KR101743488B1

KR101743488B1 - 비피더스균 추출물을 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 및 피부세포 증식용 조성물

Info

Publication number: KR101743488B1
Application number: KR1020100120371A
Authority: KR
Inventors: 심중현; 김지현; 조성아; 민대진; 김한곤; 이태룡; 노민수; 신동욱
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2017-06-07
Also published as: CN102477410A; CN102477410B; KR20120058864A

Abstract

상기 목적을 달성하기 위해, 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 조성물 및 피부세포 증식용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하여 지방유래 줄기세포의 줄기세포성을 증진시킴으로써 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가에 유용하다. 그래서, 본 발명의 조성물은 피부 볼륨감을 증진시키고, 지방유래 줄기세포 재생을 촉진시키고 손상된 피하지방의 기능을 회복시켜 주므로 피부 볼륨감 증대용 미용 또는 성형용 조성물로 활용 가능하고, 피부 볼륨감 증대용 피부외용제 조성물로 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 표피의 재생에 관여하는 피부 표피 기저층의 각질 줄기세포와 전이-증폭세포의 증식을 촉진할 수 있으므로 피부세포의 재생을 촉진할 수 있다.

Description

비피더스균 추출물을 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 및 피부세포 증식용 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR PROMOTING THE STEMNESS OF ADIPOSE-DERIVED STEM CELL AND PROLIFERATING SKIN CELL CONTAINING BIFIDOBACTERIA EXTRACTS}

본 발명은 지방유래 줄기세포의 특성을 유지 및 증진하게 하는 줄기세포성 증진용 조성물 및 피부세포 증식용 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체를 구성하고 있는 기관 중 가장 큰 기관으로, 우리 몸 부피의 약 16 %를 차지하고, 면적이 1.8 m², 두께가 2~4 mm, 무게가 약 3 kg이며, 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성되어 있다. 이러한 피부는 외부 환경과 직접 접하고 있으면서 인체 유해 미생물과 같은 다양한 유해인자들과 자외선 등과 같은 외부 자극으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 영위하는 생명유지에 필수 불가결한 기관이다. 특히, 진피 아래에 존재하는 피하지방층은 지방세포(adipocyte)의 소엽으로 구성되어 있는데, 외부의 열에 대해 피부 내부의 기관의 보호 및 충격을 흡수하는 쿠션 역할을 하며 영양성분을 트리글리세라이드(Triglyceride)의 형태로 지방체(Lipid droplet)라는 세포 소기관에 저장하여 필요시 에너지원으로 사용하기도 한다. 그러나 나이가 들어감에 따라 자연적인 요인과 각종 외부 자극에 의해 피부는 손상을 입게 되는데, 특히 진피에서 탄력을 담당하는 교원섬유(콜라겐), 탄력섬유(엘라스틴)의 활성 및 발현이 저하되며 탄력이 줄어듦과 동시에, 피하지방에서도 지방생성이 감소함으로써 결국에는 피부 전반적으로 각 구성 세포들의 본래 기능이 제대로 이루어지지 않게 된다. 그래서, 현재 널리 사용되고 있는 방법이 지방이식수술로 이는 튜립 니들(tulip needle) 모양의 끝이 날카롭지 않은 바늘을 갖는 주사기를 이용하여 자신의 지방을 채취해 탄력이 떨어져 보이는 피부의 각 부위에 이식하는 수술이다. 그러나, 지방이식수술 이후에 이식 부피의 40~60%가 다시 인체 내에 흡수된다는 것이 보고된 바 있고, 피부가 얇고 피하지방이 적은 부위에서의 지방이식수술은 세포 덩어리가 만져지는 등의 문제가 제기되며, 실제로 이식한 지방의 생존율과 생존기간이 기대에 미치지 못해 재이식이 필요한 경우가 발생한다. 이러한 문제점들이 있는 지방이식수술을 대체하면서 피하지방층을 충분히 증가시킬 수 있는 조성물에 대한 요구가 높아지고 있다. 최근 피부 탄력 감소 원인인 콜라겐과 엘라스틴의 감소를 억제하려는 목적으로 개발되어 사용되고 있는 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드는 탁월한 탄력개선 효과를 나타내지만, 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가진다. 따라서 최근 들어 이러한 원료들의 피부 자극 문제를 해소하기 위해 보다 안전하고 피부에 자극이 없는 원료를 이용한 화장품 개발에 대한 요구가 높아지고 있다.

