WO2022138955A1 - 動脈解離の治療剤 - Google Patents

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WO2022138955A1
WO2022138955A1 PCT/JP2021/048373 JP2021048373W WO2022138955A1 WO 2022138955 A1 WO2022138955 A1 WO 2022138955A1 JP 2021048373 W JP2021048373 W JP 2021048373W WO 2022138955 A1 WO2022138955 A1 WO 2022138955A1
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cells
cell
muse
dissection
group
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PCT/JP2021/048373
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佳克 齋木
誠 高橋
真理 出澤
秀光 東
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国立大学法人東北大学
株式会社生命科学インスティテュート
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Definitions

  • the present invention relates to a cell preparation for regenerative medicine. More specifically, the present invention relates to a cell preparation containing pluripotent stem cells effective for the treatment of arterial dissection, and more preferably for the prevention and / or treatment of the expansion of the dissected blood vessel diameter due to the arterial dissection and the accompanying rupture of the blood vessel.
  • the aorta is the thickest artery in the body and sends oxygen-rich blood sent from the left ventricle to the tissues of the whole body except the lungs. From the heart, it first goes up (ascending aorta), then the arteries that bend in an arch and turn to the back, branching toward the brain and arms (arch aorta), and then the aorta goes down (descending aorta). This is the thoracic aorta, and when it penetrates the diaphragm, it changes its name to the abdominal aorta, and after branching into several branches to the abdominal organs, it branches into two to become the left and right iliac arteries, which supply blood to the lower limbs.
  • aortic aneurysm and aortic dissection are diseases in which the aorta dilates, and their treatment methods are similar, such as blood pressure control, surgical artificial blood vessel replacement, and intravascular stent graft insertion, but as diseases. Is very different.
  • the aorta is composed of three layers, the intima, the media, and the outer membrane.
  • the aortic wall of the three layers degenerates and swells as it is to form an aneurysm, whereas in aortic dissection, the intima Due to the inflow of blood into the tunica media from the wound (entry) that was made in the aorta, the tunica media was torn and the aortic wall was separated into two layers, forming two cavities along the running of the artery (a false cavity was created). It is in a state.
  • Aortic dissection is a fatal disease in which the media of the aorta suddenly dissects as described above, but about 4,000 of the estimated 10,000 cases per year in Japan are targeted for surgery, and the number is still increasing. There is a tendency. Since it occurs more often in men over the age of 50, who have greater social responsibility, it also has a large social impact.
  • SSEA-3 Stage-Special Embryonic Antigen-3
  • Muse cells pluripotent stem cells
  • Muse cells can be obtained from bone marrow fluid, adipose tissue (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17, 2014)), dermal connective tissue of the skin, and the like. It is known that it is widely present in connective tissues of tissues and organs. Further, Patent Document 2 discloses that Muse cells are effective in treating aortic aneurysm among diseases related to the aorta. However, Muse cells are not known to be effective in treating aortic dissection.
  • An object of the present invention is to provide a cell preparation for treating arterial dissection.
  • the present inventors By administering human Muse cells to an experimentally induced acute aortic dissection (Stanford type B) model mouse, the present inventors accumulate Muse cells in the dissected blood vessels, and the blood vessels that are constituent cells of the aortic media. By differentiating into smooth muscles, producing elastic fibers, and suppressing the infiltration of leukocytes into the dissected blood vessels by anti-inflammatory action, the proportion of elastic fibers is kept high, and the dissection is extended by the expansion of the pseudocavity over time. We have found that it is possible to treat aortic dissection by preventing rupture, rupture, and swelling of false lumens (so-called dissecting aortic aneurysm), and completed the present invention.
  • a cell preparation for treating arterial dissection which comprises SSEA-3 positive pluripotent stem cells derived from living mesenchymal tissues or cultured mesenchymal cells.
  • the cell preparation according to [1] or [2] which is intended to reduce or suppress dilation of a vascular condition.
  • the cell preparation according to [1] or [2] which is intended to reduce or suppress stenosis or occlusion of a vascular condition.
  • the pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell having any one of the following properties: (I) Low or no telomerase activity; (Ii) Has the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; (Iii) show no neoplastic growth; and (iv) have self-renewal ability.
  • pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell having all of the following properties: (I) Low or no telomerase activity; (Ii) Has the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; (Iii) show no neoplastic growth; and (iv) have self-renewal ability.
  • pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell having any one of the following properties: (I) SSEA-3 positive; (Ii) CD105 positive; (Iii) Low or no telomerase activity; (Iv) has the ability to differentiate into one of the three germ layers; (V) show no neoplastic growth; and (vi) have self-renewal ability.
  • pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell having all of the following properties: (I) SSEA-3 positive; (Ii) CD105 positive; (Iii) Low or no telomerase activity; (Iv) has the ability to differentiate into one of the three germ layers; (V) show no neoplastic growth; and (vi) have self-renewal ability.
  • Muse cells by administering Muse cells from a blood vessel or the like to a patient with arterial dissection, Muse cells accumulate in the dissected blood vessels, maintain a high proportion of elastic fibers, and expand the pseudocavity over time. It is possible to prevent the extension or rupture of the dissection and the swelling of the false lumen to form an aneurysm (so-called dissecting aortic aneurysm), and to treat the arterial dissection. Therefore, the cell preparation containing Muse cells of the present invention can be used for the treatment of arterial dissection.
  • Muse cells can efficiently migrate and engraft at the damaged site of a blood vessel that has undergone dissociation, etc., do not necessarily require local administration, can be administered intravenously, and spontaneously engraft at the engrafted site. Since it differentiates into cells according to the tissue, it is not necessary to induce differentiation into cells to be treated in vitro prior to transplantation. In addition, since it is originally in the living body, it is non-tumor-forming and has excellent safety. In addition, Muse cells have immunomodulatory capacity and do not require human leukocyte antigen (HLA) compatibility or long-term immunosuppressive agents that are normally required for donor cell transplantation. Can be treated by direct administration. Therefore, Muse cells with the above-mentioned excellent performance can provide an easily viable means for the treatment of arterial dissection.
  • HLA human leukocyte antigen
  • C Number of double positive cells for GFP and ⁇ SMA per dissected vessel area (mm 2 ).
  • D white iron shows double-positive cells of GFP and CD31 on the dissected vessel wall 4 weeks after Muse cell administration. *: False cavity, scale bar: 200 ⁇ m (low magnification), 50 ⁇ m (high magnification).
  • E CD31 positive rate (%) of GFP-positive cells.
  • A Elastica-Masson stained image of each group. Scale bar: 200 ⁇ m.
  • B Percentage of elastic fiber area in new intima and media of dissected blood vessels (%). * P ⁇ 0.05 (Steel-Dwas test) (B). The therapeutic effect of elastin knockdown Muse cells is shown.
  • A Elastin gene expression level in Muse cells, shRNA control Muse cells, and elastin KD-Muse cells by ddPCR.
  • B Measurement of dissected blood vessel diameter by contrast CT.
  • C Dissociation blood vessel diameter expansion rate, which is the degree of expansion of the diameter at 4 weeks and 8 weeks after cell administration, based on the diameter on the first day of dissociation.
  • D Ratio (%) of the area of elastic fibers to the area of the new intima and media of dissected blood vessels by Elastica-Masson staining. * P ⁇ 0.05 (Steel-Dwass test) (D).
  • the present invention relates to a cell preparation for treating arterial dissection, which comprises SSEA-3 positive pluripotent stem cells. More preferably, it relates to a cell preparation containing pluripotent stem cells effective for the prevention and / or treatment of dissection blood vessel diameter expansion due to arterial dissection and consequent blood vessel rupture.
  • the treatment includes cure, alleviation, and prevention of recurrence of the disease or symptom.
  • Prevention also includes preventing or delaying the onset of the disease or condition, or reducing the risk of onset.
  • the present invention will be described in detail below.
  • the cell preparation containing the SSEA-3 positive pluripotent stem cells (for example, Muse cells) of the present invention is used for the treatment of arterial dissection and the like.
  • Aortic dissection is based on the dissection of the aortic wall and the inflow of blood into it, and since it changes over time immediately after the onset, it presents a dynamic pathology.
  • the lesion spreads over a wide range of blood vessels, it shows various pathological conditions, and the vascular condition is divided into 1) dilation, 2) rupture, and 3) stenosis or occlusion, and further understood in combination with the site where dissociation occurs. Will be done.
  • vascular condition refers to an artery, preferably the aorta, and includes an artery in which the lesion has already extended (particularly the aorta).
  • vascular condition refers to aortic valve insufficiency, aneurysm formation, and the like.
  • rupture of the vascular condition means cardiac tamponade, bleeding into the thoracic cavity or other parts.
  • stenosis or occlusion refers to peripheral circulatory disorders due to stenosis / occlusion of branched arteries, such as angina, myocardial infarction, cerebral ischemia, upper limb ischemia, antiparalysis, intestinal ischemia, renal failure, and lower limbs. It refers to ischemia. According to the present invention, these vascular conditions can be reduced or suppressed.
  • Reduction includes delaying the appearance of the vascular condition, reducing the frequency, reducing the severity, and the like.
  • compression includes partially or completely reducing the appearance of the vascular condition and is used interchangeably with “inhibition”.
