JP2003235542A

JP2003235542A - フィルター装置

Info

Publication number: JP2003235542A
Application number: JP2002035180A
Authority: JP
Inventors: Masaya Sumida; 政哉澄田
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2002-02-13
Filing date: 2002-02-13
Publication date: 2003-08-26

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便な操作で、短時間に、骨髄などの細胞含
有液中に存在する脂肪塊や骨片など、細胞よりも大きい
不要物質を除去する装置を提供すること。【解決手段】細胞含有液中に存在する、細胞よりも大
きい不要物質を除去するためのフィルター装置であっ
て、注射器に嵌合して接続可能な液体導入口と、液体導
出口とを備え、細胞は通過するが細胞より大きい物質を
捕捉するろ材を内部に包含した容器で構成されたフィル
ター装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、骨髄などの細胞含
有液中に存在する脂肪塊や骨片など、細胞よりも大きい
不要物質を除去するのに適したフィルターに関する。こ
のフィルターにより得られた細胞は、さらなる細胞分離
や細胞培養に供され、細胞生物学や免疫学などの基礎科
学分野および各種生体組織の病変並びに欠損の治療に用
いられる。

【０００２】

【従来の技術】生体の組織または臓器（以下、単に組織
という）の幹および／または前駆細胞を用いて、同組織
をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで形成すること
により組織の病変および欠損を治療する、いわゆる組織
工学［ティッシュエンジニアリング（Ｔｉｓｓｕｅｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。再生医学ともいう］が非常に
注目を集めており、世界各国で研究開発が盛んに行われ
ている［例えば、ＢＩＯＣｌｉｎｉｃａ，１５［１４］
（２０００年）、遺伝子医学，４［２］（２０００年）
など多数］。これらに用いられる細胞ソースとしては、
骨髄が、その入手しやすさや、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）
に付随する倫理的問題が少ないことなどの理由により、
最も有用とされている。

【０００３】骨髄は、骨の内部に存在するゼリー状組織
であり、その採取には、ヒトの場合、専用の骨髄穿刺器
（金属製）を用いて骨を貫通させて採取する。基礎実験
で用いるラットなどの動物の場合は、解体後、骨そのも
のを採取し、両端を切断し、液体を通液することにより
採取する。これらの操作により、当然ながら、破壊され
た骨の破片や、もともと骨髄中に存在する脂肪塊や凝集
塊も採取細胞液に混入する。これらは、ヒト臨床の場
合、血管閉塞の原因などになり好ましくないため、通
常、採取した骨髄（約１リットル）をステンレス製カッ
プに集め、空のステンレスカップの上に載せたステンレ
ス製篩に通す（王伯銘ら編、「新しい造血細胞移植のテ
クニック」、１９９６年、南山堂）か、米国特許第５７
２４９８８号明細書で提案されているバクスター社製の
キットが用いられている。

【０００４】動物実験の場合は、前述のヒト臨床のよう
な危険性は無いため、これらの煩雑な前処理は省略する
こともあるが（通常、ヒト臨床サンプルと比して、はる
かに少量なため、バクスター社製キットを用いることは
不可能）、混入物は、さらなる細胞分離（例えば、特開
平１３−１６１３５２１号公報で提案されているような
細胞濃縮）や細胞培養の際に悪影響を及ぼすことが危惧
されている。前述のステンレス製カップとステンレス製
篩を用いる方法は、完全開放系の操作で、たとえクリー
ンベンチ内で行ったとしても、雑菌のコンタミネーショ
ンの危惧が存在していた。そのため、非完全開放系での
簡便な操作により、骨片、脂肪塊および凝集塊を除去で
きる方法が待望されている。

