ES2608974T3 - Composiciones de células madre mesenquimales purificadas - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende células madre mesenquimales purificadas, en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm.

Description

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estar limitado por la teoría, se cree que estos agregados de MSC no se dispersan eficientemente después de la administración y son de tamaño suficiente para potencialmente causar embolias pulmonares mortales.
La presente tecnología reconoció por primera vez que la formación de un agregado que comprende MSC puede conducir a embolias pulmonares. Un aumento en las cantidades de sustancias xenogénicas puede causar, entre otras cosas, una mayor adhesión celular presumiblemente debido a ciertas sustancias xenogénicas que interaccionan con azúcares, proteínas u otras macromoléculas unidas a la membrana. Además, las prácticas actuales de fabricación de hMSC dan como resultado mayor cantidad de sustancias en la superficie de la célula, incluyendo azúcares, proteínas y otras macromoléculas (por ejemplo CD 105 y CD 166), presentes en las composiciones recogidas de hMSC. Ciertas macromoléculas, ya sean endógenas o exógenas, aumentan las características de adhesión de las MSC. A medida que las MSC se vuelven más adhesivas, exhiben una mayor tendencia a agregarse entre sí. Tales agregados pueden potencialmente aumentar el riesgo de embolismo pulmonar en receptores de composiciones farmacéuticas de hMSC. Por ejemplo, se cree que la BSA es capaz de formar una asociación no covalente con la membrana celular de MSC aumentando tanto la inmunogenicidad como las propiedades adhesivas de las MSC. Por lo tanto, la presente tecnología identificó y resolvió un problema previamente no reconocido al proporcionar composiciones de MSC con una tendencia reducida a agregarse.
Por lo tanto, se prefieren las técnicas que procesan células mediante selección simultánea de masa y tamaño, tal como filtración centrífuga, a las técnicas que seleccionan en serie la masa, y luego el tamaño, o viceversa. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 100 μm. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 50 μm. De hecho, algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición no comprende agregados de células madre mesenquimales detectables.
Algunas realizaciones de la presente tecnología se refieren a composiciones farmacéuticas de MSC, en donde la composición comprende aproximadamente 55 µg/mL de BSA residual y en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm . En otras realizaciones relacionadas con este aspecto de la presente tecnología, la composición comprende aproximadamente menos de 42 µg/mL de BSA residual y la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales, en donde el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm. En aún otras realizaciones, la composición comprende aproximadamente menos de 25 µg/mL de BSA residual y la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales, en donde el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm. En algunas realizaciones, la composición comprende aproximadamente menos de 13 µg/mL de BSA residual y la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales, en donde el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm. En algunas realizaciones, la composición comprende aproximadamente menos de 10 µg/mL de BSA residual y la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales, en donde el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm.
Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 1000 MSC. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 750 MSC. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 500 MSC. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 200 MSC. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 100 MSC. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 50 MSC. Algunas realizaciones de la presente tecnología comprenden una composición farmacéutica de MSC que consiste en una pluralidad de MSC en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales en donde ningún agregado comprende más de 10 MSC.
Después de un período de incubación de hMSC en medio de cultivo, pueden estar presentes un cierto número de moléculas en el medio de cultivo, incluyendo moléculas extracelulares y asociadas a la membrana celular. Por ejemplo,
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tales moléculas pueden incluir sustancias xenogénicas, tales como BSA y otras moléculas de origen no humano. Adicionalmente, las sustancias producidas por las propias hMSC pueden estar presentes en el medio de cultivo después de un período de incubación. Por ejemplo, tales moléculas pueden incluir proteínas secretadas tales como citoquinas y factores de crecimiento así como moléculas expresadas en la superficie celular de las hMSC. Puede ser deseable purificar las hMSC tras un período de incubación en medio de cultivo para remover las moléculas presentes en el medio de cultivo, incluyendo moléculas extracelulares y asociadas a la membrana celular. Dicha purificación puede reducir o impedir la tendencia de las hMSC a agregarse, reducir el tamaño de cualquier agregado de hMSC formado o inhibir completamente la formación de agregados de hMSC.