피부의 기본적인 구조는 피하지방조직에 의해서 유지되고, 이러한 피하지방조직은 피부의 볼륨과 강도를 좌우하는 역할을 하므로, 지방조직의 부피를 증가시키는 것이 피부의 볼륨감 유지에 좋은 해결책이 될 수 있으므로, 피부의 볼륨감 유지 및 증진을 위해 피부 자극이 없으면서 지방조직의 부피를 증가시킬 수 있는 조성물의 개발이 필요한 실정이었다.

한편, 피부의 가장 바깥에 위치하는 표피(epidermis)에서 재생능력을 보이는 것으로 알려진 것은, 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포(Keratinocyte stem cells, KSC)이다. 각질 줄기세포가 지속적으로 분열하여 크게 두 가지 세포를 생성하는데, 하나는 자기 복제(self-renewal)를 하여 만드는 똑같은 줄기세포이고, 다른 하나는 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)이다. 전이-증폭 세포들은 더욱 증폭하고, 초기 분화하여 각질 세포(Keratinocyte cells)가 되고, 계속 분화가 진행되어 이들은 피부 표면으로 밀려 올라간다. 이 과정에서 각질 세포는 분화(Differentiation)와 각화(Keratinazation)를 일으키면서 각질층을 이루게 되며, 3~4주 후에는 각질층에서 떨어져 나간다.

상기 각질 줄기세포 및 전이-증폭세포는 보통 기저층 세포들의 약 4-7% 정도로 극히 낮은 수로 분포되며, 각질 줄기세포의 수를 증가시키는 것은 전이-증폭 세포의 수를 증가시키는 것보다 쉽지 않으며, 상대적으로 더 넓은 지역에 분포되어 있지 않아 연구에 많은 어려움이 따른다. 그래서, 각질 줄기세포 및 전이 증폭세포의 증식 능력을 보이는 조성물의 개발이 필요한 실정이었다.

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 피부에 자극이 없으면서 지방조직을 증가시킬 수 있는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성을 증진시키고 피부 볼륨감을 증가시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 각질 줄기세포 및 전이-증폭세포를 증식시키면서 피부세포 재생 능력을 보이는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 증식용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증대용 피부 미용 또는 성형용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증대용 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 피부에 비피더스균 추출물을 처리하는 것을 포함하는 피부세포 증식 촉진에 의한 피부 미용 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하여 지방유래 줄기세포의 줄기세포성을 증진시킴으로써 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가에 유용하다. 그래서, 본 발명의 조성물은 피부 볼륨감을 증진시키고, 지방유래 줄기세포 재생을 촉진시키고 손상된 피하지방의 기능을 회복시켜 주므로 피부 볼륨감 증대용 미용 또는 성형용 조성물로 활용 가능하고, 피부 볼륨감 증대용 피부외용제 조성물로 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 표피의 재생에 관여하는 피부 표피 기저층의 각질 줄기세포와 전이-증폭세포의 증식을 촉진할 수 있으므로 피부세포의 재생을 촉진할 수 있다.

