法，对100只出生第7周到第26周雌性NOD鼠的血糖进行了动态观察，血糖值持续≥11.3时，即可确定为糖尿病。结果表明NOD小鼠从出生第12周出现血糖增高，随周龄增长血糖呈持续性增高，24周龄NOD小鼠的糖尿病发病率可高达80％以上(图3)。

实施例4 GAD表达蛋白对rAAV/GAD-IgG处理后的淋巴细胞免疫应答效应特异性免疫应答反应试验技术路线：

实验结果(见图13)表明：肌肉注射rAAV/GAD和rAAV/GAD-Ig后4周，取脾淋巴细胞用GAD刺激，与对照组和单独rAAV/Ig组比较，对GAD刺激应达的刺激指数性明显降低，rAAV/GAD和rAAV/GAD-Ig组的淋巴细胞已产生对GAD的特异性免疫耐受。

实施例5 rAAV/GAD、rAAV/Ig、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GAD_t和rAAV/GAD_t-IgG的治疗对NOD鼠糖尿病发病的影响

检测用rAAV-EGFP病毒^[37]感染BHK-21细胞效率，病毒细胞比分别为1×10⁶∶1、1.5×10⁶∶1、2.5×10⁶∶1、7.25×10⁶∶1、9×10⁶∶1，结果(见图8)显示：病毒细胞比在1.5×10⁶v.g-7.25×10⁶v.g：1是合适的。

1.AAV载体对NOD小鼠糖尿病发病的影响

分别取AAV(3 x 10¹¹v.g/只)和等量生理盐水，对7周龄的NOD小鼠臀部肌肉注射；在治疗第12周后，每两周检测各治疗组NOD小鼠的血糖值，当血糖连续3次≥11.3，即可确定为糖尿病。结果见表1.

生理盐水和单独应用AAV组的比较证实，AAV载体对NOD小鼠的糖尿病的发病率无明显影响。

表1 AAV载体对NOD小鼠糖尿病发病率的影响

(n＝10)

2.IgG对NOD小鼠糖尿病发病的影响

分别取rAAV/Ig(1 x 10¹¹v.g/只)和AAV(1 x 10¹¹v.g/只)，对7周龄的NOD小鼠臀部肌肉注射；在治疗第12周后，每两周检测各治疗组NOD小鼠的血糖值，检测IgG对NOD小鼠糖尿病发病的影响，结果如表2所示。

表2 IgG对NOD小鼠糖尿病发病率的影响

(n＝20)

3.rAAV/GAD和rAAV/GAD-IgG对NOD小鼠糖尿病的治疗效果

分别取rAAV/GAD(1 x 10¹¹v.g/只)和rAAV/GAD-IgG(1 x 10¹¹v.g/只)，对7周龄的NOD小鼠臀部肌肉注射；在治疗第8周取NOD小鼠脾淋巴细胞，体外用GADt蛋白刺激，以刺激率(刺激率％＝实验组刺激指数/对照组刺激指数x100)判断各治疗组对二次应答的免疫耐受程度(图14)。

结果表明与对照组比较治疗第8周，rAAV/GAD-IgG组对GADt蛋白刺激的应答反应下降，提示有特异性免疫耐受的诱导趋势；而GAD/AAV治疗组的未出现特异性免疫应答下降的趋势。同时在治疗第12周后，每两周检测各治疗组NOD小鼠的血糖值，分析rAAV/GAD和rAAV/GAD-IgG通过自身的诱导特异性免疫耐受对NOD小鼠糖尿病发病的影响(见表3)。

表3 rAAV/GAD和rAAV/GAD-IgG对NOD小鼠糖尿病的发病率影响

(n＝20)

表3结果表明，经rAAV/GAD或rAAV/GAD-IgG治疗后第16周，糖尿病发病率均低于rAAV/Ig对照组，随治疗检测时间延长到第20周，可以见到rAAV/GAD或rAAV/GAD-IgG组的糖尿病发病率均低于40％，而IgG/AAV对照组发病率则高于60％；治疗第22周至28周时，rAAV/GAD-IgG组的糖尿病发病率持续在60-70％之间，在治疗第22-24周期间，rAAV/GAD组糖尿病发病率低于56％，随治疗时间的延长，糖尿病发病率逐渐接近rAAV/Ig对照组。

取经rAAV/GAD和rAAV/GAD-IgG治疗28周的胰腺组织，病理学分析结果图15为小鼠胰腺组织切片，HE染色，100×，其中图A：正常胰腺；图15B：rAAV/Ig组胰腺；图15C：rAAV/GAD-IgG组胰腺。正常胰腺组织中胰岛周边清晰，没有淋巴单核细胞浸润，如图15A；rAAV/Ig治疗组胰腺组织中胰岛组织周边不清晰，并出现大量淋巴单核细胞浸润和破坏，胰岛已萎缩，如图15B；rAAV/GAD-IgG治疗组胰腺组织中胰岛组织周边清晰，未见淋巴单核细胞的浸润，胰岛组织形态与正常相同，如图15C所示。

以上结果提示rAAV/GAD治疗组从第7周至24周期间，NOD小鼠糖尿病的发病率明显降低；rAAV/GAD-IgG治疗治疗第7周至28周发病率明显降低；并胰腺组织病理分析也提示GAD-IgG治疗可降低淋巴单核细胞对胰岛组织浸润程度，既rAAV/GAD或rAAV/GAD-IgG经肌疗途径对IDDM的治疗是有效的。

