JP4752058B2

JP4752058B2 - 肝再生用骨髄細胞画分

Info

Publication number: JP4752058B2
Application number: JP2005286546A
Authority: JP
Inventors: 功坂井田; 崇二寺井
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2025-09-30
Also published as: JP2007089532A

Description

本発明は、骨髄液由来の肝再生用骨髄細胞画分および該肝再生用骨髄細胞画分を含有する製剤に関する。

肝炎ウイルスによる肝疾患の増加とともに、肝硬変、肝癌、劇症肝炎などの肝不全患者が増加している。現在肝不全患者に対しては、生体肝移植による治療が行われているが、ドナー不足の問題、手術侵襲の問題、経済的な問題などがあり、普及するには障害が多い。

近年になり、骨髄液中には、赤血球、免疫リンパ球、血小板を作り出す血球幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ；ＨＳＣ）の他に、骨、軟骨、脂肪、心臓、神経、肝臓など多様な細胞に分化しうる性質を持った間葉系細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ；ＭＳＣ）や、血管を再生する種になる血管内皮前駆細胞が存在することが明らかになってきている。このように、骨髄中に存在する幹細胞の存在が報告されて以来、再生医療の新たな細胞源として骨髄細胞が注目されてきた。心臓への骨髄細胞移植については、重い心筋梗塞の患者に対し、本人の骨髄から採った細胞を心臓の血管に注入して、劇的に回復した例が最近新聞報道された。

肝臓への細胞移植については、ヒト肝組織から肝幹細胞を精製し、精製後の細胞の生存を確認して、細胞移植による肝疾患の処置方法を示唆した報告（特許文献１）や、骨髄細胞より分離した単核球画分を酵素処理して、細胞表面にガラクトースを露出させて肝細胞への接着性を高め、効率的な肝細胞移植を示唆した報告（特許文献２）等があるが、患者への細胞移植の実例はなく、これらの精製法ではヒトへの注入が可能であるかどうか明らかではない。

骨髄液からの、骨髄細胞の分離方法については、赤血球沈降剤と遠心分離の組み合わせにより、単核球細胞を分離する方法（特許文献３）が報告されているが、分離された細胞は新生血管再生用の骨髄細胞あり、虚血下肢への筋肉内注射による効果を明らかにしている。

本発明者らは、骨髄細胞を用いた肝臓再生療法の臨床応用を進める基礎モデルとして、骨髄細胞から肝細胞への分化評価モデルを開発し、骨髄細胞が、持続的肝障害の肝硬変時に肝臓へ遊走され、肝細胞へ分化・増殖することを明らかにしている（特許文献４、非特許文献１、２）。

しかしながらヒトへ処置する骨髄細胞については、未だ報告がなく、充分に安全性が証明され、患者への負担の少ない効率的な処置が可能な製剤が望まれている。
特表２００５−５２０５１３公報特開２００５−１１８００５公報特開２００２−１７１９６５公報特開２００３−７０３７７公報Ｔｅｒａｉｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００３；１３４：５５１−５５８．ＭｃＴａｇｇａｒｔｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００４；３９：１１４３−１１４６．

本発明は、肝移植以外に有効な治療法がない肝不全患者に対し、肝再生療法を行うことができる精製・濃縮された骨髄液由来の肝再生用骨髄細胞含有画分を提供することを目的とする。本発明はさらに、肝再生用の安全でかつ効率的な骨髄細胞含有製剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、赤血球沈降剤と濃縮機セルプロセッサーを組み合わせて用いることにより、簡便な操作で骨髄液由来の肝再生用骨髄細胞画分を分離・濃縮することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、以下の手段を含む。
（１）（ａ）非代償性肝硬変症患者から採取された骨髄液に赤血球沈降剤を加え、赤血球を沈殿させた後に上清を回収する赤血球除去工程；
（ｂ）前記赤血球除去工程により回収された上清に含まれる微小浮遊物を、セルプロセッサーを用いて除去する微小浮遊物除去工程；
の工程（ａ）及び（ｂ）により作製された肝再生用骨髄細胞含有画分を含む肝不全の治療剤であって、骨髄液の採取源である非代償性肝硬変症患者に投与されることを特徴とする治療剤。
（２）赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルデンプンである上記（１）記載の治療剤。
（３）肝再生用骨髄細胞含有画分が、１０ｍｌ当り１×１０^８個〜１×１０^９個の生細胞を含む上記（１）又は（２）記載の治療剤。
（４）薬学上許容される物質をさらに含む上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（５）薬学上許容される物質が、ヒドロキシエチルデンプンを含む生理食塩水（ＨＥＳ４０）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）、及びＡｃｉｄＣｉｔｒａｔｅＤｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ（ＡＣＤ−Ａ）液から選ばれる１以上の溶液である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の治療剤。