도 1은 비피더스균 추출물의 처리 하에 지방유래 줄기세포의 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 2는 지방유래 줄기세포에 산화 스트레스를 가한 후 비피더스균 추출물을 처리하여 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 특징을 대표하는 유전자의 발현양상을 비교한 그래프이다.
도 3은 지방유래 줄기세포에 산화 스트레스를 가한 후 비피더스균 추출물을 처리하여 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 특징을 대표하는 단백질의 발현양상을 비교한 그래프이다.
도 4는 비피더스균 추출물의 처리 하에 피부 각질세포의 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 5는 피부 각질세포에 자외선을 가한 후 비피더스균 추출물을 처리하여 피부 각질세포의 줄기세포성 특징을 대표하는 유전자의 발현양상을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 줄기세포성(stemness)이란 줄기세포의 자기재생능력과 항상성을 지니며 줄기세포의 활성이 있는 상태를 말하며 줄기세포성 증진이란 줄기세포의 활성이 증가하는 것을 의미한다.

비피더스균(Bifidobacteria 속), 상세하게는(Bifidobacteria lysate)은 인체에 유용한 대사 산물을 만들어내고 식품 원료로도 사용될 정도로 안전한 균이다.

본 발명의 비피더스균 추출물은 비피더스균을 배양하여 호모게나이저로 세포를 파쇄하여 얻는다. 이 추출물은 비피더스균의 대사성분, 세포질, 세포벽성분, 다당체 등이 함유되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 지방유래 줄기세포(Adipose derived stem cell: ADSC)는 인간의 지방유래 줄기세포(human adipose derived stem cells, hADSCs)이다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 지방조직을 증가시켜서 피부에 볼륨감을 증대시킨다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 지방유래 줄기세포 표지마커인 분화 클러스터 29(Cluster of Differentiation 29: 이하 CD29), 분화 클러스터 44(Cluster of Differentiation 44: 이하 CD44), 분화 클러스터 73(Cluster of Differentiation 73: 이하 CD73) 또는 분화 클러스터 105(Cluster of Differentiation 105: 이하 CD105)의 발현량을 증가시킬 수 있다. 음성 대조군과 비교하여 CD29, CD44, CD73 또는 CD105의 발현량 증가는 지방유래 줄기세포의 활성이 증가된다는 것을 의미한다. CD29는 인테그린 베타 1(integrin beta 1)의 다른 이름으로 지방 유래 줄기세포의 표지 마커이고, CD44는 Wnt 시그날링(signaling) 활성을 통해 지방 유해 줄기세포의 활성을 증가시킨다. CD73은 5'-뉴클레오타이다제(5`-nucleotidase)의 다른 이름으로 뉴클레오타이드를 뉴클레오사이드로 전환시키는 효소이고 지방유래 줄기세포의 표지마커이고, CD105는 엔도그린(Endoglin)의 다른 이름으로 TGFb의 리셉터의 한 부분으로 지방유래 줄기세포의 표지마커이다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량% 함유할 수 있고, 상세하게는 0.0001~0.1 중량%, 더욱 상세하게는 0.0001~0.001 중량%를 함유할 수 있다. 0.0001 중량%미만이면 효과가 미미하고, 10 중량%이상이면 세포독성을 나타내는 문제가 있다.

본 발명의 일 실시예는 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 증식용 조성물을 제공한다.

상기 피부세포는 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cell: 이하 KSC) 또는 전이 증폭 세포(Transit-Amplifying cell: 이하 TA cell)이다.

상기 조성물에 의하면 전이-증폭 세포의 증식 촉진에 의해 피부 표피를 재생시킬 수 있으며, 전이-증폭 세포는 각질 줄기세포와 함께, 끊임없는 세포 분열을 통해 각질세포 탈락에 의한 표피 손실을 극복하고, 표피를 재생시키는 역할을 할 수 있다. 그래서, 상기 조성물은 피부를 재생시키거나 피부 노화를 방지할 수 있다.

또한 본 명세서에 정의된 용어 “피부 재생”은 전반적인 피부 노화 및 피부 표피 등에 유발된 상처 등에 대응하여 새로운 각질세포를 생성하는 능력을 포함하는 광의의 개념이다.

