JP3828905B2 - 局所麻酔薬を含有する細胞凝集抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は細胞移植医療、特に、哺乳動物の皮膚繊維芽細胞等の培養細胞を被験者に注入して皮膚等の細胞欠損を修復する再生医療に用いる細胞の凝集抑制剤に関する。

事故、病気又は老化などによって失われ、又は機能が落ちた体の一部分を生体組織工学と分子細胞生物学の力によって再生させようとする医療（再生医療）が発展を遂げている。皮膚の再生医療はやけどの治療から始まったが、現在では、アンチエイジング、美白、しわや傷跡の修正などの美容医学の分野にまで及んでいる。このような再生医療を行うためには、被験者から採取した生検材料を培養培地中で実質的に免疫原性タンパク質を含まないように培養し、増殖した自己の繊維芽細胞懸濁物を皮下又は皮下組織に注入して美容的欠陥を修正する。かかる方法により、しわ、妊娠線、陥没瘢痕、非外傷性の皮膚の陥没、ならびに唇の形成不全の矯正、修復方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。

被験者へ細胞を投与するためには、例えば、上記繊維芽細胞懸濁物をシリンジに満たし、２７ゲージの注射針を用いて皮膚のできるだけ表面に近い部分に針を挿入し、弱く圧力をかけて皮内注射を行う。多数回または連続的に注射をしてもよい。ところで、繊維芽細胞などの非造血系培養（継代培養）細胞は、高密度の細胞懸濁液の状態のまま一定時間放置すると、細胞が互いに凝集・集合し巨大化してしまい、タンパク分解酵素等を作用させても単細胞浮遊懸濁液に再調整することは困難である。このような凝集した細胞塊は注射針による細胞の注入を困難にし、また被験者に与える苦痛を増大させるという問題点がある。

特表平１１−５１００６９

実際の細胞移植操作において、シングルセル（単細胞）の状態で細胞のバイアビリティー（viability；生物活性能力、生存率）を保ち、一定時間保持することは非常に重要である。すなわち、細胞移植時、細胞はシングルセルの状態でなければならず、特に注射針などを用いて細胞を移植する場合には注射針のノズル内を凝集した細胞塊は通過し得ないからである。また、一旦凝集した細胞塊を再びシングルセルに戻すには、長時間細胞塊を酵素に暴露する必要があるが、こうした長時間の酵素暴露は細胞のバイアビリティーを著しく低下させる。本発明は、かかる問題点を解決するためになされたものであって、再生医療技術などを用いて培養した細胞から調製される培養細胞懸濁液中の細胞の凝集抑制剤を提供することを課題とする。

アミド型、エステル型などの局所麻酔薬は、膜安定化作用、神経伝達ブロック作用などにより、麻酔効果の他、抗不整脈作用もあることが知られ、長年臨床応用されている。本発明者は、この局所麻酔薬を培養細胞懸濁液に添加すると、意外にも細胞の凝集作用が顕著に低下することを見出して本発明を完成した。

すなわち、本発明の凝集抑制剤は、哺乳動物の継代された皮膚繊維芽細胞懸濁液中の細胞の凝集抑制剤として用いられるものであって、局所麻酔薬を含有する。前記局所麻酔薬は、リドカイン、メピバカイン、ジブカイン、ブピバカイン、プロピトカイン、コカイン、プロカイン、クロロプロカイン、テトラカイン及びその薬理的に許容しうる塩からなる群より選択されることを特徴とする。

また、本発明の異なる視点において、ヒト被験者の皮下組織に注入して前記被験者の皮膚欠損を修復するための、自己の継代皮膚繊維芽細胞の懸濁物であって、上記凝集抑制剤を含有する凝集作用の抑制された継代皮膚繊維芽細胞の懸濁物が提供される。この繊維芽細胞懸濁物は、（ａ）被験者の皮膚の生検により得られた皮膚繊維芽細胞を、０．５〜２０％の自己血清を含む培地中で継代培養し、脂肪細胞、ケラチノサイト、及び細胞外マトリクスを実質的に含まない皮膚繊維芽細胞を提供する工程、（ｂ）継代培養した繊維芽細胞をタンパク質分解酵素に暴露して繊維芽細胞を懸濁する工程、及び（ｃ）前記繊維芽細胞懸濁物に０．１〜５％の局所麻酔薬を添加する工程を含む方法によって製造することができる。前記局所麻酔剤はリドカイン、メピバカイン、ジブカイン、ブピバカイン、プロピトカイン、コカイン、プロカイン、クロロプロカイン、テトラカイン及びその薬理的に許容しうる塩からなる群より選択されることを特徴とする。