Sin estar limitado por la teoría, no es deseable purificar las MSC más allá de los umbrales mínimos de seguridad descritos en la presente memoria, ya que una purificación adicional puede disminuir la cantidad de moléculas de adhesión, tales como integrinas, que se expresan en la superficie de la células MSC. Tales moléculas de adhesión son necesarias para que las MSC ejerzan su efecto terapéutico. Las MSC excesivamente purificadas carecen de la cantidad de moléculas de adhesión necesarias para adherirse al sitio objetivo dentro del cuerpo. En algunas realizaciones, las MSC administradas sistémicamente albergan sitios de inflamación dentro del cuerpo. Estos sitios de inflamación exhiben mayores perfiles de expresión de moléculas de adhesión, e inducen además cambios conformacionales en moléculas de adhesión como un medio para aumentar la afinidad de las MSC con el tejido inflamado. Si las MSC carecen de las moléculas de adhesión correspondientes, no se adhieren al tejido inflamado y continúan circulando hasta la apoptosis. Por lo tanto, aunque es deseable reducir la expresión de moléculas de adhesión en las MSC en la medida necesaria para evitar la agregación, no es deseable reducir la expresión de moléculas de adhesión en las MSC hasta tal punto que pierdan su capacidad para adherirse a un sitio de un tejido inflamado.
Las sustancias xenogénicas, tales como moléculas extracelulares y de la membrana de la superficie celular, que se desean eliminar incluyen proteínas de suero tales como BSA y otros reactivos de origen no humano para el cultivo de hMSC tales como tripsina porcina. En algunas realizaciones de la presente tecnología, la cantidad de sustancias xenogénicas en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de la purificación es aproximadamente 1 log menor que la presente en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de la purificación es aproximadamente 2 log menor que la presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de la purificación es aproximadamente 3 log menor que la presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de la purificación es aproximadamente 4 log menor que la presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de la purificación es aproximadamente 5 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la composición de hMSC expandida en cultivo está sustancialmente libre de sustancias xenogénicas. En algunas realizaciones, no hay sustancias xenogénicas detectables en la composición que comprende las hMSC expandidas en cultivo.
En otras realizaciones de la presente tecnología, la cantidad de sustancias xenogénicas en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación es de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1.000 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de purificación es de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 750 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de purificación es de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de la purificación es de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 300 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de sustancias xenogénicas después de la purificación es aproximadamente 200 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo.
En otras realizaciones de la presente tecnología, la cantidad de BSA en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación es aproximadamente 1 log menor que la cantidad presente en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de la purificación es aproximadamente 2 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de purificación es aproximadamente 3 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de la purificación es de aproximadamente 4 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de purificación es aproximadamente 5 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. Adicionalmente, en algunas realizaciones, la composición de hMSC expandida en cultivo puede estar sustancialmente libre de BSA. En
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otras realizaciones, no hay BSA detectable en la composición que comprende las hMSC expandidas en cultivo después de purificación.
En algunas realizaciones de la presente tecnología, la cantidad de BSA en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación es de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1.000 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de purificación es de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 750 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de purificación es de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de purificación es de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 300 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de BSA después de purificación es aproximadamente 200 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo.
En algunas realizaciones de la presente tecnología, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación es aproximadamente 1 log menor que la cantidad presente en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es aproximadamente 2 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es de aproximadamente 3 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es aproximadamente 4 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es aproximadamente 5 log menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En otras realizaciones, la composición de hMSC expandida en cultivo está sustancialmente libre de ácidos nucleicos extracelulares. En algunas realizaciones, no hay ácidos nucleicos extracelulares detectables en la composición que comprende las hMSC expandidas en cultivo después de purificación.
En algunas realizaciones de la presente tecnología, las cantidades de BSA y ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación son cada una aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1000 veces menores que las cantidades presentes en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones de la presente tecnología, las cantidades de BSA y ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación son cada una aproximadamente 25 hasta aproximadamente 750 veces menores que las cantidades presentes en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones de la presente tecnología, las cantidades de BSA y ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación son cada una aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 veces menores que las cantidades presentes en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones de la presente tecnología, las cantidades de BSA y ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de la purificación son cada una aproximadamente 100 hasta aproximadamente 300 veces menores que las cantidades presentes en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones de la presente tecnología, las cantidades de BSA y ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación son cada una aproximadamente 200 veces menores que las cantidades presentes en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidas en cultivo.
Además, en algunas realizaciones de la presente tecnología, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares en las composiciones que comprenden las hMSC expandidas en cultivo después de purificación es de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1.000 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable de hMSC no purificadas, expandidos en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de la purificación es aproximadamente 25 hasta aproximadamente 750 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 300 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es aproximadamente 200 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo. En otras realizaciones, la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares después de purificación es aproximadamente 1000 veces menor que la cantidad presente en un lote comparable que comprende hMSC no purificadas, expandidas en cultivo; alternativamente aproximadamente 900 veces menor; alternativamente aproximadamente de 800 veces menor; alternativamente aproximadamente de 700 veces menor;
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alternativamente aproximadamente de 600 veces menor; alternativamente aproximadamente de 500 veces menos; Alternativamente alrededor de 400 veces menos; Alternativamente alrededor de 300 veces menos; alternativamente aproximadamente 200 veces menor; alternativamente aproximadamente de 100 veces menor; alternativamente aproximadamente 50 veces menor; o alternativamente aproximadamente 25 veces menor.