  • Classification of aortic dissection includes 1) classification by dissection range, 2) classification by blood condition of pseudocavity, and 3) classification by stage.
  • ⁇ Acute phase (within 2 weeks of onset, of which 48 hours or less is called hyperacute phase)
  • ⁇ Subacute phase more than 2 weeks and within 3 months after onset
  • ⁇ Chronic phase more than 3 months after onset
  • the aortic dissection in the present invention includes the aortic dissection in any of the above pathological conditions and / or the aortic dissection in any of the classifications. Further, the aortic dissection in the present invention preferably belongs to, for example, type B in the Stanford classification in the classification by the dissection range, and belongs to the acute stage in the classification by the stage. Further, the aortic dissection in the present invention is, for example, "acute” according to "Fig. 49: Diagnosis and treatment cascade of acute aortic dissection” (page 49) described in "Aortic aneurysm / aortic dissection medical treatment guideline (2020 revised edition)". Patients diagnosed with "aortic dissection” may be treated (see Fig. 1), and the expansion of the dissected blood vessel diameter due to the arterial dissection, the accompanying rupture of the blood vessel, and the subsequent transition to a dissecting aneurysm are prevented and / It can also be treated.
  • the present invention also includes arterial dissection that occurs in arteries other than the aorta.
  • Arterial dissections that occur in arteries other than the aorta include arterial dissections that occur in the middle and peripheral arteries, as well as cerebral arteries (such as carotid and vertebral arteries), coronary arteries, and other arteries (pulmonary arteries, hepatic arteries, splenic arteries, etc.). It also includes arterial dissection that occurs in the iliac arteries and visceral abdominal arteries (peritoneal arteries, superior mesenteric arteries, etc.). Therefore, the "arterial dissection" of the present invention includes “aortic dissection” and "arterial dissection occurring in arteries other than the aorta”.
  • Pluripotent stem cells The pluripotent stem cell used in the cell preparation of the present invention is a cell that Dezawa et al. Found its existence in a human body and named it "Muse (Multipleage-differentiation Stress Enduring) cell". Muse cells can be obtained from bone marrow fluid, adipose tissue (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17, 2014)), dermal connective tissue of the skin, and the like. It is known that it is widely present in connective tissues of tissues and organs.
  • this cell is a cell having both pluripotent stem cell and mesenchymal stem cell properties, and is, for example, a cell surface marker "SSEA-3 (Stage-specific embryonic antigen-3)" positive cell, preferably. Is identified as SSEA-3 positive and CD105 positive double positive cells. Therefore, a Muse cell or a cell population containing a Muse cell can be separated from a living tissue using, for example, SSEA-3 alone or the expression of SSEA-3 and CD105 as an index. Details such as Muse cell separation methods, identification methods, and characteristics are disclosed in International Publication No. 2011/007900.
  • Muse cells can be selectively concentrated by culturing under various external stress conditions such as the presence of a substance, the presence of active oxygen, mechanical stimulation, and pressure treatment.
  • pluripotent stem cells prepared from living mesophyll tissue or cultured mesenchymal tissue using SSEA-3 as an index. Cells) or cell populations containing Muse cells may simply be referred to as "SSEA-3 positive cells”.
  • the “non-Muse cell” may refer to a cell contained in a living mesenchymal tissue or a cultured mesenchymal cell and other than a “SSEA-3 positive cell”. be.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be prepared from living tissues (eg, mesenchymal tissues) using the cell surface markers SSEA-3 or SSEA-3 and CD105 as indicators.
  • the "living body” means a living body of a mammal.
  • the living body does not include a fertilized egg or an embryo in the developmental stage before the blastogenic stage, but includes a fetus or an embryo in the developmental stage after the blastogenic stage including the blastulatory embryo.
  • Mammals include, but are not limited to, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats, rabbits and guinea pigs, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, ferret and the like.
  • Muse cells used in the cell preparation of the present invention are clearly distinguished from embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem (iPS) cells in that they are directly separated from living tissues with markers.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • “membranous tissue” refers to tissues such as bone, synovial, fat, blood, bone marrow, skeletal muscle, dermal, ligament, tendon, dental pulp, umbilical cord, umbilical cord blood, sheep membrane, and tissues existing in various organs.
  • Muse cells can be obtained from bone marrow, skin, adipose tissue, blood, dental marrow, umbilical cord, umbilical cord blood, amniotic membrane and the like.
  • Muse cells may be prepared from cultured mesenchymal cells such as fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells using the above-mentioned preparation means.
  • the cell population containing Muse cells used in the cell preparation of the present invention provides cells resistant to the external stress by giving an external stress stimulus to the mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells of the living body. It can also be prepared by a method involving the recovery of cells that have been selectively grown to increase their abundance.
  • the external stress is protease treatment, culture at low oxygen concentration, culture under low phosphoric acid condition, culture at low serum concentration, culture under low nutrition condition, culture under heat shock exposure, low temperature. Culturing in, freezing treatment, culturing in the presence of harmful substances, culturing in the presence of active oxygen, culturing under mechanical stimulation, culturing under shaking treatment, culturing under pressure treatment or physical impact. It may be any or a combination of two or more.
  • the total treatment time with the protease is preferably 0.5 to 36 hours in order to give external stress to the cells.
  • the protease concentration may be any concentration used when peeling off the cells adhered to the culture vessel, breaking up the cell mass into a single cell, or recovering a single cell from the tissue.
  • the protease is preferably serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metal protease, glutamate protease or N-terminal threonine protease. Further, it is preferable that the protease is trypsin, collagenase or dispase.
  • the Muse cell used may be autologous or allogeneic to the recipient receiving the cell transplant.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be prepared from living tissues using, for example, SSEA-3 positive or double positive of SSEA-3 and CD105 as an index, but on human adult skin. Is known to include various types of stem cells and precursor cells. However, Muse cells are not the same as these cells.
  • Such stem cells and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKP), neural ridge stem cells (NCSC), melanoblasts (MB), perivascular cells (PC), endothelial progenitor cells (EP), and adipose-derived stem cells (ADSC). ).
  • SSEA-3 positive or double positive of SSEA-3 and CD105 as an index
  • Such stem cells and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKP), neural ridge stem cells (NCSC), melanoblasts (MB), perivascular cells (PC), endothelial progenitor cells (EP), and adipose-derived stem cells (ADSC).
  • Muse cells can be prepared
  • Muse cells include CD34 (marker of EP and ADSC), CD117 (c-kit) (marker of MB), CD146 (marker of PC and ADSC), CD271 (marker of NCFR), NG2 (PC marker), vWF factor (von Willebrand factor) (EP marker), Sox10 (NCSC marker), Sai1 (SKP marker), Slug (SKP marker), Typ1 (MB marker), and At least one of 11 markers selected from the group consisting of Dct (MB marker), for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 The non-expression of 11 or 11 markers can be used as an index.
  • the non-expression of CD117 and CD146 can be used as an index, and further, the non-expression of CD117, CD146, NG2, CD34, vWF and CD271 can be used as an index. It can be prepared using the non-expression of 11 markers as an index.
  • the Muse cells having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention are as follows: (I) Low or no telomerase activity; (Ii) Has the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; It may have at least one property selected from the group consisting of (iii) showing no neoplastic growth; and (iv) having self-renewal ability.
  • the Muse cells used in the cell preparation of the present invention have all the above-mentioned properties.
  • the Muse cells having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention are as follows: (I) SSEA-3 positive; (Ii) CD105 positive; (Iii) Low or no telomerase activity; (Iv) has the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; It may have at least one property selected from the group consisting of (v) no neoplastic growth; and (vi) capable of self-renewal.
  • the Muse cells used in the cell preparation of the present invention have all the above-mentioned properties.
  • telomerase activity means, for example, when the telomerase activity is detected using TRAPEZE XL telomerase detection kit (Millipore), it is low or cannot be detected.
  • Low telomerase activity means, for example, telomerase having the same level of telomerase activity as human fibroblasts, which are somatic cells, or telomerase of 1/5 or less, preferably 1/10 or less of that of Hela cells. It means having activity.
  • the Muse cell has the ability to differentiate into three germ layers (endoderm lineage, mesodermal lineage, and ectodermal lineage) in in vitro and invivo.
  • Hepatic cells including hepatoblasts or cells expressing hepatocyte markers
  • nerve cells skeletal muscle cells, smooth muscle cells, bone cells, fat cells, etc.
  • it may show the ability to differentiate into three germ layers.
  • it has the ability to migrate and engraft in injured organs (heart, skin, spinal cord, liver, muscle, etc.) by transplanting into a living body by intravenous injection, and to differentiate into cells according to the tissue.
  • Muse cells proliferate at a proliferation rate of about 1.3 days, but in suspension culture, they proliferate from one cell to form an embryonic body-like cell mass and reach a certain size. It has the property that proliferation stops in about 14 days, but when these embryo-like cell clusters are transferred to adherent culture, cell proliferation is started again, and cells proliferated from the cell clusters proliferate for about 1.3 days. It spreads at a speed. Furthermore, when transplanted into the testis, it has the property of not becoming cancerous for at least half a year.
  • Muse cells have self-renewal (self-renewal) ability.
