CN1832963A - 同种排斥反应的特异性抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性抑制对同种抗原的细胞和体液免疫应答的方法和组合物，因此可用于延长同种异体移植物的存活和治疗移植受体内的移植物抗宿主疾病。

Description

同种排斥反应的特异性抑制
涉及申请的交叉参考
本申请要求2003年3月19日提交的临时申请序列号60/456,378的优先权。
发明领域
本发明涉及免疫抑制治疗，更具体地，涉及用于改善移植后果的方法和组合物，其通过特异地抑制对供体器官、组织和细胞的受体内的供体抗原或宿主抗原的免疫应答。
发明背景
同种器官、组织和细胞的移植对广泛的退变性疾病和恶性疾病治疗已经变得越来越重要。但是，这类同种异体移植物的使用受到由供体和受体间抗原的不同引起的移植物排斥反应和/或移植物抗宿主疾病(GVHD)的限制，所述疾病最初有主要组织相容性复合物(“MHC”)的抗原参与。因此非淋巴的供体组织和固体器官的成功移植依赖于防止宿主对供体抗原的免疫应答。相反地，在供体淋巴细胞和淋巴组织的移植例如骨髓移植(“BMT”)过程中，为避免GVHD，预防供体抗宿主细胞和组织的免疫应答是必需的。
同种反应性T细胞的激发可以通过供体MHC分子促进的直接同种识别途径，和通过间接的同种识别途径，其中由受体抗原呈递细胞(APC)在自身MHC的参与下对供体抗原进行加工和呈递。Heeger，Am J.Transpl.3：525-533(2003).Both CD4+ helper T cells as well as CD8+ cytotoxic Tcells(CTL)play important roles in the alloantigen immune response。CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒T细胞(CTL)在同种抗原免疫应答中起重要作用。直接和间接激活的CD4+T细胞有助于同种抗体的产生和提供诱导CD8+CTL所需的信号，这两者都能损伤移植物。Id.鉴于它们在介导对同种抗原的免疫应答的细胞和体液成分中的重要作用，一些评论家认为对同种排斥反应必需的是CD4+T辅助细胞而不是CD8+CTL。Krieger eta/.，J.Exp.Med.184：2013-2018(1996)。在任何情况下，任何直接抗同种排斥反应的免疫抑制策略的成功依靠其抑制两种T细胞亚群具体是CD4+T细胞活性的能力。
目前的治疗方案使用对宿主免疫系统的全面免疫抑制以削弱两类T细胞的活性。大多数治疗方案包括在移植时的全面诱导相，一般包括使用强的T细胞耗竭剂，例如抗-CD3抗体(例如，OKT3)或抗-胸腺细胞球蛋白并联合高剂量类固醇，随后在受体生命中长期给予普通免疫抑制剂例如环孢霉素(cyclosporin)A(CsA)，他克莫司(tacrolimus)(FK-506)，西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(Rapamycin))，硫唑嘌呤(Imuran))和mycophenylatemofetil(CellCeptO)。通过持续抑制受体的一般免疫应答，能够增强移植物的存活。
这种普通免疫抑制方法的全面性需要受体和他们的临床医生在该受体整个生存时间里持续且平衡的作用，目的是达到足够的免疫抑制以防止移植排斥，但又不致过分而因偶然的感染严重影响受体健康。不幸的是，即使免疫抑制的正确平衡也增加受体感染的风险，并且加上病毒感染和持续T细胞抑制可导致移植受体特有的多种血液学恶性疾病，诸如移植后淋巴增生异常((PTLD)。明显地，非常需要避免对受体免疫系统全面抑制的更特异的免疫抑制手段。
在经济上和生理上两方面，目前治疗方法的长期性是另外一个主要问题。维持免疫抑制治疗的年花费可以达到$10,000之多。更重要地，目前用于维持治疗的所有免疫抑制剂都有明显的毒副作用，其使它们的长期应用变复杂。例如，目前用于维持免疫抑制的两种主要药物，CsA和FK506，与随时间的明显的肾脏毒性有关。矛盾的是，在某些情况下，移植受体的长期免疫抑制在几年后由于维持治疗导致受体肾脏破坏，致使需要另外的器官移植。明显地，也非常需要免疫抑制手段，其减少或更理想地免去长期给予这些类型普通免疫抑制剂的需要。
因此，在移植免疫生物学里主要的未满足的需要是开发专门控制对同种抗原反应的更特异的免疫抑制手段。理想地，这些手段可以抑制同种排斥反应而不需要连续的普通药物免疫抑制和随之而来的并发症和花费。达到对这种同种抗原的特异免疫耐受可以改善移植物的寿命和受体的生存质量，并且同时明显改善移植治疗的费用影响。本发明达到了这些此前难以达到的目的。
相关文献概述
已知当已经通过其T细胞受体复合物接受信号的CTL也通过其MHCI类分子的α3结构域接受信号时，MHC I类限制性T细胞(例如CD8+CTL)的活化可以被抑制。这种所谓的否决(veto)信号可以被刺激物或“否决”细胞表达的CD8分子传递。Sambhara and Miller，Science 252：1424-1427(1991)。引起的免疫抑制既是抗原特异的也是MHC限制的，并且是由于反应性CTL单向识别否决细胞的结果，而反之不然。Rammensee etal.，Eur.J.ImmunoL 12：930-934(1982)；Fink eta/.，J.Exp.Med.157：141-154(1983)；Rammenseeet al.，J.ImmunoL 132：668-672(1984)。由于否决活性与CD8α(alpha)链的存在相联系，因此如果CD8的表达被删除则否决功能丧失，当CD8α链表达时否决功能建立。Hambor et al.，J.Immunol.145：1646-1652(1990)；Hambor etal.，Intem.Immunol.2：8856-8879(1990)；Kaplanet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8512-8515(1989)。
已经提出了多种策略来开发抗原特异的抑制方法以减轻不希望的细胞毒T细胞应答。一种这样的策略包括使用多肽偶联物将CD8或其功能结构域共价连接于指导CD8对特异靶细胞的否决活性的第二配体。参见例如美国专利第5,242,687，5,601,828和5,623,056号。或者，已经研究了杂合抗体分子，其具有对结合于CD8α链细胞外结构域的MHC I类分子特异的单克隆抗体结合位点。Qi etal.，J.Exp.Med.183：1973-1980(1996)。但是这种分子有几个缺陷，而且还没有发现真正的临床效用。
最近，国际PCT公开号WO 02/102852描述了使用可溶性C8 α-链变体的CTL的抑制，其中该变体具有设计来提高对MHC I类分子亲和性的氨基酸修饰。明显地，与前述的领域一致，其说明提出的CD8α组合物是对MHC I类分子特异的，并且因此希望仅抑制CD8+CTL的应答。Id.27页。进一步显示在包括细胞和体液免疫应答的其他因素例如，MHC II类限制性T细胞如CD4+T细胞的情况下，与其他免疫抑制剂的联合是需要的。Id.28页。
发明概述
本发明以以下意外发现为基础：靶向的CD8α表达介导的否决效应可以有效并特异地抑制反应性CD4+T细胞(MHC II类限制的)和CD8+T细胞(MHC I类限制的)，并结果致使抗同种抗原的免疫应答中细胞和体液成分都因此被抑制。因此，使用这里描述的组合物和方法，人们可以选择性地抑制针对或者供体或者宿主抗原的同种排斥作用而不需要长期给予普通免疫抑制剂，有效地达到对供体组织，器官和/或细胞的特异的免疫耐受。
按照发明，为了延长同种异体移植物的存活和保护移植受体的健康，依靠同种异体移植物的性质，提供特异性抑制对供体和/或宿主抗原的同种抗原应答的方法和组合物。优选地，受试组合物和方法能抑制对这种同种抗原的体液和细胞免疫应答两者。更优选地，受试组合物和方法能诱导对这种同种抗原的稳定且特异的免疫耐受而不需要长期免疫抑制治疗。
一方面，提供特异性抑制对同种抗原免疫应答的方法，包括将表达至少一种所述同种抗原的靶细胞与编码CD8多肽全部或功能部分的表达载体接触，其中CD8优选人CD8多肽，更优选人CD8α链，借此CD8多肽由靶细胞表达并因此针对同种抗原的同种异体免疫应答被特异性抑制。在一个实施方案中，同种抗原包括供体的同种抗原且靶细胞包括同种异体移植物细胞。在另一实施方案中，同种抗原包括受体同种抗原且靶细胞包括受体细胞。在进一步的实施方案中，同种异体免疫应答既包括体液成分也包括细胞成分。在优选实施方案中，同种异体免疫应答被有效抑制而不需要普通免疫抑制剂。
另一方面，提供特异性抑制对供体同种抗原的免疫应答，包括在体内或离体条件下调节供体同种异体移植物细胞使之表达CD8多肽全部或功能部分，所述CD8多肽优选人CD8多肽，更优选人CD8α链。在一个实施方案中，调节步骤包括将移植物细胞在体内或离体条件下与编码CD8多肽全部或功能部分的表达载体接触，借此CD8多肽由移植物细胞表达并且因此针对供体同种抗原的受体免疫应答被特异性抑制。优选地，受体同种异体免疫应答的细胞和体液成分都被有效且特异地抑制而不需要普通免疫抑制剂。
另一方面，提供特异性抑制对受体同种抗原的免疫应答的方法，包括体内调节使受体细胞使之表达CD8多肽全部或功能部分，所述CD8优选人CD8多肽，更优选人CD8α链。优选用于受试调节步骤的受体细胞包括那些发现于GVHD免疫应答风险最高的受体组织和器官，例如肝脏，皮肤和肠道中的细胞。在一个实施方案中，所述调节步骤包括将这种受体细胞体内与编码CD8多肽全部或功能部分的表达载体接触，借此CD8多肽被该细胞表达，并因此针对受体同种抗原的供体免疫应答被特异性抑制。优选地，供体同种异体免疫应答被有效且特异地抑制而不需要普通免疫抑制剂。
也提供的是延长移植物在受体内存活的方法，包括在体内或离体条件下调节移植物细胞使表达CD8多肽全部或功能部分，所述CD8优选人CD8多肽，更优选人CD8α链。在一个实施方案中，所述调节步骤包括将移植物细胞在体内或离体条件下与编码CD8多肽全部或功能部分的表达载体接触，其中CD8多肽被移植物细胞表达并因此使移植物在受体内的存活时间被延长。优选地，所述调节步骤在移植物移植之前或同时进行。还更优选地，所述调节步骤在同种异体移植物的移植前离体进行，或于收获同种异体移植物之前或同时在供体体内进行。最优选地，受试方法的使用有效诱导对移植物的稳定的免疫耐受，因此不需要长期给予普通免疫抑制剂。
也提供抑制受体内GVHD的方法，包括在体内调节具有GVHD免疫应答风险的受体细胞使之表达CD8多肽全部或功能部分，所述CD8多肽优选人CD8多肽，更优选人CD8α链。在一个实施方案中，所述调节步骤包括在体内将受体细胞与编码CD8多肽全部或功能部分的表达载体接触，借此CD8多肽被此细胞表达并因此使移植的供体T细胞产生的抗受体细胞的GVHD免疫应答被抑制。优选地，所述调节步骤在同种异体移植物的移植同时或之后进行。还更优选地，所述调节步骤于移植物的移植后在受体体内进行。最优选地，受试方法的使用有效诱导对受体同种抗原的稳定免疫耐受，因此不需要长期给予普通免疫抑制剂。
用于受试方法和组合物中的优选的CD8多肽一般包括CD8α链，更优选地CD8α链的细胞外结构域，还更优选地CD8α链的Ig-样结构域。在另一优选实施方案中，CD8多肽可以包括或基本由CD8α链和跨膜结构域组成，或者更优选CD8α链的Ig-样结构域和跨膜结构域。在一特别优选的实施方案中，所述跨膜结构域是CD8α链的跨膜结构域。鉴于受试表达方法的性质，以及上面描述的CD8α链现有的可溶形式明显缺乏，认为CD8α链跨膜结构域或合适的其他跨膜区域的存在是必需的。
用于受试方法的合适表达载体和组合物包括重组和非重组的载体，和病毒载体(例如腺病毒载体，逆转录病毒载体，腺伴随病毒载体等等)以及非病毒载体(例如细菌质粒，噬菌体，脂质体等等)。
在进一步的方面，本发明提供改良的移植用同种异体移植物(transplantallograft)，其能特异有效地抑制针对它们的受体免疫应答。在一个实施方案中，改善的移植用同种异体移植物包括修饰成表达CD8多肽的同种异体移植物细胞，优选表达人CD8多肽，更优选人CD8α链。如这里讨论的，CD8多肽可以包括或可选基本由CD8α链的细胞外结构域和跨膜结构域，或者CD8α链的Ig-样结构域和跨膜结构域而组成。跨膜结构域可以是CD8α链的或者可以是另一个优势选择的跨膜结构域。移植物细胞的修饰可以按这里公开的用脂质体介导的核酸转移载体，病毒介导的核酸转移载体等完成。
在更进一步的方面，提供改良的器官保存溶液，包括编码CD8多肽的表达载体。因此，在优选实施方案中，发明提供改良的器官保存溶液，其包括含有编码CD8多肽，优选人CD8多肽，最优选人CD8α链的核酸的表达载体。在另一个优选实施方案中，改良的器官保存溶液包括含有编码CD8α链细胞外结构域和跨膜结构域的表达载体，或者可选含有编码CD8α链Ig-样结构域和跨膜结构域的核酸的表达载体。在一个特别优选的实施方案中，跨膜结构域是CD8α链的跨膜结构域。在进一步的实施方案中，载体可以进一步包括编码抗炎分子例如血红素氧合酶的核酸。
在广义方面，提供特异性抑制宿主对靶细胞特异抗原的免疫应答的方法，包括在体内或离体调节靶细胞使之表达CD8多肽全部或功能部分，所述CD8多肽优选人CD8多肽，还更优选人CD8α链，其中CD8多肽被靶细胞表达并因此针对该抗原的免疫应答被特异地抑制。在一个实施方案中，靶细胞特异的抗原是同种抗原。在另一个实施方案中，靶细胞特异的抗原是自身抗原。在一优选实施方案中，所述调节步骤包括将靶细胞在体内或离体条件下与编码CD8多肽的表达载体接触。
在更进一步的方面，提供预防自身免疫疾病发展和治疗自身免疫疾病的方法，其包括给予需要的患者包括表达载体的治疗组合物，其中所述表达载体编码CD8多肽全部或功能部分，所述CD8多肽优选人CD8多肽，还更优选人CD8α链，其中由接触过的靶细胞表达CD8可特异地抑制针对靶细胞特异性自身抗原的自身反应免疫应答。
虽然公开了多个实施方案，但是从下面的详细描述中，其显示和描述发明例证性的实施方案，本发明的其他实施方案对本领域的技术人员是明显的。如所认识到的，发明能在各种明显的方面修改，均不背离本发明精神和范围。因此，附图和详述被看做举例性质而不是限制。
附图说明
图1显示各种种属CD8α(alpha)链的蛋白质和核酸序列。也包括所示序列的登录号。
图2A-B显示野生型人CD8α链的氨基酸和核酸序列，包括人和小鼠各自的蛋白质的不同结构域的划分。
图3显示用C57BL/6脾细胞刺激的Balb/c脾细胞。培养物添加正常纤维母细胞，培养基或带有小鼠(A)或人(B)起源的CD8的纤维母细胞。收获培养物并测试其对C57BL/6源靶细胞的裂解能力。