【０００５】ところで、注射器と嵌合接続可能な、いわ
ゆるシリンジフィルターが多数発売されているが（例え
ば、ビーブラウン社製フィルター、製品番号ＬＶ５００
０、ＰＦ２０００，ＰＦ１２００など多数）、いずれも
無細胞液体（薬品など）からの除菌などを目的としてい
るため、孔径は大きくても数μｍであり、本発明の目的
に用いることはできない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
な操作で、短時間に、骨髄などの細胞含有液中に存在す
る脂肪塊や骨片など、細胞よりも大きい不要物質を除去
する装置を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる課題
を解決すべく、鋭意検討を進めた結果、通常、動物を用
いた基礎研究分野においては注射器が各種操作で汎用さ
れていること、さらに、これらの操作では注射器に針を
付けたり外したりの操作が極めて多いことを見出し、注
射器に針を刺すことなく接続できるフィルターを開発す
れば煩雑さは軽減されると考え、本発明を完成させるに
至った。

【０００８】すなわち、本発明は、以下の通りである。（１）細胞含有液中に存在する、細胞よりも大きい不要
物質を除去するためのフィルター装置であって、注射器
に嵌合して接続可能な液体導入口と、液体導出口とを備
え、細胞は通過するが細胞より大きい物質を捕捉するろ
材を内部に包含した容器で構成されたフィルター装置。（２）液体導入口は常時閉鎖されており、注射器を嵌合
して接続した時のみ連通する弁を有する（１）に記載の
フィルター装置。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、細胞含有液としては、例えば、骨髄、腎臓、膵
臓など、各種臓器や筋肉などの各種組織から酵素消化法
などにより抽出した細胞を何らかの液体に再浮遊したも
のがあげられるが、血液、すなわち、末梢血（顆粒球コ
ロニー刺激因子などの造血因子を投与して採血されたも
のも含む）、臍帯血（臍帯血管だけでなく胎盤血管から
採取されたものも含む）およびこれらに遠心分離など何
らかの処理を施したものなども含まれる。

【００１０】細胞よりも大きい不要物質としては、例え
ば、脂肪塊、骨片、線維凝集塊などがあげられるが、細
胞がこれら不要物質と複合体を形成し、単独の細胞より
も大きくなってしまったものも含まれる。本発明に用い
られるろ材は、前述の、細胞よりも大きい不要物質を捕
捉し、細胞や液体を通過させるものである。ろ材の好ま
しい開口径は、３０μｍ以上５００μｍ以下である。開
口径が３０μｍ未満の場合、細胞そのものが捕捉され、
ろ材を通過できないおそれがあり、５００μｍを越える
と、不要物質の十分な除去が行えないおそれがある。ろ
材はまた、細胞や元の臓器・組織の種類により適宜選択
され、骨髄の場合、より好ましくは７０μｍ以上２００
μｍ以下の開口径を有するろ材が用いられる。

【００１１】ろ材の材質には、いかなる種類の材料も使
用できるが、成形性、滅菌性および細胞毒性が低いとい
う点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、
ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミ
ド、ポリウレタンなどの合成高分子、アガロース、セル
ロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン
酸塩などの天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラ
ス、アルミナ、チタニアなどの無機材料、ステンレス、
チタン、アルミニムなどの金属があげられるが、これら
に限定されるものではない。

【００１２】ろ材の形状は、メッシュ、織布、不織布、
スポンジ状構造体などがあげられ、これらは、積層体、
袋状、３次元成型体（ブロック状）などの形態で用いら
れる。このろ材を内部に包含するための容器の材質は、
成形性や滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ま
しいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエス
テル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウ
レタン、塩化ビニルなどの合成高分子、ヒドロキシアパ
タイト、ガラス、アルミナ、チタニアなどの無機材料、
ステンレス、チタン、アルミニウムなどの金属があげら
れるが、これらに限定されるものではない。

【００１３】容器の形状は、直方体、立方体、円柱形、
楕円柱形などがあげられるが、いずれの形状でもよい。
この容器は、注射器と嵌合して接続可能な液体導入口と
液体導出口を備えている。注射器と嵌合して接続可能と
は、通常、注射器（特に、プラスチック製ディスポーザ
ブル注射器）の口は、注射器のサイズに関わらず、規格
で定められたオスルアー口（スリップまたはルアーロッ
ク）であるので、これに嵌合する、やはり規格で定めら
れたメスルアー口が代表的なものであるが、これに限定
されるものではない。