  • self-renewal means that the differentiation of cells contained in embryo-like cell mass obtained by culturing from one Muse cell in suspension culture to trigermoid cells can be confirmed at the same time. By bringing the cells of the embryo-like cell mass into the suspension culture again with one cell, the next generation embryo-like cell mass is formed, and from there, the embryos in the three germ layer differentiation and suspension culture are again formed. It means that an adenomorphic cell mass can be confirmed. Self-renewal may be repeated one or more cycles.
  • the cell preparations containing Muse cells of the present invention are not limited, but the Muse cells obtained in (1) above or a cell population containing Muse cells can be mixed with physiological saline or a cell population containing Muse cells. It is obtained by suspending in a suitable buffer (eg, phosphate buffered physiological saline). In this case, if the number of Muse cells separated from autologous or allogeneic tissues is small, the cells may be cultured before cell transplantation and proliferated until a predetermined number of cells is obtained. As already reported (International Publication No.
  • Muse cells do not become tumors, so even if cells recovered from living tissues are contained in an undifferentiated state, there is a possibility of canceration. Low and safe.
  • the culture of the collected Muse cells is not particularly limited, but can be carried out in a normal growth medium (for example, ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum). More specifically, with reference to the above-mentioned International Publication No. 2011/007900, in the culture and proliferation of Muse cells, a medium, additives (for example, antibiotics, serum) and the like are appropriately selected, and a predetermined concentration of Muse cells is obtained. The containing solution can be prepared.
  • a medium, additives for example, antibiotics, serum
  • a cell preparation containing Muse cells of the present invention When a cell preparation containing Muse cells of the present invention is administered to a human subject, it is effective to collect bone marrow fluid from human intestinal bone and, for example, culture bone marrow mesenchymal stem cells as adherent cells from the bone marrow fluid. After increasing the therapeutic amount of Muse cells until the resulting cell volume is reached, the Muse cells can be isolated using the SSEA-3 antigen marker as an index, and autologous or allogeneic Muse cells can be prepared as cell preparations. Alternatively, for example, bone marrow mesenchymal stem cells obtained from bone marrow fluid are cultured under external stress conditions to proliferate and concentrate Muse cells until an effective therapeutic amount is reached, and then autologous or allogeneic Muse cells are cultured.
  • the cell preparation of the present invention can be a cell population containing Muse cells, preferably containing at least 30% of Muse cells, and preferably containing at least 50%, 60%, 70%, 80%, or 85%. Is more preferable, and it is further preferable to contain at least 90%.
  • Muse cells when using Muse cells for cell preparations, dimethylsulfoxide (DMSO), serum albumin, etc. are contained in the cell preparations to protect the cells, and antibiotics, etc. are contained in the cell preparations to prevent bacterial contamination and proliferation. May be.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • other pharmaceutically acceptable ingredients eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, saline, etc.
  • Those skilled in the art can add these factors and agents to the cell preparation at appropriate concentrations.
  • Muse cells can also be used as a pharmaceutical composition containing various additives.
  • the number of Muse cells contained in the cell preparation prepared above takes into consideration the sex, age, body weight, condition of the affected area, condition of the cells used, etc. of the subject so that the desired effect can be obtained in the treatment of arterial dissection. Then, it can be adjusted as appropriate.
  • the target individual includes, but is not limited to, mammals such as humans.
  • the cell preparation containing Muse cells of the present invention can be used at multiple times and at appropriate intervals (for example, twice a day, once a day, twice a week, 1) until a desired therapeutic effect is obtained. It may be administered once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, once every three months, once every six months).
  • the therapeutically effective amount is, for example, 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 10 cells per individual, and the dose is 1 to 10 times in one year. preferable.
  • the total dose to be administered in one individual is not limited, but is limited to 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 11 cells, preferably 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, and more preferably 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10. 9 cells and the like can be mentioned.
  • the Muse cells used in the cell preparation of the present invention have the property of migrating to the damaged site of blood vessels and engrafting. Therefore, in the administration of the cell preparation, the administration site and the administration method of the cell preparation are not limited, and intravascular administration (intravenous, intraarterial), local administration and the like are exemplified.
  • the cell preparation containing Muse cells of the present invention maintains a high proportion of elastic fibers through repair and regeneration of the damaged site of a patient with arterial dissection, and the dissection is expanded or ruptured due to the expansion of the pseudocavity over time, and the pseudocavity is generated. It is possible to prevent swelling and aneurysm (so-called dissecting aneurysm) and realize treatment for arterial dissection.
  • Example 1 Preparation of human Muse cells Muse cells were obtained according to the method described in International Publication No. 2011/007900 on the separation and identification of human Muse cells.
  • Commercially available mesenchymal cells (MSC, Lonza) were used as the source of Muse cells.
  • Muse cells used for transplantation were separated by MACS (Magnetic Activated Cell Selection) as SSEA-3 positive cells in order to confirm that they had engrafted in each tissue.
  • MACS Magnetic Activated Cell Selection
  • the results are shown in FIG.
  • the gate of P1 is an SSEA-3 positive cell (Muse cell)
  • the gate of P2 is an SSEA-3 negative cell (non-Muse cell).
  • 5.0 ⁇ 0.9% of Muse cells were present in the MSC derived from human bone marrow, and sorting with MACS was able to increase the purity of Muse cells to 76.5 ⁇ 6.0%.
  • GFP-lentivirus gene was introduced so as to express green fluorescent protein (GFP) so that the cells could be labeled by this during histopathological evaluation.
  • GFP-lentivirus was introduced into MSC, and Muse cells were separated from them as double positive cells of GFP and SSEA-3 by FACS (fluorescence activated cell selection). Further, as a control, the remaining cells obtained by separating Muse cells from the MSC can be referred to as a "non-Muse cell group", and the MSC itself expressing GFP can also be included in the "MSC group" and used.
  • Example 2 Preparation of aortic dissection model mouse
  • the experimental protocol using mice in this example complies with the "Rules for Animal Experiments, etc. of Tohoku University", and the experimental animals are under the supervision of the Animal Experiment Center of Tohoku University. Made in accordance with the above regulations.
  • Acute type B aortic dissection model mice were used as aortic dissection model mice (Kurihara A et al. Circulation. 2012; 126: 3070-3080 partially modified). Specifically, an inhibitor of lysyl oxidase that matures and cross-links elastin and collagen, which are the main proteins of extracellular matrix, using C57BL6 / N strain mice (male 4 weeks old, body weight 12.5 to 18.5 g).
  • BAPN ⁇ -Aminopropionitrile fumarate
  • a fragile aortic wall is formed by BAPN, and aortic dissection develops one day after administration of AngII.
  • the mortality rate 24 hours after the onset of dissociation was about 20%, and the mortality rate up to 8 weeks after that was about 30%. Since human patients with acute type B dissection rarely receive antihypertensive or rest therapy, it is difficult to simply compare the mortality rate with the acute type B dissection model in these mice. However, the mortality rate 24 hours after the onset of the previous acute type B dissection model was 30%, and the mortality rate 48 hours later was 70% (Anzai A et al. CircRes 2015; 116: 612-23). Considering this, it can be said that the model mouse creation method of this experiment is effective. The cause of death in the model mouse was the rupture of the dissected blood vessel.
  • Example 3 Administration of Muse cells, etc.
  • the dissociation status was evaluated by contrast CT within 24 hours after the onset of dissociation, and the aortic dissociation model mice having aortic dissociation were randomly divided into groups.
  • Physiological saline Vehicle group
  • mesenchymal stem cells 5.0 ⁇ 10 4 cells / individual, 7.5 ⁇ 10 5 cells / individual: MSC-50K group, MSC-750K group
  • Muse cells (2 ⁇ 10) Any one of 4 cells / individual, 5 ⁇ 10 4 cells / individual, 8 ⁇ 10 4 cells / individual: Muse group) was administered by injecting into the tail vein of mice in each group.
  • Example 4 Survival rate of Stanford type B acute aortic dissection model After confirming dissection by CT within 24 hours after the onset of dissection of the acute type B aortic dissection model mouse prepared in Example 2, immediately, physiological saline solution (Vehicle group), mesenchymal stem cells (5.0 ⁇ 10 4 cells / individual, 7.5 ⁇ 10 5 cells / individual: MSC-50K group, MSC-750K group), Muse cells (5 ⁇ 10 4 cells / individual) Individuals: Muse group) were administered, and the survival time of each group up to 8 weeks after administration of various cells was examined by the Kaplan-Meier method.
  • physiological saline solution Vehicle group
  • mesenchymal stem cells 5.0 ⁇ 10 4 cells / individual, 7.5 ⁇ 10 5 cells / individual: MSC-50K group, MSC-750K group
  • Muse cells 5 ⁇ 10 4 cells / individual
  • Individuals: Muse group were administered, and the survival time of each group up to 8 weeks after administration of various cells was
  • the number of administered cells was set to the same number ( 5 ⁇ 104 cells / individual) as in the Muse group, and in the MSC-750K group, the Muse cells used this time (about 76% Muse) were set.
  • the amount of Muse cells converted in the case of MSC (containing about 5% Muse cells) (including cells) is set to be approximately the same as that of about 3.8 ⁇ 10 4 cells / individual.
  • the Muse group has a higher survival rate than the Vehicle group and the MSC-50K group, and there is no difference in the survival rate between the Vehicle group and the MSC-50K group.