图4显示注射了对照纤维母细胞(■和▲)或mCD8-转染的C57BL/6-(H-2b)来源的(○和●)纤维母细胞的Balb/c(H-2d)小鼠。两周后将动物处死，收获脾细胞并用C57BL/6-(H-2b)(■和○)或CBA/J(H-2k)(●和▲)脾细胞刺激，并测试它们对EL4(H-2b)(■和○)或S.AKR(H-2k)(●和▲)靶细胞的裂解能力。
图5显示靶细胞(▲)或表达CD8的靶细胞(■)，测试其被同种反应T细胞(A)或抗原特异的CTL(B)裂解的易感性。
图6显示在存在正常纤维母细胞(●)和用mAdCD8转导的纤维母细胞(A，▲)或HAdCD8(B，▲)情况下建立的MLCs(Balb/c抗-C57B/6)。对照培养中不加纤维母细胞(■)。在培养期末判定这些培养物对C57BL/6-来源靶的裂解活性。
图7显示用腺病毒否决(veto)转移载体mAdCD8的免疫。将C57BL/6小鼠用上述载体感染。10天后，收获脾细胞并在Adbgal病毒存在情况下培养。给出了母细胞数。
图8显示用mAdCD8的负性免疫。(A)将C57BL/6小鼠静脉注射Adβgal或mAdCD8免疫一次。(B)如(A)处理的动物于5天后用Adβgal再次免疫。最后一次注射后数天将动物处死，并将其脾细胞在Adβgal存在情况下培养。培养5天后，测试细胞对Adβgal-感染的同基因靶细胞的裂解能力。
图9显示与如所示转导的1×106(或不用)刺激细胞保温的3×106C57BL/6脾细胞。培养4天后通过免疫荧光分析CD4+T细胞的存在。
图10A-D显示用不同病毒构建物感染后小鼠和人CD8α链的表面表达。A.感染的细胞：MC57T纤维母细胞；插图1：假感染；插图2：用hAdCD8感染。B.感染的细胞：MC57T纤维母细胞；插图1：假感染；插图2：用mAdCD8感染。C.感染的细胞：Balb/c未选择的骨髓细胞；插图1：用lacZ腺病毒载体(AdLacZ)感染；插图2：用mAdCD8感染。D.感染的细胞：MC57T纤维母细胞；插图1：假感染；插图2：用pAAV-mCD8感染；插图3用pAAV-hCD8感染。
图11显示这些纤维母细胞存在情况下建立的MLCs(Balb/c抗C57BL/6)，其中纤维母细胞已经在加入MLCs之前于转导后培养0或5天。培养结束时，用荧光活化的细胞分析仪判定淋巴母细胞的数量。
图12显示用否决转移载体的体外抑制。在存在或缺乏未感染的或mAdCD8感染的MC57纤维母细胞(H-2b)情况下建立Balb/c抗-C57BL/6混合淋巴细胞培养(MLC)。在EL4(H-2b)靶细胞上测定CTL反应。
图13显示用AdLacZ(▲)或mAdCD8(■)免疫的Balb/c小鼠。将脾细胞在存在AdLacZ的情况下培养，并测试抗AdLacZ-感染的同基因P815靶细胞的特异裂解活性。
图14A-B显示(A)用AdLacZ(▲)或mAdCD8(■)免疫的C57BL/6动物。测定它们的脾细胞对同基因AdLacZ EL4靶细胞的裂解活性。(B)在测定它们对AdLacZ感染的EL4靶细胞的裂解活性前用AdLacZ再次免疫这些动物。
图15显示从新生心脏制备的单细胞悬液。将心肌细胞用mAdCD8(B)转导或假感染，培养48小时并染色CD8的表面表达。
图16显示用109(■)，5×107(▲)，107(●)PFU AdCD8感染的或假感染的(○)新生C57BL/6心脏。移植到Balb/c受体内38天后，测定激活的受体T细胞对供体型靶细胞的裂解活性。
图17显示AdCD8感染的(■)或假感染的(○)新生C57BL/6心脏。移植到Balb/c受体内35天后，测定激活的受体T细胞对供体型靶细胞的裂解活性。
图18显示将mAdCD8感染的(处理的)或假感染的(对照)C57BL/6心脏移植到Balb/c小鼠内。52天后，将动物处死，将组织染色(HE)，测定受体T细胞对供体型靶细胞的裂解活性。
图19显示胰岛移植方法。
图20显示正常(■)和链脲霉素处理的(●)小鼠的血糖水平。
图21显示在Balb/c(■)和C57BL/6小鼠中进行的同基因胰岛移植。
图22显示从Balb/c(●)或C57BL/6(■)小鼠收获的同基因mAdCD8转导的胰岛的移植。
图23显示移植的胰岛的生存力。患化学性诱导糖尿病的Balb/c小鼠接受完全同基因mAdCD8转导的C57BL/6胰岛移植物后的血糖水平。
图24显示在设计成肺移植后识别同基因靶的实验中，移植物特异的CTL的抑制。
图25显示移植了mAdCD8转导的C57BL/6胰岛的小鼠内的胰岛素产生。
发明内容
针对供体和/或宿主抗原的同种异体免疫应答代表了对移植方法成功的持续医学挑战。如上面所述，本发明的成功源于意外发现将移植物修饰成表达免疫调节分子诸如CD8，具体是CD8α链，会有效并特异地抑制对靶细胞特异抗原的免疫应答的体液和细胞成分。
与之一致，本发明提供组合物和方法，其抑制和/或阻止对表达同种抗原的靶细胞的同种异体免疫应答，包括调节使细胞表达免疫调节分子的全部或功能部分，所述免疫调节分子优选CD8多肽，还更优选人CD8α链。在一个优选的实施方案中，所述调节步骤包括将细胞与这里描述的编码CD8多肽全部或功能部分的表达载体接触。发明进一步涉及可选择的调节方法，其调节靶细胞中CD8的表达水平以有效并特异地抑制抗靶细胞的免疫应答，诸如，提供使CD8表达增加的转录活化物。参见，例如Mortlock etal.，Nuc.Acids.Res.31：152(2003)；Mizuguchi et al.，Hum.Gene Ther.14：1265-77(2003)。受试方法和组合物达到的免疫抑制特异性和选择性提供了对传统免疫抑制手段的明显改善，传统免疫抑制一般产生全面的和非特异的免疫系统抑制，因此使宿主对偶然感染和一些情况下对诱变和癌症高度易感。
可以将这里描述的方法单独或联合其他方法使用，例如给予本领域已知的其他活性药物，例如治疗性的或预防性的药物和/或普通免疫抑制剂(例如环孢霉素，FK506)，不同的抗体等。优选地，鉴于使用受试组合物和方法获得的同种抗原特异的免疫抑制，这些药物的使用不是必需的。
“抑制”意思是针对靶细胞特异抗原的细胞(例如白细胞募集)或体液型、天然或获得性的免疫应答的直接或间接、部分或全部抑制和/或减弱。靶细胞特异抗原包括与目的靶细胞有关的任何独特的抗原，包括例如移植的器官，组织和细胞(不同的HLA分子等等)表达的同种抗原，或与自身免疫疾病有关的自身的抗原(自身抗原)，其包括例如髓磷脂碱性蛋白(MBP)，蛋白脂质蛋白PLP-1，髓磷脂少突细胞糖蛋白，原胰岛素/胰岛素，谷氨酸脱羧酶(GAD)，基质金属蛋白酶(MMP-1)，11型胶原，甲状腺球蛋白等等。
“免疫应答”优选意思是获得性免疫应答，例如细胞或体液免疫应答。
“特异免疫抑制”或“抗原特异的免疫抑制”意思是与非抗原特异的全面免疫抑制相对而言的，针对抗原例如同种抗原的免疫应答的抑制。因此，作为例子，受体对供体抗原的细胞和/或体液免疫应答的缺失，联合对其他外源抗原的体内免疫能力，将证明供体同种抗原的特异的免疫抑制。
“稳定的免疫耐受”意思是不使用普通免疫抑制剂，至少1年的稳定的，长期的同种异体移植物的存活和/或功能。
“表达载体”意思是用于向靶细胞传送核酸的任何载体。一般可以将表达载体分成病毒载体和非病毒载体。病毒载体指但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体，慢载体等等。非病毒载体指质粒载体，裸DNA，偶联于不同载体的裸DNA，或与脂质体或其他脂类制备物相关的DNA。尽管在某些实施方案中，例如当使用脂质体或细胞消融例如某因枪(biolostic)技术时表达载体不是重组的，一般地，表达载体是重组的。用在这里的优选的重组载体是质粒载体和选自腺病毒载体，腺伴随病毒载体，疱疹病毒载体和逆转录病毒载体组成的组的病毒载体。在某些使用重组病毒载体，具体是腺病毒载体的某些实施方案中，尽管由于这里详细描述的改进使这种修饰不再必需，衣壳例如腺病毒衣壳的六邻体(hexon)蛋白的免疫原性可以按照本领域已知的方法减弱。
“接触”意思是以实现载体和细胞间的物理接触的方式和量将基因治疗表达载体给予细胞。如果载体是重组的病毒颗粒，有利地，通过这种物理接触实现病毒载体对细胞的附着并感染。如果病毒载体是其他重组病毒颗粒，例如无衣壳的病毒核酸或其他核酸，有利地，使所述核酸进入细胞。
这种“接触”可以通过本领域技术人员已知的和这里描述的任何方式进行，通过这些方法可以影响载体与靶细胞的明显接触或相互接触。可选地，可以将载体，例如腺病毒载体，与双特异的或多特异的分子(例如抗体或其片段)形成复合物，此时“接触”包括载体和双特异或多特异分子的复合物与靶细胞的明显的接触或相互接触。例如，可以将载体和双特异(多特异的)分子共价连接，例如通过本领域技术人员已知的化学方法，或其他方法。优选地，可以将载体和双特异的(多特异的)分子通过非共价作用(例如离子健，氢键，范德华力，和/或非极性作用)的方式连接。尽管可以将载体和双特异的(多特异的)分子通过在小体积的同种溶液中混合而接触，但是靶细胞和复合物不需要在小体积中进行接触，例如，在向宿主(例如人类)给予复合物的情况下，复合物通过血流达到靶细胞并与靶细胞选择性结合并进入靶细胞。优选地在将靶细胞与载体和双特异的(多特异的)分子复合物接触之前将载体与双特异的(多特异的)分子进行接触。
在进一步的实施方案中，表达载体可以选择性地进一步包括编码例如抗炎分子如血红素氧合酶的其它目的治疗分子的核酸，连同编码自身抗原和免疫调节性CD8多肽的核酸。或者，为了单独最优化治疗分子和CD8多肽对靶细胞的呈递时机，可以使用分离的表达载体。血红素氧合酶表达对减轻缺血/再灌注损伤的好处被广泛报道。参见例如，国际公开号WO00/36113，特别将其公开的在此引入以作参考。
“靶细胞”可以以单一体存在，或可以是更大的细胞群体的一部分。这种“更大的细胞群体”可以包括，例如，细胞培养物(或者混合的或者纯的)，组织(例如上皮或其他组织)，器官(例如心脏，肺脏，肝脏，胆囊，膀胱，眼或其他器官)，器官系统(例如循环系统，呼吸系统，胃肠系统，泌尿系统，神经系统，外皮系统或其他器官系统)，或生物体(例如鸟类，哺乳类，具体是人类，等等)。优选地，被靶向的器官/组织/细胞是循环系统的(例如包括但不限于心脏，血管，和血液)，呼吸系统的(例如鼻，咽，喉，气管，支气管，细支气管，肺，等等)，胃肠系统的(例如包括口，咽，食道，胃，肠，唾液腺，胰腺，肝，胆囊，和其他)，泌尿系统的(例如肾，输尿管，膀胱，尿道，等等)，神经系统的(例如包括但不局限于脑和脊髓，和特殊的感觉器官，例如眼)和外皮系统的(例如皮肤)。甚至更优选地，所述细胞选自心脏，血管，肺，肝，胆囊，膀胱，眼细胞和干细胞。培养和使用干细胞的方法在美国专利申请5,672,346，6,143,292和6,534,052中有详细描述，在此将其引入以作参考。
具体地，与表达载体例如病毒载体或质粒接触的靶细胞与其他细胞不同，前者包含可被表达载体靶向的具体的细胞表面结合位点。“具体的细胞表面结合位点”指存在于细胞表面的任何位点(即分子或分子的联合)，其中载体例如腺病毒载体为附着于细胞可以与之相互作用，并因此进入细胞。因此，具体的细胞表面结合位点包括细胞表面受体，并优选地是蛋白质(包括修饰的蛋白质)，碳水化合物，糖蛋白，蛋白多糖，脂质，粘液素(mucin)分子或粘蛋白等等。可能的细胞表面结合位点的例子包括但不局限于：发现于粘多糖上的肝素和硫酸软骨素部分；发现于粘液素，糖蛋白和神经节苷脂上的硅酸部分；主要组织相容性复合物I(MHC I)糖蛋白；发现于膜糖蛋白上的普通碳水化合物分子，包括甘露糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-葡糖胺，岩藻糖，和半乳糖；糖蛋白例如ICAM-1，VCAM，E选择素，P选择素，L选择素，和整合素分子；和癌细胞上存在的肿瘤特异抗原，例如MUC-1肿瘤特异性表位。但是，将表达载体例如腺病毒靶向细胞不限于细胞相互作用的任何具体机制(即与已知的细胞表面结合位点相互作用)。
如这里使用的和下面进一步详细说明的，“多核苷酸”或“核酸”可以指或者DNA或者RNA，或者既含有脱氧核糖核苷酸也含有核糖核苷酸的分子。核酸包括基因组DNA，cDNA和包括有义和反义核酸的寡核苷酸。这种核酸也可以含有核糖-磷酸骨架中的修饰，其增加稳定性和该分子在生理环境中的半衰期。
核酸可以是双链的，单链的，或既含有双链的也含有单链序列部分。可以被本领域技术人员理解的，单链的描述(“Watson”)也定义了另一条链的序列(“Crick”)；因此图中描述的序列也包括序列的互补链。术语“重组的核酸”在这里的意思是最初一般通过核酸内切酶的核酸操作，以通常在天然未发现的形式在体外形成的核酸。因此为本发明的目的，分离的线性形式核酸，或通过连接非正常连接的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是重组体。应理解一旦制备重组核酸并将其再次导入宿主细胞或生物体，其以非重组方式复制，即利用宿主细胞体内细胞机制而不是体外或染色体外操作；但是，所述核酸一旦被重组制备，尽管随后的复制是非重组的方式，仍然被认为是为本发明目的的重组体。
在整个说明书中可以将术语“多肽”和“蛋白”互换使用，意思是至少带二个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质，多肽，寡肽和肽。蛋白质可以由天然氨基酸和肽键，或合成的肽类似物结构构成。因此这里使用的“氨基酸”或“肽残基”既指天然产生的也指合成的氨基酸。例如，同苯型丙氨酸(homo-phenylalanine)，瓜氨酸(citrulline)和noreleucine被认为是为本发明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括亚氨基酸残基例如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是或者(R)或者(S)构型。在优选实施方案中，氨基酸为(S)或L-构型。如果使用非天然产生的侧链，不使用氨基酸取代，例如为防止或延迟体内的降解。改变天然氨基酸序列以产生用于靶向或者表达成转基因的变体蛋白和肽，例如通过本领域技术人员已知的多种方式进行。变体肽是基本上与已知肽同源，但是具有不同于该肽氨基酸序列的肽。例如同源性的程度(即相同百分比)判定可以通过使用适于这种比较的计算机程序来对较序列信息进行(例如使用GAP计算机程序，版本6.0或更高版本，由Devereux等描述(Nucleic Acids Res.，12，387(1984)，并可免费从Wisconsin大学遗传计算机组(UWGCG)获得)。可以使用本领域技术人员已知的其他方法评价变体蛋白和/或肽的活性。
就变体蛋白(肽)和参考蛋白(肽)之间不同的氨基酸残基而言，变体蛋白(肽)优选包括保守的氨基酸取代，即，使已知的氨基酸被另一大小，电荷密度，疏水性/亲水性，和/或构型相似的氨基酸取代(例如用缬氨酸取代苯丙氨酸)。变体位点特异突变的导入可以通过将包括修饰位点的合成寡核苷酸连接入表达载体来进行。或者，可以使用针对寡核苷酸的定点诱变方法，例如Walder etal.，Gene，42：133(1986)；Bauer etal.，Gene，37：73(1985)；Craik，Biotechniques，January 1995，pp.12-19；和美国专利申请4,518,584和4,737,462中公开的那些方法。
