JP2007089532A - 肝再生用骨髄細胞画分 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】骨髄液より、赤血球沈降剤と濃縮機セルプロセッサーを組み合わせて用いることにより、簡便な操作で得られる肝再生用骨髄細胞含有画分、および該骨髄細胞含有画分と薬学上許容される物質を含む製剤。
【選択図】なし
Description
(1)分離・濃縮操作により、赤血球および微小浮遊物が実質的に全て除去された骨髄液由来の肝再生用骨髄細胞含有画分。
(2)分離・濃縮操作が、採取した骨髄液に赤血球沈降剤を混合して赤血球を除去する工程、残液を濃縮機セルプロセッサーにより微小浮遊物を除去する工程、を含むことを特徴とする上記(1)に記載の肝再生用骨髄細胞含有画分。
(3)赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルデンプンである上記(1)または(2)に記載の肝再生用骨髄細胞含有画分。
(4)生細胞数が、10ml当り1×108個〜1×109個である上記(1)〜(3)のいずれかに記載の肝再生用骨髄細胞含有画分。
(5)上記(1)〜(4)のいずれかに記載の肝再生用骨髄細胞含有画分と薬学上許容される物質を含む肝再生用骨髄細胞含有製剤。
(6)肝再生用骨髄細胞含有画分とHES40、PBS、ACD−A液から選ばれる物質を1つ以上含む上記(5)の肝再生用骨髄細胞含有製剤。
(7)肝再生用骨髄細胞含有画分の生細胞数が、10ml当り1×108個〜1×109個に調整された上記(5)または(6)に記載の肝再生用骨髄細胞含有製剤。
体重70.6kg、60才代の男性、体重58.5kg、50才代の男性、体重69.0kg、60才代の男性、以上3名の非代償性肝硬変症患者を対象者とした。一連の試験については、本人および家族に説明の上、同意の文章を得て行った。
患者の腸骨から骨髄液400mlを全身麻酔下で採取し、ヘパリン混和の生理食塩水350mlと混和する。さらに、HES40を8.75g(最終HES濃度は1%)加え、得られた骨髄液を室温で40分間静置し、赤血球成分を沈降させ上清液を回収する。回収液を、濃縮機セルプロセッサー(Cytomate:登録商標、Nexell Therapeutics社製)にセットし、脂肪分、骨片等の微小浮遊物を分離した。次いで、ACD−A液(クエン酸ナトリウム2.2w/v%、クエン酸0.8w/v%、ブドウ糖2.2w/v%をリン酸緩衝生理食塩水に溶解した液)を約700ml加え、さらに洗浄、濃縮操作により、100mlの輸注用最終液を調製した。この輸注用最終液中の生細胞数は、血液検査用の自動血球装置で測定し、その結果、骨髄液から肝再生用細胞画分を確認した。再生医療に使用する生細胞数を測定した結果を表1に示す。濃縮率は、2.2倍、2.3倍、2.1倍といずれも良好であった。また、輸注用液が90%以上のバイアビリティーを有することも確認された。
実施例1で得られた輸注用液を、患者に静脈内投与する。2週間後および4週間後肝組織を採取し、以下の方法でAFP発現の確認を行った。パラフィン包埋組織切片を、キシレンに5分間浸し、キシレンを蒸発させ、さらにキシレンに3分間浸した。この操作を繰り返したのちに、無水エタノールに5分間浸した。乾燥後同様に無水エタノール1回、95%エタノール2回、80%エタノール1回、70%エタノール1回、蒸留水1回の浸漬・乾燥処理を繰り返して脱パラフィンを行った。先に0.1Mクエン酸水溶液9ml、0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液41mlに蒸留水450ml加えた溶液をマイクロウェーブ(アズマ社製、500W)で沸騰させ、そこへ上記処理を行ったプレパラートを入れ、6分間加熱し、賦活化した。その後このプレパラートを蒸留水で洗浄後冷ました。内因性ペルオキシダーゼは、0.3%の過酸化水素中に30分間浸してブロックした。このプレパラートを再水和した後、ベクタスティンのABCキット(フナコシ薬品社製)を用いて免疫染色反応を行った。すなわち、100の希釈の一次抗体(ウサギ抗体)を反応させ、4℃で一夜放置した後、洗浄し、ビオチン化抗ヤギIgG抗体と室温で60分間反応させた。洗浄後DAB(diaminobenzidine tetrahydrochloride)溶液にて発色させ顕微鏡下AFPの発現状態を観察した。その結果、図1に示すように、骨髄細胞投与後、AFPの発現が有意に増加し、患者肝組織で実際に肝再生が亢進していることが証明された。
実施例1で得られた輸注用液を、患者に静脈内投与する。術前、4週間後、24週間後に血液を採取し、血清アルブミン値を測定した。その結果、アルブミン値は上昇し、明らかに肝機能が改善していることが分かった(図2)。
実施例1で得られた輸注用液を、患者に静脈内投与する。術前、4週間後、24週間後に血液を採取し、血清プロコラーゲンIII型ペプタイド値を測定した。その結果、プロコラーゲンIII型ペプタイド値は減少し、明らかに肝線維化が改善していることが分かった(図3)。
の肝再生用骨髄細胞含有画分は、充分に基礎研究を行った上で得られた、安全性の高いものである。従って、本発明の肝再生用骨髄細胞含有製剤は、肝癌、肝硬変、劇症肝炎などの肝疾患に対する肝細胞移植治療剤として非常に有用である。
Claims (7)
- 分離・濃縮操作により、赤血球および微小浮遊物が実質的に全て除去された骨髄液由来の肝再生用骨髄細胞含有画分。
- 分離・濃縮操作が、採取した骨髄液に赤血球沈降剤を混合して赤血球を除去する工程、残液を濃縮機セルプロセッサーにより微小浮遊物を除去する工程、を含むことを特徴とする上記(1)に記載の肝再生用骨髄細胞含有画分。
- 赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルデンプンである請求項1または2に記載の肝再生用骨髄細胞含有画分。
- 生細胞数が、10ml当り1×108個〜1×109個である請求項1〜3のいずれかに記載の肝再生用骨髄細胞含有画分。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の肝再生用骨髄細胞含有画分と薬学上許容される物質を含む肝再生用骨髄細胞含有製剤。
- 肝再生用骨髄細胞含有画分とHES40、PBS、ACD−A液から選ばれる溶液を1つ以上含む請求項5の肝再生用骨髄細胞含有製剤。
- 肝再生用骨髄細胞含有画分の生細胞数が、10ml当り1×108個〜1×109個に調整された請求項5または6に記載の肝再生用骨髄細胞含有製剤。
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