CN105535022A - 外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途，其中，所述外泌体是由人经血间充质干细胞分泌的外泌体。本发明还提供了药物组合物，其中，该药物组合物含有人经血间充质干细胞分泌的外泌体和药学上可接受的载体。通过上述技术方案，本发明的药物组合物能够延长急性肝衰竭动物模型的生存时间，减少肝脏的出血和坏死率，促进肝脏细胞分泌炎症因子等，因此能够有效地治疗急性肝衰竭，从而改善急性肝衰竭患者的预后。

Description

外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物。
背景技术
细胞向外排出的囊泡包括微体(microvesicles)、外泌体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、凋亡小体(apoptoticvesicles)等。其中，微体(microvesicles)的直径在100-1000nm。而外泌体(exosome)的直径在20-100nm，是细胞主动向胞外分泌的大小均一的囊泡样小体，具有抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能。不同类型的细胞可以释放出不同的外泌体，正常生理状态下血液、尿液、乳汁和支气管灌洗液中也能分离到外泌体。在过去的几十年间，大量研究发现人类所有的体液都有外泌体的存在，因为它们包含有特异的蛋白质，核酸和脂肪成分，所以可以作为一些疾病的早期诊断指标，它相对于有创检查有自身明显的优势，不但可以减轻病人的痛苦，而且检测所需要的标本量也明显减少，并且分析速度加快，分析成本大幅度下降也是其优点。
外泌体不仅在临床疾病诊断方面发挥作用，而且在疾病治疗方面亦有独特的疗效。目前已经对外泌体的功能进行了广泛的研究。例如，中国专利申请公开CN104666344A公开了间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用，其采用脐带血间充质干细胞的外泌体治疗小鼠的肺纤维化，可明显提高小鼠成活率。
中国专利申请公开CN104382827A公开了人羊膜间充质干细胞外泌体的用途，其发现人羊膜间充质干细胞外泌体可以提高细胞内SOD酶的活性，具有抗光老化的功效。美国专利申请US2015190429A1公开了源自脐带血、脐带组织、胎盘、骨和脂肪组织等的间充质干细胞的外泌体制品来预防或治疗炎性疾病，例如神经元损伤或干细胞移植后的并发症。文献(王冰莹，人脐带间质干细胞来源的外泌体对肝细胞过氧化损伤的保护作用，临床检验杂志，2013年6月第31卷第6期第455-458页)探讨了人脐带间质干细胞来源的外泌体(hucMSC-Ex)对四氯化碳诱导的肝细胞氧化应激损伤的保护作用。
急性肝衰竭(acuteliverfailure,ALF)是一种由炎症介导的肝细胞损伤过程，是由肝细胞凋亡和出血性坏死产生的严重的临床综合征。它经常由肝炎病毒感染、药物及毒物等诱发，预后极差，除了肝移植目前尚无有效的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗急性肝衰竭的治疗方案和药物，以改善急性肝衰竭患者的预后。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途，其中，所述外泌体是由人经血间充质干细胞分泌的外泌体。
另一方面，本发明还提供了药物组合物，其中，该药物组合物含有人经血间充质干细胞分泌的外泌体和药学上可接受的载体。
通过上述技术方案，本发明的药物组合物能够延长急性肝衰竭动物模型的生存时间，减少肝脏的出血和坏死率，促进肝脏细胞分泌炎症因子等，因此能够有效地治疗急性肝衰竭，从而改善急性肝衰竭患者的预后。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是经血间充质干细胞的外泌体分离流程图。
图2是经血间充干细胞来源的外泌体的透射电子显微镜照片。
图3是经血间充干细胞来源的外泌体的CD63和Tsg101表达检测结果。
图4是不同给药的急性肝衰竭小鼠血清中的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)指标对比结果。