  • a statistically significant difference was observed, with the Logrank test p ⁇ 0.05 and the Wilcoxon test p ⁇ 0.05.
  • the mortality rate up to 8 weeks in each group was 3/34 (8.8%) in the Muse group, 6/31 (19.4%) in the MSC-750K group, 10/30 (33.3%) in the Vehicle group, and MSC.
  • the odds ratio for death was 5.17 (95% confidence interval 1.26-21.11, p ⁇ 0.
  • Example 5 Evaluation of effect of suppressing dissection blood vessel diameter expansion
  • Aortic dissection model mouse Aortic CT is repeatedly imaged at three time points: 1 day after onset of dissection, 4 weeks after cell administration, and 8 weeks after cell administration. The enlargement of the dissected vessel diameter was evaluated.
  • the contrast medium the contrast medium Iomeron (registered trademark) 300, which is actually used by humans to image contrast CT, is used, and 0.4 ⁇ (mouse body weight g) ml / h is taken intravenously from 1 minute before the start of imaging. It was continuously administered for 2.5 minutes.
  • each group was administered with Muse cells (2 ⁇ 10 4 cells / individual, 5 ⁇ 10 4 cells / individual, 8 ⁇ 10 4 cells / individual). Based on the dissociated blood vessel diameter (before cell administration) measured by CT within 24 hours after the onset of dissociation, the expansion rate of the dissociated blood vessel diameter at 4 weeks and 8 weeks after cell administration was compared.
  • the Muse cell 5 ⁇ 10 4 administration group significantly suppressed the diameter expansion compared to the Muse cell 2 ⁇ 10 4 administration group, and no significant difference was observed from the Muse cell 8 ⁇ 10 4 administration group. .. That is, since there is no significant difference in the therapeutic effect between the Muse cell 5 ⁇ 10 4 administration group and the Muse cell 8 ⁇ 10 4 administration group, the dose number of Muse cells considered to be most suitable for treatment is 5 ⁇ 10 4 It was determined to be a cell / individual and used as a Muse group in subsequent tests.
  • the dissected blood vessel diameter was evaluated using a short-axis image on contrast-enhanced CT.
  • the early phase of contrast-enhanced CT is more suitable for diagnosing dissociation, and the examination rate is considerably high in clinical practice. Due to the rapid out, it was difficult to image the early phase with a single dose of contrast medium.
  • the contrast medium was continuously administered intravenously to enhance the contrast effect in the aorta and used as a substitute.
  • the usage and dosage of this contrast medium have not been reported, and it was the first to be performed in this experiment.
  • the presence or absence of the onset of type B dissection was evaluated based on whether or not the aortic lumen was two lumens in a plurality of short axis images.
  • individuals with dissection in the ascending aorta (type A dissection) were excluded.
  • the evaluation of the dissected vessel diameter was performed by comparing the aorta in the range from the distal left subclavian artery bifurcation to the lower left ventricular level, which includes most of the largest part, with the maximum minor diameter on the short axis image.
  • dissected blood vessel diameter varied depending on the individual at the time of onset, the comparison of dissected blood vessel diameters was made 4 weeks after cell administration and 8 weeks after cell administration based on the dissected blood vessel diameter on CT taken within 24 hours after the onset of dissection. We examined the ratio of how much it expanded.
  • the three groups that dissociated even 8 weeks after cell administration were compared with the Sham group (1.02 ⁇ 0.03 times), and the Diameter group (1.36 ⁇ 0.07 times) and the MSC-750K group (1. 23 ⁇ 0.11), the diameter of the Muse group (1.09 ⁇ 0.02 times) is significantly larger (p ⁇ 0.01), but the Muse group is the Vehicle group (p ⁇ 0.01) and MSC- Compared with the 750K group (p ⁇ 0.01), it was shown that there was a significantly more significant diameter expansion inhibitory effect than 4 weeks after cell administration. In addition, although it is relatively lesser than Muse cells (lesser extend), it was shown that the MSC-750K group has a significant effect of suppressing diameter expansion as compared with the Vehicle group (p ⁇ 0.05) (FIG. 5). ).
  • Example 6 Evaluation of in vivo aortic distribution and systemic distribution of Muse cells
  • Akaluc (Iwano S et al., Science 2018; 359: 935-9) was introduced into the labels of Muse cells and MSCs. After labeling the artificial enzyme Akaluc with green fluorescent protein (Venus), it was introduced into human bone marrow-derived MSC using lentivirus (created by Akaluc-MSC), and double positive cells of Venus and SSEA-3 were transferred to FACS. (Akaluc-Muse cell production).
  • a group administered intravenously (Akaluc-MSC-750K group) was prepared, and systemic localization in vivo was evaluated by IVIS Spectrum CT at 1, 4, and 8 weeks after cell administration. Localization of Akaluc-Muse cells and Akaluc-MSC is evaluated by Average Radiance (average value of brightness of organ surface emitted from light source (photons / sec / cm 2 / sr)), and signal intensity is Total Flux.
  • the total flux value of each organ of the Akaluc-Muse group and the Akaluc-MSC-750K group is the value obtained by subtracting the total flux (autofluorescence) of each organ of the Vehicle group.
  • the results are shown in FIGS. 6 and 7.
  • the results of IVIS showed that in the Akaluc-Muse group, a signal was confirmed from the distal arch aorta where dissection occurred in the aorta to the descending aorta to the upper part of the abdominal aorta, and the maximum intensity and range were 1 week, 4 weeks, and 8 weeks. It did not diminish even after the passage. No signal was observed in the lungs at any of the 1st, 4th, and 8th weeks. In the lower limb bones (femur, tibia), a weak signal was observed at 1 week of cell administration, but no signal was observed at 4 and 8 weeks (FIGS. 6A, 6C, 6E).
  • the luminous intensity of the Akaluc-Muse group was significantly higher than that of the Akaluc-MSC-750K group at all time points of cell administration 1, 4 and 8 weeks in the aorta, and 1 week. 3.19 times (1562 ⁇ 86 vs 489 ⁇ 108; P ⁇ 0.001) (Fig. 6B), 3.85 times (1853 ⁇ 448 vs 481 ⁇ 146; P ⁇ 0.01) at 4 weeks (Fig. 6D) ), It was 3.68 times (2058 ⁇ 625 vs. 559 ⁇ 112; P ⁇ 0.05) at 8 weeks (Fig. 6F).
  • the brightness of the Akaluc-MSC-750K group was significantly higher than that of the Akaluc-Muse group at 1 week of cell administration (5400 ⁇ 2287 vs. no signal, P ⁇ 0.05), but at 4 and 8 weeks. No signal was observed, and no significant difference was observed.
  • Example 7 Evaluation of Muse Cell Differentiation Locally Dissected Vascular by Fluorescent Immunostaining (Anti-GFP and Anti- ⁇ SMA), (Anti-GFP and Anti-CD31)
  • GFP-introduced Muse cells or MSCs are administered by the method described above (Muse group or MSC-750K group).
  • the cells were sacrificed 4 to 8 weeks after administration, and the inside of the blood vessel was washed out with PBS, and then the whole trunk was immersed and fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours. After that, the aorta was removed from the ascending to the bifurcation of the common iliac artery and embedded with a frozen tissue embedding agent.
  • Sections of 6 ⁇ m in the short axis direction of the aorta were prepared and subjected to fluorescent immunostaining to evaluate the differentiation of Muse cells into vascular smooth muscle.
  • Rabbit anti-GFP antibody (1: 500) as primary antibody
  • mouse anti- ⁇ SMA (Smooth Muscle Actin) antibody (1: 200) as smooth muscle markers
  • Alexa 594-labeled donkey anti-rabbit antibody and Alexa 680-labeled donkey as secondary antibodies.
  • An anti-mouse antibody (1: 500) was used.
  • fluorescent immunostaining was performed to evaluate the differentiation of Muse cells into vascular endothelial cells.
  • Rabbit anti-GFP antibody (1: 500) as primary antibody and goat anti-CD31 IgG antibody (1:50) which is an endothelial cell marker, Alexa 594-labeled donkey anti-rabbit antibody and Alexa 647-labeled donkey anti-goat antibody (Alexa 647-labeled donkey anti-goat antibody) as secondary antibodies. 1: 500) was used. The ratio of the number of ⁇ SMA-positive cells or the number of CD31-positive cells (double-positive cells) among the GFP-positive cells in the media or intima of the dissected aorta was further counted.
  • the number of double-positive cells of GFP and ⁇ SMA and the number of double-positive cells of GFP and CD31 per dissected aorta area were counted.
  • the number of cells was counted in 5 sections for each aortic tissue, and the average was calculated.
  • Fig. 8 The results are shown in Fig. 8.
  • GFP and ⁇ SMA double-positive cells were observed in the dissected vascular media at 4 and 8 weeks, and GFP and CD31 double-positive cells were observed in the dissected angiogenic intima (FIGS. 8A and 8D).
  • a similar tendency was observed in the MSC-750K group, but the number was smaller than that in the Muse group.
  • the ⁇ SMA positive rate of GFP-positive cells in the media of dissected blood vessels was 42.3 ⁇ 8.8% at 4 weeks, compared with 22.8 ⁇ 4.0% in the MSC-750K group. It was statistically significantly higher and 1.86 times higher (P ⁇ 0.05).