免疫调节分子
在本说明书的上下文中，“免疫调节分子”是多肽分子，其调节，即增强或减弱针对靶细胞的、抗原特异方式的细胞和/或体液宿主免疫应答，并且优选地可减轻宿主免疫应答。一般地，依据本发明所述，自这里描述的载体表达后，可以将免疫调节分子与靶细胞表面膜结合，例如，插入到细胞表面膜中或共价或非共价地结合于其上。
在优选实施方案中，免疫调节分子包括CD8蛋白的全部或功能部分，并且甚至更优选CD8α链的全部或功能部分。对于人CD8编码序列，参见Leahy，Faseb J.9：17-25(1995)；Leahy et al.，Cell 68：1145-62(1992)；Nakayamaet al.，Immunogenetics 30：393-7(1989)。关于CD8蛋白和多肽“功能部分”意思是保留本文所述的否决活性的CD8α链的一部分，更具体为保留CD8α链的HLA-结合活性的部分，且具体为CD8α链细胞外区的Ig样结构域。实例的变体CD8多肽描述于Gao and Jakobsen，Innunology Today 21：630-636(2000)，在此将其引入以作参考。在某些实施方案中，使用全长CD8α链。但是，在某些实施方案中，缺失了胞质结构域。优选保留跨膜结构域和细胞外结构域。
如可被本领域技术人员所理解的，可以将CD8α链的跨膜结构域和其他分子的跨膜结构域交换，如果需要，修饰细胞外结构域与靶细胞表面的结合。在该实施方案中，将编码CD8α链细胞外结构域的核酸可操作性地连接于编码跨膜结构域的核酸。发明中可以使用任何跨膜蛋白的跨膜结构域。或者未在跨膜蛋白上发现的跨膜蛋白。在这个实施方案中“合成的跨膜结构域”含有大约20-25个疏水氨基酸，其后至少一个且优选两个带电氨基酸。在某些实施方案中，通过本领域的传统技术将CD8细胞外结构域连接于靶细胞膜。优选的CD8α链序列示于图1，并且包括编码CD8α链全长的氨基酸序列或核酸序列的全长序列，其来自以下种属：人，小鼠，大鼠，猩猩，蜘蛛猿(spider monkey)，豚鼠，牛，刚毛棉鼠(hispid cotton rat)，家猪和猫。
在优选的实施方案中，CD8α链不是融合蛋白，而是其中缺失了细胞内结构域的截短蛋白。如图2描述的，人CD8α链基因表达235个氨基酸的蛋白。可以考虑将蛋白分成下列结构域(在多肽的氨基端开始并在羧基端结束)：信号肽(氨基酸1-21)；免疫球蛋白(Ig)样结构域(大约氨基酸22-136)；膜近侧茎区(membrane proximal stalk region)(氨基酸137-181)；跨膜结构域(氨基酸183-210)和胞质结构域(氨基酸211-235)。编码这些不同结构域的编码序列的核苷酸包括：编码信号肽的1-63，编码细胞外结构域的64-546，编码细胞外结构域的大约547-621和编码细胞内结构域的大约622-708。同样地，也可将小鼠序列分成如下结构域。可将多肽分成包括氨基酸1-27的信号肽，包括大约氨基酸28-194的细胞外结构域，包括大约氨基酸195-222的跨膜结构域和包括大约223-310的细胞内结构域。相似地，编码这些结构域的编码序列的核苷酸包括编码信号肽的核酸1-81，编码细胞外结构域的大约82-582，编码跨膜结构域的大约583-666和编码细胞内结构域的大约667-923。
在某些实施方案中，基因转移载体中包括编码全长蛋白的核酸。在其他实施方案中，在基因递送载体里多核苷酸中不包括编码细胞内结构域的核酸，导致膜锚定蛋白缺失细胞内结构域。在其他种属里也可以鉴定相应的结构域，包括在优选实施方案中的小鼠。
本领域的技术人员也会理解，可以发现与上面提到多肽基本同源的免疫调节分子优先用于发明中。因此，例如，“CD8多肽”也包含与图2所示核苷酸编码的多肽具有至少大约80％序列同一性，通常至少大约85％序列同一性，优选至少大约90％序列同一性，更优选至少大约95％序列同一性且最优选大约98％序列同一性的同源多肽。
“编码CD8的核酸分子”和其同义词意思是如图2所示的人CD8的核苷酸序列，以及这样的核苷酸序列，其与图2所示核苷酸有至少80％的序列相同，通常至少大约85％的序列相同，优选至少大约90％的序列相同，更优选至少大约95％的序列相同且最优选大约的98％序列相同，并且编码具有图2所示序列的多肽，并列于图1。
如前所述，可以使用许多不同程序鉴定是否蛋白或核酸与已知序列具有序列相同性或相似性。使用本领域已知的标准技术判定序列相同性和/或相似性，包括但不局限于：Smith & Waterman的局部序列相同性算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)，Needleman & Wunsch的序列相同性比对算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)，Pearson & Lipman的搜索相似性的方法，PNASUSA85：2444(1988)，这些算法的计算机执行(在Wisconsin遗传软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，Wl)，Devereux等描述的Best Fit序列程序，Nucl.Acid Res.12：387-395(1984)，优选地使用缺省设置或通过检查。优选地，用以下列参数为基础的FastDB计算相同百分比：错配罚分为1；空位(gap)罚分为1，空位大小罚分为0.33；和连接罚分为30，″Current Methods in SequenceComparison and Analysis，″Macromolecule Sequencing and Synthesis，SelectedMethods and Applications，pp127-149(1988)，Alan R.Liss，Inc.
有用的算法的例子是PILEUP。使用累进的成对比对，PILEUP创造从一组相关序列的多序列比对。它也可以绘制表示聚类关系的树图用于创建比对。PILEUP使用Feng & Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)累进对比方法的简化；该方法与Higgins & Sharp CABIOS 5：151-153(1989)描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括缺省的空位量为3.00，缺省的空位长度为0.10，和测量末端空位。
有用的算法的另一个例子是BLAST算法，描述于Altschul etal.，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)和Karlin etal.，PNAS USA 90：5873-5787(1993)。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其来自Altschul etal.，Methods in Enzymology，266：460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html]。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其大多数设置成缺省值。可调节的参数用如下值设定：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字符阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2是动态参数，并且由程序本身根据具体序列的组成和于其中搜索目的序列的具体数据库的组合建立，但是，可以调节所述值以增加灵敏度。
另一个有用的算法是Altschul et al.Nucleic Acids Res.25：3389-3402报道的空位BLAST。空位BLAST使用BLOSUM-62取代打分；阈值T参数设为9；双击方法以触发非空位拓展；空位长度记为10+k；Xu设为16，且Xg对数据库搜索阶段设为40和对算法输出阶段设为67。由相当于～22bits触发空位比对。
氨基酸或核酸序列相同性％值通过匹配的相同残基数除以比对区中“较长”序列的残基总数判定。“较长”序列是在比对区中具有最多实际残基者(忽略WU-BLAST-2导入的空位至最大比对打分)。
比对可以包括在被对比的序列中导入空位。此外，对于含有比图2所示核苷酸所编码多肽的氨基酸序列或者更多或者更少的氨基酸序列，在一个实施方案中理解，判断序列相同性百分比以相对于氨基酸总数的相同氨基酸数目为根据。因此，在一个实施方案中，例如短于图2中核苷酸所编码多肽的序列的序列相同性，如下面讨论的，使用较短的序列中氨基酸数目判断。在相同百分比计算中，相对权重不被赋予序列变异的各种表现，例如插入，删除，取代等等。
在一个实施方案中，仅将相同性打正分(+1)，包括空位的序列变体的所有形式记分为“0”，其避免用于序列相似性计算的下述加权尺度(weightedscale)或参数的需要。可以计算序列相同性百分比，例如，通过用匹配相同残基数除以比对区中“较短”序列的残基总数，再乘以100来进行。“较长”序列是在比对区中具有最多实际残基者。
与图2中核酸编码的多肽序列相同性低于100％的CD8一般从除人类以外的其他种属的天然CD8核苷酸序列以及人或非人来源的天然CD8核苷酸序列的变体来制备。在这点上，很明显许多技术是本领域熟知的，并且可以按常规使用以制备天然CD8序列的核苷酸序列变体，并测定那些变体的多肽产物中通常与天然CD8多肽相关的至少一种活性的存在。在一个优选的实施方案中，CD8α链来自人类，但是如图1所示，来自大鼠，小鼠，和灵长类的CD8α链是已知的并也用于发明中。
具有CD8活性的多肽可以短于或长于图2的核苷酸编码的多肽。因此，在优选实施方案中，CD8多肽的定义包括图2中核苷酸编码的多肽的部分或片段。在这里的一个实施方案中，如果a)它们具有至少所示的序列相同性；和b)优选如上所述具有天然产生的CD8的生物活性，则认为图2中核苷酸编码的多肽的片段是CD8多肽。
此外，如下面更详细描述的，可以将CD8α链作成长于图2中核苷酸编码的多肽；例如，通过添加其他融合序列，或附加的编码和非编码序列的说明。
优选CD8多肽是重组的。“重组的多肽”是用重组技术生产的多肽，即，通过如下所述的重组核酸的表达来制备。在优选的实施方案中，发明的CD8通过图2所示核酸序列或其片段的表达生产。重组多肽在至少一个或多个特性上不同于天然产生的蛋白。例如，可以将多肽从通常在野生型宿主中与其有关系的一些或全部蛋白与化合物中分离或纯化，因此可以基本上是纯的。例如，分离的多肽不掺杂至少某些在天然状态通常与其相关的物质，优选组成在给定样品中占总蛋白的重量至少大约0.5％，更优选至少大约5％。基本纯的多肽占总多肽重量的包括至少大约75％，优选至少大约80％，且具体优选至少90％。所述定义包括在不同生物体或宿主细胞中从一种生物体制备CD8多肽。
或者，可以以明显高于正常所见的浓度制备多肽，其通过使用可诱导的启动子或高表达启动子，使得以升高的浓度水平生产多肽。或者，多肽可以是正常时天然未发现的形式，如下面讨论的，如添加了氨基酸取代，插入和删除。
在一个实施方案中，本发明提供核酸CD8变体。这些变体属于三类中的一种或多种：取代的，插入的或删除的变体。变体的制备一般通过在图2的核苷酸中核苷酸定点诱变进行，使用盒式诱变或PCR诱变或本领域熟知的其他技术，生产编码变体的DNA，包括在基因治疗载体中的变体和此后DNA的表达。氨基酸序列变体特征是变异的预先决定性，使它们与CD8氨基酸序列的天然等位基因变异或种间变体区分开。所述变体一般表现出与天然产生的类似物相同性质的生物学活性，但也可以选择如下面更详细描述的具有改变特性的变体。
当预先决定了导入序列变体的位点或区域时，突变本身不需预先决定。例如，为了最优化在已知位点突变的进行，可以在靶密码或区域进行随机突变，并筛选表达的变体的最优所需活性。用于在具有已知序列的DNA中的预先决定的位点进行取代突变的技术是熟知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。制作变体的另一个技术例子是基因改组方法，因此允许核苷酸序列的相似变体的片段联合以产生新的变体联合。这种技术的例子见美国专利5,605,703；5,811,238；5,873,458；5,830,696；5,939,250；5,763,239；5,965,408；和5,945,325，在此将其每一个以其全部引入以作参考。
氨基酸取代通常是单个残基的；尽管可以耐受相当大的插入，插入通常大约1-20个氨基酸。缺失幅度从大约1至大约20个残基，尽管某些情况下可以是更大的缺失，且可以包括其片段的细胞质结构域。
可以使用取代，缺失，插入或它们的任何联合以达到最终衍生物。一般地，在少数氨基酸上进行这些改变以使分子的改变降到最低。但是，在某些情况下可以允许更大的改变。当希望CD8的特性改变较小时，一般按照下表进行取代：
表1
原始残基                      取代实例
Ala                           Ser
Arg                           Lys
Asn                           Gln，His
Asp                           Glu
Cys                           Ser
Gln                           Asn
Glu                           Asp
Gly                           Pro
His                           Asn，Gln
Ile                           Leu，Val
Leu                           Ile，Val
Lys                           Arg，Gln，Glu
Met                           Leu，Ile
Phe                           Met，Leu，Tyr
Ser                           Thr
Thr                           Ser
Trp                           Tyr
Tyr                           Trp，Phe