En algunas realizaciones de la presente tecnología, las MSC purificadas pueden ser almacenadas en un medio de crioconservación apropiado, por ejemplo un medio de crioconservación que comprende DMSO. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición farmacéutica de MSC puede comprender MSC y aproximadamente 20% de DMSO. En otras realizaciones, una composición farmacéutica de MSC puede comprender MSC y aproximadamente 10% de DMSO. En otras realizaciones, una composición farmacéutica de MSC puede comprender MSC y aproximadamente 3,8% de DMSO. En algunas realizaciones, se puede añadir DMSO a MSC purificadas.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" se refiere a revertir, prevenir, aliviar o inhibir el progreso de una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección. Tal como se usa en la presente memoria, "tratamiento" también puede referirse a disminuir la probabilidad o incidencia de la ocurrencia de una enfermedad, trastorno o afección en un mamífero comparado con una población de control no tratada, o comparado con el mismo mamífero antes del tratamiento. Por ejemplo, tal como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" puede referirse a la prevención de una enfermedad, trastorno o afección, y puede incluir el retraso o la prevención de la aparición de una enfermedad, trastorno o afección o el retraso o prevención de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "tratamiento" también puede referirse a la reducción de la severidad de una enfermedad, trastorno o afección o de los síntomas asociados con tal enfermedad, trastorno o afección antes del padecimiento con la enfermedad, trastorno o afección. Tal prevención o reducción de la severidad de una enfermedad, trastorno o afección previa al padecimiento se refiere a la administración de la composición de la presente tecnología, tal como se describe en la presente memoria, a un sujeto que no está al momento de la administración padeciendo de la enfermedad, trastorno o afección. Tal como se usa en la presente memoria, "tratamiento" también puede referirse a la prevención de la recurrencia de una enfermedad, trastorno o afección de uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad, trastorno o afección. Los términos "terapia", "tratamiento" y "terapéuticamente", como se utilizan aquí, se refieren al acto de tratamiento como se definió anteriormente.
El término "expandido en cultivo" en referencia con las hMSC significa el paso de las hMSC una o más veces bajo condiciones estándar de cultivo celular en un medio mínimo esencial (i) esencialmente libre de células de origen hematopoyético; y, (ii) suplementado con FBS al 10% (en volumen) dando como resultado un mayor número de MSC no diferenciadas.
El término "composición farmacéutica" se refiere a composiciones en cualquier etapa del procedimiento de fabricación, incluyendo el producto final farmacéuticamente aceptable y cualquier compuesto intermedio del mismo en el proceso.
Las composiciones farmacéuticas de la presente tecnología pueden ser producidas por contacto de una preparación que incluye células madre mesenquimales con una solución de lavado, agitando la preparación y la solución de lavado y recuperando las células madre mesenquimales purificadas.
En algunas realizaciones, la solución de lavado puede incluir una solución electrolítica que comprende uno o más compuestos iónicos o ionizables. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio trihidratado, cloruro de potasio y cloruro de magnesio, fosfato de sodio y fosfato de potasio. La solución de lavado puede estar constituida por una solución equilibrada de electrolito, estando compuesta la solución equilibrada de electrolito de una concentración apropiada de sodio, potasio, cloruro o combinaciones de los mismos para mantener una osmolalidad normal. Las soluciones electrolíticas equilibradas incluyen soluciones salinas conocidas usadas en una variedad de composiciones, incluyendo, por ejemplo, terapia de reemplazo de electrolitos del fluido, lavado de tejidos y células, y diluyentes para células y otros factores.
En una realización, por ejemplo, la solución de lavado puede ser una solución isotónica no pirogénica que, por cada 100 mL de solución, hay aproximadamente 526 mg de cloruro de sodio, 502 mg de gluconato de sodio (C6H11NaO7), 368 mg de acetato de sodio trihidratado (C2H3NaO2.3H2O), 37 mg de cloruro de potasio y 30 mg de cloruro de magnesio. Una de tales soluciones isotónicas comercialmente disponibles de electrolitos es vendida como PlasmaLyte A, un producto de Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois.