图5是不同给药的急性肝衰竭小鼠肝脏组织内TNF-α、IL-6和IL-1β的表达比例对比结果。
图6是不同给药的急性肝衰竭小鼠肝脏的组织切片并进行HE染色的结果图。
图7是不同给药的急性肝衰竭模型小鼠的生存时间图。
图8是经血间充质干细胞分泌的外泌体和微体治疗急性肝衰竭模型小鼠的平行对比实验的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)指标图。
图9是经血间充质干细胞分泌的外泌体和微体治疗急性肝衰竭模型小鼠的平行对比实验的生存时间图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途，其中，所述外泌体是由人经血间充质干细胞分泌的外泌体。
其中，所述人经血间充质干细胞可以是本领域常规制备和使用的人经血间充质干细胞，例如文献CN201510112156.3公开的方法分离培养及鉴定的人经血间充质干细胞。
其中，人经血间充质干细胞在常规培养条件下可以分泌产生外泌体，收集和分离人经血间充质干细胞的外泌体的方法和条件可以与收集和分离其它来源的间充质干细胞的外泌体的方法和条件相同，例如可以与文献(王冰莹，人脐带间质干细胞来源的exosomes对肝细胞过氧化损伤的保护作用，临床检验杂志，2013年6月第31卷第6期第455-458页)中所述的人脐带间充质干细胞的外泌体的收集和分离条件。
其中，所述外泌体的直径可以不大于100nm；可以通过常规的滤膜，例如0.22微米滤膜或0.1微米滤膜去除直径大于外泌体的微体(microvesicles)。
其中，所述外泌体的表面可以具有特异性的标志物的表达，该特异性的标志物特异性地出现在外泌体的表面，而不出现在直径大于外泌体的微体(microvesicles)的表面，优选地，所述外泌体的表面的标志物包括CD63和Tsg101。其中，CD63是指NCBI数据库中GENEID为963的基因的表达产物；Tsg101是指NCBI数据库中GENEID为7251的基因的表达产物。
其中，所述外泌体是人经血间充质干细胞分泌而来的，人经血间充质干细胞可以是从健康妇女的经血中分离培养得到的，优选地，所述外泌体来源于健康人体，更优选地来源于健康的年轻女性，例如年龄为16-25岁的女性，因为其活力更高。
其中，所述外泌体可以是从经血间充质干细胞的原代培养上清液中分离得到的。本发明的外泌体可以通过本领域的各种分离方法进行分离。例如可以采用直接超速离心法，也可以采用市售的外泌体提取试剂盒进行提取。
根据本发明的一种优选的实施方式，所述外泌体可以通过包括如下步骤的方法制备得到：(1)培养原代经血间充质干细胞；(2)从培养的经血间充质干细胞收集上清液；(2)离心除去细胞碎片，并且过滤除去直径大于100nm的囊泡；(3)通过超滤将上清液浓缩；和，(4)将浓缩的上清液与外泌体提取试剂混合过夜，离心去除上清，将沉淀重悬浮于磷酸盐缓冲液中得到外泌体。其中，外泌体提取试剂可以是具有适合分离外泌体的密度梯度的离心分散介质，如特定分子量的聚乙二醇溶液。
根据本发明的一种更具体的实施方式，所述外泌体可以通过下述方法制备：(1)依据常规的经血间充质干细胞的分离培养方法(例如专利文献CN201510112156.3中的方法)进行经血间充质干细胞的原代分离培养，并优选进行三系分化(包括分化为神经、骨骼和肝的能力)和表面标志物(包括CD63和Tsg101)的流式细胞术鉴定；(3)将原代分离培养的经血间充质干细胞培养至P5代接种于培养瓶中，开始加入无血清αMEM培养基进行培养，待细胞融合度为80％-90％时收集上清液；(4)将收集的上清液进行离心以去除细胞碎片，将去除了细胞碎片的上清液用0.22μm的过滤器进行过滤以去除直径过大的囊泡，然后再将过滤后的上清液转移至30kDa的MWCO超滤离心管中进行离心浓缩，将浓缩后的液体与外泌体提取试剂(购自SBI公司的exosome快速提取试剂)混合均匀并过夜放置；然后离心去除上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀，得到外泌体。
其中，所述外泌体可以分装后于低温(-200℃至-70℃)下冷冻保存；也可以用蛋白定量试剂盒(如BCA)法进行蛋白定量检测；也可以通过扫描电镜或透射电镜检测外泌体的形态；还可以用免疫杂交方法来验证外泌体的蛋白标记CD63和Tsg101的表达情况，从而对经血间充质干细胞来源的外泌体进行鉴定。