本発明の細胞凝集抑制剤は、再生（細胞）医療に用いるために調製された哺乳動物の継代された皮膚繊維芽細胞懸濁液中の細胞の凝集を抑制して被験者への注入を容易にし、同時に被験者の苦痛を低減する効果を有する。さらに本発明の上記細胞凝集抑制剤は、従来より医薬品として臨床応用されてきた薬剤であるから安全性はすでに確立されており、調製された細胞懸濁物はそのままの形で安全に生体に投与することができる。

［細胞凝集抑制剤としての局所麻酔薬］
末梢の知覚神経線維に作用して、求心性インパルスの伝導を遮断することにより、意識や反射機能を損なわないで目的とする部分の知覚を鈍麻、又は消失させる薬剤として局所麻酔薬が知られている。局所麻酔薬は、神経線維に作用して細胞の内側からナトリウムイオンの細胞内への流入を抑制し、脱分極阻止（膜の安定化）、活動電位の発生抑制によりインパルス（興奮）の発生、伝導を抑制する。その化学構造からアミド型とエステル型に大きく２つに分けられる。アミド型としてリドカイン（キシロカイン）、メピバカイン、ジブカイン、ブピバカイン、プロピトカイン及びそれらの薬理学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）が挙げられ、また、エステル型としてコカイン、プロカイン、クロロプロカイン、テトラカイン及びそれらの薬理学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。これらの中でも他の局所麻酔薬に比べて安全域が広く、麻酔作用及び細胞凝集抑制作用の何れもが速く、その持続時間も長いことから、リドカイン及びその薬理的に許容しうる塩が特に好ましい。種々の濃度の塩酸リドカインの注射液や外用液、ゼリー、ビスカス、及びスプレー等が、キシロカイン（商品名）としてアストラゼネカ社等から販売されている。

本発明の細胞凝集抑制剤は、種々の剤型のものが使用できるが、例えば、浸潤麻酔、伝達麻酔、静脈内局所麻酔に使用される注射液が好ましい。細胞懸濁液に容易に添加し、所定の濃度となるように混合しやすいからである。これらは通常、生理食塩水に０．５〜５重量％程度のリドカイン等の局所麻酔薬を溶解したものである。本発明の細胞凝集抑制剤は培養細胞の懸濁液と任意の割合で混合して用いることができる。あるいは、遠心分離操作等によりペレット化した細胞を直接懸濁するための懸濁液として用いてもよい。従って、注射液のように滅菌された形態にあることが好ましい。これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる緩衝剤、界面活性剤、保存剤、防腐剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、標準的な方法により製造することができる。また上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであっても良い。

［細胞懸濁物の調製方法］
本発明の細胞凝集抑制剤は、培養細胞の培養液又は増殖させた細胞を酵素処理等により回収した高密度の細胞懸濁液に添加することによって凝集作用の抑制された細胞懸濁物を調製することができる。培養細胞としては、例えば、血小板等の血液細胞や、繊維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、臓器の実質細胞及び幹細胞等の種々の培養細胞に対して用いることができるが、好ましくは通常の培養条件下で紡錘形をなしている繊維芽細胞である。皮膚の繊維芽細胞は容易に得られ増殖させることができる。皮膚繊維芽細胞培養は、例えば、被験者から採取した皮膚の３ｍｍ×５ｍｍ程度の生検材料から開始する。培養を始める前に、生検材料は、抗生物質や抗真菌剤で繰り返し洗浄する。次に、表皮及び皮下の脂肪細胞含有組織を取り、その結果得られる培養物を実質的に非繊維芽細胞を含まないようにし、真皮の試料をメス又はハサミで細切する。検体片をピンセットで組織培養フラスコの乾燥表面上に１つずつ置き、５〜１０分の間付着させ、次に少量の培地を付着した組織断片をはがさないように注意しながらゆっくり加える。２４時間インキュベーションした後、フラスコに追加の培地を入れる。７５ｃｍ^２の組織培養フラスコを使用して培養を開始する時は、培地の初期の量は３〜４ｍｌである。生検検体からの細胞株の樹立には通常２〜３週間かかり、増殖するために、適切な時期に初期の培養容器から細胞をはがすことができる。

