CN116058334B

CN116058334B - 一种可视化gvhd动物模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN116058334B
Application number: CN202211452915.7A
Authority: CN
Inventors: 詹林盛; 孙苏静; 周欠欠; 王小慧
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-11-21
Also published as: CN116058334A

Abstract

本发明提供了一种可视化GVHD动物模型的构建方法及其应用，属于医学和生物实验模型的制备技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：小鼠以8Gy⁶⁰Coγ射线辐照后，输注细胞悬液，得到可视化GVHD小鼠模型；所述细胞悬液由去除T细胞后的骨髓细胞和被eqFP650、HSV‑TK与Gaussia荧光素酶(Gluc)报告基因标记的T细胞混合得到。本发明构建的可视化动物模型可以同时对多种过继性输注的细胞进行实时监测，以观察和量化供者T细胞在受者体内的活化和增殖情况，可以从整体水平研究供者T细胞增殖活化与GVHD发生的关系。

Description

一种可视化GVHD动物模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于医学和生物实验模型的制备技术领域，尤其涉及一种可视化GVHD动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

移植物抗宿主病(GVHD)的发生主要原因是移植物中供者免疫活性细胞攻击受者靶器官和组织，是多细胞、多因子参与的复杂病理过程。在GVHD发生过程中，按其发生先后可分为三个阶段：(1)既往治疗和放化疗等预处理所致组织细胞损伤，导致炎症细胞因子大量释放，促进供者或受者抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells，APC)成熟与活化，进而增强供者T淋巴细胞对受者抗原识别能力。(2)抗原递呈后供者T淋巴细胞活化与增殖，分泌大量炎症细胞因子，致使Th1、Th2类细胞因子分泌失衡，促进GVHD发生发展。(3)效应细胞及细胞因子介导靶组织损伤的效应阶段。此阶段，供者T细胞通过穿孔素/颗粒酶、Fas/FasL及TNF-α三大途径杀伤受者靶细胞。以上三个阶段密切相关，并具有逐级放大功能，最终导致靶器官与组织损伤，形成局部或者全身性GVHD。可见，供者T细胞的过度活化是整个GVHD发生过程中的关键。因此，了解供体T细胞在活体内的分布、扩增、活化及迁徙规律对于阐明GVHD的发展状态和发生机制非常重要。

并且，由于T细胞进入受者体内易受到多种因素影响，许多生物学特性只能在体内表现出来，体外研究所获取的功能信息无法完全模拟体内生理或病理环境下的免疫信号和细胞结构改变，所以T细胞在活体内的动态研究和观察十分必要。但目前能够实现体内水平T细胞直接示踪的方法仍然较少，常用方法主要通过血清细胞因子水平，靶器官组织切片等手段间接反映T细胞增殖及浸润情况。并且，近年来，随着多种个体化医疗手段不断兴起，细胞治疗也逐渐成为GVHD的有效治疗手段，但过继性输注的细胞在体内的分布及迁移规律也尚未完全明确。因此，开发一种能够实现实时动态监测T细胞在体增殖活化的新型成像手段迫在眉睫，并且通过成像手段实现过继性输注细胞在体动态实时成像也十分必要，也是研究过继性输注细胞与供体T细胞共定位的有利手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可视化GVHD动物模型的构建方法，可实现供者T细胞和过继性输注细胞在受者体内的实时生物学行为监测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种可视化GVHD动物模型的构建方法，包括以下步骤：小鼠以8Gy⁶⁰Coγ射线辐照后，输注细胞悬液，得到可视化GVHD小鼠模型；所述细胞悬液由去除T细胞后的骨髓细胞和被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞混合得到。

优选的，所述辐照剂量率为60～62cGy/min，照射时间为12～13min。

优选的，所述细胞悬液中去除T细胞后的骨髓细胞数量为4.5～5.5×10⁶个。

优选的，所述细胞悬液中被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞数量为1.5～2.5×10⁷个。

优选的，所述细胞悬液输注方式为尾静脉过继性输注。

优选的，所述去除T细胞后的骨髓细胞的制备方法包括：分离小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，通过磁珠阳选的方法去除T细胞。

优选的，所述被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞的制备方法包括：采用表达eqFP650、HSV-TK与Gluc的慢病毒载体与骨架载体共转染HEK293T细胞，制备具有感染性的慢病毒颗粒并感染T细胞。