구체적으로, 피부 재생은 피부 표피의 기저층에 존재하는 각질 줄기세포의 분열에 의해 생성된 전이-증폭 세포들이 더욱 증폭하고, 초기 분화하여 각질 세포가 되고, 피부 표면으로 밀려 올라가 분화(Differentiation)와 각화(Keratinazation)를 일으키면서 각질층을 이루게 되는 모든 과정을 의미한다. 그 중에서 피부 재생의 핵심 과정은 기저층에 존재하는 각질 줄기세포와 이 세포의 딸세포인 전이-증폭 세포의 증식에 있다. 피부의 겉부분만이 소실되는 `찰과상', 긁혔을때 나타나는 `열상', 불에 의한 화상 등 외부의 물리적, 화학적 환경에 의해 일어나는 피부 손상이 일어났을 때, 이를 빠른 시간에 회복하기 위해서는 피부 기저층에 존재하며 피부 재생을 담당하고 있는 각질 줄기세포와 전이-증폭세포들의 활발한 증식이 필요하다. 보통 어릴때는 피부 손상이 일어나더라도 흉터가 남지 않는 반면, 나이가 들어 피부 손상이 일어나게 되면 흉터가 남는 이유도 피부 재생에 필요한 각질 줄기세포와 전이-증폭 세포의 증식의 수준 정도가 나이 정도에 따라 현저하게 낮아지기 때문이다. 즉, 노화가 진행하게 되면, 이러한 세포들의 증식 정도가 낮아지게 되며, 이는 피부 재생 능력이 감퇴하는 것으로, 상처 등의 회복이 지연되거나, 피부 탄력 감소가 심화될 수 있다.

상기 피부세포 증식용 조성물을 이용해 증식된 피부세포를 각질 줄기세포를 필요로 하는 개체에 이식할 수 있다.

본 발명자들은 하기의 시험예를 통해 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 비피더스균 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부세포 증식용 조성물을 피부 각질 세포에 적용하여서, 각질줄기세포 표지 마커의 발현이 유효하게 증가함을 밝혀내었다.

상기 각질줄기세포는 피부 표피 기저층의 약 4-7% 정도로 극히 낮은 수로 분포되어 있어, 앞서 언급한 바와 같이 표피를 재생시키는 데 중요한 역할을 담당한다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물에 의한 각질 줄기세포수의 증가를 통해, 상처 회복을 위한 피부 재생 능력을 향상시키고, 피부 재생 능력 감퇴로 인한 피부 탄력 감소 및 피부 노화의 심화를 방지할 수 있다.

상기 조성물은 분화 클러스터 71(Cluster of Differentiation 71:이하 CD71) 및 α6 인테그린(α6 integrin)를 발현하는 전이-증폭 세포의 표지 마커의 발현을 증가시킬 수 있으며, 상기 CD71 및 α6 인테그린은 전이-증폭 세포에 특이적인 표지 마커 단백질들이다.

상기 CD71 단백질은 트랜스페린(Transferrin) 수용체라고도 하며, 기저층에만 존재한다. 구체적으로, 상기 CD71 단백질은 세포 혈류를 타고 흐르는 철분과 결합되는 트랜스페린(transferring) 단백질과 상호작용을 하여, 수용체 매개 트랜스페린 함입 (receptor mediated transferrin endocytosis)이라는 과정을 거쳐, 세포 내에 철분을 공급하는 역할을 한다. 활성화되고 있는 세포나, 증식하는 세포는 세포 내에 철분을 많이 필요로 하는데, 이때 CD71 단백질의 발현이 증가할 수 있다.

상기 α6 인테그린은 세포의 상호 전달(cellular communication)을 매개하고, 세포 이동, 증식 및 분화 같은 다양한 영역의 세포 기능에 영향을 미칠 수 있으며, α6 인테그린이 발현되지 않는 경우 심각한 피부 수포가 발생할 수 있다.