培養の初期段階で、組織片が培養容器の底に付着していることが望ましい。付着していない組織片は新しい容器に再度植え込むべきである。当業者に公知の技術により、遺伝子組み換え技術で製造され、動物由来成分を含まないトリプシン様活性を有するセリンプロテアーゼに組織培養物を短時間暴露することにより、繊維芽細胞を刺激して増殖させることができる。セリンプロテアーゼへの暴露は非常に短い時間であるため、培養容器の壁に付着した繊維芽細胞は遊離しない。培養物が樹立されてコンフルエンスに近づいた後に直ちに、繊維芽細胞のサンプルを凍結保存のために取り出すことができる。正常なヒト繊維芽細胞の細胞培養物の継代数は制限されるため、継代数の多い繊維芽細胞より継代数の少ない繊維芽細胞を凍結保存することが好ましい。

繊維芽細胞は、これを保存するのに適した任意の凍結培地中で凍結することができる。７０容量％の増殖培地、２０容量％のヒト血清（保存する細胞と同一個体由来）および１０容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる培地を使用すると良好な効果が得られる。解凍した細胞を使用して二次培養を開始すると、第二の検体を得るという不便さなしに、同じ被験者で使用するための懸濁物を得ることができる。

生検検体からの皮膚の繊維芽細胞の播種に適した任意の組織培養法を、本発明を実施するために、細胞の増殖に使用することができる。当業者に公知の技術は、R.I．Freshney編、ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH（IRL Press，Oxford England，1986）およびR.I．Freshney編、CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES，Alan R．Liss & Co.，New York，1987）に記載されており、これらは参考文献として本明細書に組み込まれる。

この培地は初代繊維芽細胞培養物の増殖に適した任意の培地である。多くの例で、この培地には０．５％〜２０％（ｖ／ｖ）の血清を添加し、繊維芽細胞の増殖を促進する。高濃度の血清は、繊維芽細胞のより速い増殖を促す。好適な実施態様において、血清はヒト血清（保存する細胞と同一個体由来）であり、これは培地の１０％の最終濃度になるよう加える。培地は、例えば、２ｍＭグルタミン、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）のヒト自己血清（保存する細胞と同一個体由来）および抗生物質を添加した、高グルコースＤＭＥＭ（「完全培地」）である。細胞はセリンプロテアーゼ処理により新しいフラスコに継代される。増殖のため、各フラスコに１／３を分けて入れる。三底Ｔ−１５０フラスコ（総培養面積４５０ｃｍ^２）が、本発明の実施に適している。三底Ｔ−１５０（総培養面積４５０ｃｍ^２）は、約６×１０^６個の細胞を接種して、約１．８×１０^７個の細胞を産生する能力を有する。

インキュベーションの最後に、細胞をセリンプロテアーゼによって組織培養フラスコからはがし、遠心分離でペレット化したものを生理食塩水に再懸濁してさらに充分に洗浄し、注入のために等量の０．２〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％、最も好ましくは約２重量％キシロカイン注射液で懸濁する。容量いっぱいに増殖させた三底Ｔ−１５０フラスコからは、約１０^７個の細胞が産生され、これは約０．３ｍｌの懸濁物を作製するのに充分である。

［被験者への細胞懸濁物の投与］
本発明の細胞懸濁物は通常の外科的手法により被験者の体内、特に顔へ注入することができる。具体的には、注入希望部位に、所望により局所麻酔薬含有テープ（例えば、ペンレス（商品名））を貼って１５分程度放置する。急ぎの場合はこの過程は省略可能である。次に、上述した方法により調製した細胞懸濁物を、例えば、２７ゲージの注射針を付けたシリンジで皮下に注入する。注入量の目安としては、１ｍｌ（３×１０^７個の細胞）はおよそ皮膚表面積の６〜１０ｃｍ^２に注入可能な量である。具体的には、片側下眼瞼全体で約０．３ｍｌ〜０．６ｍｌ使用する。

本発明は以下の実施例により、さらに具体的に説明されるが、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、機能的に均等な方法及び成分は本発明の範囲に含まれる。

通常の方法で培養したヒト真皮繊維芽細胞を、酵素（トリプシンＥＤＴＡ）を用いて回収し以下の実験に使用した。ヒト真皮繊維芽細胞と（１）生理食塩水、（２）牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培地、又は（３）キシロカイン（１重量％）を添加した生理食塩水とを用い細胞浮遊液を作製した。各細胞浮遊液は、室温（約２６℃）、又は冷蔵（４℃）にて静置し、培養細胞の生物活性の変化、細胞の凝集状態の変化を経時的（１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び１２時間）に観察した。

