CN109689074A - 采用多能干细胞的缺血再灌注肺损伤的减轻及治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供在再生医疗中使用多能干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。本发明提供包含自活体的间充质组织或培养间充质细胞分离得到的SSEA‑3阳性的多能干细胞的用于减轻和治疗缺血再灌注肺损伤的细胞制剂及医药组合物。本发明的细胞制剂基于通过向具有上述疾病的对象给予Muse细胞而植入肺组织，减轻和治疗上述疾病的机理。

Description

采用多能干细胞的缺血再灌注肺损伤的减轻及治疗
技术领域
本发明涉及再生医疗中的细胞制剂。更具体来说，本发明涉及含有多能干细胞的对缺血再灌注肺损伤的治疗有效的细胞制剂及新的治疗方法。
背景技术
一般来说，组织缺血是由于组织中的缺氧以及炎症诱发性细胞因子、特别是TNF-α、和IL-1β、IL-6及IL-10的诱导，导致可能会引发细胞功能障碍及坏死的化学现象。如果血流恢复(再灌注)，则会发生导致进一步损伤的另一系列现象，这些现象被认为大部分是由自由基形成引起，由在再灌注部位被激活的嗜中性粒细胞带来。大多数情况下，再灌注损伤特别是发生短时间缺血的情况下，比缺血损伤更严重。
肺中的缺血再灌注损伤在血流中断又恢复时随时可能发生。作为发生缺血再灌注肺损伤的时期，可例举例如脏器移植后、心脏手术时的体外循环使用后、伴随血管形成或血流阻断的肺癌等的胸部外科手术后、肺血栓栓塞症的血栓溶解后或血栓摘除后等的血流重新流通时。现在，缺血再灌注损伤的治疗中，采用给予肾上腺皮质类固醇或前列环素、吸入一氧化氮(NO2)、改良肺保存液等，但缺血再灌注肺损伤还是在15～30％的肺移植中发生，与肺移植后的急性期的排异反应及其导致的死亡相关(非专利文献1和2)。
近年来，再生医疗领域中，针对各种各样的疾病对使用干细胞的细胞疗法进行了研究，也不断应用于临床。例如，已知骨髓间充质干细胞部分(MSC)分离自成体，具有分化成骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的能力(非专利文献3和4)。然而，MSC是包括各种细胞的细胞群体，其分化能力的本质还不清楚，治疗效果存在较大差异。此外，作为来自于成体的多能干细胞已报道有iPS细胞(专利文献1)，iPS细胞的确立不仅需要在作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞部分中将特定的基因或特定的化合物导入体细胞这样非常复杂的操作，而且因为iPS细胞具有高肿瘤形成能力，所以临床应用存在巨大的障碍。
根据本发明人之一的出泽的研究，存在于间充质细胞部分、无需诱导操作即可获得的作为表面抗原表达SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3，阶段特异性胚胎抗原-3)的多能干细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells，多系分化持续应激细胞；Muse细胞)负责间充质细胞部分所具有的多能性，显示可应用于以组织再生为目的的疾病治疗。此外，已知Muse细胞可通过对间充质细胞部分以各种压力进行刺激来富集(专利文献2、非专利文献5)。然而，还没有明确将Muse细胞用于缺血再灌注肺损伤的减轻和/或治疗并获得所期待的治疗效果的例子。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特许第4183742号公报
专利文献2:国际公开第2011/007900号
非专利文献
非专利文献1:Fiser,S.M.等,J.Heart Lung Transplant.,20,p.631-636(2001)
非专利文献2:Meyers,B.F.等,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,120,p.20-26(2000)
非专利文献3:Dezawa,M.等,J.Clin.Invest.,Vol.113,p.1701-1710(2004)
非专利文献4:Dezawa,M.等,Science,Vol.309,p.314-317(2005)
非专利文献5:Wakao,S.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.108,p.9875-9880(2011)
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供在再生医疗中使用多能干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。更具体来说，本发明的目的在于提供包含Muse细胞的对缺血再灌注肺损伤的治疗有效的细胞制剂及医药组合物、以及新的治疗方法。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人制备缺血再灌注肺损伤模型大鼠，发现通过用肺动脉注射给予了Muse细胞，缺血再灌注肺损伤得到减轻，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
[1]一种用于减轻和/或治疗缺血再灌注肺损伤的细胞制剂，其中，包含自活体的间充质组织或培养间充质细胞分离得到的SSEA-3阳性的多能干细胞。
[2]根据上述[1]所述的细胞制剂，其中，包含通过外部压力刺激富集了SSEA-3阳性的多能干细胞的细胞部分。
[3]根据上述[1]或[2]所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD105阳性。
[4]根据上述[1]～[3]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性且CD146阴性。
[5]根据上述[1]～[4]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性且CD271阴性。
[6]根据上述[1]～[5]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性且Dct阴性。
[7]根据上述[1]～[6]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞是具有以下的所有性质的多能干细胞：
(i)端粒酶活性低或无端粒酶活性；
(ii)具有分化为三胚层中的某一胚层的细胞的能力；
(iii)不显示肿瘤性增殖；以及