优选的，所述慢病毒载体中，eqFP650和HSV-TK融合表达，启动子为CMV，Gluc基因由CMV增强子和颗粒酶B启动子调控。

本发明还提供了上述构建方法在研究GVHD发展状态和发展机制，或制备和/或筛选治疗GVHD药物中的应用。

本发明还提供了上述构建方法在评价过继性输注细胞治疗异基因移植的GVHD效果中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明构建的GVHD动物模型具有双成像功能，通过eqFP650蛋白成像可以考察供者T细胞在受者体内的定位及增殖情况，Gaussia荧光素酶(Gluc)具有分泌性信号肽，可以通过外周血Gaussia成像观察供者T细胞在受者体内的活化情况。本发明通过生物发光成像监测供者T细胞在受者体内所呈现的时间和空间上的程序性迁移、聚集和活化，可以从整体水平研究供者T细胞增殖活化与GVHD发生的关系。

本发明构建的GVHD动物模型可以同时对多种过继性输注的细胞进行实时监测，如过继性输注携带有Fluc基因的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗GVHD，可以同时进行MSCs在体内分布的成像，可以观察和量化T细胞与过继性输注的细胞的共定位随时间变化趋势，便于研究两者间的相关关系，明确其具体的促进/抑制效应，并据此评估过继性输注细胞的潜在疗效。

附图说明

图1：细胞移植后受者小鼠基因型变化；

图2：移植受体小鼠体重变化；

图3：移植受体小鼠存活率变化；

图4：移植受体小鼠体内炎性细胞因子水平变化；

图5：移植受体小鼠各器官病理切片；

图6：移植受体小鼠eqFP650蛋白成像情况；

图7：移植受体小鼠外周血中Gluc荧光信号强度；

图8：移植受体小鼠MSCs治疗后成像情况，a为通过eqFP650成像显示的MSCs治疗后第4天的T细胞增殖情况，b为对a图中各组小鼠的全身荧光值的统计，c为输注MSCs后第4天，小鼠各器官成像结果；

图9：MSCs在移植受体小鼠体内的分布成像；

图10：eqFP650-HSV-TK-Gluc基因插入的示意图。

具体实施方式

本发明先将小鼠以8Gy ⁶⁰Coγ射线辐照，所述辐照剂量率为60～62cGy/min，照射时间为12～13min，所述辐照剂量率优选为61.2cGy/min，照射时间优选为12’47”。

本发明对辐照后的小鼠输注细胞悬液，构建可视化GVHD小鼠模型。

在本发明中，所述细胞悬液由去除T细胞后的骨髓细胞和被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞混合均匀得到。其中，细胞悬液中骨髓细胞数量为4.5～5.5×10⁶个，优选为5×10⁶个；T细胞数量为1.5～2.5×10⁷个，优选为2×10⁷个。每只小鼠输注细胞悬液的总体积为400～600μl，优选为500μl。作为一种可选的实施方式，每只辐照后的小鼠注射5×10⁶个去除T细胞的骨髓细胞和2×10⁷个T淋巴细胞，具体输注时，可根据需要输注小鼠的数量配置相应输注用细胞悬液。

本发明所述细胞悬液输注方式优选为尾静脉过继性输注。

本发明所述去除T细胞后的骨髓细胞(TCD-BM)的制备方法包括：分离小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，通过磁珠阳选的方法去除T细胞。作为一种可选的实施方式，本发明解剖小鼠，机械分离其股骨、胫骨得到骨髓细胞悬液，向骨髓细胞悬液中加入T细胞阳选磁珠，T细胞能与偶联抗体的磁珠特异性结合，从而使T淋巴细胞被标记。将此时的骨髓细胞悬液通过分选柱(柱子周围连磁铁)，带磁珠的T细胞吸附在分选柱中，不带磁珠的骨髓细胞则无法吸附在分选柱中，收集得到去除T细胞后的骨髓细胞。

本发明所述被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞的制备方法包括：采用表达eqFP650、HSV-TK与Gluc的慢病毒表达载体与骨架载体共转染HEK293T细胞，制备具有感染性的慢病毒颗粒并感染T细胞，得到被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞。