此外，本发明所要预防或治疗的急性肝衰竭优选为药物引起的损伤。
另一方面，本发明还提供了药物组合物，其中，该药物组合物含有人经血间充质干细胞分泌的外泌体和药学上可接受的载体。
其中，所述药物组合物的剂型可以为常见的各种剂型，优选地，所述药物组合物的剂型为注射液；并且，以外泌体中的蛋白的重量计算，所述药物组合物中的所述外泌体的含量为0.1-10μg/μL，更优选为0.5-2μg/μL。
其中，所述药学上可接受的载体可以包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。
其中，所述外泌体的表面可以具有特异性的标志物的表达，该特异性的标志物特异性地出现在外泌体的表面，而不出现在直径大于外泌体的微体(microvesicles)的表面，优选地，所述外泌体的表面的标志物包括CD63和Tsg101。其中，CD63是指NCBI数据库中GENEID为963的基因的表达产物；Tsg101是指NCBI数据库中GENEID为7251的基因的表达产物。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
参照图1所示的流程图，采用专利文献CN201510112156.3的方法分离培养及鉴定经血间充质干细胞，分离出的经血间充质干细胞于37℃、5％的CO2和饱和湿度培养箱内培养。选择生长状态良好的3-6代经血间充质干细胞先用含15体积％胎牛血清的αMEM培养基培养，待细胞融合至70-80％时换无血清αMEM培养基培养，24h后收集培养上清。将收集的经血间充质干细胞上清液于4℃、2000×g离心10min，以除去细胞碎片，将去除细胞碎片的上清用0.22μm的过滤器进行过滤，以去除过直径较大的囊泡，然后再将过滤后的上清转移至30kDa的MWCO超滤离心管中，4℃、4000×g离心1h进行浓缩，将浓缩液缓慢移至外泌体提取试剂(购自SBI公司的exosome快速提取试剂)中，过夜4℃放置。第二天取出后4℃、12000rpm离心1h，去除上清，用PBS重悬沉淀，得到外泌体。
用BCA蛋白质定量试剂盒法进行外泌体的蛋白质定量检测，然后用PBS调整含有外泌体的液体中的蛋白含量为1μg/μL，得到药物组合物。将得到的药物组合物分装后于-80℃保存。将1μg/μL的经血间充质干细胞来源的外泌体20μl充分混匀后滴加于直接2mm的载样铜网上，于室温静置10min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将磷钨酸滴一滴于铜网上，室温下负染10分钟，最后将铜网在白炽灯下烘干。置于透射显微镜下观察并拍照。直接用预制的10％电泳胶，将上述提取的外泌体充分蛋白裂解后加入1/3体积的上样缓冲液(LoadingBuffer)，煮沸10min，按30μg蛋白质总量上样，电转移(200mA，70min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含5重量％BSA的TBST溶液室温封闭1h，分别与兔抗人CD63抗体和兔抗人Tsg101抗体于4℃反应过夜，第二天用TBST洗膜3次，每次10分钟后，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10分钟后，加入ECL化学发光底物，用化学发光凝胶成像系统进行检测并拍照。
图2和图3分别是对经血间充干细胞来源的外泌体的透射电子显微镜和免疫杂交(WesternBlot)鉴定结果。根据图2可见，经血间充干细胞来源的外泌体的直径不大于100nm。根据图3可见，经血间充干细胞特异性地表达CD63和Tsg101。
实施例2
本实施例证实经血间充质干细胞分泌外泌体对急性肝衰竭的治疗作用。
将体重20g的小鼠用D-氨基半乳糖(D-GalN)和脂多糖(LPS)联合腹腔注射建立动物模型，最佳剂量为900mg/kg体重和50ng/kg体重，每隔半小时观察小鼠的生存精神状态，成功构建小鼠急性肝衰竭模型。
在每只小鼠急性肝衰竭模型的尾静脉注射剂量为1000μL的1μg/μL的PBS分散的经血间充质干细胞分泌的外泌体进行治疗，以PBS注射正常小鼠为阴性对照组，以水飞蓟素注射小鼠急性肝衰竭模型为阳性药物组。
检测急性肝衰竭小鼠血清中的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)指标，结果如图4所示，可见与D-GalN/LPS模型对照组相比，经血间充质干细胞来源的外泌体可以减少AST和ALT的释放，即降低了肝损伤水平。