(iv)具有自我更新能力。
[8]根据上述[1]～[7]中的任一项所述的细胞制剂，其中，缺血再灌注肺损伤是肺移植后、心脏手术时的体外循环使用后、伴随血管形成或血流阻断的肺癌等的胸部外科手术后、和/或肺血栓栓塞症的血栓溶解后或血栓摘除后的血流重新流通时发生的肺损伤。
[9]根据上述[1]～[8]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞具有植入肺组织的能力。
发明的效果
本发明可通过对患有缺血再灌注肺损伤的对象给予Muse细胞，从而使其选择性地聚集于肺组织的患处，在该组织内Muse细胞持续地分泌细胞因子和组织保护因子等，构建正常的肺组织。
附图说明
图1表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型中使用Muse细胞的肺的功能性评价(P/F比)的结果。
图2表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型中使用Muse细胞的肺的功能性评价(A-aDO2)的结果。
图3表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型中使用Muse细胞的肺的功能性评价(左肺顺应性)的结果。
图4表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型中使用Muse细胞的肺的组织学评价(苏木精-伊红染色后的病理学评价)的结果。
图5表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型中使用Muse细胞的肺的组织学评价(TUNEL阳性细胞数)的结果。
图6表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型的肺组织片中的人golgi阳性细胞数的测定结果。
图7A表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型的肺组织中的各种细胞因子的mRNA表达量。
图7B表示缺血再灌注肺损伤大鼠模型的肺组织中的各种细胞因子的mRNA表达量。
图8表示使用缺血再灌注肺损伤大鼠模型的肺组织的冷冻切片评价的肺泡上皮增殖能力的测定结果。
具体实施方式
本发明涉及包含SSEA-3阳性的多能干细胞(Muse细胞)的用于减轻和/或治疗缺血再灌注肺损伤的细胞制剂及医药组合物以及新的治疗方法。以下，对本发明进行详细说明。
1.适用疾病及其诊断
本发明使用包含SSEA-3阳性的多能干细胞(Muse细胞)的细胞制剂或医药组合物，以缺血再灌注肺损伤的减轻及治疗为目标。“缺血再灌注肺损伤”是指被认为是肺移植后的移植肺功能衰竭的主要原因，还参与肺移植后3个月以后发生的慢性排异反应的缺血再灌注后在肺发生的缺血再灌注损伤。
一般来说，“缺血再灌注损伤”是指处于缺血状态的脏器或组织发生血液再灌注时，该脏器或组织内的微循环中诱发产生各种毒性物质而导致的损伤。McCord最初报道了缺血再灌注理论(N.Engl.J.Med.,312,159-163(1985))。损伤的程度根据缺血的时间和程度、脏器的种类等而不同。有时不完全缺血的损伤更大。一般认为再灌注带来血管内皮细胞损伤、微循环损伤，进而发展为脏器损伤。作为引发损伤的机理，被认为有超氧化物(O2-)和羟基自由基(HO·)等活性氧或一氧化氮(NO)等自由基的产生导致的损伤，各种细胞因子、内皮素、花生四烯酸等各种化学介质的产生导致的损伤，基于活化嗜中性粒细胞与血管内皮细胞的相互作用的损伤等的机理。不仅是局部，间接地对全身的主要脏器带来损伤(远隔脏器损伤)。特别是脑、肺、肝、肾等成为目标脏器，导致多脏器衰竭。多见于针对心肌梗塞、脑梗塞、肠系膜血管闭塞症等的再灌注疗法后或脏器移植后。
采用本发明的细胞制剂或医药组合物的适用疾病是肺中的缺血再灌注肺损伤，没有限定，但可例举肺移植后、心脏手术时的体外循环使用后、伴随血管形成或血流阻断的肺癌等的胸部外科手术后、肺血栓栓塞症的血栓溶解后或血栓摘除后等的血流重新流通时发生的肺损伤。
根据本发明，为了治疗上述的适用疾病，可向对象给予(以下也统称为“移植”)后述的细胞制剂及医药组合物，实现适用疾病的减轻和/或治疗。在此，“减轻”是指伴随缺血再灌注肺损伤的各种症状的缓和及发展的抑制，较好是缓和症状至对日常生活不产生影响的程度。此外，“治疗”是指抑制伴随缺血再灌注肺损伤的各种症状或使其完全消失。
2.细胞制剂及医药组合物
(1)多能干细胞
本发明的细胞制剂及医药组合物中所用的多能干细胞典型的是作为本发明人之一的出泽在人体内发现了其存在并命名为“Muse(Multilineage-differentiating StressEnduring)细胞”的细胞。Muse细胞可从骨髓液、脂肪组织(Ogura F.等,Stem Cells Dev.,2013年11月20日(Epub)(发表于2014年1月17日))和真皮结缔组织等皮肤组织获得，也散布于各脏器的结缔组织。此外，该细胞为同时具有多能干细胞和间充质干细胞的性质的细胞，例如被鉴定为分别作为各自的细胞表面标记物的“SSEA-3(Stage-specific embryonicantigen-3，阶段特异性胚胎抗原-3)”和“CD105”的双阳性。因此，Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群可例如以这些抗原标记物为指标从活体组织分离。此外，Muse细胞呈抗逆性，可从间充质组织或培养间充质细胞通过各种压力刺激富集。本发明的细胞制剂中还可使用通过压力刺激富集了Muse细胞的细胞部分。Muse细胞的分离法、鉴定法、及特征等详细内容揭示于国际公开第WO2011/007900号。此外，如Wakao等(2011，上述)所报道，已知从骨髓、皮肤等培养间充质细胞，将其用作Muse细胞的母群的情况下，SSEA-3阳性细胞全部为CD105阳性细胞。因此，本发明中的细胞制剂及医药组合物中，从活体的间充质组织或培养间充质干细胞分离Muse细胞的情况下，可单独将SSEA-3作为抗原标记物纯化Muse细胞后使用。另外，本说明书中，也将用于减轻和/或治疗缺血再灌注肺损伤的细胞制剂及医药组合物中可使用的以SSEA-3为抗原标记物从活体的间充质组织或培养间充质组织分离的多能干细胞(Muse细胞)或包含Muse细胞的细胞群简略记作“SSEA-3阳性细胞”。此外，本说明书中，“非Muse细胞”是指活体的间充质组织或培养间充质组织所含的除“SSEA-3阳性细胞”以外的细胞。