프로테인 63(protein 63: 이하 p63)은 대표적인 각질줄기세포마커(Keratinocyte stem cell marker)로서 줄기세포에서만 특이적으로 발현되는 단백질이다. p63이 완전히 결핍된 쥐의 경우 아예 표피가 생성되지 않고 발생기간 중에 사망하며, 활성을 절반으로 줄일 경우 피부 전반에 이상이 생기고 노화가 촉진되어 수명이 30% 단축된다. 인간에서 p63의 돌연변이가 생기면 발생 단계에서 표피를 형성하는 외배엽(Ectoderm)층이 제대로 발달되지 않아 구개 파열 및 손, 발가락 기형을 초래하는 이이씨 신드롬(EEC Syndrome; Ectrodactyly Ectodermal dysplasia Cleft lip Syndrome)을 일으킨다. 이상의 연구들을 보면 p63이 표피줄기세포의 활성 조절과 표피층의 재생에 매우 중요한 역할을 하는 것은 명확하다. 본 발명의 조성물은 상기 각질 줄기세포 마커인 p63의 발현량을 증가시킨다.

본 발명의 일 실시예는 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증대용 피부 미용 또는 성형용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량% 함유할 수 있고, 상세하게는 0.0001~0.1 중량%, 더욱 상세하게는 0.0001~0.001 중량%를 함유할 수 있다. 0.0001중량% 미만이면 효과가 미미하고, 10 중량%이상이면 세포독성을 나타내는 문제가 있다.

상기 조성물은 비제한적인 예로 유방 조직 형성을 통한 가슴 확대, 미세지방 이식술, 자가지방 이식술 등 얼굴에 피부 볼륨감을 증진시켜 팔자 주름 및 미간주름 제거 및 탄력 유지를 목적으로 사용할 수도 있다.

상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 주사용 제형은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 그러나, 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 특정 부위에 직접 투여할 수 있다. 이때, 조성물의 주입은 주사기를 이용하여 이루어진다. 상기 조성물의 1일 투여량은 1× 10⁵ 내지 1× 10⁷세포/kg 체중, 바람직하게는 5× 10⁵내지 5× 10⁶ 세포/kg 체중이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 분화 및 증식시키고자 하는 지방세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예는 비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증진용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 유연 화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 에센스, 영양크림, 팩 등의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투업 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지2.5mg/kg/일이다.

본 발명에 의한 지방유래 줄기세포의 줄기세포성을 증진시키는 조성물의 적용 부위는 신체의 모든 지방 조직을 포함하며, 특정 부위에 한정하지는 않지만, 예를 들면, 지방층이 적은 얼굴 부위를 포함할 수 있다. 또한 상기 지방조직의 증가 효과로는 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가 효과로 인해 피부 볼륨감 증가 효과가 있고, 피부 탄력 증대 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 재생 효과, 피부 노화 방지 효과 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예는 피부에 비피더스균 추출물을 처리하는 것을 포함하는 피부세포 증식 촉진에 의한 피부 미용 방법을 제공한다. 상기 비피더스균 추출물은 비피더스균을 배양하여 호모게나이저로 세포를 파쇄하여 얻은 추출물이다.

상기 피부세포 증식은 생체 외에서 수행될 수 있고, 증식된 피부세포는 각질줄기세포를 필요로 하는 개체에 이식될 수 있다.

이하 하기 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[시험예 1] 비피더스균 추출물의 인간 지방유래 줄기세포 및 피부 각질세포에서의 세포독성 파악

지방유래 줄기세포를 75 cm² T-flask에 계대배양을 하여, CO₂ 배양기 (CO2 Incubator)에서 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양을 하였다. 통상적으로 두 번째 또는 세 번째에서 세포의 계대 배양(passage)을 진행하였다.