【００１４】液体導出口は、液体が導出されればどんな
形状でもよく、必要に応じて、単なるチューブ、スパイ
ク（血液バッグとの接続に便利）、金属針、オス、メス
ルアーなどを選択する。また、血液バッグなどの回収容
器を直接接続したものでもよい。これらの液体導入口や
液体導出口は、容器に直接接続されていても、チューブ
を介して接続されていてもよい。液体導入口と液体導出
口の位置は、液体導入口から細胞含有液が入り、ろ材を
経て液体導出口に至るものであれば、容器における位置
は限定されない。

【００１５】本発明において、常時閉鎖しており注射器
を嵌合して接続した時のみ連通する弁を有する液体導入
口は、ビーブラウン社製ＳＡＦＳＩＴＥ（登録商標）な
どの、いわゆるシリンジアクティベイテッドチェックバ
ルブ（以下、単にチェックバルブと呼ぶ）に類するもの
である。チェックバルブの場合には、注射器を接続する
と、注射器の口（オスルアー）の先端で押すことにより
弁が開き、注射器を外すと弁が閉じるものである（通
常、メスルアー口が具備されており、バネまたは弾性体
が内蔵されており、前述の動作が行われる）。

【００１６】本発明で得られた、細胞よりも大きい不要
物質が除去された細胞含有液は、そのまま、または必要
に応じて、さらなる分離精製、培養、活性化、増幅、遺
伝子導入などが施された後、細胞生物学や免疫学などの
基礎科学実験や各種生体組織の病変および欠損の治療に
用いられる。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下に実施例により本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもの
ではない。

【００１８】

【実施例１】（１）フィルター装置図１は、本発明のフィルター装置の一例を示す概略図で
ある。開口径１５０μｍメッシュを内部に具備するドリ
ップチャンバー（ビーブラウン社製、商品番号Ｓ５００
７５５５。本来、薬剤の点滴に用いられるもの）１の入
口側には、長さ２ｃｍの塩化ビニル製チューブ２を介
し、メスルアーロック口を有するアダプター（ＳＡＦＳ
ＩＴＥＶａｌｂｅ（登録商標）、ビーブラウン社製）
３を接続して液体導入口が構成されている。ドリップチ
ャンバー１の出口側には、長さ８ｃｍの塩化ビニル製チ
ューブ４を介し、スパイク（コシナ社製、商品番号２３
２０４）５を接続して液体導出口が構成されている。こ
の装置は、酸化エチレンガスで滅菌されている。

【００１９】（２）骨髄細胞浮遊液常法により、ラット４匹の脚部から２％牛胎児血清を加
えたダルベッコリン酸塩緩衝液を用いて骨髄を採取し、
同じ液体で希釈して５０ｍｌの骨髄細胞浮遊液とした。
これを５０ｍｌプラスチック製ディスポーザブル注射器
に入れた。なお、この細胞浮遊液は採取時に骨の破壊に
より発生、混入したと考えられる目視で確認できる骨片
が存在していた。

【００２０】（３）本フィルター装置の使用図１に示すフィルター装置の液体導入口に、（２）で準
備した骨髄細胞浮遊液入り注射器を接続し、液体導出口
であるスパイク５を２００ｍｌ血液バッグに接続した。
次に、注射器のプランジャーを押して、骨髄細胞浮遊液
をドリップチャンバー１に導入、ろ過してスパイク５を
介して２００ｍｌ血液バッグに回収した。（４）さらなる細胞分離（３）で得られた細胞浮遊液から赤血球を除去し、有核
細胞を採取する目的で以下の細胞分離操作を行った。