En otra realización, las células madre mesenquimales se lavan en un aparato que incluye, por ejemplo, una bolsa que provee células, una bolsa de solución de lavado, una bolsa de recirculación del lavado, un filtro de membrana de centrífuga que tiene puertos de entrada y salida, una bolsa de filtrado, una zona de mezcla, una bolsa de producto final para las células lavadas y tubería apropiada. El aparato puede ser un sistema cerrado, reduciendo así el potencial de contaminación.
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tanto El procedimiento de fabricación. Para entender las reacciones adversas asociadas con los productos celulares y de origen animal, tales como la anafilaxia y una enfermedad similar a la enfermedad del suero, en el contexto de la administración intravenosa de composiciones que comprenden MSC, se empleó un modelo animal para determinar el potencial antigénico de los residuos xenogénicos.
5 Se seleccionó ovoalbúmina ("OVA") como una proteína xenogénica representativa, ya que está estructuralmente relacionada con BSA, significativamente más inmunogénica que BSA y tripsina, y se documentó en un número significativo de reportes publicados. BSA tiene un potencial alergénico significativamente menor en comparación con OVA (Hilton J. y colaboradores, Food Chem Toxicol, 1997, 35: 1209).
Se administró OVA mediante inyección sistémica, no mucosa, intraperitoneal (IP) ya que esta ruta se consideró más
10 relevante para la administración intravenosa. Se ha demostrado que las rutas IP e IV de administración de antígenos en animales dan como resultado un resultado similar (Shepard y colaboradores, Infection and Immunity, 1982, 38: 673).
Para el cálculo de las tolerancias de umbral de BSA y de tripsina en una composición farmacéutica de MSC, se seleccionó la dosis acumulativa más baja de OVA que no desencadenó una respuesta de IgE detectable. La dosis de OVA acumulativa más baja que no desencadenó la sensibilización cuando se administra en forma IP es 10 μg/ratón, 15 que corresponde a 500 μg/kg con base en un peso corporal promedio por ratón de 20 g. Por lo tanto, una dosis acumulativa segura de residuos de proteína animal en composiciones farmacéuticas de MSC para pacientes no susceptibles que reciben tratamientos con MSC es de 500 μg/kg. De acuerdo con el límite de seguridad, se podría administrar en forma segura un paciente de 100 kg, una composición farmacéutica de MSC que comprende aproximadamente menos de 50 mg de proteína animal; a un paciente de 40 kg se le podría administrar en forma segura
20 una composición farmacéutica de MSC que comprende aproximadamente menos de 20 mg de proteína animal; o a un paciente pediátrico de 5 kg se le podría administrar en forma segura una composición farmacéutica de MSC que comprende aproximadamente menos de 2,5 mg de proteína animal.
Habiendo reconocido y resuelto el problema asociado con el umbral de exposición IV a los antígenos, se podrían implementar ahora los parámetros para un proceso de fabricación adecuado para producir una composición
25 farmacéutica segura de MSC. Para la terapia que consiste de 2 infusiones intravenosas de 8 x 106 MSC/kg de peso corporal por tratamiento, se calculó un umbral para BSA residual y de tripsina por composición farmacéutica de MSC (830 µg correspondiente a 55 µg/mL) como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Umbrales para sustancias xenogénicas en una composición farmacéutica de MSC para administración IV
Peso corporal del paciente
Dosisacumulativapara residuos Células/kgpor dosis No. detratamientos dehMSC/infusiones Dosis decélulas porinfusión (x106 ) Dosis de célulaspor tratamiento –2 infusiones(x106) Dosis acumulativade células – 3 tratamientos (x 106) No. Total debolsas deproducto final Residuospermitidos por bolsa de productofinal (mg) Cantidadpermitida deresiduos(µg/mL)
5 kg
2,5 mg 8 x 108 3/6 40 80 240 2,5-3 0,831 55,3-66,7
40 kg
20 mg 8 x 106 3/6 320 640 1920 19-20 1-1,05 66,7-70
100 kg
50 mg 8 x 106 3/6 800 1600 4800 48 1,04 69,3
300 kg
150 mg 8 x 106 3/6 2400 4800 14400 144 1,04 69,3
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Ejemplo 2 Pureza de la composición farmacéutica de MSC
Para evaluar los efectos potenciales de las MSC expandidas en cultivo sobre el cambio potencial en la función pulmonar en función de la pureza de la composición farmacéutica de MSC, se preparó una composición farmacéutica de hMSC que consiste esencialmente de: 1) una población de MSC; y, 2) un vehículo consiste de 85% de PlasmaLyte A, 10% de DMSO y 5% de FBS (en volumen).