简单来说，Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群可单独使用针对作为细胞表面标记物的SSEA-3的抗体，或者同时使用分别针对SSEA-3及CD105的抗体，从活体组织(例如间充质组织)分离。在此，“活体”是指哺乳动物的活体。本发明中，活体不包括受精卵或发育阶段在囊胚期之前的胚胎，但包括胎儿或含囊胚的囊胚期以后的发育阶段的胚胎。哺乳动物无限定，可例举人、猴等灵长类，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等啮齿类，猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。本发明的细胞制剂及医药组合物所使用的Muse细胞在从活体组织直接用标记物分离这点上与胚胎干细胞(ES细胞)和iPS细胞明显不同。此外，“间充质组织”是指骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、牙髓、脐带、脐带血等组织及存在于各种脏器的组织。例如，Muse细胞可从骨髓或皮肤、脂肪组织获得。例如，较好是采集活体的间充质组织，从该组织分离Muse细胞并使用。此外，可使用上述分离手段从成纤维细胞或骨髓间充质干细胞等培养间充质细胞分离Muse细胞。本发明的细胞制剂及医药组合物中，所使用的Muse细胞对于受体可以是自体细胞，也可以是异体细胞。
如上所述，Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群可例如以SSEA-3阳性、及SSEA-3和CD105的双重阳性为指标从活体组织分离，已知人的成人皮肤包含各种类型的干细胞及前体细胞。然而，Muse细胞与这些细胞不同。这样的干细胞及前体细胞可例举皮肤来源前体细胞(SKP)、神经嵴干细胞(NCSC)、成黑素细胞(MB)、血管周细胞(PC)、内皮前体细胞(EP)、脂肪来源干细胞(ADSC)。这些细胞可将固有的标记物的“不表达”为指标分离Muse细胞。更具体来说，Muse细胞可将选自CD34(EP及ADSC的标记物)、CD117(c-kit)(MB的标记物)、CD146(PC及ADSC的标记物)、CD271(NGFR)(NCSC的标记物)、NG2(PC的标记物)、vWF因子(血管性血友病因子)(EP的标记物)、SoxlO(NCSC的标记物)、Snail(SKP的标记物)、Slug(SKP的标记物)、Tyrpl(MB的标记物)及Dct(MB的标记物)的11个标记物中的至少1个，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标记物的不表达作为指标进行分离。例如，虽然无限定，可将CD117及CD146的不表达作为指标进行分离，也能将CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及CD271的不表达作为指标进行分离，还能将上述的11个标记物的不表达作为指标进行分离。
此外，本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的具有上述特征的Muse细胞可具有选自下述性质中的至少一个：
(i)端粒酶活性低或无端粒酶活性；
(ii)具有分化为三胚层中的某一胚层的细胞的能力；
(iii)不显示肿瘤性增殖；以及
(iv)具有自我更新能力。
本发明的一种形态中，本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的Muse细胞具有所有上述性质。在此，关于上述(i)，“端粒酶活性低或无端粒酶活性”是指例如使用TRAPEZEXL端粒酶检测试剂盒(密理愽(Millipore)公司)检测端粒酶活性的情况下，检测结果低或无法检出。端粒酶活性“低”是指例如具有与作为体细胞的人成纤维细胞同等程度的端粒酶活性，或者与Hela细胞相比具有1/5以下、较好是1/10以下的端粒酶活性。关于上述(ii)，Muse细胞具有在体外和体内分化为三胚层(内胚层系、中胚层系、及外胚层系)的能力，例如通过以体外进行诱导培养，可分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。此外，在体内移植到睾丸的情况下有时也显示出分化为三胚层的能力。另外，还具有通过用静脉注射移植到活体而迀移并植入受损伤的脏器(心脏、皮肤、脊髄、肝、肌肉等)，分化为与组织相对应的细胞的能力。关于上述(iii)，Muse细胞具有下述性质：悬浮培养时以约1.3天的增殖速度增殖，但悬浮培养时从1个细胞开始增殖，形成类胚体样细胞团，至14天左右增殖停止；但如果将这些类胚体样细胞团进行贴壁培养，则重新开始细胞增殖，从细胞团增殖的细胞逐渐扩散。另外，在移植到睾丸的情况下，具有至少半年时间不癌化的性质。此外，关于上述(iv)，Muse细胞具有自我更新(自我复制)能力。在此，“自我更新”是指能确认从通过从1个Muse细胞以悬浮培养方式进行培养而得的类胚体样细胞团中所含的细胞向三胚层性的细胞分化，同时通过将类胚体样细胞团的细胞再次以1个细胞进行悬浮培养，使其形成下一代的类胚体样细胞团，能确认由此重新开始的三胚层性的分化和悬浮培养中的类胚体样细胞团。自我更新进行1次或重复多次的循环即可。
此外，本发明的细胞制剂中所使用的包含Muse细胞的细胞部分可以是SSEA-3阳性及CD105阳性的多能干细胞富集的细胞部分，所述细胞部分可通过包括下述工序的方法获得：对活体的间充质组织或培养间充质细胞给予外源压力刺激，回收对该外源压力具耐性的细胞；所述细胞部分具有以下的性质中的至少一个、较好是全部：
(i)SSEA-3阳性；
(ii)CD105阳性；
(iii)端粒酶活性低或无端粒酶活性；
(iv)具有分化为三胚层的能力；
(v)不显示肿瘤性增殖；以及
(vi)具有自我更新能力。
上述外源压力可以是蛋白酶处理、低氧浓度下的培养、低磷酸条件下的培养、低血清浓度下的培养、低营养条件下的培养、暴露于热冲击下的培养、低温下的培养、冻结处理、有害物质的存在下的培养、活性氧的存在下的培养、机械刺激下的培养、振荡处理下的培养、压力处理下的培养或物理冲击中的任一种或多种的组合。例如，采用上述蛋白酶的处理时间较好是为了给予细胞外源压力而进行合计0.5～36小时。此外，蛋白酶浓度为剥离贴壁于培养容器的细胞时、将细胞团分散为单一细胞、或从组织回收单一细胞时所用的浓度即可。蛋白酶较好是丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或N末端苏氨酸蛋白酶。另外，所述蛋白酶较好是胰蛋白酶、胶原酶或分散酶。