本発明によれば、患者から採取した骨髄液を、分離・濃縮操作を行うことにより、安全かつ効率のよい、肝再生用骨髄細胞含有製剤を得ることができ、肝不全患者に対する肝再生医療のために有効な製剤を提供することが可能になる。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有画分は、ヒト腸骨から骨髄液を採取して、分離・濃縮操作により赤血球および微小浮遊物を除去したものであり、肝再生用の骨髄移植用細胞含有製剤である。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有画分は、ヒト骨髄液に赤血球沈降剤を混合して赤血球を除去したのち、上清を濃縮機セルプロセッサーで処理してすることに骨髄に含まれる微小浮遊物を除去することにより得ることができる。

本発明で用いる赤血球沈降剤とは、赤血球の表面に変化を与え、静置もしくは軽度の遠心操作を行った場合に有核細胞との沈降速度の差を生じさせることによって、赤血球を優先的に沈降させるものである。赤血球沈降剤としては特に限定されないが、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、高分子デキストラン、フィブリノーゲン、α−グロブリン等を挙げることができる。好ましくはヒドロキシエチルデンプンである。ヒドロキシエチルデンプンは、従来から各種分野で利用されているもののいずれでもよい。好ましくは、赤血球沈降剤として市販されている、分子量約４０万のヒドロキシエチルデンプンを０．９％食塩液に６ｗ／ｖ％濃度で溶解させたもの（ＨＥＳ４０；株式会社ニプロ社製）である。このものは、従来から医薬品分野で用いられており、安全性の高いものである。

本発明の、ヒドロキシエチルデンプンによる骨髄液中の赤血球沈降操作は、例えば以下のように実施することができる。採取した骨髄液を分離バッグに入れ、ヘパリンを混和した生理食塩水などの媒体で、必要に応じて希釈し、この液中にヒドロキシエチルデンプンの適量を添加する。骨髄液に対するヒドロキシエチルデンプンの添加量は、特に制限されるものではないが、一般には、最終濃度が０．０１−０．１％（ｗ／ｖ％）となる範囲にするのが適当である。上記ヒドロキシエチルデンプンの添加後、分離バッグを、分離スタンドにセットして静置することによって、赤血球を沈降させ、肝再生用骨髄細胞はその上清として回収することができる。

次いで、回収された肝再生用骨髄細胞を含む上清は、分離スタンドにセットした状態のまま濃縮機セルプロセッサーに接続する。この濃縮機セルプロセッサーは、骨髄に含まれる微小浮遊物を除去することにより、肝再生用の骨髄細胞含有画分として不適当な成分を除去するものである。微小浮遊物としては、主に骨片、脂肪分等がある。

本発明で用いる濃縮機セルプロセッサーは、液体の容量減少、細胞の濃縮等が可能であり、処理後も回収細胞が高いバイアビリティを保持し、細胞のロスを抑制でき、迅速かつ効率良い、細胞の処理装置であればどのようなものでも良い。好ましくは、Ｃｙｔｏｍａｔｅ（登録商標）である。Ｃｙｔｏｍａｔｅ（登録商標）は、４ミクロンのポアサイズの膜を使用した磁気分離システムにより、不必要な細胞、死細胞、サイトカインなどを除去することができる装置である。Ｃｙｔｏｍａｔｅ（登録商標）は、完全閉鎖系になっており、無菌的に、また、作業者への感染のリスクも抑えて、短時間に処置を行うことができる。

上述した方法で得られる、本発明の肝再生用骨髄細胞含有画分に存在する生細胞数は、１０ｍｌ当り１×１０^７個〜１×１０^９個程度で、この処理により細胞の生細胞率は９０％を超える。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有画分は、そのままで肝再生用として使用することができ、あるいは肝再生用骨髄細胞含有画分に、薬学上許容される物質を加えた製剤の形で使用することもできる。