Los experimentos señalados en este Ejemplo 2 se llevaron a cabo de acuerdo con las Regulaciones de Buenas Prácticas de Laboratorio de la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos codificadas en la norma 21 de CFR 58, excepto que no existía documentación de la concentración, pureza y composición del componente PlasmaLyte del vehículo (adquirido como un componente estéril). La fabricación del artículo de ensayo se realizó de acuerdo con las Buenas Prácticas de Manufactura. La selección de especies y el número de animales analizados fueron respaldados por las guías de la FDA para Estudios de Agudos Ampliados, las Pautas Tripartitas Armonizadas de la ICH, la Guía de la FDA para Terapia Celular Somática Humana y Terapia Génica y procedimientos generalmente aceptados para pruebas farmacológicas preclínicas.
Se cultivó una población de MSC derivada de médula ósea de rata de la siguiente forma. Se enjuagó la médula recolectada con solución amortiguada de Hank. Se combinaron, las células se contaron y se centrifugaron a 100 g durante 10 min. Se sembraron en matraces las células a razón 120 x 106 célula/cm2 en 10% de FBS, 45% de F-12 de Ham, 45% de medio esencial mínimo alfa ("α-MEM") suplementado con 100U/mL de penicilina G y 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina. Se incubaron los matraces en CO2 al 10% a 37°C. Después de 8 días, se retiraron las células no adherentes y las células restantes se separaron con tripsina porcina al 0,05% y EDTA 0,53 mM. Las células adherentes se sembraron nuevamente en placa a razón de 2.000 células/cm2. Se realizaron dos (2) pases subsiguientes a intervalos de 4 días.
Después de la expansión, se obtuvo una alícuota de la suspensión de células para evaluar los niveles residuales de BSA. Se lisaron las células de la alícuota antes de realizar un ELISA para determinar la BSA residual, cuyos resultados se exponen en la Tabla 2. Las MSC en α-MEM fueron entonces congeladas en crioviales que contenían un número conocido de MSC.
Para preparar las formulaciones de dosificación para cada concentración, se calculó el volumen de suspensión final estimado a partir de la concentración deseada de células y el recuento estimado de células por criovial asumiendo una viabilidad del 90% de las MSC. La cantidad de vehículo necesaria para alcanzar el volumen de suspensión final estimado se transfirió a un tubo cónico. Los crioviales que contienen la población de MSC se transfirieron desde el almacenamiento en nitrógeno líquido a un baño de agua hasta que se descongelaron a semilíquidos. Se transfirieron aproximadamente 0,5 mL de vehículo a cada criovial para facilitar la descongelación completa. Se transfirió la población de MSC al tubo cónico en cuyo momento se purificó la población mediante: (A) Centrifugación Básica; o, (B) Filtración centrífuga.
(A)
Centrifugación Básica. Se centrifugó la suspensión de célula/vehículo durante aproximadamente 10 minutos a 500 g de fuerza a 4°C (1480 – 1540, 3.000 RPM en un rotor Beckman GS-6R GH 3.8). Se removió el sobrenadante y se mantuvo en un vial separado. Se resuspendieron las células precipitadas con vehículo si fuera necesario. Se contaron las MSC y se confirmó la viabilidad. Con base en el recuento total de células, se añadió la cantidad de vehículo necesaria para lograr el volumen de suspensión final deseado para proporcionar una composición farmacéutica de hMSC. Se analizaron las composiciones purificadas por centrifugación básica mediante ELISA para determinar la BSA residual, cuyos resultados se exponen en la Tabla 2.
(B)
Filtración Centrífuga. Se lavó la suspensión de células/vehículo durante aproximadamente 25 minutos a temperatura ambiente en un sistema de procesamiento de células Cytomate (vendida por Baxter en 2007) que tiene un filtro de membrana para centrífuga con un tamaño de poro de aproximadamente 4 μm y utilizando una configuración de las veces que se produce una reducción residual (RFR) de 150. Se hizo un recuento de las MSC y se confirmó la viabilidad. Las composiciones purificadas por filtración centrífuga se analizaron mediante un ensayo de ELISA para determinar la BSA residual, cuyos resultados se muestran en la Tabla 3.
Con base en el recuento total de células, se añadió la cantidad necesaria de vehículo para alcanzar el volumen de suspensión final deseado para proporcionar una composición farmacéutica de hMSC. Todas las composiciones farmacéuticas de hMSC se prepararon menos de 4 horas antes de la administración. Se dosificaron los animales a través de catéter femoral. Como se muestra en la Tabla 2 a continuación, las composiciones farmacéuticas de MSC purificadas por filtración centrífuga no demostraron muertes mientras que las composiciones farmacéuticas de MSC purificadas por técnicas de centrifugación tradicionales dieron como resultado una mortalidad del 80%. Se determinó que las causas de muerte fueron por embolia pulmonar.