인간의 지방유래 줄기세포(human adipose derived stem cells, hADSCs)를 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 비피더스균 추출물의 세포독성을 파악하기 위하여 0.0001~10%의 농도로 처리하고 세포독성 정도를 CCK-8키트 (Dojindo)를 이용하여 확인하였다. 비피더스균은 CLR-Chemisches Laboratorium Dr. Kurt Richter GmbH사의 Repair Complex CLR^TM PF원료를 구입하여 사용하였다(INCI name=Bifida Ferment Lysate). 도 1의 결과를 보면, 0.001%의 농도 처리시 세포독성 없이 약 10% 정도의 세포분열 증진 효과를 확인할 수 있었다.

피부 각질세포를 75 cm² T-flask에 계대배양을 하여, CO₂ 배양기 (CO2 Incubator)에서 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양을 하였다. 통상적으로 두 번째 또는 세 번째에서 세포의 계대 배양(passage)을 진행하였다.

인간의 피부 각질세포(keratinocyte)를 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 비피더스균 추출물의 세포독성을 파악하기 위하여 0.0001~10%의 농도로 처리하고 세포독성 정도를 CCK-8키트 (Dojindo)를 이용하여 확인하였다. 도 4의 결과를 보면, 0.0001~0.1%의 농도범위 내에서 세포독성 없이 약 10% 정도의 세포분열 증진 효과를 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 지방유래 줄기세포 및 피부줄기세포/전이-증폭세포 표지 마커 유전자의 발현 수준에 대한 비피더스균 추출물의 효과 측정

지방유래 줄기세포의 산화스트레스는 과산화수소수 (H₂O₂)를 200 uM 농도로 24시간 처리하였고, 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진효과를 파악하기 위해서 비피더스균 추출물을 5%로 배지에 첨가하였다. 피부 각질세포의 경우, UVB를 100mJ/cm²로 조사한 후 비피더스균 추출물을 처리하였다.

2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 이후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다.

지방유래 줄기세포에서 CD29, 44, 73, 105 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan^® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) (CD29 유전자 프라이머: Hs00559595_m1, CD44 유전자 프라이머: Hs01075861_m1, CD73 유전자 프라이머: Hs01573922_m1, CD105 유전자 프라이머: Hs00923996_m1)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

피부 각질 세포에서 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드 바이오 시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan^®gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) (α6 인테그린 유전자 프라이머: Hs01041011_m1, CD71 유전자 프라이며: Hs00951083_m1, p63 유전자 프라이머: Hs00978340_m1)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 각 유전자의 발현 양이 음성대조군 대비, 약 2.5~4배 정도 증가함을 확인하였다. 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.

[시험예 3] 유세포 분석을 통한 지방유래 줄기세포의 측정

인간 지방유래 줄기세포를 0.25 % 트립신 (Trypsin -EDTA)으로 75 cm² Ti 플라스크로부터 분리한 뒤 1500 rpm에서 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 뒤에 3 ml의 차단버퍼: Blocking buffer, 2% 우태아혈청(Fetal calf serum: FCS), 2% 소의 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin(BSA) KGM-2)을 넣어주어 세포를 현탁하였다.

4°C에서 15분 동안 세포 (약 10⁶개의 세포)를 적응시킨 다음, PE-Cy(phycoerythrin-cyanine)가 부착된 CD29 항체(Cat No. 559882) (BD Pharmingen, CA, US)을 각각 100: l로 넣어주어, 4°C 하에서 45분 동안 반응시켰다. 한편, 음성 대조군으로 사용되는 세포에는 PE-Cy5 mouse IgG1 k 아이소타이프(Cat No. 555750)를 역시 100: l로 넣어주어, 4°C 하에서 45분 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후 3 ml의 워싱 버퍼(2% Bovine Serum Albumin (BSA) KGM-2)로 두 번 세척한 후, 세포를 현탁하였다. 이후 FACSCalibur(BD Bioscience, San Jose, CA, U.S)로 지방유래 줄기세포에서 CD29를 발현하는 세포들의 숫자의 변화를 관찰하고, 이를 도 3, 표 1에 나타내었다.