Val                           Ile，Leu
通过选择保守性比表1所示取代低的取代进行功能或免疫学特性的实质改变。例如，可以进行有更明显影响的取代：在改变区内多肽骨架的结构，例如α螺旋或β折叠结构；在靶位点的分子的电荷或疏水性；或者侧链的大小。一般希望产生多肽特性上最大改变的取代是那些其中(a)亲水性残基，例如丝氨酰(seryl)或苏氨酰取代(或被取代为)疏水性残基，例如亮氨酰，异亮氨酰，苯丙氨酰，缬氨酰或丙氨酰；(b)半胱氨酰或脯氨酰取代(或被取代为)任何其他残基；(c)具有带正电侧链的残基，例如赖氨酸，精氨酸或组氨酸取代(或被取代为)带负电的残基，例如谷氨酰或天门冬氨酰；或者(d)具有大侧链的残基例如苯丙氨酸，取代(或被取代为)没有侧链的残基例如甘氨酸。
尽管按照需要也选择改变CD8特性的变体，但是变体一般表现同样性质的生物学活性，并引起与天然类似物同样的免疫应答。或者，可以设计变体以改变蛋白质的生物学活性。
多肽的一种共价修饰类型包括改变多肽的天然糖基化模式，其包括在本发明范围里。“改变天然的糖基化模式”在这里目的是意图缺失一个或多个发现于天然CD8多肽序列中的糖部分，和/或添加一个或多个天然序列多肽中不存在的糖基化位点。
可以通过改变其氨基酸序列完成对多肽添加糖基化位点。例如，所述改变的进行可以通过向天然序列多肽添加，或置换成一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)。所述氨基酸序列可选通过在DNA水平的变化而改变，具体是通过在预先选好的碱基处突变编码多肽的DNA，以致产生翻译成所需氨基酸的密码。
多肽上存在的糖部分的去除可以通过突变性取代作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子进行。
重组核酸一旦从其天然来源例如包含在质粒或其他载体中分离，或从中切出作为线性核酸片段，可以将其进一步用作探针以鉴定和分离其他核酸。也可以被用作“前体”核酸以制备经修饰的或变体核酸和蛋白。也可以按照这里描述的将其连入载体或其他递送载体以治疗靶细胞。
表达载体
在本发明的全文中，可以使用任何合适的表达载体。如本领域的技术人员所理解的，“载体”是基因转移的工具。按照本发明表达载体包括但不局限于质粒，噬菌体，病毒，脂质体，等等。按照本发明表达载体优选包括附加的序列和突变。具体地，按照发明的表达载体包括核酸，其包括编码免疫调节分子具体是如这里所限定的CD8α链的转基因。核酸可以包括全部或部分合成制备的编码或其他遗传序列或者基因组或互补DNA(cDNA)序列，并可以以或者DNA或者RNA形式提供。
可以将编码免疫调节分子的基因移入或移出病毒载体或杆状病毒或合适的原核的或真核的表达载体以表达mRNA和生产蛋白质，并评价其他生化特性。
根据按照发明的载体(包括重组腺病毒载体和转移载体)的生产，可以用标准分子和遗传技术构建这种载体，例如本领域技术人员已知的那些。可以在适当的细胞系中用病毒载体生产包括病毒体或病毒颗粒的载体(例如重组腺病毒载体)。相似地，包括一个或多个嵌合外壳蛋白的颗粒可以在标准细胞系中生产，例如那些通常用于腺病毒载体者。如果希望，可以然后将这些得到的颗粒靶向特异的细胞。
可以使用任何合适的表达载体(例如Pouwels et al.，Cloning Vectors：ALaboratory Manual(Elsevior，N.Y.：1985)所描述的)和相应的合适的宿主细胞来在宿主细胞中生产重组肽或蛋白。表达宿主包括但不局限于细菌类，所述细菌属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属，哺乳动物或昆虫宿主细胞系统，包括杆状病毒系统(例如，如Luckow et al.，Bio/Technology，6，47(1988)所描述的)，和建立的细胞系，例如COS-7，C127，3T3，CHO，HeLa，BHK，等等。按照发明用于制备嵌合蛋白(肽)的具体优选的表达系统是杆状病毒表达系统，其中使用Trichoplusia ni，Tn 5B1-4昆虫细胞，或其他合适的昆虫细胞生产高水平的重组蛋白。当然，普通技术人员当然知道根据所产生肽的类型表达宿主的选择是不同的。例如，在酵母或哺乳动物细胞(例如COS-7细胞)中生产的肽的糖基化与在细菌细胞诸如埃希氏大肠菌中生产的肽的不同。
在一个优选实施方案中，所述蛋白在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达系统也是本领域已知的，并包括逆转录病毒系统。哺乳动物启动子是任何能结合哺乳动物RNA聚合酶并起动下游(3’)蛋白编码序列转录成mRNA的DNA序列。启动子可以有通常位于靠近编码序列5’端的转录起始区，和TATA盒，其利用定位在转录起始位点上游25-30个碱基对。认为TATA盒指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子也含有上游启动元件(增强子)，通常位于TATA盒上游100-200个碱基对处。上游启动元件决定转录起动速率并可以在任何方向起作用。具体用作哺乳动物启动子的是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因经常高表达并具有广泛的宿主范围。例子包括SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子，腺病毒主要晚期启动子，单纯疱疹病毒启动子，和CMV启动子。
一般地，由哺乳动物细胞识别的转录终止和polyA序列是位于翻译终止密码子3’端的调节区，因此，与起始元件一起，与编码序列侧接。成熟mRNA的3’末端通过位点特异的翻译后裂解和多腺嘌呤化形成。转录终止子和多腺嘌呤化信号的例子包括源自SV40的那些。
向哺乳动物宿主以及其他宿主中导入外源核酸的方法是本领域熟知的，并可以依使用的宿主细胞而变化。所述技术包括葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀法，polybrene介导的转染，原生质体融合，电穿孔，病毒感染，将多聚核苷酸包裹在脂质体中，和直接向细胞核中显微注射DNA。
也可以使用本领域熟知的技术将蛋白制成融合蛋白。因此，例如，可以将蛋白制成融合蛋白以增加表达，或因为其他原因。例如，当蛋白是肽时，为表达的目的，可以将编码肽的核酸与其他核酸连接。
为测试CD8，表达后将蛋白纯化或分离。依据样品中存在什么其他成分，可以以本领域技术人员已知的许多方法将蛋白分离或纯化。标准的纯化方法包括电泳技术，分子技术，免疫学技术和层析技术，其中层析包括离子交换层析，疏水层析，亲和层析，和反相高压液相层析，和层析聚焦。例如，可以使用标准的CD8抗体柱将CD8蛋白纯化。也使用与蛋白质浓缩结合的超滤和透析技术。对于合适的纯化技术中一般的指导说明参见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982)。必需的纯化程度会依据CD8蛋白的使用而改变。在某些情况下不需要纯化。在某些情况下在细胞表面检测CD8的表达，例如通过抗体结合并经荧光或通过荧光活化的细胞分选(FACS)来检测。
可以将编码CD8的核酸分子以及来源于CD8核酸的或者编码链或者非编码链的任何核酸分子以本领域已知并常规的各种方式与靶细胞接触，其中所述接触可以是在离体或体内进行。
病毒粘附，进入和基因表达的评价最初可以通过利用含有目的插入序列的腺病毒载体以产生表达所需蛋白或RNA和标志基因例如β-半乳糖苷酶的重组病毒。在用含β半乳糖苷酶基因(Ad-LacZ)的腺病毒感染的细胞中，β半乳糖苷酶的表达可以最早在向细胞加入Ad-Gluc两小时后检测到。此方法提供对重组病毒进入细胞和基因表达的快速有效分析，并是使用传统技术的普通技术人员容易使用的。
使用本发明编码蛋白的核酸，可以制备各种表达载体。表达载体可以是或者自我复制的染色体外载体，或者是整合到宿主基因组中的载体。一般地，这些表达载体包括转录和翻译调节核酸，其可操作地连接于编码蛋白的核酸。术语“控制序列”指在具体宿主机体内表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合原核细胞的控制序列，例如，包括启动子，或者操纵子序列，和核糖体结合位点。已知对于真核细胞，利用启动子，polyA信号，和增强子。
当将其与另外一个核酸序列放置成功能关系时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果被表达成参与多肽分泌的前蛋白，将前序列或分泌性前导区的DNA可操作地连接于多肽的DNA；如果其影响序列的转录，将启动子或增强子可操作地连接于编码序列；或如果被置于有利于翻译处，将核糖体的结合位点可操作地连接于编码序列。如另一个例子，可操作地连接指连接DNA序列使它们邻接，并且在分泌性前导的情况下，邻接并在读码相中。但是，增强子不必是邻接的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果这种位点不存在，按照传统方法使用合成寡核苷酸接头(adaptor)或连接物(linker)。转录和翻译调节核酸一般适合于用来表达CD8的宿主细胞；例如，优选使用人转录和翻译调节核酸序列来在人类细胞中表达CD8。对各种宿主细胞合适的许多种类型表达载体，和适合的调节序列是本领域已知的。
总体上，转录和翻译调节序列可以包括但不局限于：启动子序列，核糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，和增强子或活化序列。在一个优选的实施方案中，所述调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。
启动子序列编码或者组成性或者可诱导性启动子。所述启动子可以是或者天然产生的启动子或者杂合启动子。结合一个启动子以上元件的杂合启动子，也是本领域已知的，并且在本发明中是有用的。
此外，表达载体可以包括额外的元件。例如，所述表达载体可以具有两个复制系统，因此允许其在两种生物体内维持，例如在哺乳动物的或昆虫细胞中表达和在原核宿主中克隆和扩增。而且，对于整合型表达载体，表达载体含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，并优选与表达构建物侧接的两个同源序列。通过选择载体中包含的合适同源序列，可以将整合载体定向到宿主细胞内的特定位置。整合载体的构建物是本领域熟知的。
在进一步的实施方案中，所述表达载体可以含有可筛选的标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的，并且根据使用的宿主细胞而不同。
优选地，载体是病毒载体，例如腺病毒载体，腺伴随病毒载体，疱疹病毒载体或逆转录病毒载体等。最优选地，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体可以源于任何腺病毒。“腺病毒”是腺病毒属家族的任何病毒，并希望是哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属(例如，哺乳动物腺病毒)或者禽腺病毒(Aviadenovirus)属(例如，禽类的腺病毒)的腺病毒。腺病毒是任何血清型。可以用作腺病毒来源的腺病毒原种(stock)可以从腺病血清型1到47扩增，其目前可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)获得，或者从可得到的任何其他资源的腺病毒血清型扩增。例如，腺病毒可以是A亚型(例如，血清型12，18，和31)，B亚型(例如，血清型3，7，11，14，16，21，34，和35)，C亚型(例如，血清型1，2，5，和6)，D亚型(例如，血清型8，9，10，13，15，17，19，20，22-30，32，33，36-39，和42-47)，E亚型(例如，血清型4)，F亚型(例如，血清型40和41)，或任何其他腺病毒血清型。但是优选地，腺病毒是血清型2，5，或9。有利地，腺病毒包括同种血清型的外壳蛋白(例如五邻体基质(pemtpm base)，六邻体，和/或尾丝)。然而，也优选地，一个或多个外壳蛋白可以是嵌合的，在此意义上，例如，全部或部分给定外壳蛋白可以来自另一种血清型。
尽管优选是腺病毒载体的病毒载体可以有复制能力，但是优选地，病毒载体是复制缺陷的或条件性复制缺陷。例如，优选是腺病毒的病毒载体包括具有使病毒复制缺陷的至少一个修饰的基因组。对病毒基因组的修饰包括但不局限于：DNA片段的缺失，DNA片段添加，DNA片段的重排，DNA片段的置换，或DNA损伤的诱导。DNA片段可以是小至一个核苷酸或大至36kb，即接近病毒基因组的大小，或38kb，这是能被包装腺病毒毒粒中的最大量。
对病毒具体是腺病毒基因组的优选修饰包括，除了使病毒复制缺陷的修饰外，编码这所定义的免疫调节分子转基因的插入，另外并优选至少一种编码目的治疗分子的转基因。病毒，例如腺病毒，也优选可以是共整合的，即，病毒例如腺病毒的基因组序列与其他序列例如质粒，噬菌体或其他病毒的序列连接。
根据腺病毒载体(具体是复制缺陷的腺病毒载体)，这种载体可以包括或者完全的衣壳(即，包括病毒基因组例如腺病毒基因组)或者空衣壳(即，其中病毒基因组缺失，或被降解，例如通过物理的或化学的方法)。优选地，病毒载体包括完整衣壳，即，作为携带以下物质的手段：编码免疫调节分子的转基因，并且选择地并优选至少一种编码抑制手段的转基因。或者，优选地，所述转基因可以在腺病毒衣壳的外面被携带入细胞。
为达到优选的或所希望的将病毒例如腺病毒靶向具体细胞的程度，可以基本上将病毒用作将质粒DNA转移入细胞中的核内体裂解剂，其中质粒DNA包含标志基因并与多聚赖氨酸形成复合物并浓集，其中所述多聚赖氨酸共价结合于细胞结合配体，诸如转铁蛋白(Cotten et al.，PNAS(USA)，89，6094-6098(1992)；and Curiel et al.，PNAS(USA)，88，8850-8854(1991))。已经证实转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNA复合物与腺病毒的偶联(例如，通过针对腺病毒的抗体，利用转谷氨酰胺酶，或经生物素/链霉抗生物素桥)大大促进了基因转移(Wagner et al.，PNAS(USA)，89，6099-6103(1992))。
或者，一种或多种病毒外壳蛋白，例如腺病毒尾丝，可以被修饰，例如，或者通过掺入细胞表面受体的配体序列或者允许结合双特异抗体的序列(即，一端有对尾丝的特异性和另一端有对细胞表面受体特异性的分子)(PCT国际专利申请WO 95/26412(第412申请)和Watkins et al.，″TargetingAdenovirus-Mediated Gene Delivery with Recombinant Antibodies，″Abst.No.336)。在两种情况下，经典的尾丝/细胞表面受体相互作用被取消，病毒例如腺病毒通过其尾丝被重新定向于细胞表面新受体。