  • the Muse group was 46.3 ⁇ 8.5%, which was statistically significantly higher than the MSC-750K group 22.2 ⁇ 3.7%, 2.09 times (P). ⁇ 0.05) and the difference widened (Fig. 8B).
  • the Muse group was 9.0 ⁇ 0.3%, which was statistically significantly higher than the MSC-750K group 4.0 ⁇ 1.8% (P ⁇ 0.05). ), 2.25 times (Fig. 8E).
  • the number of double-positive cells of GFP and ⁇ SMA per dissociated vessel area was 115.9 ⁇ 17.5 cells / mm 2 at 4 weeks in the Muse group, and 20.2 ⁇ 7.8 in the MSC-750K group. It was statistically significantly higher than the number / mm 2 (P ⁇ 0.001) (FIG. 8C).
  • the Muse group was 130.1 ⁇ 11.7 pcs / mm 2 , which was statistically significant compared to 14.8 ⁇ 4.8 pcs / mm 2 in the MSC-750K group. Many (P ⁇ 0.05), the difference expanded to 8.79 times (Fig. 8C).
  • the number of double-positive cells of GFP and CD31 per dissociated blood vessel area was 19.5 ⁇ 6.9 cells / mm 2 at 4 weeks in the Muse group, and 3.9 ⁇ 0 in the MSC-750K group. It was statistically significantly higher than .6 / mm 2 (P ⁇ 0.05) (Fig. 8F).
  • the Muse group was 19.7 ⁇ 8.0 pieces / mm 2 , which was statistically significant compared to 2.9 ⁇ 1.0 pieces / mm 2 in the MSC-750K group. Many (P ⁇ 0.05), the difference expanded to 6.79 times (Fig. 8F).
  • Example 8 Evaluation of Vascular Elastic Fiber Area (Elastica-Masson Staining) Eight weeks after the onset of dissection, the blood vessel diameter was evaluated by contrast-enhanced CT, the model mouse was slaughtered, and the inside of the blood vessel was washed out with PBS, and then 4 The whole trunk was immersed and fixed in% paraformaldehyde for 24 hours. After that, the aorta was removed from the ascending to the bifurcation of the common iliac artery and embedded in paraffin. Sections of 3 ⁇ m in the short axis direction of the aorta were prepared and stained with Elastica-Masson as an evaluation of elastic fibers.
  • Fig. 9A The results are shown in Fig. 9.
  • the ratio of elastic fiber area (Elastin area) (%) to the area of new intima and media was 43.5 ⁇ 1.2% in the Sham group, 21.5 ⁇ 2.0% in the Vehicle group, and MSC-750K group. 27.8 ⁇ 1.7% and 33.6 ⁇ 1.9% in the Muse group, showing a statistically significant difference in comparison between all groups (P ⁇ 0.05) (Fig. 9B).
  • the elastic fiber composition ratio in the dissected aorta was significantly higher in the Muse group than in the Vehicle group and the MSC-750 group, and was significantly higher in the MSC-750 group than in the Vehicle group.
  • Example 9 Elastic fiber production effect by elastin knockdown Muse cells Significantly suppressed expansion of dissociated blood vessel diameter (Fig. 5) and a high proportion of elastic fiber regions (Fig. 9B) were observed in the Muse group, and Muse cells homing to the dissociation site. It was suggested that is differentiated into vascular smooth muscles that produce elastic fibers (FIGS. 8A, 8B, 8C). It was assumed that the effect of suppressing the expansion of the dissociated aortic diameter was obtained. Therefore, elastin shRNA lentivirus was transfected and Muse cells in which elastin production was suppressed were intravenously administered. Then, the dissected aortic diameter was measured by contrast CT to evaluate the contribution of elastic fiber production in Muse cells.
  • Elastin shRNA lentivirus (sc-43360-V, Santa Cruz Biotechnology) was transfected into MSC, and Muse cells (elastin knockdown Muse cells) into which elastin shRNA was introduced were sorted by FACS as SSEA-3 positive cells. gone.
  • Muse cells elastin knockdown Muse cells
  • SSEA-3 positive cells sorted by FACS as SSEA-3 positive cells. gone.
  • 4 ⁇ 10 elastin knockdown Muse cells were intravenously administered within 24 hours after the onset of dissociation (elastin KD-Muse group).
  • control shRNA lentivirus (sc-108080, Santa Cruz Biotechnology) was transfected into MSC in the same manner, and Muse cells into which control shRNA was introduced (SHRNA control Muse cells) were sorted by FACS.
  • RNA extraction kits (NucleoSpin RNA XS, Takara Bio Inc., Shiga, Japan) were used for the extraction and purification of RNA from various Muse cells.
  • SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen, Waltham, Mass) was used for the synthesis of single-stranded cDNA.
  • elastin elastin, Hs00355783
  • primer m1 Thermo-Fisher Scientific
  • FIG. 10A The results are shown in FIG.
  • the expression level of the elastin gene was examined by ddPCR in elastin KD-Muse cells, shRNA-controlled Muse cells, and Muse cells.
  • elastin KD-Muse cells the expression level of elastin gene was compared with that of shRNA-controlled Muse cells. It was 3% lower (Fig. 10A).
  • the dissected blood vessel diameter was measured by contrast-enhanced CT in the same manner as described above (FIG. 10B).
  • the ratio (%) of the area of the elastic fibers to the area of the new intima and media of the dissected blood vessel was 8 weeks after the cell administration.
  • the Muse group shows an excellent effect of suppressing dissection blood vessel diameter expansion (FIG. 5), and dissection.
  • the number of ⁇ SMA and CD31 positive cells in blood vessels was large (FIGS. 8B, 8C, 8E, 8F), and a large amount of elastic fibers was maintained (FIG. 9B). This may be due to the fact that Muse cells in the MSC-750K group have a lower migration rate to dissected blood vessels than Muse cells in the Muse group (FIG. 6).
  • Sphingosine-1-phosphate is a substance produced from a damaged tissue and induces migration of Muse cells to the damaged tissue, and S1P-S1P receptor 2 is used for selective migration of Muse cells to the damaged tissue.
  • the axis (Yamada Y, et al. CircRes. 2018; 122: 1069-83) is involved.
  • Non-Muse cells (712,000) contained in a larger amount than Muse cells (38,000) in the MSC-750K group affected the difference in action and effect between the MSC-750K group and the Muse group. It is suggested that there is a possibility.
  • Muse cells When the cell preparation of the present invention is administered to a patient who develops arterial dissection, Muse cells accumulate in the dissected blood vessels, maintain a high proportion of elastic fibers, and the dissection expands or ruptures due to the expansion of the pseudocavity over time. It can be applied to the treatment of arterial dissection by preventing the false lumen from swelling and becoming aneurysm (so-called dissecting aneurysm).

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Abstract

本発明は、動脈解離を治療するための再生医療用医薬品を提供することを目的とする。本発明によれば、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、動脈解離を治療するための細胞製剤が提供される。動脈解離は好ましくは大動脈解離、さらに好ましくは急性大動脈解離スタンフォードＢ型に属するものである。

Description

動脈解離の治療剤
　本発明は、再生医療のための細胞製剤に関する。より具体的には、動脈解離の治療、更に好ましくは、動脈解離による解離血管径の拡大とそれに伴う血管破裂の予防及び／又は治療に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。
　大動脈は、体内で最も太い動脈で、左心室から送られてきた酸素を多く含む血液を、肺を除く全身の組織へ送り出している。心臓から出てまず上に向かい（上行大動脈）、弓状に曲がって背中側に回りながら脳や腕に向かう動脈が枝分かれし（弓部大動脈）、その後、大動脈は下に向かう（下行大動脈）。ここまでが胸部大動脈で、横隔膜を貫くと腹部大動脈と名前を変え、腹部の臓器へ数本枝分かれした後、２つに分岐して左右の腸骨動脈となり、下肢に血液を供給する。
　この大動脈に関する疾患として、主要なものに大動脈瘤と大動脈解離がある。大動脈瘤と大動脈解離は、ともに大動脈が拡張する疾患であり、血圧のコントロール、外科的手術による人工血管置換術、血管内ステントグラフト内挿術等、その治療方法は同様なものであるが、疾患としては大きく異なっている。
　大動脈は、内膜、中膜、外膜の３層で構成されているが、大動脈瘤では、その３層の大動脈壁が変性しそのまま膨らんで瘤を生じるのに対し、大動脈解離では、内膜にできた傷（エントリー）から中膜に血液が流入する等の原因により、中膜が裂けて大動脈壁が２層に分離し、動脈の走行に沿って２腔になった（偽腔が生じた）状態である。
　大動脈解離は、上記のように大動脈中膜が突然断離する致死的疾患であるが、本邦において年間約１万例と推測される発症者うち約４０００例が手術対象となっており、なお増加傾向にある。社会的責任が大きくなる５０歳以上の男性に多く発生することから、社会的な影響も大きい。
　現在、一般的な大動脈解離の治療としては、発症後早期に破裂を生じ致死的な可能性が高いスタンフォード（Stanford）Ａ型解離では人工血管置換術が行われている。また、発症後早期に破裂を生じないことが多い合併症のないスタンフォードＢ型解離では、まず降圧療法が選択され、必要であれば経時的な偽腔の拡大による解離の伸展や破裂、偽腔が膨らんで瘤化（いわゆる、解離性大動脈瘤）することを防止するため血管内ステントグラフト内挿術が行なわれているが、大動脈解離に対するステントグラフト治療は認可されてから１０余年と日が浅く、長期予後は不明である。また、急性期にこれらの治療が奏功した場合でも、慢性期に解離血管径が拡大し、再ステントグラフト内挿術や胸腹部大動脈置換術が必要となる例もしばしば見られ、問題となっている。つまり、スタンフォードＢ型解離であっても、現在確立されている慢性的な破裂を予防する根本的な治療は、解離血管の人工血管置換術しか存在しない。また、高齢者に対する胸腹部大動脈置換術はスタンフォードＡ型解離に対する人工血管置換術同様に侵襲が大きいものであることに加え、術後脊髄虚血による対麻痺など重大な合併症のリスクもある。
　一方、出澤らの研究により、間葉系細胞画分に存在し、遺伝子導入やサイトカイン等による誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（例えば、特許文献１；非特許文献１～３）。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｊａｎ １７，２０１４））や皮膚の真皮結合組織等から得ることができるほか、広く組織や臓器の結合組織に存在することが知られている。そして、特許文献２にはＭｕｓｅ細胞が大動脈に関する疾患のうち大動脈瘤の治療に有効であることが開示されている。しかし、Ｍｕｓｅ細胞が大動脈解離の治療に有効であることは知られていない。
国際公開第２０１１／００７９００号 国際公開第２０１８／０２１５１５号
Kuroda Y et al. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 8639-8643. Wakao S et al. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 9875-9880. Kuroda Y et al. Nat Protc 2013; 8: 1391-1415.