Tabla 2: Cambios en la función pulmonar como una función de la pureza de la composición farmacéutica de MSC
Grupo A
Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
Número de ratas
10 10 10 10 10
Número de células en infusión
37,5x106 células/kg 37,5 x106 células/kg 75x106 células/kg cero, sólo solución salina cero, sólo vehículo
Método de Purificación
Centrifugación básica Filtración centrífuga Filtración centrífuga n/a n/a
Viabilidad después del lavado (antes de la infusión)
68,7% 67,8% 67,8% n/a n/a
Resultados
7 ratas murieron inmediatamente después de la infusión; 1 muerte después de 24 horas de la infusión; 2 sobrevivieron hasta la necropsia planeada Sin muertes no programadas Sin muertes no programadas Sin muertes no programadas Sin muertes no programa das
De los diversos parámetros estudiados posteriormente, un segundo análisis que compara la cantidad de BSA residual presente en una composición de MSC con los límites del nivel de eventos adversos no observados ("NOAEL"), cuyos resultados se muestran en la Tabla 3, proporcionó los resultados más sorprendentes.
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Tabla 3: Correlación de BSA residual: NOAEL
Método de proceso
BSA residual (µg/mL) Nivel de eventos adversos no observados Número de ratas
Sin procesamiento
26,00 No determinado No determinado
Centrifugación básica
1,29 4 x106 células/kg 10
Filtración Centrífuga
0,13 40 x106 células/kg 120
De las 10 ratas infundidas con una composición de MSC purificada por centrifugación básica a la que se hace referencia en la Tabla 2, 7 ratas murieron inmediatamente después de la dosificación, 1 rata murió al día siguiente de la dosificación y 2 ratas sobrevivieron 14 días hasta la necropsia terminal planificada. Antes de continuar con otros
10 estudios de fase preclínica o clínica, existió el deseo de aumentar el margen de seguridad proporcionado por las composiciones de MSC purificadas por centrifugación básica.
Se realizó una prueba toxicológica adicional sobre composiciones farmacéuticas de MSC purificadas por filtración centrífuga. En este experimento, se administró a 120 ratas 10x106 células/kg, 40x106 células/kg, o 75x106 células/kg. De las 120 ratas estudiadas sólo 2 animales murieron durante el estudio. Para reforzar aún mas los resultados binarios
15 completos (supervivencia total o fatalidad tota) de este experimento se observó también que los animales que recibieron composiciones farmacéuticas de MSC filtradas de forma centrífuga no mostraron casi ningún síntoma clínico, incluso con un nivel de dosis dos veces tan alto (75x106 células/kg) como el fatal cuando se purificó por centrifugación básica.
Después de realizar este experimento, se adaptaron todos los protocolos de procesamiento de células para la filtración centrífuga.
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Como se muestra en la Tabla 3, se encontró que las composiciones de MSC purificadas por centrifugación básica tenían 1,29 µg/mL de BSA residual que dio como resultado una NOAEL de 3 x 106 células/kg. Comparativamente, se encontró que las composiciones de MSC purificadas por filtración centrífuga tenían 0,13 µg/mL de BSA residual que dio como resultado una NOAEL de 40 x 106 células/kg presentando por lo tanto un aumento de aproximadamente 10 veces en los márgenes de seguridad. Como la disminución de aproximadamente 20 veces en BSA residual entre composiciones de MSC no purificadas y composiciones de MSC purificadas por centrifugación no aumentó el límite de NOAEL a una dosis clínicamente significativa (por ejemplo 10x106 células/kg, 40x106 células/ kg, o 75x106 células/kg) y todavía resultó en mortalidad completa a 37,5x106 células / kg, fue bastante sorprendente observar que un aumento adicional de 10 veces en la pureza aumentaría el límite de NOAEL 1 log adicional y también dio como resultado una supervivencia completa de la población analizada de animales.
Al analizar en combinación los residuos de bovinos y porcinos, la filtración centrífuga redujo el nivel residual de proteínas animales aproximadamente 1000 veces con respecto a la centrifugación básica. Esta reducción de 1000 veces aumentó la dosis máxima tolerada para la infusión en bolo de 20 x 106 células/kg hasta 65 x 108 células/kg.
Las fotografías tomadas con un aumento de 10x de una composición de MSC no purificada (Figura 2), una composición de MSC purificada por centrifugación (Figura 3) y una composición de MSC purificada por filtración centrífuga (Figura 4) muestran la tendencia reducida de composiciones de MSC purificadas por filtración centrífuga para formar agregados.