或者，可以将能特异结合于所选细胞类型的靶向元件偶联于高亲和性结合对的第一分子，并给予宿主细胞(PCT国际专利申请第WO 95/31566)。然后，可以向宿主细胞给予偶联于高亲和性结合对的第二分子的基因递送载体，其中第二分子能特异性结合于第一分子，使得基因递送载体靶向所选择的细胞类型。
同样，因为方法(例如电穿孔，转化，三亲杂交的偶联(conjugation oftriparental mating)，(共)转染，(共)感染，膜融合，显微注射的使用，与磷酸钙-DNA沉淀一同保温，直接显微注射；等等)对转移以其核酸序列(即RNA或DNA)形式的病毒，质粒和噬菌体是可得的，所以在缺乏任何关联蛋白例如衣壳蛋白，和缺乏任何被膜脂质情况下，载体可以同样包括RNA或DNA。
相似地，由于脂质体通过与细胞膜融合实现进入细胞，所以载体可以包括带有编码外壳蛋白的组成性核酸的脂质体。这种脂质体是可商业得到的，例如，从Life Technologies，Bethesda，Md.，并且可以按照生产商的建议使用。而且，可以将脂质体用于实现基因递送，并且可以使用具有增强转移能力和/或在体内降低毒性的脂质体。或者在按照生产商说明制备脂质体后，或者在脂质体制备过程中，可以将可溶性嵌合体外壳蛋白(按照这里描述的方法制备的)加入脂质体。
按照发明的载体不限于那些能用于发明方法中者，而是也包括中间型载体(例如“转移载体”)其能用于基因转移载体的构建。
体内递送一种或多种核酸序列的优选方法之一包括腺病毒表达载体的使用。“腺病毒表达载体”意思是包括含有腺病毒序列的那些构建体，所述序列足以(a)支持构建物的包装和(b)以有义或反义方向表达已克隆到其中的多核苷酸。当然，在反义构建体情况下，表达不需要合成基因产物。
表达载体包括腺病毒的基因改造的形式。对腺病毒遗传组织的认识，36kb，线性，双链DNA病毒，允许用达7kb的外源序列取代腺病毒DNA大片段(Grunhaus and Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，腺病毒感染宿主细胞不导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以无潜在遗传毒性的附加体方式复制。而且，腺病毒结构稳定，大量扩增后未检测到基因组重排。实际上腺病毒可以感染所有上皮细胞，无论它们的细胞周期阶段。迄今为止，在人类腺病毒感染似乎只与轻微的疾病例如急性呼吸道疾病有关。
由于其中等大小的基因组，易于操作，高滴度，广泛的靶细胞范围和高感染性，腺病毒特别适合于用作基因转移载体。病毒的基因组两端都含有100-200个碱基对反向重复(ITRs)，其是病毒DNA复制和包装必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区含有被病毒DNA复制起始分开的不同转录单位。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组转录的和一些细胞基因的蛋白。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白的合成。这些蛋白参与DNA复制，晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。包括大部分病毒衣壳蛋白的晚期基因的产物，只在主要晚期启动子(MLP)引起的单个初始转录物的明显加工后表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染的晚期是特别有效的，并且所有由该启动子引起的mRNA’具有5’-三分前导序列(TPL)，其使它们是翻译的优选mRNA。
在目前的系统中，重组腺病毒从穿梭(shuttle)载体和原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体间可能重组，所以可以从此方法产生野生型腺病毒。因此，从各个噬斑分离单克隆病毒并检测其基因组结构是重要的。
复制缺陷的腺病毒载体的产生和增殖依靠特定的辅助细胞系。天然地，腺病毒可以包装大约野生型基因组的105％(Ghosh-Choudhury et al.，1987)，提供大约额外2kb DNA的容量。加上在E1和E3区之间可置换的大约5.5KbDNA，目前腺病毒载体的最大容量低于7.5Kb，或大约载体总长度的15％。80％以上的腺病毒基因组仍存在于载体骨架(backbone)中并且是载体携带的细胞毒的来源。而且，E1-缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。例如，已经观察到用目前可得到的载体以高度感染复数(MOI)使用时有病毒基因表达的漏出(Mulligan，1993)。
辅助细胞系可以来自人类细胞例如人类胚胎肾细胞，肌肉细胞，造血细胞或其他人类胚胎间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可以源自容许人类腺病毒的其他哺乳动物种属的细胞。这种细胞包括例如，Vero细胞或其他猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。如上所述，目前优选的辅助细胞系是293。
最近，Racher等(1995)公开了培养293细胞和繁殖腺病毒的改良方法。在一种形式中，天然细胞聚集物的生长通过将单个细胞接种于含有100-200毫升培养基的1升硅化处理的旋转培养瓶(Techne，Cambridge，UK)中进行。40rpm搅拌后，细胞活力用台盼兰估计。在另一种形式中，如下使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。将重悬于5毫升培养基的细胞接种物加入在250毫升Erlenmeyer培养瓶中的载体(50毫升)中并静置1-4小时，时而摇动。然后将培养基换成50毫升新鲜培养基并开始摇动。对于病毒生产，允许细胞生长至大约80％满底，此后更换培养基(至终体积的25％)并将腺病毒以0.05MOI加入。将培养物静置过夜，随后将体积增加至100％并开始再摇动72小时。
在优选实施方案中，腺病毒是如本领域已知的“gutless”腺病毒。“gutless”腺病毒载体是最近开发的用于腺病毒基因转移的系统。腺病毒的复制需要辅助病毒和特殊的人类293细胞系，其既表达E1a也表达Cre，这是天然环境中不存在的条件。在目前最有效的系统中，将E1-缺失的辅助病毒用作由噬菌体P1 loxP位点(”floxed”)侧接的包装信号。由于从辅助病毒DNA中缺失了包装信号，所以用gutless病毒连同有floxed包装信号的辅助病毒感染辅助细胞应该只产生gutless rAV。但是，如果使用以293为基础的辅助细胞，辅助病毒DNA可以与整合到辅助细胞DNA中的Ad5DNA重组。结果，重新获得野生型包装信号，以及E1区。因此，如果使用E1-缺失的辅助病毒，在基于293(或911)的辅助细胞上gutless rAV的产生也能导致RCA的产生。
所述载体的所有病毒基因被剥夺。因此该载体是非免疫原性的，并且如果需要可以重复使用。Gutless腺病毒载体还含有36kb的空间以接纳转基因，因此允许向细胞共转移大量基因。可以将特殊的序列基序例如RGD基序插入腺病毒载体的H-I环以增强它的感染性。腺病毒重组体的构建通过将特定转基因或转基因片段克隆到任何腺病毒载体中进行，所述腺病毒载体例如这里描述的和本领域已知的那些。可以将腺病毒重组体用于以非侵入方式转导脊椎动物的表皮细胞以用作免疫药剂。
对于异源DNA的大插入物的插入，gutless腺病毒的使用是特别有优势的(综述，参见Yeh.and Perricaudet，FASEB J.11：615(1997))，在此将其引入以作参考。此外，gutless腺病毒载体和制作方法以及它们的使用在美国专利第6,156,497和6,228,646中有更详细的描述，在此特别将这两者引入以作参考。
除了需要腺病毒载体是复制缺陷的，或至少条件性缺陷的以外，认为腺病毒载体的性质对发明的成功进行不重要。腺病毒可以是任何42种不同的已知血清型或A-F亚群。为了获得用于本发明的条件性复制缺陷腺病毒载体，C亚群的5型腺病毒是优选的起始物质，因为5型腺病毒是人类腺病毒，其中已知关于它的大量生物化学的和遗传的资料，并且它已经被用于使用腺病毒作作为载体的大多数构建。
如上所述，按照本发明的常见载体是复制缺陷的并且没有腺病毒E1区。因此，它最利于在E1编码序列被删除的位置导入编码免疫调节分子和/或额外的目的治疗蛋白的转基因。然而，表达构建物在腺病毒序列中插入的位置对发明不重要。也可以如Darlsson等(1986)描述的，在E3置换载体中插入目的转基因以取代删除的E3区，或者在辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的情况下插入E4区中。
腺病毒是在体外和体内易于生长和操作并表现出广范的宿主范围。可以以高滴度例如每毫升109-1011菌落形成单位获得这组病毒，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒转移的外源基因是附加体，并因此，对宿主细胞具有低遗传毒性。在用野生型腺病毒作为疫苗的研究中未见副作用的报道(Couch et al.，1963；Topet al.，1971)，证明它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。
腺病毒载体已经被用于真核基因表达(Levrero et al.，1991；Gomez-Foixet al.，1992)和疫苗开发(Grunhaus and Horwitz，1992；Graham and Prevec，1992)。最近，动物研究显示重组腺病毒可被用于基因治疗(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet et al.，1990；Rich et al.，1993)。向不同组织给予重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1992)，肌肉注射(Ragot et al.，1993)，外周静脉内注射(Herz and Gerard，1993)和向脑内的定向(stereotactic)接种(LeGal La Salle et al.，1993)。
相应地，在优选实施方案中，这里使用的表达载体是腺病毒载体。合适的腺病毒载体包括人类腺病毒例如Ad2 Ad5的修饰，其中病毒体内复制必需的遗传元件例如E1区被去除，并且将编码目的外源基因的表达盒插入腺病毒基因组中。
此外，如上所述，优选的表达载体系统是逆转录病毒载体系统，例如PCT/US97/01019和PCT/US97/01048中一般描述的，在此特别将两者引入以作参考。
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，特征是通过逆转录过程在感染的细胞中将它们的RNA转变成双链DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得的DNA作为前病毒稳定整合到细胞染色体中，并指导病毒蛋白质的合成。整合导致在受体细胞和其子代中保留病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有三个基因，gag，pol，和env，其分别编码衣壳蛋白，聚合酶，和包膜成分。gag基因上游发现的序列含有将基因组包装成病毒粒的信号。两个长末端重复序列(LTR)存在于病毒基因组的5’和3’末端。它们含有强的启动子和增强子序列，并且也是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码一个或多个目的寡核苷酸或多核苷酸的核酸插入病毒基因组，取代某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒颗粒，构建含有gag，pol和env基因但没有LTR和包装成分的包装细胞系(Mann et al.，1983)。当将含有cDNA的重组质粒，连同逆转录病毒LTR和包装序列导入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的RNA转录本被包装入病毒颗粒，所述病毒颗粒然后被分泌到培养基中(Nicolas and Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann et al.，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，可选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能感染广泛的细胞类型。但是整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind et al.，1975)。
最近开发了设计为允许逆转录病毒载体的特异靶向的新方法，其以向病毒被膜上通过化学方法添加乳糖残基的逆转录病毒的化学修饰为基础。这种修饰可以允许经唾液酸糖蛋白受体的肝细胞的感染。
设计重组逆转录病毒的靶向的不同方法，其中使用抗逆转录病毒外壳蛋白和抗特异细胞受体的生物素化的抗体。使用链霉抗生物素经由生物素成分偶联所述抗体(Roux et al.，1989)。使用抗主要组织相容性复合物I类和II类抗原的抗体，他们证明了嗜亲性(ecotropic)病毒在体外对许多带有那些表面抗原的人类细胞的感染(Roux et al.，1989)。合适的逆转录病毒载体包括LNL6，LXSN，和LNCX(参见Byun et al.，Gene Ther.3(9)：780-8(1996 forreview)。
AAV(Ridgeway，1988；Hermonat and Muzycska，1984)是细小病毒，作为腺病毒原种的污染物而被发现。它是一种普遍的病毒(抗体存在于85％的美国人群中)，其不与任何疾病有关系。它也被分类为依赖病毒属，因为它的复制依赖辅助病毒例如腺病毒的存在。已经分离了5种血清型，其中AAV-2是最具特征的。AAV有单链线性DNA，其被包裹在衣壳蛋白VP1，VP2和VP3内以形成直径20到24nm的二十面体病毒粒(Muzyczka andMcLaughlin，1988)。