实施例6 rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG对NOD小鼠糖尿病的治疗效果

为提高GAD或GAD-IgG对自身T淋巴细胞特异免疫耐受性，达到对NOD小鼠糖尿病的更有效的治疗效果；取分别取rAAV/GADt(3 x 10¹¹v.g/只)和rAAV/GADt-IgG(3 x 10¹¹v.g/只)，对7周龄的NOD小鼠臀部肌肉注射；在治疗第8周取NOD小鼠脾淋巴细胞，体外用GADt蛋白刺激，以刺激率判断各治疗组对二次应答的免疫耐受程度(图16)；结果表明与对照组比较治疗第8周，rAAV/GADt-和rAAV/GADt-IgG组的应答反应均明显下降，提示经rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG治疗8周后，NOD小鼠体内的淋巴细胞已对GADt产生特异性免疫耐受。结果见表4

表4 rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG对NOD小鼠糖尿病的发病率影响

(n＝6)

表4结果表明，经rAAV/GADt治疗后至第20周前，糖尿病发病率持续为0；第20周至24周前，发病率由0增至17％，治疗第24周至30周期间，尽管治疗组的部分NOD小鼠血糖值超过11.3被确认为糖尿病，但随治疗时间延长至第30周，血糖值逐步下降使得糖尿病的发病率降至第24周的水平，提示尽管rAAV/GAD和rAAV/GADt均可有效地治疗NOD小鼠的糖尿病；但应用T淋巴细胞表位肽制备的GADt/AAV对糖尿病的治疗效果明显优于rAAV/GAD组；rAAV/GADt-IgG治疗20周前，糖尿病发病率在50％以下，治疗第20-30周期间糖尿病的发病率则接近rAAV/IgG对照组。

由于NOD小鼠因遗传因素，在出生第5周出现糖尿病病变，12周开始出现血糖异常增高症状，而rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG是在NOD小鼠出生第7周进行治疗的，在通过肌肉注射一次后8周，免疫应答结果证实rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG治疗组的淋巴细胞对GAD或GADt的刺激产生了耐受效应；并且从第7周治疗开始观察到rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG治疗组的糖尿病发病率分别得到不同程度的控制；胰腺病理学分析提示，经AAV途径介导的GAD-Ig在治疗组的NOD体内有效的抑制了自身T细胞对胰腺组织细胞的攻击；相反，Ig治疗组胰岛被淋巴单核细胞浸润和破坏，胰岛已萎缩，这与NOD鼠糖尿病发病率的高低相吻合。以上实验结果证实了rAAV/GAD、rAAV/GAD-IgG、rAAV/GADt和rAAV/GADt-IgG通过经肌肉途径对I型非肥胖性糖尿病(IDDM)的治疗是有效的。

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序列表

<110>本元正阳基因技术股份有限公司

     军事医学科学院基础研究所

<120>用于治疗和预防I型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途

<160>19

<210>1

<211>556

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白

<400>1

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽

<400>2

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于末尾带终止密码子的GADt基因的上游引物

<400>3

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于末尾带终止密码子GADt基因的下游引物

<400>4

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于末尾不带终止密码子GADt基因的上游引物

<400>5

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于末尾不带终止密码子GADt基因的下游引物

<400>6

<210>7

<211>339

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GADt

<400>7

<210>8

<211>1671

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GADt-Ig

<400>8

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RT-PCR检测GAD基因的上游引物

<400>9

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RT-PCR检测GAD基因的下游引物

<400>10

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RT-PCR检测Ig基因的上游引物

<400>11

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RT-PCR检测Ig基因的下游引物

<400>12

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RT-PCR检测GADt基因的上游引物

<400>13

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RT-PCR检测GADt基因的下游引物

<400>14

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于GAD的cDNA进行RT-PCR的上游引物

<400>15

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于GAD的cDNA进行RT-PCR的下游引物

<400>16

<210>17

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于IgG1的重链cDNA进行RT-PCR的上游引物

<400>17

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于IgG1的重链cDNA进行RT-PCR的下游引物

<400>18

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IgG1的重链信号肽的碱基序列

<400>19

Claims (9)

1、一种重组DNA分子，其编码谷氨酸脱羧酶T细胞表位肽GAD500-585，或者编码上述谷氨酸脱羧酶T细胞表位肽GAD500-585和免疫球蛋白的融合蛋白，其序列分别是序列表中SEQID NO.7或SEQ ID NO.8所示的序列。

2、一种融合蛋白，其由谷氨酸脱羧酶T细胞表位肽和免疫球蛋白组成，所述表位肽是由序列为序列表中SEQ ID No.7所表示的重组DNA分子编码。

3、如权利要求2所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4、一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5、一种重组病毒载体，其病毒内包含了权利要求1的重组DNA分子，所述病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、新培斯病毒或鸡痘病毒。

6、如权利要求5所述的重组病毒载体，其为包含权利要求1的重组DNA分子的重组腺相关病毒。

7、一种药物组合物，其包含权利要求1的重组DNA分子及合适的基因转运载体。

8、一种药物组合物，其包含权利要求2或3的融合蛋白及药物学可接受的载体。

9、权利要求1的重组DNA分子或者权利要求2或3的融合蛋白或者权利要求4的蛋白质或者权利要求5或6的重组病毒载体在制备用于治疗和预防I型糖尿病的药物中的应用。

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