Se describirán a continuación realizaciones adicionales de la presente tecnología descrita; sin embargo, el alcance de la presente tecnología no pretende estar limitado por las mismas. Las realizaciones adicionales de la presente tecnología incluyen:
Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende células madre mesenquimales purificadas, en donde la composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 150 μm.
La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 94, en donde el D90O de dichos agregados es aproximadamente menor a 100 µm
La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 95 en donde el D90 de dichos agregados es aproximadamente menor a 50 μm.
La composición farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los párrafos 94 -96, en donde la viabilidad de las células madre mesenquimales purificadas es aproximadamente mayor a 70%.
La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 97, en donde la viabilidad de las células madre mesenquimales purificadas es aproximadamente mayor a 80%.
La composición farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los párrafos 94-98, que comprenden además dimetilsulfóxido (DMSO).
La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 99 que comprende aproximadamente 10% de DMSO.
La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 99 que comprende aproximadamente 3,8% de DMSO.
[Párrafo 98] Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende células madre mesenquimales purificadas, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 55 µg/mL de albúmina de suero bovina residual y en donde las células madre mesenquimales presentan un D90 entre aproximadamente 18 μm y aproximadamente 30 μm.
La composición del párrafo 102, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 42 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 103, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 25 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 104, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 13 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 105, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 10 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
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La composición del párrafo 146, en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 13 µg/mL de
albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo 147, en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 10 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición de cualquiera de los párrafos 140 -143, en donde dicho suero es suero bovino y dicha composición
comprende entre aproximadamente 7 µg/mL y aproximadamente 15 µg/mL de albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo 149, en donde dicha composición comprende entre aproximadamente 8 µg/mL y aproximadamente 12 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende células madre mesenquimales purificadas, en donde dichas células madre mesenquimales se expanden en cultivo en medios que contienen albúmina de suero bovino; y en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 55 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 151, en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 42 µg/mL de
albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo, en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 25 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 153, en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 13 µg/mL de
albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo, en donde dicha composición comprende aproximadamente menos de 10 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 151, en donde dicha composición comprende entre aproximadamente 7 µg/mL y
aproximadamente 15 µg/mL de albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo 156, en donde dicha composición comprende entre aproximadamente 8 µg/mL y aproximadamente 12 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende células madre mesenquimales purificadas, en donde la
composición comprende aproximadamente menos de 55 µg/mL de albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo 158, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 42 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 159, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 2,5 µg/mL de
albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo 160, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 13 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 161, en donde la composición comprende aproximadamente menos de 10 µg/mL de
albúmina de suero bovino residual. La composición del párrafo 158, en donde la composición comprende entre aproximadamente 7 µg/mL y aproximadamente 15 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
La composición del párrafo 163, en donde la composición comprende entre aproximadamente 8 µg/mL y aproximadamente 12 µg/mL de albúmina de suero bovino residual. La composición de cualquiera de los párrafos 158 -164, que comprende además DMSO. La composición del párrafo 165, que comprende además aproximadamente 10% de DMSO. La composición del párrafo 165, que comprende además aproximadamente 3,8% de DMSO.
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(iv) Recuperar la composición farmacéutica de células madre mesenquimales.
El método del párrafo 185, en donde los agregados de células madre mesenquimales presentan el D90 de aproximadamente menos de 100 μm. El método del párrafo186, en donde los agregados de células madre mesenquimales presentan el D90 de
aproximadamente menos de 5,0 μm. El método de cualquiera de los párrafos 185 -187, en donde dicha composición farmacéutica de células madre
mesenquimales comprende células madre mesenquimales que presentan un D90 entre aproximadamente 18 μm y aproximadamente 30 μm. El método del párrafo 188, en donde dicha composición farmacéutica de células madre mesenquimales comprende
células madre mesenquimales que presentan un D90 entre aproximadamente 18 μm y aproximadamente 25 μm.
El método del párrafo 189, en donde dicha composición farmacéutica de células madre mesenquimales comprende células madre mesenquimales que presentan un D90 entre aproximadamente 20 μm y aproximadamente 25 μm. Una composición que comprende una población de células madre mesenquimales purificadas obtenidas por el método
de cualquiera de los párrafos 185 -190, en donde la viabilidad de las células es aproximadamente mayor al 70%. La composición del párrafo 191, en donde la viabilidad de las células es aproximadamente mayor al 80%. La composición de cualquiera de los párrafos 185 -192, que comprende además DMSO. La composición del párrafo 193, que comprende aproximadamente 10% de DMSO. La composición del párrafo 193, que comprende aproximadamente 3,8% de DMSO. Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende células madre mesenquimales purificadas, en donde la
composición comprende uno o más agregados de células madre mesenquimales y dichos agregados presentan un D90 de aproximadamente menos de 150 μm; y en donde las células madre mesenquimales presentan un D90 entre aproximadamente 18 µm y aproximadamente 30 µm.