AAV DNA大约是4.7kb长。它含有两个开放读码框架并侧接两个ITR。在AAV基因组中有两个主要的基因：rep和cap。Rep基因编码负责病毒复制的蛋白，而cap编码衣壳蛋白VP1-3。每个ITRs形成T-形发夹结构。这些末端重复是AAV染色体整合的唯一必需的顺式元件。因此，可以将AAV用作去除了所有病毒编码序列并由基因盒取代以便进行递送的载体。已经鉴定了三种病毒启动子，并按照它们的图谱位置命名为p5，p19，和p40。从p5和p19的转录导致rep蛋白的产生，从p40的转录产生衣壳蛋白(Hermonat and Muzyczka，1984)。
由于其安全性AAV也是转移载体的良好选择。有一种相关复杂营救机制：动员rAAV不仅需要野生型腺病毒而且需要AAV基因。同样地，AAV是非致病的，并且不与任何疾病相关。去除病毒编码序列使对病毒基因表达的免疫反应降至最低，并因此，rAAV不引起炎症反应。其他涉及AAV的公开在美国专利申请第6,531,456中提及，在此特别将其引入以作参考。
在本发明中可以使用其他病毒载体作为表达载体用于将免疫调节分子递送到宿主细胞。可以使用源于病毒例如痘苗病毒，慢病毒，脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒的载体(Ridgeway，1988；Coupar et al.，1988)。它们提供对多种哺乳动物细胞的有吸引力的特点(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Coupar et al.，1988；Horwich et al.，1990)。
表达载体的递送
为使免疫调节分子(例如CD8α链)和/或额外的治疗蛋白有效表达，必须将表达载体递送入细胞。这种递送可以用如对转化细胞系的实验方法在体外完成，或如对某些疾病状态的治疗那样在体内或离体完成。如上所述，递送的一种优选地机制是经由感染，其中核酸被包裹在重组病毒颗粒中。
一旦表达载体被递送进细胞，可以将编码所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸定位在不同位点并表达。在某些实施方案中，编码构建体的核酸可以稳定整合到细胞基因组中。这种整合可以是经同源重组(基因置换)在具体位置和方向进行，或者可以为随机的、非特异位点的整合(基因增加)。在进一步和优选的实施方案中，核酸可以以分离的DNA附加体片段在细胞中稳定维持。这种核酸片段或“附加体”编码序列足以允许独立于或同步于宿主细胞循环的维持和复制。如何将表达载体递送入细胞和在细胞中核酸保留在何处依赖于使用的表达载体的类型。
在发明的某些实施方案中，表达载体可以简单地由裸重组DNA或质粒组成。载体的转移可以通过上面提到的通过物理或化学方法使细胞膜通透的任何方法进行。这特别适用于体外转移，但也可用于体内使用。Dubenskyet al.(1984)向成年的和新生的小鼠肝脏和脾脏成功注射了磷酸钙沉淀形式的多瘤病毒DNA，证明活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Reshef(1986)也证明直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致转染的基因的表达。设想编码目的基因的DNA在体内也可以以相似的方式转移并表达基因产物。
本发明向细胞转移裸DNA表达构建物的另一实施方案可以包括粒子轰击。该方法依靠加速DNA包被的微粒至高速的能力，该速度允许它们穿过细胞膜并进入细胞而不杀伤细胞(Klein et al.，1987)。已经开发了加速小颗粒的几种装置。一种这样的装置依靠高电压发射以产生电流，其反过来提供动力(Yang et al.，1990)。使用的微型轰击粒子(microprojectile)一般含有生物学上的惰性物质例如钨或金珠。
在体内已经轰击了选定的器官，其包括大鼠和小鼠的肝，皮肤，和肌肉组织(Yang et al.，1990；Zelenin et al.，1991)。这可能需要组织或细胞的手术暴露，以减少在枪和靶器官之间的任何干扰组织，即，离体处理。此外，编码具体基因的DNA可以经此方法转移，并且仍包含在本发明中。
在本发明的一个优选实施方案中，通过脂质体介导的核酸转移将核酸分子导入靶细胞。关于这一点，许多以脂质体为基础的试剂是本领域熟知的，是可商业得到的，并且可以常规用于向靶细胞导入核酸分子。本发明的某些实施方案会使用阳离子脂质转移载体例如Lipofectamine或Lipofectin(Life Technologies)，二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)(DOPE)连同阳离子胆固醇衍生物(DC胆固醇)，N[1-(2，3-二油氧(dioleyloxy)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物(trimethylammonium chloride)(DOTMA)(Sioud etal.，J.Mol.Biol.242：831-835(1991))，DOSPA：DOPE，DOTAP，DMRIE：胆固醇，DDAB：DOPE等等。脂质体包裹的核酸的制备是本领域熟知的，并一般联用大约1∶1的脂类和核酸。
本发明的应用
如上面详细描述的，这里描述的和使用的方法和组合物可普遍应用于抑制对供体和/或受体抗原的同种异体免疫应答中，例如用在移植和GVHD的治疗中。按照本发明，通过调节移植物细胞表达CD8多肽，更优选地，CD8α链，可以延长移植物存活而不需要长期的普通免疫抑制剂。如这里描述的CD8多肽的定向表达导致有效特异地抑制抗同种异体移植物中供体抗原的受体免疫应答。相反地，调节有GVHD风险的受体细胞，使其表达CD8多肽导致有效特异地抑制来自移植物的供体T细胞对该受体细胞的GVHD免疫应答，并因此可以预防和/或治疗GVHD。
不受理论限制，认为CD8在靶细胞上的表达赋予靶细胞诱导对宿主免疫系统“否决效应”的能力。即，如上所述，当将表达CD8的细胞与宿主T细胞接触时，T细胞被下调或杀伤。相应地，通过“否决”或“否决效应”意思是靶细胞下调针对靶细胞的免疫应答的能力。认为CD8具体是CD8α链是否决效应诱导或转移所必需的。通过“否决效应的转移”意思是将否决效应转移至正常情况不诱导否决效应的细胞上。即，将减弱或下调对靶细胞免疫应答的能力通过诱导或增加的CD8表达而赋予靶细胞。如这里第一次报道的，现在已经惊奇地发现靶细胞上CD8α链的存在可以“否决”CD4+T细胞以及CD8+T细胞，并因此免疫应答的细胞和体液成分都可以因此被抑制。
相应地，本发明可用于通过诱导否决效应减弱对靶细胞免疫应答。这导致会识别靶细胞的T细胞的下调和缺失。当靶细胞是表达自身抗原的细胞时，诱导否决效应可对抗抗宿主自身免疫应答。当靶细胞是用在例如移植方案中以再建具体细胞类型群体的干细胞时，诱导抗干细胞的否决效应保护干细胞的群体。当靶细胞是同种异体移植物细胞例如移植的组织，诱导否决效应可保护免受排斥，这可通过减弱或下调抗同种异体移植物表达或其中存在的非自身抗原或同种抗原的免疫应答实现。同样地，通过抑制针对自非人类哺乳动物例如猪，马，非人灵长类等等移植的器官，组织和细胞中的抗异种抗原的免疫应答，也考虑这里提供的方法和组合物可用于异种移植领域中。
一般地，当CD8表达用于移植方案中时，移植物存活可被显著延长，超过缺乏受试核酸时正常预期的时间，更通常至少5天，更优选地至少大约30天，甚至更优选大约3个月，最优选大约6个月到1年。移植物存活的实际时间可以随方法的各种情况变化，具体依赖被移植的器官类型。而且，如果靶细胞CD8表达下降以致被宿主免疫应答识别，可以重复用含有CD8核酸的转移载体对靶细胞的处理。这对已经使用异种移植物、等待同种异体移植物的区域也是有用的，以允许减少普通免疫抑制剂的量或避免一起使用这种免疫抑制剂。
本发明的表达载体因此具有体外用途。可将该载体用作研究工具，用在病毒清除和存留的研究中以及评价防止免疫应答手段的有效性的方法中。相似地，可以在体内使用表达载体，优选重组表达载体，具体是病毒或腺病毒载体，其包括转基因和至少一种编码免疫调节分子的基因。
体内递送包括但不局限于直接注入器官，经导管，或通过输注的其他方式。可以将核酸在移植器官的临近部位经血管内给药或全身给药。本领域的技术人员会知道每种递送方式的优点和缺点。例如，直接注射可以在器官中产生核酸的最高滴度，但是核酸的分布可能在整个器官中不平均。在移植器官附近导入核酸一般导致与器官的细胞的更多接触，但是全身给药一般更简单。也可以在切下所述器官前向供体给药。可以通过单次给药或数次给药来导入核酸，所述给药在从供体切下器官前以及移植后开始。不需更多实验，技术人员能判断令人满意的给药手段和给药方案。
使用技术人员熟知的方法，可以将核酸与移植器官的细胞离体接触。如这里描述的，可以考虑通过添加这里详述的表达载体来明显改良传统的器官保存溶液。保存器官的温度可以是常规的，一般在大约1℃到8℃。器官在培养基中的放置时间一般在10分钟到48小时的范围内，更通常大约10分钟到2小时。可以将核酸与器官的细胞在体内和离体条件下接触。
在一个优选实施方案中，通过直接注入移植的器官将核酸与器官移植物的细胞接触。就这一点，本领域熟知，活细胞能内化并掺入与之接触的外源核酸分子。然后所述核酸可以由将其掺入其细胞核的细胞表达。在一个优选实施方案中，通过经血管内注入移植器官附近，将核酸与移植器官的细胞接触。在另外的优选实施方案中，通过全身给药将核酸与移植器官的细胞接触。
可以将受试核酸用于广泛的宿主，具体是灵长类，更具体是人类，或家养动物。可以将受试核酸与各种器官移植联合使用，包括但不局限于肾脏，心脏，肝脏，脾脏，骨髓，胰腺，肺，和朗格汉斯(Langerhans)胰岛。可以将受试核酸用于同种的以及异种的移植物。
通过给予细胞校正性(corrective)DNA，也可以将本发明的表达载体例如重组腺病毒载体用于治疗许多疾病中的任何一种，所述DNA例如编码缺失或者受损的功能的DNA。这种治疗的候选疾病包括，例如，癌症，例如黑色素瘤或胶质瘤，囊性纤维化，遗传疾病，和病原体感染，包括HIV感染。参见例如，共同未决的美国专利申请XX，在此将其引入以作参考。在进一步优选的实施方案中，能表达带有或不带有额外治疗分子的免疫调节分子(例如CD8)的载体，可以被优选用于抑制宿主抗移植组织的免疫应答，或预防对自身抗原的自身免疫应答。本发明的方法和组合物的其他应用对本领域的技术人员是明显的。
表达载体的制剂和剂量
本领域的技术人员会理解许多向动物给予表达载体(具体是腺病毒载体)有许多合适方法(见，例如，Rosenfeld et al，Science，252，431-434(1991)；Jaffe et al.，Clin.Res.，39(2)，302A(1991)；Rosenfeld et al.，Clin.Res.，39(2)，311A(1991)；Berkner，BioTechniques，6，616-629(1988))，并且尽管可以使用不止一种途径给药，但是具体的途径比另一种途径能提供更及时更有效的反应。用在表达载体给药的可药用赋形剂和/或抑制免疫应答的方法对本领域的技术人员也是熟知的，并是易于得到的。赋形剂的选择部分由用于给予表达载体的具体方法和抑制免疫应答的方式决定。相应地，本发明提供组合物，其包括单独编码免疫调节分子(例如CD8α链)的单独的表达载体或进一步与适宜载体中的转基因组合的表达载体，并且对本发明的相关使用中有大量合适的制剂。具体地，本发明提供组合物，其包括含有编码CD8α链(或其功能片段)的基因的表达载体和其载体。在另外的实施方案中，所述表达载体进一步编码治疗分子或目的蛋白例如抗炎分子。这种组合物可进一步包括其他活性物质，例如本领域已知的治疗性或预防性物质和/或免疫抑制剂。下面的方法和赋形剂仅作为例子，绝不是限制。
适合口服给药的制剂包括(a)脂质溶液，例如有效量的化合物，其溶解于稀释剂，例如水，盐水，或橙汁；(b)胶囊，囊剂(sachet)或片剂，各含有预定量的例如固体或颗粒的活性成分；(c)在合适液体中的悬液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可包括一种或多种乳糖，甘露醇，玉米淀粉，马铃薯淀粉，微晶纤维素，阿拉伯胶，明胶，二氧化硅胶，交联甲羧纤维素钠(croscarmellose sodium)，滑石粉，硬脂酸镁，硬脂酸，和其他赋形，色素，稀释剂，缓冲剂，湿润剂，防腐剂，调味剂，和药理学相容的赋形剂。糖锭(lozenge)形式可包括调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄芪胶)中的活性成分，以及包含惰性基质例如明胶和甘油，乳剂，凝胶剂等中的活性成分的锭剂，所述惰性基质中除含有活性成分外，还含有例如本领域已知的赋形剂。
可制备气溶胶制剂用于吸入给药。可将这种气溶胶制剂放入可加压的推进剂中，所述推进剂例如二氯二氟甲烷，丙烷，氮等等。也可将它们制剂成药物用于非加压制备物，例如在喷雾器或雾化器中的药剂。
适用于肠道外给药的制剂包括水性的和非水性的，等渗等张的无菌注射液，其可含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，和溶质(其使制剂与意图受体的血液等渗等张)，和水性和非水性无菌悬液(其可包括悬着剂，助溶剂，增稠剂，稳定剂，和防腐剂)。制剂可以在单位剂量或多剂量密封的容器中存在，例如安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥的(冻干的)条件贮存，在临用前，仅需要加入无菌的液体赋形剂例如水用于注射。也可以从前面描述的无菌粉末，颗粒，和片剂制备即配即用的注射液和悬液。此外，可以用各种基质制备栓剂，例乳化的基质或水溶的基质。适合阴道给药的制剂可以以阴道栓剂，塞子，乳膏，凝胶剂，糊剂，泡沫剂，或喷雾剂剂型提供，其中除含有活性成分外，还含有例如本领域已知的合适的载体。
给予动物，具体是人类的剂量，在本发明的全文中会根据以下因素变化：目的治疗转基因，载体的来源和/或免疫调节分子的性质，使用的组合物，给药方法，和治疗的具体位点以及生物体。但是，优选地，使用相当于载体(例如按照本发明的腺病毒载体)有效量的剂量。“有效量”是足以在宿主中产生所需效应的量，其可用本领域技术人员已知的几种终点监测。例如，一种所需效应是核酸转移入宿主细胞。这种转移可通过多种方式监测，包括但不局限于：治疗效果(例如某些与所治疗的疾病，状态，紊乱或综合症相关的症状的减轻)，或通过宿主中转移的基因或编码序列或其表达的证据(例如使用聚合酶链式反应，Northern或Southern杂交，或用来检测宿主细胞中的核酸的转录实验，或使用免疫印迹分析，抗体介导的检测，或具体化的测定以检测由转移的核酸编码的、或其水平或功能受影响的蛋白或多肽)进行监测。描述的这些方法并没有包括全部，并且适合具体应用的其它方法对普通技术人员是明显的。就此而言，应当指出宿主对导入载体，例如病毒载体，具体是腺病毒载体，以及编码抑制免疫应答手段的载体的应答可以依下列情况而变化：给予的病毒剂量，给予的位点，和载体以及转基因的基因组成和抑制免疫应答的方式。