此外，本发明的细胞制剂中所使用的具有上述特征的Muse细胞被认为通过静脉给予等给予活体后，植入至存在缺血再灌注肺损伤的肺组织，然后Muse细胞发挥抗炎症作用和组织保护作用的同时分化为构成该组织的细胞，减轻和/或治疗缺血再灌注肺损伤。
(2)细胞制剂及医药组合物的制备及使用
本发明的细胞制剂及医药组合物无限定，使上述(1)中得到的Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群悬浮于生理盐水或适当的缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水)而获得。该情况下，从自体或异体的组织分离的Muse细胞数少的情况下，在给予前培养细胞，使其增殖至获得规定的细胞浓度。另外，如已报道那样(国际公开第WO2011/007900号文本)，Muse细胞不会肿瘤化，从活体组织回收的细胞即使在未分化的状态下含有，癌化的可能性也低，安全。此外，回收的Muse细胞的培养无特别限定，可在通常的增殖培养基(例如含10％小牛血清的α-最低必需培养基(α-MEM))中进行。更具体来说，可参照国际公开第W02011/007900号，在Muse细胞的培养及增殖中，适当地选择培养基、添加物(例如抗生素、血清)等，制备包含规定浓度的Muse细胞的溶液。向人类对象给予本发明的细胞制剂或医药组合物的情况下，可从人的髂骨采集数mL左右的骨髓液，例如作为来自骨髓液的贴壁细胞培养骨髓间充质干细胞，使其增殖至可分离有效的治疗量的Muse细胞的细胞量后，以SSEA-3的抗原标记物为指标分离Muse细胞，作为细胞制剂制备自体或异体的Muse细胞。或者，例如可将SSEA-3的抗原标记物为指标分离Muse细胞后，培养细胞而使其增殖至有效的治疗量后，作为细胞制剂制备自体或异体的Muse细胞。
此外，将Muse细胞用于细胞制剂及医药组合物的情况下，可使细胞制剂及医药组合物为了保护该细胞而含有二甲亚砜(DMSO)或血清白蛋白等，为了防止细菌的混入和增殖而含有抗生素等。另外，还可使细胞制剂及医药组合物含有制剂上允许的其他成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)或者间充质细胞所含的Muse细胞以外的细胞或成分。本领域一般技术人员可将这些因子和药剂以适当的浓度添加于细胞制剂及医药组合物。
对于上述中制备的细胞制剂及医药组合物中含有的Muse细胞数，为了在缺血再灌注肺损伤的减轻和/或治疗中获得所期望的效果(例如P/F比、A-aDO2、肺顺应性、呼吸指数的正常化)，可考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等适当进行调整。后述的实施例3～8中，使用缺血再灌注肺损伤模型大鼠，对通过Muse细胞移植得到的各种效果进行了探讨，通过对体重约290～340g的该模型大鼠以1×105细胞/PBS200μl(每一个体)给予SSEA3阳性细胞，获得了非常好的效果。根据该结果，期待通过向哺乳动物(包括人)的一个体给予对约1×105细胞/kg～约1×106细胞/kg(例如3×105细胞/kg)进行体重换算而得的细胞量而获得良好的效果。另一方面，为了防止向血管的细胞给予导致阻塞，作为1次给予的量，例如以1×108细胞/个体以下、较好是5×107细胞/个体以下、更好是1.8×107细胞/个体以下使细胞制剂含有SSEA-3阳性细胞即可。在此，个体包括大鼠、人，但并不仅限于此。此外，本发明的细胞制剂及医药组合物可多次(例如2～10次)以适当的间隔(例如1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次)给予，直到获得所期望的治疗效果。因此，虽然也根据对象的状态而不同，但作为治疗上的有效量，较好是例如一个体1×104细胞～1×108细胞、1～10次的给予量。作为一个体的给予总量无限定，可例举1×104细胞～1×109细胞、1×104细胞～5×108细胞、1×104细胞～1×108细胞、1×104细胞～5×107细胞、1×104细胞～1×107细胞、1×104细胞～5×106细胞、1×104细胞～1×106细胞、1×104细胞～5×105细胞、1×104细胞～1×105细胞、1×105细胞～1×109细胞、1×105细胞～5×108细胞、1×105细胞～1×108细胞、1×105细胞～5×107细胞、1×105细胞～1×107细胞、1×105细胞～5×106细胞、1×105细胞～1×106细胞、1×106细胞～1×109细胞、1×106细胞～5×108细胞、1×106细胞～1×108细胞、1×106细胞～5×107细胞、1×106细胞～1×107细胞、1×107细胞～1×109细胞、1×107细胞～5×108细胞、1×107细胞～1×108细胞等。
本发明的细胞制剂或医药组合物以缺血再灌注肺损伤，例如脏器移植后、心脏手术时的体外循环使用后、伴随血管形成或血流阻断的肺癌等的胸部外科手术后、肺血栓栓塞症的血栓溶解后或血栓摘除后的血流重新流通时发生的肺损伤为减轻和治疗对象，但作为给予时期，为缺血再灌注后根据呼吸内科的观察结果、胸部超声波影像诊断或MRI等诊断为缺血再灌注肺损伤后，可以是刚诊断后起数个月以内。例如，该细胞制剂等较好是在刚受损后给予，但即使是受损后的较晚时期，例如自受损起1小时后、1天后、1周后、1个月后、3个月后、6个月后，也可期待本发明的细胞制剂等的效果。此外，本发明人的实验中确认所使用的Muse细胞即使来自于异体的情况下也不会引发免疫应答，所以缺血再灌注肺损伤的减轻和治疗中可适当给予至获得所期望的效果。
3.缺血再灌注肺损伤模型大鼠的制备
本说明书中，为了探讨采用本发明的细胞制剂的缺血再灌注肺损伤的减轻和治疗效果，可制备缺血再灌注肺损伤模型大鼠使用。作为该模型使用的大鼠无限定，一般可例举Sprague-Dawley(SD)系大鼠、Wistar/ST系大鼠。制备缺血再灌注肺损伤模型大鼠的方法公知，例如可按照Manning,E.等(Hum.Gene Ther.,21,p.713-727(2010))的方法制备缺血再灌注肺损伤模型大鼠。此外，可通过后述的肺功能的评价对以上述方法制备的模型大鼠是否存在缺血再灌注肺损伤进行确认。
本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的Muse细胞具有聚集于患部的性质。因此，细胞制剂或医药组合物的给予中，它们的给予部位(例如腹腔内、肌肉内、患部)、给予的血管种类(静脉和动脉)等无限定。此外，作为确认所给予的Muse细胞到达患部并植入的方法，例如制备预先引入基因而使其表达荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白质(GFP))的Muse细胞，给予活体后通过可检测荧光的系统进行观察，确认Muse细胞的动态。另外，本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的Muse细胞来源于人，因此与大鼠为异种的关系。模型动物中给予异种的细胞等的实验中，为了抑制异种细胞在活体内的排异反应，可在异种细胞给予前或同时给予免疫抑制剂(环孢素等)。