	음성대조군	비피더스균 추출물
CD29를 발현하는 지방유래 줄기세포	2558	3030
CD29를 발현하는 지방유래 줄기세포	증가 %	19%

도 3, 표 1을 참조하면, 음성대조군에 비해서 CD29는 19% 증가하였음을 확인할 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제형예 및 제제예를 예시한다.

[제형예 1] 유연화장수

상기 비피더스균을 함유하는 유연화장수 제형을 하기 표 2에 나타낸 조성으로 통상의 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
베타인	3.0
낫토검	3.0
셀룰로오스검	0.005
에탄올	10.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.2
초산토코페롤	2.0
비피더스균 추출물	10
방부제	미량
색소	미량
향	미량
정제수	잔량

[제형예 2] 영양화장수

상기 비피더스균을 함유하는 영양화장수 제형을 하기 표 3에 나타낸 조성으로 통상의 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
세틸에틸렌헥사노에이트	4.0
세토스테아릴알콜	1.0
친유형모노스테아릴산스테아레이트	1.0
스쿠알란	0.5
비피더스균 추출물	5.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
카르복시비닐폴리머	0.2
방부제	미량
색소	미량
향	미량
정제수	잔량

[제형예 3] 크림

상기 비피더스균을 함유하는 크림 제형을 하기 표 4에 나타낸 조성으로 통상의 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
글리세릴스테아레이트	3.0
폴리솔베이트 60	1.0
세토스테아레이트	2.5
밀납	1.0
스쿠알란	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
세틸에틸헥사노에이트	0.5
유동파라핀	5.0
유효성분혼합물	5.0
글리세린	3.0
프로필렌글리콜	3.0
비피더스균 추출물	5.0
방부제	미량
색소	미량
향	미량
정제수	잔량

[제제예 1] 정제

본 발명에 따른 비피더스균 추출물 추출물 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[제제예 2] 캡슐제

본 발명에 따른 비피더스균 추출물 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 미용 조성물로서,
상기 비피더스균 추출물은 비피다 발효 용해물(Bifida Ferment Lysate)인 것인, 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 미용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 줄기세포는 인간의 지방유래 줄기세포(human adipose derived stem cells: 이하 hADSCs)인 것을 특징으로 하는 줄기세포성 증진용 미용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 지방조직을 증가시켜서 피부에 볼륨감을 증진시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 증진용 미용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 지방유래 줄기세포 표지마커인 CD29, CD44, CD73 또는 CD105의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 증진용 미용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포성 증진용 미용 조성물.
비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 증식용 미용 조성물로서,
상기 비피더스균 추출물은 비피다 발효 용해물(Bifida Ferment Lysate)인 것인, 피부세포 증진용 미용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 피부세포는 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cell: 이하 KSC) 또는 전이 증폭 세포(Transit-Amplifying cell: 이하 TA cell)인 것을 특징으로 하는 피부세포 증식용 미용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 피부를 재생시키거나 피부 노화를 방지시키는 것을 특징으로 하는 피부세포 증식용 미용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 각질 줄기세포 표지마커인 p63 의 발현량을 증가시키거나, 전이 증폭 세포 표지 마커인 CD71 또는 α6인테그린의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부세포 증식용 미용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부세포 증식용 미용 조성물.
비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증대용 피부 미용 조성물로서,
상기 비피더스균 추출물은 비피다 발효 용해물(Bifida Ferment Lysate)인 것인, 피부 볼륨감 증대용 피부 미용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증대용 피부외용제 조성물로서,
상기 비피더스균 추출물은 비피다 발효 용해물(Bifida Ferment Lysate)인 것인, 피부 볼륨감 증대용 피부외용제 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물
비피더스균 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 볼륨감 증대용 성형용 조성물로서,
상기 비피더스균 추출물은 비피다 발효 용해물(Bifida Ferment Lysate)인 것인, 성형용 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 비피더스균 추출물 0.0001~10중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 성형용 조성물.