一般地，为确保本发明的载体有效转移，优选每个被接触的细胞上使用大约1-5000拷贝的按照发明的载体，其以通过给定给药途径而被接触的大约细胞数为基础，并且甚至更优选大约3-300pfu进入每个细胞。但是，这只是一般原则，其不排除在体外或体内使用更高或更低量，如可能在具体应用中是正当的。相似地，如果以含有蛋白的组合物的形式，抑制免疫应答的手段的量应当足以抑制对包括转基因的重组载体的免疫应答。例如，实际剂量和方案可以根据组合物是否与其他药用组合物联合，或根据药代动力学，药物分布和代谢中的个体差异而变动。相似地，根据靶向的具体细胞类型或载体转移的方式，在体外应用中所述量可以改变。考虑实际情况的需要，本领域的技术人员可以容易地进行任何必需的调整。
尽管已经参考优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员知道在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行形式和细节的改变。这里提到的每个专利，发表物和其他参考文献在此特别以其全部引入以作参考。
实施例1否决效应-用载体研究
a.使用质粒表达载体将纤维母细胞改造为否决细胞
将纤维母细胞改造成在其表面表达或者人类或者小鼠CD8α链。将纤维母细胞用pCMVhCD8α质粒或pCMVmCD8α质粒转染，其中CD8α链的表达由CMV立即早期启动子/增强子(Invitrogen)驱动。当将CD8α链转染的纤维母细胞(H-2b)加入混合的淋巴细胞物培养(Balb/c；H-2d抗-C57BL/6；H-2b)时，只有表达CD8α链的细胞系抑制CTL应答。如图3A和B描述的，表达或者小鼠或者人类CD8α链的MC57T纤维母细胞的添加完全抑制了CTL的诱导。相反，添加非转染的纤维母细胞不影响T-淋巴细胞激活。除了建立CD8α链的抑制功能，这些实验也证明小鼠T-淋巴细胞可以用人CD8α链否决。因此，在对设计成用于临床使用的否决的检测中，小鼠模型是有用的。
经改造的否决细胞的体内功能
判断是否经改造的否决在动物体内有功能。将转染成表达CD8α链的C57BL/6(H-2b)-源的纤维母细胞注入Balb/c(H-2d)小鼠内。向对照动物注射非转染的纤维母细胞。8-40天后收获脾细胞并导入MLCs培养物，以C57BL/6(H-2b)脾细胞作为刺激细胞。5天后，收获培养物并测试它们裂解EL4(C57BL/6，H-2b)靶细胞的能力。在注射了表达CD8α链的纤维母细胞的动物中，抗H-2bCTL应答的诱导被完全抑制(图4)。对抗H-2bT细胞的抑制高度特异。从这些小鼠来的T细胞对第三组H-2k同种-MHC分子仍旧应答(still mounted)。这些实验确认经改造的否决细胞在体内与传统的否决细胞相似，可特异地抑制免疫应答，并且可以将非经典的否决细胞改造成为否决细胞。换言之，经改造的细胞使动物对这些细胞携带的抗原负性免疫。
检测是否CD8α链的表达干扰完全激活的T细胞的功能。为此目的，测试表达CD8α链的靶细胞被完全活化的CTL裂解的易感性。为这些研究选择两种不同的T细胞群，在MLCs中刺激的同种反应性CTL和活化的肽-特异性CTL。如图5所示，表达CD8α链的靶被同种反应T细胞群有效裂解，但不被抗原特异T细胞裂解。这些结果显示经改造的否决甚至能干扰正在进行的抗原特异性免疫应答，例如那些自身免疫中发现的免疫应答。
b.用病毒转移载体将纤维母细胞改造为否决细胞
腺病毒转移载体m-CD8的否决功能：开发携带小鼠CD8α链的复制缺陷载体，腺病毒转移载体(mAdCD8α)。用mAdCD8否决转移载体感染的小鼠纤维母细胞(MC57)在第2天表达高水平的小鼠CD8α链。在这些快速增殖的细胞中，小鼠CD8α链的表达在第5天明显减弱。虽然效率较低(结果未显示)，mAdCD8也感染其他小鼠细胞系，例如EL4。
在随后的实验中，将mAdCD8α感染的MC57纤维母细胞(H-2b)加入Balb/C(H-2d)抗-C57B1/6(H-2b)MLCs。5天后，收获培养物并测试抗H-2bCTL的存在。已经加入感染的纤维母细胞的MLCs不再含有抗H-2bCTL(图12)。这些实验确定了否决转移载体介导免疫抑制的能力。
此外，已经生产了人类CD8-版的腺病毒载体。而且，已经生产了表达小鼠CD8α链的腺伴随病毒。已经证明这些病毒诱导各自的CD8链表达。表达或者小鼠或者人类CD8α链的腺病毒否决载体介导杀伤T细胞诱导的完全抑制(见图7)。
用mAdCD8否决转移载体的负性免疫：设计两个不同的实验来判断是否mAdCD8在体内抑制免疫应答。第一个实验中，将C57Bl/6小鼠用相当剂量的或者mAdCD8否决载体或者编码β-半乳糖而不是小鼠CD8α链(Adβgal)的相似腺病毒对照载体进行感染。免疫几天后，将这些动物处死。将它们的脾细胞单细胞悬液在存在Adβgal病毒情况下培养5天。然后收获培养物并评价它们的增殖能力。如图7所示，从Adβgal免疫的小鼠收获的、对Adβgal增殖活跃的T细胞表明存在高增殖活性的CD4+T细胞。相反，从注射了mAdCD8的动物收获的T细胞不能扩增。
在第二步，我们测定是否这些培养物含有功能性的CD8+CTL，测定它们裂解Adβgal-感染的靶细胞(EL4，H-2b)的能力。仅在从注射了Adβgal小鼠建立的培养物中发现了CTL(图8)。这第一个实验表明AdCD8α可能由于表达CD8α链而不诱导对腺病毒抗原的应答。但是，可能AdCD8诱导免疫应答失败有不同原因。AdCD8在某些不明确的情况下是没功能的，或者小鼠仅对mAdCD8中没发现的β半乳糖苷酶蛋白起反应。
为测试不同结论的正确性，将C57Bl/6小鼠用mAdCD8或者Adβgal注射一次，随后在7天后第二次输注Adβgal。7天后，处死小鼠，在Adβgal存在情况下进行5天的脾细胞培养。测定反应性T细胞对Adβgal-感染的靶细胞的裂解能力(图8)。实际上，两次暴露于Adβgal导致更好的免疫。这些研究也显示AdCD8注射后，小鼠不再对Adβgal应答，并且Adβgal主要(如果不是唯一地)诱导对两种载体的共同腺病毒蛋白的CTL应答。这一系列实验强烈显示生产基因治疗病毒载体是可能，所述载体能够对这些载体携带基因的应答产生负性免疫。
否决对CD4+T淋巴细胞的抑制：为检验是否能将否决转移载体用于抑制CD4+T淋巴细胞的诱导，建立下面的实验系统。将C57Bl/6-源纤维母细胞刺激物被转化以表达同种MHC II类分子(H-2E7k)和免疫刺激物CD80。将这些未经照射而保留其全部刺激能力的缓慢增殖型纤维母细胞用mAdCD8或者Adβgal转移载体转导，并加入未经选择的C57Bl/6脾细胞。4天后，收获这些培养物并用表面免疫荧光分析活化的，即分裂型(blasting)CD4+T淋巴细胞的存在(图9)。发现与正常或Adβgal-转导的刺激细胞一起培养的未经选择的C57Bl/6脾细胞具有高数目的CD4+T淋巴母细胞。相反，加入mAdCD8-感染的刺激物的培养物中仅检测到少量CD4+T淋巴母细胞。这些研究确认否决抑制CD4+T淋巴细胞，并且此外可将病毒的否决转移载体用于此目的。
用不同病毒构建体感染后小鼠和人CD8α链的表面表达
染色方法：
mAdCD8：
将MC57T在改良的IMDM中用mAdCD8以大约104的感染复数进行假感染或感染3天。收获感染的细胞并用直接标记了FITC的抗小鼠CD8α链抗体(Pharmingen)染色CD8α-链的表面表达。在荧光活化的细胞分析仪(FACScan，Beckton-Dickinson)上测定表面荧光强度(图10)。
从Balb/c小鼠股骨腔中收获骨髓细胞。将细胞在改良的IMDM中用表达β-半乳糖苷酶的腺病毒对照载体(AdLacZ)或mAdCD8以104的感染复数3天。收获感染的细胞，并用直接标记了FITC的抗小鼠CD8α链抗体染色CD8α-链的表面表达。测定表面荧光的强度(图10C)。此外，判断包括CD34+骨髓细胞，即干细胞库中的细胞的几种细胞类型被有效转导(表1)。
  标志   细胞类型   阳性染色
  CD11aCD34CD19CD3  白细胞造血系B淋巴细胞T淋巴细胞 29.3％      31.5％13.8％      10.5％0.6％       7.7％0.6％       未检测到
表1
hAdCD8：
将MC57T假感染。hAdCD8的病毒滴度未知。将100μl其原液用于感染3×105细胞3天。收获感染的细胞并用直接标记了FITC的抗人CD8α链抗体(Pharmingen)染色CD8α-链的表面表达。在荧光活化的细胞分析仪(FACScan，Beckton-Dickinson)上测定表面荧光强度(图10)。
AAV-为基础的否决载体
使用类似Strategene/Avigen系统生产AAV-为基础的否决载体。在这些构建件中，人类和小鼠CD8α链由同一CMV立即早期启动子/增强子驱动。将两种病毒，mAAVCD8和hAAVCD8包装在HEK 293包装细胞系中。使用的系统不需辅助病毒。mAAVCD8和hAAVCD8有效感染小鼠纤维母细胞(MC57T)，并且各自引起小鼠或人类CD8α链的高水平表达。在荧光活化的细胞分析仪上测定荧光强度(图10D)。值得注意的是，在转导后36小时内观察到CD8α链表达的高水平。这一发现与其他人的观察形成对比。他们发现AAV-驱动的基因表达需要几天以达到显著水平(PH Schmelck，PrimeBiotech)。用AAV否决载体的另外的研究重复了我们前面的发现，即可以将它们用于抑制免疫应答。这里，使用标准的MLC方法(图6)。
实施例2：体外抑制研究-混合的淋巴细胞培养
从Balb/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠收获脾细胞。制备单细胞悬液。将C57BL/6脾细胞用3,000拉德(rad)(Mark 1 Cesium Irradiator)射线照射。在24孔板(TPP，Midwest Scientific，Inc.)上将每孔4×106Balb/c脾细胞(应答/效应细胞)与4×106照射的C57BL/6脾细胞(刺激细胞)一起培养，其中培养基采用IMDM(Sigma)，其含有10％胎牛血清(FCS)(Sigma)，HEPES，青霉素G，硫酸链霉素，硫酸庆大霉素，L-谷氨酰胺，2-巯基乙醇，非必需氨基酸(Sigma)，丙酮酸钠和碳酸氢钠(改良的IMDM)。在CO2孵箱(FormaScientific)中培养5天后，收获全部培养物，并测定其裂解57BL/6-源靶细胞(H-2b)的能力。
向一些这样的培养物中加入已经用12,000拉德射线照射的4×105MC57T纤维母细胞(H-2d)。在抑制培养中，包括4×105MC57T细胞，所述细胞已经用mAdCD8以大约104比1的感染复数感染2天。
细胞毒T淋巴细胞杀伤实验
计数从混合的淋巴细胞培养物收获的细胞中母细胞的数目，作为活化的T淋巴细胞的指标。将这些效应细胞加入U-形底96孔板的单孔中。以3倍滴度梯度从每孔3×106或1×105效应细胞开始滴定每孔效应细胞数。向这些效应细胞加入1×104靶细胞EL4(H-2b)，MC57T(H-2b)或P815(H-2d)每孔。所述靶细胞之前已经用51Cr(Na-Chromate，Perkin-Elmer)标记。将1×106靶细胞与100μCi一起大约500μl体积的改良的IMDM中保温90分钟。此后，用改良的IMDM多次洗涤去除未掺入的51C。
将效应细胞和靶细胞以200μl的总体积在CO2孵箱中保温4小时。此后，将所述板在离心机(Centra CJ35R，International Equipment Company)上1500转/分旋转3分钟。从每孔中去除100μl培养基，从靶细胞释放的51Cr的量在4000型γ计数仪(Beckman Instruments)上计数。设立对照培养，其中忽略效应细胞以判定本底释放。判定孔中掺入靶细胞中的51Cr总量，其中用1％Triton×100溶液(Sigma)取代效应细胞。
特异裂解的量如下测定：
％＝(特异释放-本底释放)/(总释放-本底释放)×100
体外mAdCD8的活性
建立混合的淋巴细胞培养(Balb/c抗-C57BL/6)。向这些培养物中加入MC57T纤维母细胞(如所示)，其已经用12,000拉德射线照射并已经用mAdCD8感染。培养5天后，收获培养物并测定它们在不同效应物对靶(E/T)比例时裂解EL4(H-2b)靶细胞的能力。
如可观察到的，甚至在混合的淋巴细胞培养中，表达CD8的细胞抑制裂解性T淋巴细胞的诱导。
mAdCD8和hAdCD8的产生
在AdEasyTM系统的辅助下从Biogene生产两种腺病毒载体。这里将小鼠和人CD8α链cDNA掺入转移载体中(步骤1)。与Ad5ΔE1/ΔE3载体的重组在BJ5183 EC细菌中完成(步骤2)。然后将重组载体转移入QBI-HEK293A细胞中，其含有E1A和E1B腺病毒5病毒的基因，其补充了重组腺病毒中此必需区的缺失。这些细胞产生的hAdCD8和mAdCD8因此是复制缺陷的。
作为表达细菌LacZ基因(β-半乳糖苷酶)的对照载体，Qbiogene提供QBI-Infect+Viral Particle(Ad5.CMVLacZΔE1/ΔE3)。使用的小鼠CD8α-链序列。该序列与公开的小鼠序列相似：
实际序列：MASPLTRFLS LNLLLMGESI ILGSGEAKPQAPELRIFPKKMDAELGQKVD LVCEVLGSVS QGCSWLFQNSSSKLPQPTFVVYMASSHNKI TWDEKLNSSK LFSAVRDTNNKYVLTLNKFS KENEGYYFCSVISNSVMYFS SVVPVLQKVNSTTTKPVLRT PSPVHPTGTS QPQRPEDCRPRGSVKGTGLD FACDIYIWAPLAGICVAPLL SLIITLICYH RSRKRVCKCPRPLVRQEGKP RPSEKIV
使用人CD8α-链。此序列与所示公开的人序列相比具有沉默突变。
实际序列：MALPVTALLL PLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGWTVE LKCQVLLSNP TSGCSWLFQPRGAAASPTFL LYLSQNKPKAAEGLDTQRFS GKRLGDTFVLTLSDFRRENE GYYFCSALSN SIMYFSHFVPVFLPAKPTTT PAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGG AGNRRRVCKCPRPVVKSGDK PSLARYV
pAAV-mCD8和pAAV-hCD8的制备
在AAV无辅助物系统(Helper-Free System)的帮助下从Stratagene制备这些载体。通过在pAAV-MCS克隆载体中插入小鼠和人的序列使系统工作。然后将此质粒与辅助质粒(含有必需的腺病毒蛋白)和pAAV-RC载体(含有衣壳基因)一起共转染到HEK293细胞中以产生重组AAV颗粒。