4.缺血再灌注肺损伤模型大鼠中的基于Muse细胞的减轻和治疗效果
本发明的实施方式中，本发明的细胞制剂及医药组合物可减轻和/或治疗包括人的哺乳动物中的缺血再灌注肺损伤及伴随其的各种症状。如果采用本发明，可使用上述中制备的缺血再灌注肺损伤模型大鼠，以实验方式探讨基于Muse细胞的症状的减轻等，评价该Muse细胞的效果。作为评价方法，可使用利用大鼠的评价肺功能的一般的测定体系进行。
(1)功能性评价
根据本发明，肺的功能性评价可使用被本领域技术人员认可的常规方法进行，例如可通过P/F比、A-aDO2(肺泡气-动脉血氧分压差)、肺顺应性的测定进行。
(a)P/F比
P/F比是肺的功能性评价中一般所使用的氧合的指数，该比值通过PaO2(动脉血氧分压)/FiO2(吸入氧分压)计算。如果是健康人，正常值为400～500。如果在该数值以下，被认为是低氧状态。上述的氧分压可通过血液气体分析装置(例如GASTAT-navi(株式会社技术医疗(Techno Medica)，横滨，日本))测定，但没有限定。如后述的实施例3所示，正常的大鼠的P/F比为500左右，缺血再灌注肺损伤模型大鼠低于100，通过给予Muse细胞可使P/F比接近正常。
(b)A-aDO2(肺泡气-动脉血氧分压差)
A-aDO2是指肺泡气氧分压(PAO2)与动脉血氧分压(PaO2)的差，通过求出A-aDO2，可判断肺泡中的气体交换是否正常进行。PaO2可采集动脉血并利用血液气体分析装置进行测定，但PAO2为肺泡所含的氧分压，所以无法直接测定。因此，PAO2通过计算公式(PAO2＝(760-47)×0.21-PaCO2/0.8)求出理论值。如果是健康人，正常值为5～15。如果在该数值以上，被认为气体交换不正常。如后述的实施例3所示，正常的大鼠的A-aDO2为150mmHg左右，缺血再灌注肺损伤模型大鼠为500mmHg以上，通过给予Muse细胞可使A-aDO2接近正常。
(c)肺顺应性
肺顺应性是表示肺的柔软度的指数，以肺收缩的性质(弹性)的倒数表示。以使肺伸展的压力(ΔP)为横轴、肺的容量变化(ΔV)为纵轴作图即获得压力-容量曲线，该曲线的斜率(ΔV/ΔP)为静态肺顺应性。本研究中，为了更简便地测定、算出肺顺应性，使用通过1次换气量(ml)/换气压(cmH2O)求得的动态肺顺应性。此外，本研究中使用的大鼠处于成长过程中，肺也在成长，因此为了修正个体间的大小差异，以将动态肺顺应性除以个体体重(kg)而得的数值(ml/cmH2O/kg)进行比较。如果肺顺应性高，则可认为肺为易伸展的状态；另一方面，如果肺顺应性低，则可认为肺为僵硬的状态。如后述的实施例4所示，正常的大鼠的肺顺应性为1左右，缺血再灌注肺损伤模型大鼠低于0.6，通过给予Muse细胞可使肺顺应性接近正常。与使用大鼠的情况下的测定方法不同，人的情况下200ml/cmH2O为正常值。
(2)组织学评价
根据本发明，组织学评价可使用被本领域技术人员认可的常规方法进行，例如可通过苏木精-伊红(HE)染色、TUNEL染色进行。
(a)苏木精-伊红染色
组织染色法中，苏木精-伊红染色被经常使用，本领域技术人员周知。根据本发明，作为肺的组织学评价，可提取肺组织，该染色后，根据4个病理学项目(肺泡腔内的浮肿、肺泡腔内的出血、肺泡和肺泡壁的淤血、炎症性细胞的浸润)的程度将急性肺损伤的程度分级为0～4+的5级，通过在各动物实验组间进行比较来进行评价。更具体来说，评价中2名为盲测，对于上述的病理学项目，分别使用5级评价进行评分，即，0分:病变部0％，1分:病变部1～25％，2分:病变部26～50％，3分:病变部51～75％，4分:病变部76～100％。如后述的实施例5所示，给予Muse细胞的处置组中，与仅给予PBS的对照组相比，可减少所有病理学项目中的平均评分。
(b)TUNEL染色
根据本发明，可使用TUNEL(TdT介导的dUTP缺口末端标记，TdT-mediated dUTPnick end labelling)法，对损伤肺中的细胞凋亡进行评价。该方法为将细胞凋亡的过程中产生的组织切片中的片段化DNA用生物素标记核苷酸进行标记后，使HRP标记链霉亲和素与其反应而进行染色的方法。作为检测试剂，可以是FITC、DAB、Blue Label中的任一种。染色后，在显微镜下，通过计数TUNEL阳性细胞数，可在各实验组间进行比较。例如，如实施例6所示，显微镜下在10视野中比较TUNEL阳性细胞数，与给予PBS的对照相比，采用Muse细胞的处置组中，可使源于细胞凋亡的TUNEL阳性细胞的数量显著减少。
通过以下的实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例
实施例1:各种细胞的制备
(1)间充质干细胞的制备
使用从龙沙日本株式会社购入的人间充质干细胞(MSC)。按照现有报道，使用向含低葡萄糖、L-谷氨酰胺的DMEM(生物技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，美国)中添加了10％胎牛血清(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，美国)和卡那霉素的培养基，在10cm培养皿中以37℃、5％CO2的条件进行了培养。细胞达到90％汇合度的细胞密度后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(生物技术公司，卡尔斯巴德，美国)剥离细胞，以1:2进行传代。同样地重复培养、传代，将第7～8次传代的细胞用于实验。
(2)Muse细胞的制备