　本発明は、動脈解離を治療するための細胞製剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、実験的に誘導された急性大動脈解離（スタンフォードＢ型）モデルマウスにヒトＭｕｓｅ細胞を投与することによって、Ｍｕｓｅ細胞が解離血管に集積し、大動脈中膜の構成細胞である血管平滑筋に分化し、弾性繊維を産生することと抗炎症作用により白血球の解離血管への浸潤を抑制することにより、弾性繊維の割合を高く保持し、経時的な偽腔の拡大による解離の伸展や破裂、偽腔が膨らんで瘤化（いわゆる、解離性大動脈瘤）することを防止し、大動脈解離を治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
　［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、動脈解離を治療するための細胞製剤。
　［２］動脈解離が大動脈解離である、［１］に記載の細胞製剤。
　［３］血管状態の拡張を低減又は抑制するためのものである、［１］又は［２］に記載の細胞製剤。
　［４］血管状態の破裂を低減又は抑制するためのものである、［１］又は［２］に記載の細胞製剤。
　［５］血管状態の狭窄又は閉塞を低減又は抑制するためのものである、［１］又は［２］に記載の細胞製剤。
　［６］大動脈解離が、スタンフォード分類のＢ型に属するものである、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［７］大動脈解離が、急性大動脈解離スタンフォードＢ型に属するものである、［６］に記載の細胞製剤。
　［８］大動脈解離が、スタンフォード分類のＡ型に属するものである、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［９］動脈解離が、大動脈以外の動脈に生じる動脈解離である、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［１０］大動脈以外の動脈に生じる動脈解離が、脳動脈、頸動脈、椎骨動脈、冠動脈、その他の動脈に生じる動脈解離である、［９］に記載の細胞製剤。
　［１１］前記多能性幹細胞が、以下の性質のいずれか１つを有する多能性幹細胞である、［１］～［１０］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
　［１２］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項［１］～［１０］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
　［１３］前記多能性幹細胞が、以下の性質のいずれか１つを有する多能性幹細胞である、［１］～［１０］のいずれかに記載の細胞製剤：
　（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
　（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
　（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
　（ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
　（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
　（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
　［１４］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、［１］～［１０］のいずれかに記載の細胞製剤：
　（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
　（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
　（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
　（ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
　（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
　（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
　本発明によれば、動脈解離の患者に対し、Ｍｕｓｅ細胞を血管等から投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が解離血管に集積し、弾性繊維の割合を高く保持し、経時的な偽腔の拡大による解離の伸展や破裂、偽腔が膨らんで瘤化（いわゆる、解離性大動脈瘤）することを防止し、動脈解離を治療することができる。したがって、本発明のＭｕｓｅ細胞を含む細胞製剤は動脈解離の治療に使用できることができる。
　Ｍｕｓｅ細胞は、解離などを生じた血管の障害部位に効率的に遊走して生着することができ、必ずしも局所投与の必要はなく、経静脈的投与も可能であり、生着した部位で自発的に組織に応じた細胞に分化するため、移植に先立って生体外で治療対象細胞への分化誘導が不要である。また、もともと生体にあるため非腫瘍形成性であり安全性にも優れる。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は免疫調整能を有し、ドナー細胞移植であれば通常必要とされるヒト白血球型抗原（Human Leukocyte Antigen; HLA）適合や長期にわたる免疫抑制剤を必要とせずに、ドナーＭｕｓｅ細胞を直接投与することによって治療が可能である。従って、上記に示す優れた性能を有するＭｕｓｅ細胞により、動脈解離の治療のため、容易に実行可能な手段を提供することができる。
大動脈解離の診断及び治療における現在のストラテジーを示す図である（「大動脈瘤・大動脈解離診療ガイドライン（2020年改訂版）」より引用）。 ＭＳＣのＦＡＣＳでの解析とＭＡＣＳでソーティングされた細胞群の内訳を示す。 解離モデルの各種細胞投与後の生存曲線を示す。 経時的な大動脈径の拡大率を示す図である。 経時的な大動脈径の拡大率を示す図である。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定）。 Ｉｎ　ｖｉｖｏでの投与細胞の全身分布を示す。大動脈、肺、骨（下肢骨）での細胞投与後１週（Ａ）、４週（Ｃ）、８週（Ｅ）での表面平均光度。各臓器での細胞投与後１週（Ｂ）、４週（Ｄ）、８週（Ｆ）での合計光度。Ｍｕｓｅ細胞は解離大動脈に選択的に集積しており、その量もＭｕｓｅ群がＭＳＣ－７５０Ｋ群と比較して統計学的有意に高い。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定）（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。 各臓器でのＩＶＩＳ像を示す。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群での細胞投与後１週間での脳、心臓、肝臓、膵臓、脾臓、胃、小腸、大腸などの他臓器に有効なシグナルは認められなかった。４週間、８週間でのＩＶＩＳ像も同様で有効なシグナルは認められなかった（非表示）。 解離血管に遊走したＭｕｓｅ細胞、ＭＳＣの分化を示す。Ａ、白の鏃はＭｕｓｅ細胞投与後４週での解離血管壁のＧＦＰとαＳＭＡの２重陽性細胞を示す。＊：偽腔、スケールバー：２００μｍ（低倍率）、５０μｍ（高倍率）。Ｂ、ＧＦＰ陽性細胞のαＳＭＡ陽性の割合（％）。Ｃ、解離血管面積（ｍｍ２）あたりのＧＦＰとαＳＭＡの２重陽性細胞数。Ｄ、白の鏃はＭｕｓｅ細胞投与後４週での解離血管壁のＧＦＰとＣＤ３１の２重陽性細胞を示す。＊：偽腔、スケールバー：２００μｍ（低倍率）、５０μｍ（高倍率）。Ｅ、ＧＦＰ陽性細胞のＣＤ３１陽性の割合（％）。Ｆ、解離血管面積（ｍｍ２）あたりのＧＦＰとＣＤ３１の２重陽性細胞数。モデルマウス数は各群ｎ＝３とした。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ））。 解離血管の弾性繊維の評価を示す。Ａ、各群のＥｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色像。スケールバー：２００μｍ。Ｂ、解離血管の新生内膜と中膜における弾性繊維面積の割合（％）。＊Ｐ＜０．０５（Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓ検定）（Ｂ）。 エラスチンノックダウンＭｕｓｅ細胞による治療効果を示す。Ａ、ｄｄＰＣＲによるＭｕｓｅ細胞、ｓｈＲＮＡ対照Ｍｕｓｅ細胞、エラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ細胞のエラスチン遺伝子発現量。Ｂ、造影ＣＴでの解離血管径の測定。Ｃ、解離発症１日目の径を基準として、細胞投与４週、８週の径がどの程度拡大したかという解離血管径拡大率。Ｄ、Ｅｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色での解離血管の新生内膜と中膜面積に対する弾性繊維の面積の割合（％）。＊Ｐ＜０．０５（Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定）（Ｄ）。
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、動脈解離を治療するための細胞製剤に関する。更に好ましくは、動脈解離による解離血管径の拡大とそれに伴う血管破裂の予防及び／又は治療に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。なお、治療には、疾患又は症状の治癒、緩和、及び再発防止などが含まれる。また、予防には、疾患又は症状の発症を防止若しくは遅延させること、又は発症の危険性を低下させることが含まれる。本発明を以下に詳細に説明する。
１．適用疾患
本発明のＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（例えば、Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤は、動脈解離の治療等に使用される。
　大動脈解離は、大動脈壁の解離とそこへの血液流入を本態とし、発症直後から経時的な変化を起こすため、動的な病態を呈する。また、広範囲の血管に病変が伸展するため種々の病態を示し、血管状態を、１）拡張、２）破裂、及び３）狭窄又は閉塞に分け、さらに解離の生じている部位との組み合わせで理解される。本明細書で使用する場合、「血管状態」とは、動脈、好ましくは大動脈を指し、すでに病変が伸展した動脈（特に、大動脈）が含まれる。また、血管状態の「拡張」とは、大動脈弁閉鎖不全、瘤形成などをいう。また、血管状態の「破裂」とは、心タンポナーデ、胸腔内や他の部位への出血などをいう。さらに、「狭窄又は閉塞」とは、分枝動脈の狭窄・閉塞による末梢循環障害、例えば、狭心症、心筋梗塞、脳虚血、上肢虚血、対麻痺、腸管虚血、腎不全、下肢虚血などをいう。本発明によれば、これらの血管状態を低減又は抑制することができる。「低減」には、上記血管状態の出現の遅延、頻度の減少、重症度の低下などが含まれる。一方、「抑制」には、上記血管状態の出現を部分的に又は完全に減少させることが含まれ、「阻害」と互換的に使用される。