その結果を以下の表１〜４、及び図１及び２に示す。表１は、室温で保存したときの培養細胞浮遊液の凝集、集合状態を倒立顕微鏡で観察した結果をまとめたものである。表中、＋は細胞の凝集の度合いを示したもので＋の数が多いほど激しく凝集することを表わす。一方、−はほとんど細胞が凝集せずにシングルセルとして浮遊している状態を示す。なお、表中、生理食塩水に浮遊させた細胞の６０分後の状態（＋＋＋）を倒立顕微鏡（１００倍）で観察した結果を図１に、また、キシロカイン添加生理食塩水に浮遊させた細胞の６０分後の状態（−）を倒立顕微鏡（１００倍）で観察した結果を図２にそれぞれ示した。図１及び２に示したように、生理食塩水に浮遊させた細胞は明らかに凝集が起こる（図１）のに対し、キシロカイン添加生理食塩水ではほとんど凝集が起こっていない（図２）ことが分かる。

次に、各細胞浮遊液を冷蔵保存（４℃）したときの結果を表２にまとめた。室温に比べて凝集は起こりにくくなるが、キシロカインを添加した場合と添加しなかった場合とでは明らかに差が認められた。

続いて、上記室温及び冷蔵のそれぞれの条件で保存した場合の細胞の生物活性保持状態をトリパンブルー染色法にて調べた。すなわち、細胞懸濁液０．０５〜０．１ｍｌに対し等量のトリパンブルーを添加し、約１分間放置した後、顕微鏡で検査を行った。単位体積（１×１０^−４ｍｌ）あたりの染色細胞と非染色細胞の比からバイアビリティー（生存率）を計算した。生存している細胞は細胞膜が機能しているために細胞質は染色されないが、死滅した細胞では細胞膜が機能しないために細胞質に色素（トリパンブルー）が入り込み染色される。そこで、次式により細胞のバイアビィティーを計算した。
（非染色細胞数／全体の細胞数）×１００

その結果を以下の表３及び４に示す。室温で７２０分保存した場合、バイアビィティーは約９０％とやや低下するが、それ以外の条件下では９５％以上のバイアビリティーがあることが分かった。

実施例１において、生理食塩水中で６０分間静置したヒト真皮繊維芽細胞の顕微鏡写真（１００倍）である。 実施例１において、キシロカイン（１重量％）を添加した生理食塩水中で６０分間静置したヒト真皮繊維芽細胞の顕微鏡写真（１００倍）である。

Claims (6)

1. リドカイン、メピバカイン、ジブカイン、ブピバカイン、プロピトカイン、コカイン、プロカイン、クロロプロカイン、テトラカイン及びその薬理的に許容しうる塩からなる群より選択される何れかの局所麻酔薬を含有することを特徴とする哺乳動物の継代された皮膚繊維芽細胞懸濁物用凝集抑制剤。
2. 前記局所麻酔薬が、塩酸リドカインである請求項１に記載の凝集抑制剤。
3. 前記局所麻酔薬が、皮膚繊維芽細胞懸濁物中に０．１〜５重量％添加される請求項１又は２に記載の凝集抑制剤。
4. ヒト被験者の皮下組織に注入して前記被験者の皮膚欠損を修復するための、自己の継代皮膚繊維芽細胞の懸濁物であって、請求項１〜３の何れかに記載の凝集抑制剤を含有することを特徴とする凝集作用の抑制された継代皮膚繊維芽細胞懸濁物。
5. 被験者へ注入する際に、被験者の痛みが低減されることを特徴とする請求項４に記載の継代皮膚繊維芽細胞懸濁物。
6. （ａ）被験者の皮膚の生検により得られた皮膚繊維芽細胞を、０．５〜２０容量％の自己血清を含む培地中で継代培養し、脂肪細胞、ケラチノサイト、及び細胞外マトリクスを実質的に含まない皮膚繊維芽細胞を提供する工程、
   （ｂ）継代培養した繊維芽細胞をタンパク質分解酵素に暴露して繊維芽細胞を懸濁する工程、及び
   （ｃ）前記繊維芽細胞懸濁物に０．１〜５重量％の局所麻酔薬を添加する工程
   を含み、前記局所麻酔剤がリドカイン、メピバカイン、ジブカイン、ブピバカイン、プロピトカイン、コカイン、プロカイン、クロロプロカイン、テトラカイン及びその薬理的に許容しうる塩からなる群より選択されることを特徴とする凝集作用の抑制された継代皮膚繊維芽細胞懸濁物の製造方法。

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