对人MSC进行培养、传代，使用第7～8次传代的细胞。首先，向44ml的FluoroBriteDMEM(生物技术公司，卡尔斯巴德，美国)中加入5ml的5％牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，美国)、1ml的100mM EDTA，制成缓冲液。将大鼠IgM抗阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)抗体(1:1000，BioLegend公司，圣地亚哥，美国)作为一级抗体，在MSC和制成的缓冲液中于冰上反应1小时。然后，以400g离心5分钟，除去上清并加入900μl的缓冲液，用移液管小心吹打进行清洗。重复该清洗操作3次，将FITC共轭抗大鼠IgM抗体(1:100，JacksonImmunoresearch公司，巴尔的摩，美国)作为二级抗体于冰上反应1小时。与二级抗体反应后，进行前述的清洗3次。接着，使抗FITC微球(1:10，美天旎生物技术有限公司，德国)于冰上反应15分钟，清洗2次后，用MACS(磁激活细胞分离，magnetic-activated cell sorting)将SSEA-3阳性细胞作为Muse细胞进行分离。分离细胞后，使用BD FACS Aria(BD生物科技公司，富兰克林湖，美国)，分析以MACS分离的细胞的一部分，确认经分离的细胞集团中所含的SSEA-3阳性细胞数的比例。采用FACS的分析中，将SSEA-3阳性率为70％以上的细胞用于实验。以下所述的实验中所用的“Muse细胞”是通过含70％以上SSEA-3阳性细胞的MACS分离的细胞。
实施例2:缺血再灌注肺损伤模型大鼠的制备和各种细胞的给予
本研究中，设置向缺血再灌注肺损伤模型大鼠给予PBS的PBS组、给予人MSC的MSC组、给予Muse细胞的Muse组、不进行手术操作的正常组这共计4组。缺血再灌注肺损伤后的肺功能的评价以各组n＝8进行了评价。刚再灌注后对左肺动脉用30G针穿刺，用1分钟对PBS组给予200μl的PBS，对MSC组给予1.5×105细胞MSC/200μl的PBS，对Muse组给予1.5×105细胞Muse细胞/200μl的PBS。
使用出生9周、体重290～340g的雄性Sprague-Dawley大鼠。通过使其吸入异氟烷进行麻醉。得到充分安静的状态后，通过14G血管导管进行气管内插管，连接大鼠用人工呼吸器。麻醉中以1次换气量1ml/100g、呼吸数80次/分钟、呼气末正压2cmH2O、吸入麻醉药浓度1％进行管理。让大鼠呈右侧卧姿，左后侧方切开，在第5肋间开胸。切离肺韧带，松动左肺，充分剥离左肺门后，通过左奇静脉给予50单位的肝素。给予肝素起经过5分钟后，吸气末用微手术用血管夹阻断左肺动脉、左肺静脉和左主支气管。阻断中，在肺上遮盖湿润纱布，用保温垫将胸腔内温度保持于37℃。阻断时间按照van der Kaaji NP等的报告(Eur JCardiothorac Surg2005；27:774-782)设为2小时。刚解除阻断后，从左肺动脉分别给予PBS、MSC、Muse细胞。然后，用3-0丝线将肋间、肌层、皮肤缝合闭合创口。闭合创口后，以中止异氟烷的吸入的状态继续换气，确认自主呼吸重新开始，拔去14G导管。
实施例3:肺的氧合能力和换气能力的评价
再灌注3天、5天时对大鼠在采用异氟烷的全身麻醉下进行气管切开，将14G血管导管插入气管。用3-0丝线结扎，固定导管和气管，连接导管和人工呼吸器。通过胸骨正中切开进行开胸。切开左右的横膈膜，用纱布防止腹部脏器脱出至胸腔内。将右肺门在显微镜下剥离后，结扎右肺动脉。然后，以吸入氧浓度100％、1次换气量1ml/体重100g、呼吸数80/分钟、呼气末正压2cmH2O使其换气5分钟后，从升主动脉进行采血。进行血液气体分析，在各组间对动脉血氧分压/吸入氧浓度比(P/F比)、以及通过下式算出的A-aDO2(A-aDO2＝713-动脉血二氧化碳分压/0.8-动脉血氧分压)进行比较。血液气体分析使用GASTAT-navi(株式会社技术医疗)，横滨，日本))测定。以各组n＝8进行了评价。
在再灌注起第3天(Day3)、再灌注起第5天(Day5)进行动脉血血液气体分析，测定P/F比、A-aDO2并进行比较。关于P/F比，在第3天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、Muse组与MSC组(p＜0.01)确认统计学上的显著差异；在第5天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、Muse组与MSC组(p＜0.001)、MSC组与PBS组(p＜0.01)确认统计学上的显著差异(图1)。关于A-aDO2，在第3天，Muse组与PBS组(p＜0.01)、Muse组与MSC组(p＜0.05)确认统计学上的显著差异；在第5天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、Muse组与MSC组(p＜0.001)、MSC组与PBS组(p＜0.01)确认统计学上的显著差异(图2)。根据这些结果，通过Muse细胞的给予，缺血再灌注肺损伤模型大鼠中的肺功能得到改善，可确认缺血再灌注肺损伤中的Muse细胞的治疗有效性。
实施例4:左肺顺应性的评价
血液气体分析后，将右肺门用蚊式止血钳阻断，将换气数设定为80次/分钟，将分时换气量从40ml分阶段提高至200ml，测量各换气量下的换气压。将1次换气量除以个体重量进行调整，求出换气量/换气压(ml/kg/cmH2O)，作为肺顺应性在各组间进行比较。以各组n＝8进行了评价。
在再灌注起第3天(Day3)、再灌注起第5天(Day5)测定左肺顺应性并进行比较。在第3天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、Muse组与MSC组(p＜0.05)、MSC组与PBS组(p＜0.05)确认统计学上的显著差异；在第5天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、MSC组与PBS组(p＜0.05)确认统计学上的显著差异(图3)。与实施例3同样，根据该结果可确认缺血再灌注肺损伤中的Muse细胞的治疗有效性。
实施例5:组织学评价
测定左肺顺应性后，摘取心肺部分，从气管以10cmH2O的压力注入4％多聚甲醛，将左肺在4％多聚甲醛中固定24小时。固定后，分割肺组织，将一半包埋于石蜡，另一半包埋于O.C.T.复合物，分别制成石蜡切片、冷冻切片。石蜡切片以3μm制成薄切片，冷冻切片以8μm制成薄切片。
(1)缺血再灌注肺损伤的病理学检索
使用石蜡切片进行苏木精-伊红染色，基于Okada Y等的报道(Transplantation1997；64:801-806)，根据4个病理学项目(肺泡腔内的浮肿、肺泡腔内的出血、肺泡和肺泡壁的淤血、炎症性细胞的浸润)的程度将急性肺损伤的程度分级为0～4+的5级，在各组间进行比较。在第3天、第5天分别以各组n＝8进行了评价。