La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 196, en donde dichos agregados presentan una D90 de
aproximadamente menos de 100 μm. La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 197, en donde dichos agregados presentan un D90 de aproximadamente menos de 50 μm.
La composición farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los párrafos 196 -198 en donde las células madre
mesenquimales presentan un D90 entre aproximadamente 18 µm y aproximadamente 25 µm. La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 199, en donde las células madre mesenquimales presentan un D90 entre aproximadamente 20 μm y aproximadamente 25 μm.
La composición farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los párrafos 196 -200, en donde dicha composición
comprende entre aproximadamente 7 µg/mL y aproximadamente 15 µg/mL de albúmina de suero bovino residual. La composición farmacéuticamente aceptable del párrafo 201, en donde dicha composición comprende entre aproximadamente 8 µg/mL y aproximadamente 12 µg/mL de albúmina de suero bovino residual.
Un método para seleccionar una suspensión de células que contiene al menos una proteína no humana para administración a un paciente que comprende las etapas de:
(a)
obtener al menos una muestra representativa de dicha suspensión de células;
(b)
determinar el nivel de dicha proteína no humana presente en dicha muestra; e
(c)
identificar dicha suspensión de células como adecuadas para administración a un paciente cuando dicha muestra contiene aproximadamente menos de 42 microgramos de dicha proteína no humana por mililitro.
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El método del párrafo 226, en donde dichas células humanas son células madre mesenquimales. El método del párrafo 226, en donde dicha proteína no humana es albúmina. El método del párrafo 226, en donde dicha proteína no humana es albúmina de suero bovino. El método del párrafo 235 o 236, en donde la etapa (d) comprende:
i. poner en contacto dicha muestra con al menos un anticuerpo anti-albúmina; y
ii.
cuantificar un nivel de albúmina en dicha muestra. El método del párrafo 226, en donde dicha proteína no humana es tripsina. El método del párrafo 226, en donde dicha proteína no humana es tripsina porcina. El método del párrafo 238 o 239, en donde la etapa (d) comprende:
i.
poner en contacto dicha muestra con al menos un agente que se une selectivamente a tripsina; y
ii.
cuantificar un nivel de tripsina en dicha muestra. El método del párrafo 240, en donde dicho al menos un agente es un inhibidor de tripsina. El método del párrafo 240, en donde dicho al menos un agente es un anticuerpo antitripsina. El método del párrafo 238 o 240, en donde la etapa (d) comprende:
i.
poner en contacto dicha muestra con un inhibidor de tripsina inmovilizado para formar un conjugado de inhibidor de tripsina inmovilizado-tripsina
ii.
poner en contacto dicho conjugado inmovilizado con un anticuerpo antitripsina para formar un complejo de inhibidor de tripsina inmovilizado-tripsina-anticuerpo; y
iii. detectar una señal generada por dicho complejo. Un método para fabricar un producto de terapia celular que comprende las etapas de:
(a)
incubar células humanas en una solución que comprende una tripsina no humana;
(b)
añadir un volumen de un vehículo líquido a dichas células para obtener una suspensión de células farmacéuticamente aceptable;
(c)
obtener al menos dos muestras representativas de dicha suspensión de células farmacéuticamente aceptable;
(d)
determinar un nivel de tripsina en una primera muestra;
(e)
incubar una segunda muestra en una solución que comprende al menos un agente que se une selectivamente a tripsina para obtener un control;
(f)
determinar un nivel de tripsina en dicho control;
(g)
comparar el nivel de tripsina en dicha primera muestra con el nivel de tripsina en dicho control para obtener un nivel de tripsina en dicha suspensión de células; y
(h)
retener dicha suspensión de células de células para administración a un paciente cuando dicha suspensión de células contiene aproximadamente menos de 30 microgramos de tripsina por mililitro.
El método del párrafo 244, que comprende además retener dicha suspensión de células cuando dicha suspensión de células contiene aproximadamente menos de 25 microgramos de tripsina por mililitro.
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La suspensión de células del párrafo 259, en donde dicha proteína no humana es tripsina. La suspensión de células del párrafo 259, en donde dicha proteína no humana es tripsina porcina.

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