薬学上許容される物質とは、例えば、ショ糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤、各種無機塩のｐＨ調整剤、ヒドロキシエチルデンプン、クエン酸ナトリウム、クエン酸、ブドウ糖、リン酸ナトリウム、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などの細胞の保護・安定化剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの活性化剤があり、これらを添加剤として加えても良いが、生理食塩水やリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶解して使用することもできる。好ましいのは、ヒドロキシエチルデンプンの生理食塩水（ＨＥＳ４０）、ＰＢＳ、ＡＣＤ−Ａ（ＡｃｉｄＣｉｔｒａｔｅＤｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ）液から選ばれる１つ以上の溶液を含んで調整した製剤である。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有製剤は、通常の細胞移植用剤と同様の注射剤乃至注入剤形態に調製され、この形態に応じて血管内、筋肉内、皮下、皮内などに投与することもできる。一般的には、静脈内投与が好ましく、特に抹消の静脈内に投与することが好ましい。該製剤は、細胞を安定させる物質と共に冷蔵、冷凍して保存することもできる。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有製剤の投与量、投与間隔は、患者の疾患の程度、投与回数、性別、年齢より異なるが、投与量としては、成人一人一回当たり、有効成分とする肝再生用骨髄細胞量として、１×１０^６個／ｋｇ〜１×１０^８個／ｋｇ程度が好ましい。注入量としては、５０ｍｌ〜４００ｍｌであるが、１００ｍｌ〜２００ｍｌの注入量がより好ましい。投与間隔は、６ヶ月〜１２ヶ月程度であり、好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月である。上記処置は、患者の回復度に応じて適宜変更することが望ましい。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有製剤は、これを肝疾患患者、特に肝硬変患者に投与することによって、その有効成分とする肝再生用骨髄細胞が、肝臓へ遊走・定着し、肝細胞へ分化し、増殖して、肝疾患の治癒効果を奏する。肝細胞への分化・増殖は、患者の肝組織における肝再生の亢進や、肝機能の改善、肝線維化の改善により確認することができる。例えば、肝組織における肝再生の亢進は、肝生検検体におけるアルファーフェトプロテイン（ＡＦＰ）発現の増加により確認することができる。肝機能の改善は、血清アルブミン値の上昇、血小板値の上昇から確認することができ、肝線維化の改善は、肝線維化マーカー蛋白である血清プロコラーゲンＩＩＩ型ペプタイド値の減少や、血清ヒアルロン酸値の低下から、あるいは組織の顕微鏡観察により確認することができる。

本発明の肝再生用骨髄細胞含有製剤に使用する濃縮された肝再生用骨髄細胞は、自己もしくは血縁者の骨髄由来であることが好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、骨髄バンクなどに保管されている非血縁者の骨髄由来の細胞も利用できる。かかる場合には、必要に応じて、免疫抑制剤等を併用することが好ましい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜対象者＞
体重７０．６ｋｇ、６０才代の男性、体重５８．５ｋｇ、５０才代の男性、体重６９．０ｋｇ、６０才代の男性、以上３名の非代償性肝硬変症患者を対象者とした。一連の試験については、本人および家族に説明の上、同意の文章を得て行った。

＜骨髄肝細胞の採取・洗浄・濃縮方法＞
患者の腸骨から骨髄液４００ｍｌを全身麻酔下で採取し、ヘパリン混和の生理食塩水３５０ｍｌと混和する。さらに、ＨＥＳ４０を８．７５ｇ（最終ＨＥＳ濃度は１％）加え、得られた骨髄液を室温で４０分間静置し、赤血球成分を沈降させ上清液を回収する。回収液を、濃縮機セルプロセッサー（Ｃｙｔｏｍａｔｅ：登録商標、ＮｅｘｅｌｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）にセットし、脂肪分、骨片等の微小浮遊物を分離した。次いで、ＡＣＤ−Ａ液（クエン酸ナトリウム２．２ｗ／ｖ％、クエン酸０．８ｗ／ｖ％、ブドウ糖２．２ｗ／ｖ％をリン酸緩衝生理食塩水に溶解した液）を約７００ｍｌ加え、さらに洗浄、濃縮操作により、１００ｍｌの輸注用最終液を調製した。この輸注用最終液中の生細胞数は、血液検査用の自動血球装置で測定し、その結果、骨髄液から肝再生用細胞画分を確認した。再生医療に使用する生細胞数を測定した結果を表１に示す。濃縮率は、２．２倍、２．３倍、２．１倍といずれも良好であった。また、輸注用液が９０％以上のバイアビリティーを有することも確認された。