在第3天和第5天进行HE染色，关于上述的4个病理学项目以0～4的5级进行了评价。在第3天，关于肺泡内浮肿，Muse组与PBS组(p＜0.01)、Muse组与MSC组(p＜0.01)确认统计学上的显著差异；关于肺泡内出血，Muse组与PBS组(p＜0.01)、Muse组与MSC组(p＜0.01)确认统计学上的显著差异；关于毛细血管的淤血，Muse组与PBS组(p＜0.01)、Muse组与MSC组(p＜0.05)确认统计学上的显著差异；关于嗜中性粒细胞，Muse组与PBS组(p＜0.01)、Muse组与MSC组(p＜0.01)确认统计学上的显著差异(图4)。在第5天，关于嗜中性粒细胞浸润，Muse组与PBS组(p＜0.001)、Muse组与MSC组(p＜0.05)确认统计学上的显著差异(未示出数据)。如上所述，给予Muse细胞的处置组中，与仅给予PBS的对照组相比，所有病理学项目中的平均评分均减少，由此可确认Muse细胞对缺血再灌注肺损伤的治疗有效。
(2)大鼠损伤肺中的细胞凋亡的评价
为了损伤肺中的细胞凋亡进行评价，采用TUNEL(TdT介导的dUTP缺口末端标记，TdT-mediated dUTP nick end labelling)法。TUNEL法使用DeadEnd(商标)荧光法TUNEL系统(普洛麦格公司，威斯康星，美国)，按照所附的实验方案进行染色。以200倍观察10视野，计数TUNEL阳性细胞数，将10视野的合计的TUNEL阳性细胞数在各组间进行比较。在第3天、第5天分别以各组n＝4进行了评价。
在第3天和第5天，使用PBS组、MSC组和Muse组的左肺切片实施TUNEL法，检测凋亡细胞，以200倍视野观察10视野，对TUNEL阳性细胞数进行了比较(图5)。在第3天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、MSC组(p＜0.05)相比显著较少；在第5天，Muse组与PBS组(p＜0.001)、MSC组(p＜0.01)相比显著较少。由该结果可知，采用Muse细胞的处置组中，可显著减少因缺血再灌注肺损伤而导致凋亡的细胞的数量。
实施例6:大鼠损伤肺中的人细胞数的评价
使用冷冻切片，作为一级抗体使兔抗人golgi抗体(1:50，艾博抗公司，剑桥，英国)于4℃反应一晚。作为二级抗体使Cy3共轭驴抗兔IgG抗体(1:500，Jackson Immunoresearch公司，巴尔的摩，美国)于室温反应2小时，实施免疫组织化学处理，计数MSC组、Muse组中的抗人golgi抗体阳性细胞数。2组均每一个体分别制成3个切片，测定切片的面积，对每个切片计数全部阳性细胞数，对单位面积的抗人golgi抗体阳性细胞数在2组间进行了比较。在第3天、第5天分别以各组n＝4进行了评价。
在第3天、第5天，对左肺组织实施采用抗人golgi抗体的免疫组织化学处理，各个体分别对于3个切片，计数各切片中的人golgi阳性细胞数。在第3天，向缺血再灌注肺损伤模型大鼠给予Muse细胞的组与向正常大鼠给予MSC的组(p＜0.05)、向正常大鼠给予Muse细胞的组(p＜0.05)和向缺血再灌注肺损伤模型大鼠给予MSC的组(p＜0.05)相比，残留显著更多的人细胞。此外，在第5天，向缺血再灌注肺损伤模型大鼠给予Muse细胞的组与向缺血再灌注肺损伤模型大鼠给予MSC的组(p＜0.01)相比，残留显著更多的人细胞(图6)。即，可认为Muse细胞能够比MSC更高效、更持续地作用于损伤肺。
实施例7:大鼠损伤肺中的表达蛋白质的评价
为了对损伤肺中的表达蛋白质进行比较，从损伤肺提取蛋白质，实施蛋白质印迹。再灌注后第3天摘取PBS组、MSC组、Muse组的左肺组织，通过匀浆器进行匀浆，通过添加蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司，曼海姆，德国)的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％Triton X-100)于冰上反应15分钟。提取的蛋白质量通过Bradford法进行了定量。然后，添加与裂解缓冲液等量的×2样品缓冲液(30％甘油、4％十二烷基硫酸钠、125mM Tris-HCl(pH6.8)、100mM二硫苏糖醇、10mM EDTA、10％β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝)，在100℃孵育10分钟。各样品分别用50μg的10％、15％SuperSep Ace(和光纯药工业株式会社，大阪，日本)进行电泳，转印至Immobilon-P转印膜(默克密理博公司，比尔里卡，美国)。用5％脱脂奶(半井测试技术株式会社(Nacalai Tesque)，京都，日本)在4℃封闭1小时后，作为一级抗体使用用5％脱脂奶稀释的兔抗IL-10抗体(1:2500，艾博抗公司，剑桥，英国)、兔抗IL-1β抗体(1:5000，默克密理博公司，比尔里卡，美国)、小鼠抗IL-6抗体(1:2000，艾博抗公司，剑桥，英国)、山羊抗KGF抗体(1:2000，R&D Systems公司，明尼阿波利斯，美国)、兔抗PGE2抗体(1:1000，博奥森公司，波士顿，美国)、兔抗SDF(基质细胞衍生因子，Stem cell drivedfactor)-1抗体、兔抗上皮性钠通道(ENaC)抗体(1:500，赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，美国)、兔抗Akt抗体(1:2000，赛信通公司，丹佛斯，美国)、兔抗Bcl-2抗体(1:500，艾博抗公司，剑桥，英国)、小鼠抗β-肌动蛋白抗体(1:10000，艾博抗公司，剑桥，英国)，在4℃反应一晩。二级抗体使用过氧化物酶共轭山羊抗小鼠IgG抗体(1:10000)或过氧化物酶共轭山羊抗兔IgG抗体(1:15000)、过氧化物酶共轭驴抗山羊IgG抗体(1:5000)，在室温下反应1小时。显色利用Piece Western Blotting Substrate Plus(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，美国)，显色5分钟，用LAS-4000IR Multicolor(富士胶卷株式会社，东京，日本)进行拍摄，算出各蛋白质相对于β-肌动蛋白的表达水平比，在各组间进行了比较。
在第3天，从PBS组、MSC组、Muse组的左肺组织提取蛋白质实施蛋白质印迹，在各组间比较条带的浓淡的结果示于图7。Muse组与MSC组之间，PGE2(p＜0.01)、SDF-1(p＜0.05)、IL-6(p＜0.05)、ENaC(p＜0.05)、Bcl-2(p＜0.05)、Akt(p＜0.01)上Muse组的表达统计学上显著更高；Muse组与PBS组之间，PGE2(p＜0.01)、SDF-1(p＜0.01)、IL-6(p＜0.05)、ENaC(p＜0.05)、Bcl-2(p＜0.05)、Akt(p＜0.01)上Muse组的表达统计学上显著更高。虽然未发现统计学的显著差异，但KGF、IL-10、MMP2、IGF-1的表达在Muse组中高，IL-1b的表达在Muse组中低。