本发明所述T细胞的分选方法包括：将小鼠脱颈处死后，解剖分离小鼠得到混合淋巴细胞悬液。再向细胞悬液中加入阴选磁珠，充分摇匀，除T淋巴细胞之外，其余细胞表面的抗原能与偶联抗体的磁珠结合，从而使细胞被标记。将此时的单细胞悬液通过分选柱(柱子周围连磁铁)，带磁珠的细胞被吸附在分选柱上，不带磁珠的细胞则不能被吸附(即T淋巴细胞)，从而实现T淋巴细胞的分选。分选得到的T淋巴细胞用于制备被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞。

本发明上述慢病毒载体包括携带三联探针的慢病毒表达载体及骨架载体，其中，eqFP650和HSV-TK融合表达，启动子为CMV，以指示供体T细胞的分布和增殖，Gluc基因(Gaussia荧光素酶基因)由CMV增强子和颗粒酶B启动子调控。当GVHD发生时，eqFP650指示供体T细胞在体内的分布及具体器官，供体T细胞受到APC细胞和Th细胞刺激扩增活化使颗粒酶B转录上调，从而表达分泌性的Gaussia荧光素酶，因此，外周血中Gaussia的表达水平可以用来指示供者T细胞的激活程度。

在本发明中，通过酶切连接构建慢病毒表达载体。本发明所述慢病毒表达载体包括但不限于pCMVR8.2；本发明所述eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因经连接为eqFP650-HSV-TK-Gluc后一次性插入，本发明所述eqFP650-HSV-TK-Gluc目的基因头尾处通过引入酶切位点BamHI和XhaI插入载体中。本发明所述eqFP650-HSV-TK-Gluc目的基因插入的示意图见图10，本发明所述eqFP650-HSV-TK-Gluc目的基因的具体序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述慢病毒骨架载体为：psPAX2和PMD2G。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明具体实施例中，Balb/c小鼠购自维通利华，C57BL/6J小鼠购自维通利华。载体pCMVR8.2购自Addgene；载体psPAX2购自Addgene；载体PMD2G购自Addgene。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、获得Balb/c小鼠T淋巴细胞：

将Balb/c小鼠脱颈处死后，于75％酒精浸泡15分钟。超净台内解剖小鼠，分离小鼠脾脏，轻柔研磨制备为单细胞悬液后，加入红细胞裂解液裂解5分钟。4℃，500g离心5分钟。弃去上清后以PBS轻柔洗涤2遍。所得细胞即为混合淋巴细胞悬液。向混合淋巴细胞悬液中加入阴选磁珠，充分摇匀，通过分选柱(柱子周围连磁铁)，T淋巴细胞不能吸附在分选柱上，分选得到T淋巴细胞。

2、获得被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞：

(1)构建三联探针慢病毒表达载体：

构建包含有eqFP650-HSV-TK-Gluc三联探针的慢病毒表达载体：通过PCR扩增，将含有eqFP650-HSV-TK-Gluc三联探针的目的基因(目的基因序列如SEQ ID NO.1所示)引入表达载体pCMVR8.2的BamHI和XbaI之间，所述BamHI酶切位点为GGATCC，XbaI酶切位点为TCTAGA，构建得到pCMVR8.2-eqFP650-HSV-TK-Gluc。

(2)转染HEK293T细胞：

将(1)中构建所得pCMVR8.2-eqFP650-HSV-TK-Gluc表达载体10μg，与慢病毒骨架载体psPAX210μg、PMD2G 5μg混匀后加入转染试剂LipofiterTM 75μL，震荡后室温孵育15分钟。缓慢滴加至70～80％融合的HEK293T细胞中。转染后16h更换含10％FBS的新鲜完全培养基。

(3)收集慢病毒液：观察步骤(2)中HEK293T细胞病变程度，当细胞病变至80％左右时收集细胞及细胞上清，即为包含有目的基因的慢病毒液；

(4)按照MOI＝10向的Balb/c小鼠T淋巴细胞中加入慢病毒液，吸附4小时后，继续加入2mL的新鲜完全培养基，48h后荧光显微镜下观察荧光蛋白eqFP650的表达效率，阳性即为携带目的探针的Balb/c T淋巴细胞。