　大動脈解離の分類としては、１）解離範囲による分類、２）偽腔の血液状態による分類、及び３）病期による分類などがある。
　１）解離範囲による分類には、
　・スタンフォード分類（Ａ型：上行大動脈に解離があるもの、Ｂ型：上行大動脈に解離がないもの）、
　・ＤｅＢａｋｅｙ分類（Ｉ型：上行大動脈に裂口（ｔｅａｒ）があり、弓部大動脈より末梢に解離が及ぶもの、ＩＩ型：上行大動脈に解離が限局するもの、ＩＩＩ型：下行大動脈にtearがあるもの、ＩＩＩａ型：腹部大動脈に解離が及ばないもの、ＩＩＩｂ型：腹部大動脈に解離が及ぶもの）、及びＤｅＢａｋｅｙ分類において追加できる亜型分類（弓部型：弓部にｔｅａｒがあるもの、弓部限局型：解離が弓部に限局するもの、弓部広範型：解離が上行又は下行大動脈に及ぶもの、腹部型：腹部にtearがあるもの、腹部限局型：腹部大動脈のみに解離があるもの、腹部広範型：解離が胸部大動脈に及ぶもの）、
などがある。
　２）偽腔の血液状態による分類には、
　・偽腔開存型（偽腔に血流があるもの、部分的に血栓が存在する場合や、大部分の偽腔が血栓化していても潰瘍様突出像（ｕｌｃｅｒ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ：ＵＬＰ）から長軸方向に広がる偽腔内血流を認める場合にはこの中に入れる）、
　・ＵＬＰ型（偽腔の大部分に血流を認めないが、ｔｅａｒ近傍に限局した偽腔内血流を認めるもの）、
　・偽腔閉塞型（三日月形の偽腔を有し、ｔｅａｒ（ＵＬＰを含む）及び偽腔内血流を認めないもの）、
などがある。
　３）病期による分類には、
　・急性期（発症２週間以内、この中で発症４８時間以内を超急性期という）、
　・亜急性期（発症後２週間を超えて３か月以内）、
　・慢性期（発症後３か月を超えるもの）、
などがある。
　本発明における大動脈解離は、上記いずれの病態における大動脈解離、及び/又はいずれの分類における大動脈解離も含む。また、本発明における大動脈解離は、例えば、解離範囲による分類では、典型的には、スタンフォード分類のＢ型、病期による分類では急性期に属するものであることが好ましい。更に、本発明における大動脈解離は、例えば、「大動脈瘤・大動脈解離診療ガイドライン（2020年改訂版）」に記載の「図４９：急性大動脈解離の診断・治療カスケード」（４９頁）にしたがって「急性大動脈解離」と診断された患者を治療対象とすることもあり（図１参照）、当該動脈解離による解離血管径の拡大やそれに伴う血管破裂、その後の解離性動脈瘤への移行も予防及び／治療することもできる。
　また、本発明には、大動脈以外の動脈に生じる動脈解離も含まれる。大動脈以外の動脈に生じる動脈解離には、中動脈や末梢動脈に生じる動脈解離を含み、また、脳動脈（頸動脈や椎骨動脈など）、冠動脈、その他の動脈（肺動脈、肝動脈、脾動脈、腸骨動脈、腹腔内臓動脈（腹腔動脈、上腸管膜動脈など））に生じる動脈解離も含まれる。したがって、本発明の「動脈解離」には、「大動脈解離」、及び「大動脈以外の動脈に生じる動脈解離」が含まれる。
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
　本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、出澤らが、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ　２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｊａｎ １７，２０１４））や皮膚の真皮結合組織等から得ることができるほか、広く組織や臓器の結合組織に存在することが知られている。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－３）」陽性細胞、好ましくはＳＳＥＡ－３陽性かつＣＤ１０５陽性の二重陽性細胞として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３単独又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５の発現を指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｍｕｓｅ細胞が様々な外的ストレスに対する耐性が高いことを利用して、蛋白質分解酵素処理や、低酸素条件、低リン酸条件、低血清濃度、低栄養条件、熱ショックへの暴露、有害物質存在下、活性酸素存在下、機械的刺激下、圧力処理下など各種外的ストレス条件下での培養によりＭｕｓｅ細胞を選択的に濃縮することができる。なお、本明細書においては、動脈解離を治療するための細胞製剤として、ＳＳＥＡ－３を指標として用いて、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から調製された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」以外の細胞を指すことがある。
　Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ－３又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５を指標として生体組織（例えば、間葉系組織）から調製することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織、血液、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などから得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を調製し、利用することが好ましい。また、上記調製手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を調製してもよい。
　また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与えることにより、該外的ストレスに耐性の細胞を選択的に増殖させてその存在比率を高めた細胞を回収することを含む方法によっても調製することができる。
　前記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。
　前記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５～３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。
　前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。更に、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
　なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
　上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３陽性又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から調製することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を調製することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に調製することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に調製することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に調製することができる。
　また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。
　別の態様では、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。
　上記「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ ＸＬ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
　上記「三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ」に関して、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞（肝芽細胞又は肝細胞マーカーを発現する細胞を含む）、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで傷害を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。
　上記「腫瘍性増殖を示さない」に関して、Ｍｕｓｅ細胞は、増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り一定の大きさになると１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に移行すると、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が約１．３日の増殖速度で広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
　また、上記「セルフリニューアル能を持つ」に関して、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
（２）Ｍｕｓｅ細胞を含む細胞製剤の調製及び使用
　本発明のＭｕｓｅ細胞を含む細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞数が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第２０１１／００７９００号）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ）など）において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第２０１１／００７９００号を参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明のＭｕｓｅ細胞を含む細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞が得られる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、骨髄液から得られた骨髄間葉系幹細胞を外的ストレス条件下で培養して有効な治療量に達するまでＭｕｓｅ細胞を増殖、濃縮した後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。なお、本発明の細胞製剤は、Ｍｕｓｅ細胞を含む細胞集団であることができ、Ｍｕｓｅ細胞を少なくとも３０％含むことが好ましく、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は８５％含むことがより好ましく、少なくとも９０％含むことがさらに好ましい。