＜ＡＦＰの発現＞
実施例１で得られた輸注用液を、患者に静脈内投与する。２週間後および４週間後肝組織を採取し、以下の方法でＡＦＰ発現の確認を行った。パラフィン包埋組織切片を、キシレンに５分間浸し、キシレンを蒸発させ、さらにキシレンに３分間浸した。この操作を繰り返したのちに、無水エタノールに５分間浸した。乾燥後同様に無水エタノール１回、９５％エタノール２回、８０％エタノール１回、７０％エタノール１回、蒸留水１回の浸漬・乾燥処理を繰り返して脱パラフィンを行った。先に０．１Ｍクエン酸水溶液９ｍｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液４１ｍｌに蒸留水４５０ｍｌ加えた溶液をマイクロウェーブ（アズマ社製、５００Ｗ）で沸騰させ、そこへ上記処理を行ったプレパラートを入れ、６分間加熱し、賦活化した。その後このプレパラートを蒸留水で洗浄後冷ました。内因性ペルオキシダーゼは、０．３％の過酸化水素中に３０分間浸してブロックした。このプレパラートを再水和した後、ベクタスティンのＡＢＣキット（フナコシ薬品社製）を用いて免疫染色反応を行った。すなわち、１００の希釈の一次抗体（ウサギ抗体）を反応させ、４℃で一夜放置した後、洗浄し、ビオチン化抗ヤギＩｇＧ抗体と室温で６０分間反応させた。洗浄後ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液にて発色させ顕微鏡下ＡＦＰの発現状態を観察した。その結果、図１に示すように、骨髄細胞投与後、ＡＦＰの発現が有意に増加し、患者肝組織で実際に肝再生が亢進していることが証明された。

＜血清アルブミン値＞
実施例１で得られた輸注用液を、患者に静脈内投与する。術前、４週間後、２４週間後に血液を採取し、血清アルブミン値を測定した。その結果、アルブミン値は上昇し、明らかに肝機能が改善していることが分かった（図２）。

＜血清プロコラーゲンＩＩＩ型ペプタイド値＞
実施例１で得られた輸注用液を、患者に静脈内投与する。術前、４週間後、２４週間後に血液を採取し、血清プロコラーゲンＩＩＩ型ペプタイド値を測定した。その結果、プロコラーゲンＩＩＩ型ペプタイド値は減少し、明らかに肝線維化が改善していることが分かった（図３）。

生体肝移植が困難な状況で、肝不全患者の肝再生療法のための製剤であり、本発明
の肝再生用骨髄細胞含有画分は、充分に基礎研究を行った上で得られた、安全性の高いものである。従って、本発明の肝再生用骨髄細胞含有製剤は、肝癌、肝硬変、劇症肝炎などの肝疾患に対する肝細胞移植治療剤として非常に有用である。

骨髄細胞投与後、顕微鏡下ＡＦＰの発現状態が有意に増加し、患者肝組織で実際に肝再生が亢進していることを証明している図面である。骨髄細胞投与後、血清アルブミン値が有意に増加し、患者肝組織で実際に肝機能が改善していることを証明している図面である。骨髄細胞投与後、血清プロコラーゲンＩＩＩ型ペプタイド値が有意に減少し、肝線維化が改善していることを証明している図面である。

Claims

以下の工程（ａ）及び（ｂ）により作製された肝再生用骨髄細胞含有画分を含む肝不全の治療剤であって、骨髄液の採取源である非代償性肝硬変症患者に投与されることを特徴とする治療剤。
（ａ）非代償性肝硬変症患者から採取された骨髄液に赤血球沈降剤を加え、赤血球を沈殿させた後に上清を回収する赤血球除去工程；
（ｂ）前記赤血球除去工程により回収された上清に含まれる微小浮遊物を、セルプロセッサーを用いて除去する微小浮遊物除去工程；
赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルデンプンである請求項１記載の治療剤。
肝再生用骨髄細胞含有画分が、１０ｍｌ当り１×１０^８個〜１×１０^９個の生細胞を含む請求項１又は２記載の治療剤。
薬学上許容される物質をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
薬学上許容される物質が、ヒドロキシエチルデンプンを含む生理食塩水（ＨＥＳ４０）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）、及びＡｃｉｄＣｉｔｒａｔｅＤｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ（ＡＣＤ−Ａ）液から選ばれる１以上の溶液である請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。