3、获得去除T细胞后的骨髓细胞

(1)超净台内解剖Balb/c小鼠，机械分离其股骨、胫骨，并剔除表面肌肉组织。将1640培养基置于10厘米培养皿中，冲洗分离出的股骨、胫骨，尽可能使其表面光滑。用无菌镊子剪掉股骨、胫骨两端，充分暴露骨髓腔，置于新的无菌1640培养基中。用1ml注射器吸取皿中培养基，反复冲洗骨髓腔，待骨髓腔变为白色时停止。移液器轻轻吹打皿中液体至组织细胞全部散开。用200目滤网过滤，500g，离心5min，弃上清。用1ml培养基重悬沉淀，得到骨髓细胞悬液。

(2)向制备的骨髓细胞悬液中加入T细胞阳选磁珠，使T淋巴细胞被标记。将此时的骨髓细胞悬液通过分选柱(柱子周围连磁铁)，带磁珠的T细胞留在分选柱中，收集获得去除T细胞的骨髓细胞。

4、GVHD小鼠模型构建：

C57BL/6J小鼠以8Gy ⁶⁰Coγ射线辐照，辐照剂量率为61.2cGy/min，照射时间为12’47”。每只辐照后的C57BL/6J小鼠尾静脉注射500μl细胞悬液(包括5×10⁶个去除T细胞的骨髓细胞和2×10⁷个T淋巴细胞)。

实施例2

以C57BL/6J小鼠(H-2K^b)作为受鼠，Balb/c小鼠(H-2K^d)作为供鼠进行异基因型造血干细胞移植，方法同实施例1。

受体小鼠在0d进行8Gy ⁶⁰Coγ射线照射后，6h内经尾静脉输注供者去除T细胞后的骨髓细胞和被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞的细胞混合悬液。

(1)在移植后第1，3，7天利用流式细胞术考察供者植入情况，结果见图1(图1由左到右依次为第1，3，7天小鼠基因变化)。

图1显示，受者小鼠基因型已从H-2K^b转变为H-2K^d，证实已形成完整的供体植入，移植成功。

(2)对移植受体小鼠和对照组(未进行移植，正常养殖)小鼠日常活动状态，体重及存活率进行每日监测，结果见图2～3。

图2显示，移植后，移植受体小鼠的体重随着时间增加呈下降趋势，对照组小鼠的体重随时间增加呈上升趋势；图3显示，移植受体小鼠的存活率自移植第4天开始逐渐下降，对照组小鼠的存活率不变。

(3)在移植后第7天，眼眶采血收集移植受体小鼠外周血，分离血清后，分别检测炎性细胞因子IL-6、IL-1β。

炎性细胞因子检测方法为：

取小鼠外周全血，500g，5min离心，取上层血清；加样：100μL/孔加入稀释后的标准品及样品，100μL孔加入dilutionbuffer至空白对照孔；加检测抗体：50μL/孔加入biotinylated antibody工作液，混匀后盖上封板膜，37℃温育90分钟；洗板：扣去板内液体，300μL/孔加入washing buffer工作液，停留1分钟后弃去孔内液体，重复4次，每一次在滤纸上扣干；加酶：100μL/孔加入streptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，37℃温育30分钟；洗板：重复上述洗板步骤；显色：100μL/孔加入TMB，37℃避光孵育15分钟；终止反应：100μL/孔迅速加入stop solution终止反应。读板：终止后10分钟内，用检测波长450nm读值。检测结果见图4。

图4显示，受者小鼠在移植后体内炎性细胞因子水平显著上升，证实受者小鼠发生了全身性的GVHD反应。

(4)移植后第7天脱颈处死小鼠，分离GVHD小鼠受累器官，病理切片观察炎性细胞浸润情况。

病理切片观察炎性细胞浸润情况方法为：

脱颈处死小鼠，分离小鼠各脏器，包括小肠、淋巴结、肺脏、肝脏、皮肤、脾脏。4％多聚甲醛固定过夜。组织处理成1.5cm×1.5cm的小块，进行石蜡包埋。蜡块切片后于热水中展片，捞片，晾干。脱蜡：脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟，事先准备好盖玻片。覆水：100％(Ⅰ、Ⅱ)、90％、80％、70％酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟×3次。苏木精染色5分钟，流水冲洗。分化：5％乙酸分化1分钟，流水冲洗。返蓝：返蓝液返蓝10s。伊红染色1分钟，流水冲洗。脱水：70％、80％、90％、100％酒精各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。滴上中性树胶，封片，避免中间有气泡。显微镜下观察并拍照。结果见图5。