采用定量RT-PCR技术检测急性肝衰竭小鼠肝脏组织内TNF-α、IL-6和IL-1β的表达比例，结果如图5所示，可见与D-GalN/LPS模型对照组相比，经血干细胞分泌外泌体可以缓解相关炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达。
制取急性肝衰竭小鼠肝脏的组织切片并进行HE染色，结果如图6所示，可见，与D-GalN/LPS的阳模型对照组相比，经血间充质干细胞分泌外泌体明显可以保护肝脏受到急性药物的损伤。
根据急性肝衰竭模型小鼠的生存时间，制作急性肝衰竭模型小鼠的生存时间图，结果如图7所示，可见，与模型对照D-GalN/LPS相比；经血间充质干细胞分泌外泌体明显的促进急性肝衰竭模型小鼠的生存时间的延长，表现为。
对比例1
采用专利文献CN201510112156.3的方法分离培养及鉴定经血间充质干细胞，按照文献FKongetal.Impactofcollection,isolationandstoragemethodologyofcirculatingmicrovesiclesonflowcytometricanalysis.Experimental&TherapeuticMedicine,2015,10(6):2093-2101中的方法，分离经血间充质干细胞的微体。
分离经血间充质干细胞的微体的方法包括：选择生长状态良好的3-6代经血间充质干细胞先用含15体积％胎牛血清的αMEM培养基培养，待细胞融合至70-80％时换无血清αMEM培养基培养，24h后收集培养上清。将收集的经血间充质干细胞上清液于4℃、2000×g离心10min，以除去细胞碎片，将去除细胞碎片的上清用20500×g离心1小时，去除上清，用PBS重悬沉淀，得到微体。
对制备得到经血间充质干细胞的微体进行电子显微镜检测检测，发现微体的直径大于100nm。
按照实施例2的方法，将蛋白含量为1μg/μL的PBS分散的经血间充质干细胞分泌的外泌体和将蛋白含量为1μg/μL的PBS分散的经血间充质干细胞分泌的微体进行肝衰竭治疗实验的平行对比。平行对比实验的结果如图8(天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)指标图)和图9(急性肝衰竭模型小鼠的生存时间图)所示。由图8和图9可见，经血间充质干细胞分泌的外泌体对急性肝衰竭的疗效要显著强于经血间充质干细胞分泌的微体。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途，其特征在于，所述外泌体是由人经血间充质干细胞分泌的外泌体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述外泌体的直径不大于100nm。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述外泌体的表面标志物包括CD63和Tsg101。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述外泌体来源于健康人体。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述外泌体是从经血间充质干细胞的原代培养上清液中分离得到的。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述急性肝衰竭为药物损伤性急性肝衰竭。
7.药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有人经血间充质干细胞分泌的外泌体和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的剂型为注射液；并且，以外泌体中的蛋白的重量计算，所述药物组合物中的所述外泌体的含量为0.1-10μg/μL。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。
10.根据权利要求7或8所述的药物组合物，其中，所述外泌体的表面标志物包括CD63和Tsg101。
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