【００２１】４−１細胞分離フィルター装置図２は、細胞分離フィルター装置の一例を示す概略図で
ある。容器外寸（縦×横×厚み）４１ｍｍ×４１ｍｍ×
１８ｍｍで、液体流出口と液体流入口を対角線上に持つ
ポリカーボネート製容器の出口側に平均繊維径１２μｍ
のポリエステル繊維からなる不織布がくるように下記の
細胞分離回収材を充填して、細胞分離フィルター６が構
成されている。

【００２２】この細胞分離フィルターの入口側には、先
端がスパイク７で、途中に細胞回収バッグ１１への分岐
を有する三方活栓９を有するチューブ１２が接続されて
いる。細胞分離回収フィルター６の出口側には、途中に
三方活栓１０を有し、末端がドレインバッグ８に接続さ
れるチューブ１３が接続されている。細胞分離回収材：
平均繊維径２．３μｍのポリエステル繊維からなる不織
布（目付約６０ｇ／ｍ²、嵩高約０．３ｍｍ）１８枚と
平均繊維径１２μｍのポリエステル繊維からなる不織布
（目付約１００ｇ／ｍ²、嵩高約０．４７ｍｍ）１６枚
を重ね、押し切りカッターで３５ｍｍ角に切断したも
の。

【００２３】４−２細胞分離操作図２に示す細胞分離フィルター装置のスパイク７に、
（３）で得られた骨髄細胞浮遊液入り血液バッグ（以
下、血液バッグ）を接続した。三方活栓９は血液バッグ
と細胞分離フィルター６のみが連通する方向に、三方活
栓１０は細胞分離フィルター６とドレインバッグ８のみ
が連通する方向にして原料細胞浮遊液を細胞分離フィル
ター６に落差で通液ろ過し、フィルターから流出した赤
血球をドレインバッグ８に回収した。次に、三方活栓１
０に（２）で用いた骨髄採取液２５ｍｌを入れた３０ｍ
ｌ注射器（ルアーロック口）を接続し、三方活栓１０は
注射器と細胞分離フィルター６のみが連通する方向に
し、三方活栓９は細胞分離フィルター６と細胞回収バッ
グ１１のみが連通する方向にした。引き続き、注射器の
プランジャーを手で押して細胞分離回収フィルター６に
捕捉されている細胞を回収バッグ１１に回収した。

【００２４】本操作に要した時間は約１０分であり、極
めて短い時間であった。これは、本発明による前処理フ
ィルター装置を使用することによって、骨片が効果的に
除去されていたためであると考えられる。

【００２５】

【比較例】前処理用フィルター装置を用いた前処理を行
わない以外は実施例１と同様の操作を行ったところ、約
２０ｍｌを細胞分離フィルターに流した時点で目詰まり
を起こし（徐々に流速が落ちていたが、この時点で完全
に止まった。ここまでにもすでに３０分経過してい
た）、以降の細胞分離が行えなかった。

【００２６】

【発明の効果】本発明の前処理用フィルター装置を用い
ることによって，簡便な操作で、短時間に、骨髄などの
細胞含有液中に存在する脂肪塊や骨片など、細胞よりも
大きい不要物質を除去できる。そのため、細胞生物学や
免疫学などの基礎科学分野や各種生体組織病変および欠
損の治療の研究の発展に対する貢献が極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のフィルター装置の一例を示す概略図。

【図２】細胞分離フィルター装置の一例を示す概略図。

【符号の説明】

１ドリップチャンバー２チューブ３アダプター４チューブ５スパイク６細胞分離フィルター７スパイク８ドレインバッグ９方活栓１０三方活栓１１細胞回収バッグ１２チューブ１３チューブ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞含有液中に存在する、細胞よりも大
きい不要物質を除去するためのフィルター装置であっ
て、注射器に嵌合して接続可能な液体導入口と、液体導
出口とを備え、細胞は通過するが細胞より大きい物質を
捕捉するろ材を内部に包含した容器で構成されたフィル
ター装置。
【請求項２】液体導入口は常時閉鎖されており、注射
器を嵌合して接続した時のみ連通する弁を有する請求項
１記載のフィルター装置。