图5显示，GVHD小鼠各器官发生广泛炎性浸润，证实小鼠发生全身性的GVHD反应。

(5)在移植后第1、2、3天，利用IVIS Lumina II成像系统及Living image软件对eqFP650蛋白进行成像，考察供者T细胞在受者体内分布情况。结果见图6。图6显示，GVHD小鼠体内荧光范围显著扩大，小鼠各器官eqFP650蛋白大量表达，证实供者T细胞在受者体内大量增殖，证实受者小鼠发生了全身性的GVHD反应。

由于Gaussia荧光素酶具有分泌性信号肽，可以通过内质网分泌到细胞外，因此可以通过检测外周血中的荧光强度来反映T细胞的活化程度，以此明确供者T细胞在受者体内的活化情况，结果见图7。图7显示，移植组外周血中Gaussia荧光信号显著增强，证实供者T细胞在受者体内剧烈活化。

实施例3

通过双成像GVHD小鼠模型评价过继性输注间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)治疗异基因移植的GVHD效果

(1)分离Fluc+转基因Balb/c小鼠骨髓细胞，经培养筛选得到MSCs，常规传代至第3～10代可用于GVHD小鼠的治疗。

(2)按照实施例1所述方法建立可视化GVHD小鼠模型，建立的可视化GVHD小鼠模型随机分为GVHD组和MSC治疗组。MSC治疗组在移植后24h内按照2×10⁶/只经尾静脉过继性输注Fluc+MSCs(携带有萤火虫荧光素酶报告基因)，每天以IVIS Lumina II活体成像系统观察受鼠体内异基因T细胞扩增情况，每日观察Fluc+MSC在体内分布情况，以及对GVHD小鼠的治疗效果，结果见图8和图9。

图8中，a为通过eqFP650成像显示的MSCs治疗后第4天的T细胞增殖情况，b为对a图中各组小鼠的全身荧光值的统计，c为输注MSCs后第4天，处死小鼠，分离各GVHD受累器官，并进行成像的结果。图8显示，GVHD小鼠在经MSCs治疗后，全身及各器官荧光强度显著降低，各组织器官切片也提示靶器官炎性细胞浸润减少，组织破坏程度减轻，确证可视化GVHD动物模型建立成功。

通过Fluc对过继性输注的MSCs在受者体内的分布进行成像，结果显示，在MSCs过继性输注后第1、2、3天，通过IVIS Lumina II对MSCs进行成像，观察MSCs在体分布。图9显示，随着输注时间的延长，MSCs在体内分布范围逐渐扩大，MSCs输注24h内主要聚集于肺部，并于72h内逐渐向其余各GVHD受累器官迁移，包括肝脏、脾脏等。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种可视化GVHD动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以C57BL/6J小鼠作为受体小鼠，以Balb/c小鼠作为供体小鼠，受体小鼠以8Gy⁶⁰Coγ射线辐照后，输注供体小鼠细胞悬液，得到可视化GVHD小鼠模型；所述细胞悬液由去除T细胞后的骨髓细胞和被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞混合得到。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述辐照剂量率为60～62cGy/min，照射时间为12～13min。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液中去除T细胞后的骨髓细胞数量为4.5～5.5×10⁶个。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液中被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞数量为1.5～2.5×10⁷个。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液输注方式为尾静脉过继性输注。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述去除T细胞后的骨髓细胞的制备方法包括：分离小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，通过磁珠阳选的方法去除T细胞。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述被eqFP650、HSV-TK与Gluc报告基因标记的T细胞的制备方法包括：采用表达eqFP650、HSV-TK与Gluc的慢病毒载体与骨架载体共转染HEK293T细胞，制备具有感染性的慢病毒颗粒并感染T细胞。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述慢病毒载体中，eqFP650和HSV-TK融合表达，启动子为CMV，Gluc基因由CMV增强子和颗粒酶B启动子调控。

9.权利要求1～8任意一项所述的构建方法在研究GVHD发展状态和发展机制，或制备和/或筛选治疗GVHD药物中的应用。

10.权利要求1～8任意一项所述的构建方法在评价过继性输注细胞治疗异基因移植的GVHD效果中的应用。