实施例3：在动物模型上经改造的否决
在移植研究前，我们研究了动物对注射大剂量mAdCD8如何应答。在实验的第一部分(set)，对Balb/c小鼠(每组两只)经静脉注入相当剂量的mAdCD8或编码β-半乳糖苷酶(AdLacZ)的腺病毒对照载体。7天后将动物处死。将脾细胞在AdLacZ存在下培养5天。然后测定它们裂解AdLacZ-感染的靶细胞(P815，Balb/c-源)的能力。如图13所示，可以将具有特异裂解活性的CTL从已经用AdLacZ免疫的Balb/c小鼠扩增，但是不能从已经接受mAdCD8的小鼠扩增。结果显示由于CD8α-链的表达，AdCD8不诱导对腺病毒抗原的免疫应答。
在第二部分(set-up)，将C57Bl/6小鼠用相当剂量的mAdCD8(2只小鼠)或AdLacZ(2只小鼠)免疫。免疫7天后，处死每组的一只动物。将它们的脾细胞在AdLacZ存在下在细胞悬液中培养5天。然后测定它们特异性裂解AdLacZ-感染的靶细胞(EL-4，C57Bl/6-源)的能力。此外，AdLacZ的注入诱导了特异性杀伤细胞的产生但频率较低，而mAdCD8无此效果(图14)。
在实验的第二阶段，已经接受或者mAdCD8或者AdLacZ的其余C57BL/6小鼠在它们接受第一次病毒注射后7天接受第二次AdLacZ给药。7天后，处死小鼠，并在AdLacZ存在下进行5天的脾细胞培养。再次测定反应性T细胞对AdLacZ-感染的EL4-靶细胞的裂解能力(图14B)。实际上，两次暴露于AdLacZ使免疫在某种程度得以改善。但是以前已经接受mAdCD8的动物仍不能产生应答。这些实验表明AdCD8不仅不能诱导免疫应答，而且防止针对其自身的免疫应答的诱导。因此，mAdCD8逃避免疫系统。
皮肤移植
建立皮肤移植模型。第一步，将小鼠处死并收获它们的皮肤部分。将所述皮肤用携带β-半乳糖苷酶的腺病毒对照病毒(AdLacZ)感染。转导24小时后，将这些皮片在含有IPTG的培养基中培养，其通过表达的β-半乳糖苷酶的作用被转变成蓝色(结果未显示)。与这些研究同时，我们最优化了外科方法。将供体动物处死，并收获大约0.5cm2卵圆形全厚背部皮片。小心去除脂肪组织。在同基因的移植研究中，将Balb/c皮肤移植给Balb/c受体。经过一段时间皮肤愈合良好(结果未显示)。然后我们转为完全异基因品系组合(fully allogeneic strain combination)，其中将感染了或者mAdCD8或者AdLacZ的Balb/c供体皮肤移植给C57BL/6小鼠。在第12天，所有AdLacZ-感染的皮肤表现出活跃的炎症迹象。而mAdCD8-感染的皮肤在此时间点看起来健康。但是在此模型中，没有诱导耐受，皮肤最终受到了排斥，明显由于后来判断出的事实，其中大多数皮肤细胞排斥腺病毒载体的感染。
同种异基因心脏移植
建立下面的心脏移植模型。将新生小鼠的心脏组织移植在受体小鼠的耳部皮下。建立移植系统的同时，我们检验了心肌细胞如何能被mAdCD8载体最佳感染。从新生的心脏制备单细胞悬液并在不同条件下用AdCD8感染。用免疫荧光检测小鼠CD8α链表面表达的强度。如图15，以大约103的MOI与mAdCD8保温24小时后，mAdCD8有效转导了小鼠心肌细胞。
已经确定了心肌细胞对mAdCD8转导的易感性，我们判定最适于抑制免疫系统的病毒浓度。将C57BlL/6(H-2b)新生心脏分成两半，每个移植物中注入109，5×107或107PFU的AdCD8，然后于37℃保温4小时。然后将它们移植到完全同基因的Balb/c(H-2d)小鼠耳部皮下。对照实验中使用假感染的心脏组织。移植31天后，处死小鼠并收获它们的脾细胞。建立MLCs(受体-抗-供体(Balb/c抗C57BL/6))5天，并测定它们裂解C57BL/6源的EL-4靶细胞的能力。如图17所示，从接受假感染心脏或者接受感染了最高浓度mAdCD8的心脏的小鼠收获的T淋巴细胞表现出对供体组织类型细胞的高度裂解性应答。接受两种较低浓度mAdCD8感染的心脏的小鼠所来源的T淋巴细胞表现出严重受抑制的免疫应答。在此实验中，证明用5×107PFU的mAdCD8感染最有效。因此将此病毒量用于接下来的实验。将感染了5×107PFU AdCD8或假感染的C57BL/6心脏移植入另外的Balb/c受体小鼠。在移植后38天将一组动物处死。切下携带移植物的耳朵。将组织固定并进行免疫组织化学染色(抗H-2b-过氧化物酶/HE)以检测供体型心脏组织的存在。清楚观察到仅AdCD8-感染的心脏组织存活。存在的心脏组织未表现出任何细胞浸润的迹象，说明排斥被阻止。在接受假感染心脏的小鼠，我们不再分辨出完整的心脏组织。
我们也收获这些动物的脾细胞并建立抗经辐照的供体型脾细胞的MLCs。测定这些培养物中抗-C57BL/6 CTL的存在。如图17所示，与从对照小鼠收获的T淋巴细胞对比，mAdCD8小鼠中T淋巴细胞的裂解活性下降至大约7％。第二组移植的小鼠保持52天，届时将它们处死，分析它们的移植物和免疫活性。在此研究中，对组织进行常规染色(HE)(结果未显示)，mAdCD8感染的心脏组织形态健康。相反，接受假感染心脏的动物中，肌肉组织几乎难以辨认。组织的破坏伴有大量浸润细胞。
我们又研究了这些动物中同种反应性T细胞的功能。将从Balb/c受体收获的脾细胞用供体型即C57BL/6刺激细胞刺激，然后测定它们对刺激物的活性。如图18所示，接受AdCD8处理的心脏的动物所来源的T淋巴细胞明显减少至对照的大约9％。
这些实验显示mAdCD8不仅防止同种异基因心脏的排斥，而且明显减少各自的同种异体反应性T淋巴细胞的频率。因此这些实验表明用mAdCD8作为治疗载体的经改造的否决可以防止完全的同种异基因器官的排斥。
胰岛移植
既进行同基因移植也进行同种异基因移植。因为移植排斥约在大约第7天开始，所以如果动物在此开始期表现出血糖水平下降则对移植物记分(见图19中适应期)。推测移植的胰岛没有功能，其中未观察到在这种早期血糖降低(即低于15μM)的动物中。图20描述在未经处理的小鼠(即正常的)和接受链脲霉素以破坏其胰岛的小鼠中血糖水平如何变化。
进行两种不同的同基因胰岛移植品系组合：C57BL/6植入C57BL/6和Balb/c植入Balb/c。在研究中胰岛未被转导。在两组小鼠中，移植后达到正常和稳定的血糖水平。在这些研究中，全部观察期达到6个月以上(图21)。这些研究后进行下列实验，其中胰岛用mAdCD8转导。前面已经建立了感染条件(见上)。再次观察到血糖水平的正常化(图21)。有趣地，对于Balb/c供体，观察到延缓的血糖水平降低，表明胰岛花费较长时间进行转导以适应其新的环境。
已熟知腺病毒和用腺病毒转导的组织诱导引起被转导组织受到破坏的强烈(virulent)免疫应答。这种免疫原性是为什么基因治疗没有获得最初预期的较大益处的主要原因。但是，在我们的实验中用腺病毒载体感染胰岛不影响它们在同基因宿主中的存活。因此，得出结论mAdCD8有效抑制了抗腺病毒抗原的免疫应答。
我们发现当否决载体mAdCD8在直接注射给小鼠时逃避免疫系统(见上)，这种观点得到独立支持。在6个月后处死一只接受同基因mAdCD8-转导的移植物的Balb/c小鼠。在肾包膜下鉴定了移植的胰岛并染色以检测小鼠CD8α链的存在。有趣地发现，6个月后仍可以检测到该链(结果未显示)。结果显示因为胰岛内发现的细胞的过低更新率，mAdCD8在此期间没有被稀释。
接下来研究了mAdCD8是否能防止同种异基因胰岛的排斥。使用相同的实验条件。将大约2000 C57BL/6胰岛用mAdCD8转导并移植完全到同种异基因的Balb/c受体内。不使用额外的免疫抑制治疗。这些结果很明显，急性排斥的初始阶段被完全抑制。在前30天内，全部三只小鼠没有显示任何排斥的迹象。然而，甚至排斥的晚期阶段诸如慢性排斥也被有效抑制。这些小鼠之一现在已经被观察超过4个月，其没有任何胰岛素产生降低的迹象(图25)。因此，我们从有限的研究中得出结论，经改造的否决(本文中为腺病毒否决载体)，防止在完全同种异基因品系组合中的移植物排斥。
气管和肺移植模型
我们设计一系列研究来检查携带小鼠CD8基因的腺病毒(AdCD8)抑制在气管移植和肺移植小鼠模型中同种异基因异体移植物的排斥的能力。
在我们的第一项研究中，从C57BL/6供体小鼠无菌取出气管，并去除所有附着组织。将这些片段用AdCD8(1.2×1011pfu)于37℃感染24小时。然后将这些感染的气管片段与小鼠抗人CD8 FITC(Ancell Corp)一同保温。将未感染的气管片段也与这些抗血清一同保温。在荧光显微镜下检查气管节段。样品的相对亮度表示人CD8存在于气管节段(segment)上，并且是暴露的，使得抗体能结合(表2)。AdLacZ相对于PBS而言，将气管节段与1.8×109pfu的AdLacZ保温显示仅AdLacZ-处理的样品与底物IPTG一同保温时呈蓝色。
表2
  处理  Pfu  明显的移植b   相对亮度a
  PBSAdCD8  -1.2×109  -++   50.7290.58
  AdLacZ  1.2×109  --   (蓝色)
AdCD8处理的小鼠气管片段的移植。将5个来自BALB/c小鼠的环状片段自所有结缔组织游离，并用IMDM中的1.2×1011pfu AdCD8或1.2×109pfu AdLacZ感染过夜。然后将样品置于C57BL/6受体耳部皮下。在a中，感染后24小时观察样本。在b中，移植后60天观察样本。
将PBS处理的对照组织移植到Balb/c小鼠耳部皮下。至此未观察到经载体处理的组织的排斥，并且所有移植的片段都是可见的并可触及的。移植物已经保持60天。
将Balb/c供体的肺组织样本用AdCD8于37℃感染过夜。然后将组织移植到C57BL/6受体背部皮下。对照动物接受未处理的或未感染的组织。将动物在移植后8，12，19，20和22天时处死。收获脾细胞，以追踪观察(follow)在有否决型(vetoing)CD8分子的组织存在的情况下受体的免疫应答(图24)。与我们前面在心脏移植模型中的发现相似，用AdCD8处理移植物导致设计为识别同种异基因靶的实验中移植特异性CTL被抑制。
通过在福尔马林中固定并利用苏木精-伊红染色制备移植的组织样品进行组织学检查。未经AdCD8(A)预处理的小鼠肺的组织显示组织以及支气管中典型的细胞浸润模式，其完全被细胞或胶原沉积(Genden，2003)闭合(occlude)。
用载体预处理过夜的组织中被浸润的支气管较少。在移植后22天，没用载体处理的肺组织在整个肺以及支气管和肺泡中都有细胞浸润。经载体处理的组织中浸润区域明显减少。通过计数每组样本中开放或闭合的气道数评价切片。未经处理的肺组织所来源的组织中有83％的气道闭塞，17％开放。相反，用AdCD8处理的组织有30％的组织充满细胞沉积，76％开放。
结论是，用AdCD8预处理沉气管和肺组织明显减少受体小鼠中支气管或肺泡通道中炎性细胞的出现。没有料到这一情况。OB在组织学特征上的明显减少是开发AdCD8用于肺移植患者的治疗中的主要突破。

Claims (26)

1.用于特异性抑制宿主对靶细胞特异性抗原的免疫应答的方法，其包括将表达该抗原的靶细胞与编码包括CD8α链的CD8多肽的表达载体接触，其中该CD8多肽由该靶细胞表达，并因此宿主抗该靶细胞的免疫应答被特异性抑制。
2.按照权利要求1的方法，其中该靶细胞特异抗原是同种抗原。
3.按照权利要求2的方法，其中该同种抗原包括供体同种抗原，并且该靶细胞包括供体同种异体移植物细胞。
4.按照权利要求2的方法，其中该同种抗原包括受体抗原，并且该靶细胞包括受体细胞。
5.特异性抑制受体内对供体抗原的免疫应答的方法，其包括在将该同种异体移植物细胞植入该受体之前或同时，调节具有该供体抗原的供体同种异体移植物细胞以表达包括CD8α链的CD8多肽，其中该同种异体移植物细胞对该CD8多肽的表达特异性抑制该受体对所述供体抗原的同种异体免疫应答。
6.延长同种异体移植物在受体内存活的方法，其包括在将该同种异体移植物植入该受体前或同时，调节该同种异体移植物细胞以表达包括CD8α链的CD8多肽，其中CD8多肽由该同种异体移植物细胞表达，并且因此该同种异体移植物的存活时间被延长。
7.按照权利要求5或6的方法，其中该调节步骤包括将该同种异体移植物细胞与编码该CD8多肽的表达载体接触。
8.按照权利要求5或6的方法，其中该调节步骤于将该同种异体移植物细胞植入所述受体之前或同时离体进行。
9.按照权利要求5或6的方法，其中该调节步骤在收获该同种异体移植物细胞之前或同时在供体体内进行。
10.特异性抑制移植的供体T细胞对受体抗原免疫应答的方法，其包括在将该供体T细胞植入该受体同时或之后，调节有移植物抗宿主疾病风险的受体细胞使之表达包括CD8α链的CD8多肽，其中由该受体细胞对所述CD8多肽的表达特异性抑制该供体对所述受体抗原的同种异体免疫应答。
11.抑制受体内GVHD的方法，其包括在将同种异体移植物植入该受体同时或之后，调节有GVHD风险的所述受体的细胞使之表达包括CD8α链的CD8多肽，其中所述CD8多肽由该受体细胞表达并因此抑制该同种异体移植物内供体T细胞抗受体细胞的GVHD免疫应答。
12.按照权利要求10或11的方法，其中该调节步骤包括将该同种异体移植物细胞与编码该CD8多肽的表达载体接触。
13.按照权利要求10或11的方法，其中该调节步骤在该供体T细胞移植的同时或之后在受体体内进行。
14.按照权利要求1至13任何一个的方法，其中该CD8多肽是人CD8多肽。
15.按照权利要求1至14任何一个的方法，其中该CD8多肽主要由跨膜结构域和CD8α链的细胞外结构域组成。
16.按照权利要求1至14任何一个的方法，其中该CD8多肽主要由跨膜结构域和CD8α链的细胞外结构域组成。
17.按照权利要求15或16的方法，其中该跨膜结构域是CD8α链跨膜结构域。
18.改良的同种异体移植物，其包括经修饰以表达包括CD8α链的CD8多肽的同种异体移植物细胞，其中该同种异体移植物能有效地特异性抑制对同种抗原的受体免疫应答。
19.权利要求18的改良的同种异体移植物，其中该同种异体移植物细胞的修饰利用病毒介导的对编码所述CD8多肽的核酸的递送来完成。
20.按照权利要求18或19的改良的同种异体移植物，其中该CD8多肽是人CD8多肽。
21.改良的器官保存液，其包括含有编码CD8多肽的核酸的载体，该CD8多肽包括CD8α链。
22.按照权利要求21的改良的器官保存液，其中该CD8多肽是人CD8多肽。
23.按照权利要求21或22的改良的器官保存液，其中该CD8多肽主要由跨膜结构域和CD8α链的细胞外结构域组成。
24.按照权利要求21至23任何一个的改良的器官保存液，其中该跨膜结构域是CD8α链的跨膜结构域。
25.按照权利要求21的改良的器官保存液，其中编码所述CD8多肽的核酸包括SEQ ID NO：所示的序列。
26.按照权利要求21的改良的器官保存液，其中该CD8多肽基本由SEQ ID NO：所示的序列组成。
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