通过向缺血再灌注肺损伤模型大鼠给予Muse细胞，与给予MSC相比，获得了更好的功能改善效果。通过损伤肺的蛋白质印迹，Muse组中，KGF、PGE2、IL-10、SDF-1、IL-6、MMP2、IGF-1、ENaC、Bcl-2、Akt高度表达，IL-1β的表达低。ENaC是在I型肺泡上皮细胞和II型肺泡上皮细胞表达的钠离子通道，通过钠离子的吸收在肺泡腔的水分清除中起到重要的作用，还参与包括缺血再灌注肺损伤的急性肺损伤中的肺水肿的发生。KGF诱导ENaC的表达，使肺泡水分清除亢进。通过ENaC的表达被促进，肺泡水分清除亢进，有利于病理组织中的肺泡内浮肿的改善，被认为参与肺功能改善。
IL-6、IGF-1、SDF-1促进细胞增殖，修复组织。这些细胞因子高表达的Muse组中，采用PCNA的I型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮细胞的增殖能力的评价中，处于分裂期的细胞数均显著较多。此外，缺血再灌注肺损伤中细胞凋亡与肺功能障碍的发生有较大的关联，Bcl-2和Akt是细胞凋亡通路中具有抑制细胞凋亡的作用的蛋白质。Muse组中，这些蛋白质的表达亢进，由TUNEL法中阳性细胞数在Muse组中减少可知，Muse组中细胞凋亡更强地被抑制。即，可认为Muse组中缺陷再灌注损伤后生存的I型和II型肺泡上皮细胞更多。I型和II型肺泡上皮细胞大量生存或增殖分别意味着有效的气体交换面积的增加和肺表面活性蛋白的产生，被认为分别直接有利于氧合能力和肺顺应性的改善。另外，损伤肺中的I型和II型肺泡上皮细胞的增加意味着肺泡上皮细胞上表达的ENaC增加，被认为也由此有利于肺泡内浮肿的改善。
PGE2除了抑制T细胞的增殖而具有免疫抑制效果、血管内皮细胞保护的直接作用之外，还具有介以IL-10的抗炎症作用。PGE2高表达的Muse组中，具有强力的抗炎症作用、免疫抑制作用的IL-10也高表达，Muse组中参与作为炎症性细胞因子的IL-1b的下降、病理组织中的嗜中性粒细胞浸润的减轻，被认为有利于肺功能的改善。
实施例8:大鼠损伤肺中的肺泡上皮增殖能力的评价
使用冷冻切片，以Tris-EDTA(pH9.0)、80℃、20分钟用微波进行抗原活化后，使用作为增殖期的细胞标记物的小鼠抗PCNA(增殖细胞核抗原，Proliferating cell nuclearantigen)抗体(1:500，艾博抗公司，剑桥，英国)、作为II型肺泡上皮细胞的标记物的兔抗亲表面活性蛋白C抗体(1:1000，默克密理博公司，比尔里卡，美国)、作为I型肺泡上皮细胞的标记物的兔抗水通道蛋白5抗体(1:250，艾博抗公司，剑桥，英国)作为一级抗体，在4℃反应一晚。二级抗体分别使用FITC共轭驴抗小鼠IgG抗体(1:500，Jackson Immunoresearch公司，巴尔的摩，美国)、Cy3共轭驴抗兔IgG抗体(1:500，Jackson Immunoresearch公司，巴尔的摩，美国)于室温反应2小时。以200倍视野进行观察，分别以10视野计数PCNA和亲表面活性蛋白C的共阳性细胞、PCNA和水通道蛋白5的共阳性细胞。分别将它们作为处于增殖期的II型肺泡上皮细胞、I型肺泡上皮细胞在PBS组、MSC组、Muse组间进行比较。在再灌注后第3天、第5天分别以各组n＝4进行了评价。
在第3天、第5天使用抗PCNA抗体计数处于分裂期的细胞数。分别进行作为I型肺泡上皮细胞标记物的水通道蛋白5和作为II型肺泡上皮细胞标记物的亲表面活性蛋白C的抗体的共染色，以200倍视野观察10视野计数共阳性细胞。结果示于图8。关于PCNA和水通道蛋白5的共阳性细胞数，在第3天，Muse组与MSC组(p＜0.01)和PBS组(p＜0.01)相比统计学上共阳性细胞数显著更多。在第5天，虽然未发现统计学的显著差异，但Muse组中共阳性细胞数更多。关于PCNA和亲表面活性蛋白C的共阳性细胞数，在第3天，Muse组与MSC组(p＜0.05)和PBS组(p＜0.05)相比共阳性细胞数显著更多。在第5天，Muse组的共阳性细胞数比其他2组更多，特别是在与PBS组之间确认了统计学的显著差异(p＜0.05)。
工业上利用的可能性
本发明的细胞制剂及医药组合物可应用于缺血再灌注肺损伤的减轻和治疗。
本说明书中引用的所有的刊物和专利文献通过参照整体援引于本说明书中。另外，为了示例而在本说明书中对本发明的特定的实施方式进行了说明，但本领域一般技术人员应能理解在不超出本发明的主旨和范围的情况下可进行各种改变。

Claims (9)

1.一种用于减轻和/或治疗缺血再灌注肺损伤的细胞制剂，其中，包含自活体的间充质组织或培养间充质细胞分离得到的SSEA-3阳性的多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其中，包含通过外部压力刺激富集了SSEA-3阳性的多能干细胞的细胞部分。
3.根据权利要求1或2所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD105阳性。
4.根据权利要求1～3中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性且CD146阴性。
5.根据权利要求1～4中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性且CD271阴性。
6.根据权利要求1～5中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性且Dct阴性。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞是具有以下的所有性质的多能干细胞：
(i)端粒酶活性低或无端粒酶活性；
(ii)具有分化为三胚层中的某一胚层的细胞的能力；
(iii)不显示肿瘤性增殖；以及
(iv)具有自我更新能力。
8.根据权利要求1～7中的任一项所述的细胞制剂，其中，缺血再灌注肺损伤是肺移植后、心脏手术时的体外循环使用后、伴随血管形成或血流阻断的肺癌等的胸部外科手术后、和/或肺血栓栓塞症的血栓溶解后或血栓摘除后的血流重新流通时发生的肺损伤。
9.根据权利要求1～8中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞具有植入肺组织的能力。
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