　また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
　上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、動脈解離の治療において所望の効果が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。なお、対象とする個体はヒトなどの哺乳動物を含むがこれに限定されない。また、本発明のＭｕｓｅ細胞を含む細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり一回につき１×１０３細胞～１×１０１０細胞で１年間の間に１～１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０３細胞～１×１０１１細胞、好ましくは１×１０４細胞～１×１０１０細胞、さらに好ましくは１×１０５細胞～１×１０９細胞などが挙げられる。
　本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、血管の障害部位へと遊走し、生着する性質を有する。したがって、細胞製剤の投与において、細胞製剤の投与部位や投与方法は限定されず、血管内投与（静脈内、動脈内）、局所投与などが例示される。
　本発明のＭｕｓｅ細胞を含む細胞製剤は、動脈解離の患者の障害部位の修復及び再生を通して、弾性繊維の割合を高く保持し、経時的な偽腔の拡大による解離の伸展や破裂、偽腔が膨らんで瘤化（いわゆる、解離性動脈瘤）することを防止し、動脈解離の治療を実現することができる。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
　ヒトＭｕｓｅ細胞の分離及び同定に関する国際公開第２０１１／００７９００号に記載された方法に準じて、Ｍｕｓｅ細胞を得た。Ｍｕｓｅ細胞のソースとしては市販の間葉系細胞（ＭＳＣ、Ｌｏｎｚａ社）を用いた。また、各組織に生着したことを確認するために、移植に使用されるＭｕｓｅ細胞は、ＳＳＥＡ－３陽性細胞としてＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）にて分離した。その結果を図２に示す。Ｐ１のゲートがＳＳＥＡ－３陽性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）であり、Ｐ２のゲートがＳＳＥＡ－３陰性細胞（非Ｍｕｓｅ細胞）である。ヒト骨髄由来ＭＳＣ中には５．０±０．９％のＭｕｓｅ細胞が存在し、ＭＡＣＳでのソーティングにより７６．５±６．０％までＭｕｓｅ細胞の純度を高めることができた。
　また、病理組織評価の際には細胞がこれにより標識されるように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するようにＧＦＰ－レンチウイルス遺伝子を導入した。まず、ＭＳＣにＧＦＰ－レンチウイルスを導入し、そこからＧＦＰとＳＳＥＡ－３の二重の陽性細胞としてＭｕｓｅ細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）にて分離した。さらにコントロールとしてＭＳＣからＭｕｓｅ細胞を分離した残りの細胞を「非Ｍｕｓｅ細胞群」とし、ＧＦＰを発現するＭＳＣ自身も「ＭＳＣ群」に含めて使用することができる。
実施例２：大動脈解離モデルマウスの作製
　本実施例におけるマウスを用いた実験プロトコールは、「国立大学法人東北大学動物実験等に関する規定」を遵守し、実験動物は、東北大学動物実験センターの監督下において該規定に沿って作製された。大動脈解離モデルマウスとして、急性Ｂ型大動脈解離モデルマウスを用いた（Kurihara A et al. Circulation. 2012; 126: 3070-3080を一部改変）。具体的には、Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ系統マウス（雄性４週齢、体重１２．５～１８．５ｇ）を使用し、細胞外マトリックスの主要タンパク質であるエラスチンやコラーゲンの成熟架橋を行うリシルオキシダーゼの阻害剤（β－アミノプロピオニトリルフマル酸塩；ＢＡＰＮ）を１ｇ/ｋｇ/１日、４週間経口投与し、その後アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）を１μｇ/ｋｇ/分、浸透圧ポンプにより持続投与時間２４時間で投与することにより、本急性Ｂ型大動脈解離モデルを作成した。
　このようにして得られたモデルは、ＢＡＰＮにより脆弱な大動脈壁が形成され、ＡｎｇＩＩ投与により１日後には大動脈解離を発症する。また、解離発症から２４時間後の死亡率は２割程度であり、それ以降８週間後までの死亡率も３割程度であった。ヒトの急性Ｂ型動脈解離患者は降圧や安静療法を行わないことは少ないため、このマウスでの急性Ｂ型解離モデルとの死亡率を単純に比較することは難しい。しかし、以前の急性Ｂ型解離モデルの発症２４時間後の死亡率が３０％、４８時間後の死亡率が７０％であった（Anzai A et al. Circ Res 2015; 116:612-23）ことを考慮すると、本実験のモデルマウス作成方法は有効なものと言える。なお、モデルマウスの死因は解離血管の破裂によるものである。
実施例３：Ｍｕｓｅ細胞等の投与
　上記の大動脈解離モデルマウスは、解離発症後２４時間以内に造影ＣＴで解離状況が評価され、大動脈解離を有する大動脈解離モデルマウスを無作為に各群に分け、生理食塩水（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）、間葉系幹細胞（５．０×１０４細胞／個体、７．５×１０５細胞／個体：ＭＳＣ－５０Ｋ群、ＭＳＣ－７５０Ｋ群）、Ｍｕｓｅ細胞（２×１０４細胞／個体、５×１０４細胞／個体、８×１０４細胞／個体：Ｍｕｓｅ群）のいずれかを各群のマウスの尾静脈に注射することにより投与した。
実施例４：スタンフォードＢ型急性大動脈解離モデルの生存率
　実施例２で作成された急性Ｂ型大動脈解離モデルマウスの解離発症後２４時間以内にＣＴで解離を確認した後、速やかに、生理食塩水（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）、間葉系幹細胞（５．０×１０４細胞／個体、７．５×１０５細胞／個体：ＭＳＣ－５０Ｋ群、ＭＳＣ－７５０Ｋ群）、Ｍｕｓｅ細胞（５×１０４細胞／個体：Ｍｕｓｅ群）を投与し、各種細胞投与後８週間までの各群の生存期間をカプラン・マイヤー法で検討した。モデルマウス数はＶｅｈｉｃｌｅ群（ｎ＝３０）、ＭＳＣ－５０Ｋ群（ｎ＝１０）、ＭＳＣ－７５０Ｋ群（ｎ＝３１）、Ｍｕｓｅ群（ｎ＝３４）とした。なお、ＭＳＣ－５０Ｋ群は、Ｍｕｓｅ群と投与細胞数が同数（５×１０４細胞／個体）に設定されたものであり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群は、今回使用したＭｕｓｅ細胞（約７６％のＭｕｓｅ細胞を含む）とＭＳＣ（約５％のＭｕｓｅ細胞を含む）とした場合に換算されたＭｕｓｅ細胞が約３．８×１０４細胞／個体とほぼ同量になるよう設定されたものである。
　結果を図３に示す。Ｍｕｓｅ群はＶｅｈｉｃｌｅ群、ＭＳＣ－５０Ｋ群と比較して生存率が高く、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＭＳＣ－５０Ｋ群では生存率に差はない。各群間での検定ではログランク検定ｐ＜０．０５、ウィルコクソン検定ｐ＜０．０５と統計学的有意差が認められた。各群の８週間目までの死亡率はＭｕｓｅ群３／３４（８．８％）、ＭＳＣ－７５０Ｋ群６／３１（１９．４％）、Ｖｅｈｉｃｌｅ群１０／３０（３３．３％）、ＭＳＣ－５０Ｋ群４／１０（４０．０％）であり、死亡に対するオッズ比は、Ｍｕｓｅ群に対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で５．１７（９５％信頼区間１．２６－２１．１１、ｐ＜０．０５）、ＭＳＣ－５０Ｋ群で６．８９（９５％信頼区間１．２２－３８．９９、ｐ＜０．０５）であった。他の群間での比較で統計学的有意差は認められなかった。Ｍｕｓｅ群で死亡率が有意に減少しているのは、解離血管破裂による死亡数を減量させているからである。なお、ＭＳＣ－５０Ｋ群はＶｅｈｉｃｌｅ群と死亡率において統計学的有意差が認められず、ＭＳＣ－７５０Ｋ群はＭＳＣ－５０Ｋ群に比較して高い死亡率の抑制効果を示したことから、以降の試験において、ＭＳＣの投与量を７．５×１０５細胞／個体（ＭＳＣ－７５０Ｋ群）として使用した。
実施例５：解離血管径拡大抑制効果の評価
　大動脈解離モデルマウス同一個体を解離発症１日目、細胞投与４週間後、細胞投与８週間後の３つの時点で造影ＣＴを繰り返し撮像することにより大動脈解離血管径の拡大を評価した。造影剤は実際にヒトが造影ＣＴを撮像する際に使用される造影剤イオメロン（登録商標）３００を使用し、０．４×（マウス体重ｇ）ｍｌ／ｈを撮像開始１分前から経静脈的に２．５分間持続投与した。はじめに、Ｍｕｓｅ細胞の投与量を決定するため細胞投与数決定のため、Ｍｕｓｅ細胞（２×１０４細胞／個体、５×１０４細胞／個体、８×１０４細胞／個体）投与群を各群ｎ＝５で作成し、解離発症２４時間以内にＣＴで測定した解離血管径（細胞投与前）を基準として、細胞投与後４週間、８週間時点での解離血管径の拡大率を比較した。
　結果を図４に示す。８週間の時点でＭｕｓｅ細胞５×１０４投与群はＭｕｓｅ細胞２×１０４投与群よりも有意に径の拡大を抑制し、Ｍｕｓｅ細胞８×１０４投与群とは有意差は認められなかった。すなわち、Ｍｕｓｅ細胞５×１０４投与群とＭｕｓｅ細胞８×１０４投与群の治療効果に有意差はないことから、最も治療に適していると思われるＭｕｓｅ細胞の投与量数を５×１０４細胞／個体と決定し、以降の試験においてＭｕｓｅ群として使用した。
　次に、大動脈径の治療効果を、Ｍｕｓｅ群（５．０×１０４細胞／個体）、ＭＳＣ－７５０Ｋ群（７．５×１０５細胞／個体）、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、Ｓｈａｍ群（解離なし）の４群の比較で検討した。各群ｎ＝１０が得られるまでモデルマウスを作成した。解離血管径の評価は造影ＣＴでの短軸像を用いて行った。ヒトの場合、解離の診断には造影ＣＴの早期相がより適しており、実臨床でも検査率はかなり高いが、マウスでは心拍数がヒトの約４～６倍と腎排泄性造影剤のｗａｓｈ　ｏｕｔが早いため、造影剤の単回投与による早期相の撮像が困難であった。そのため、造影剤を経静脈的に持続投与することで大動脈内の造影効果を高めて代用した。この造影剤の用法・用量は報告例がなく、本実験で初めて施行されたものである。Ｂ型解離発症の有無の評価は、大動脈内腔が複数枚の短軸像で２腔となっているかどうかで判断した。また、上行大動脈に解離が及んでいる個体（Ａ型解離）は除外した。解離血管径の評価は最大部のほとんどが含まれる左鎖骨下動脈分岐部遠位～左室下端レベルまでの範囲の大動脈を短軸像での最大短径で比較した。解離血管径は発症時点で個体によりばらつきが認められたため、解離血管径の比較は解離発症２４時間以内に撮像したＣＴでの解離血管径を基準として細胞投与後４週間、細胞投与後８週間時点でどの程度拡大したかという比率で検討した。
　結果を図５に示す。解離血管径拡大率では、細胞投与後４週でＶｅｈｉｃｌｅ群（１．２３±０．１０倍）、ＭＳＣ－７５０Ｋ群（１．１５±０．１０倍）、Ｍｕｓｅ群（１．０５±０．０２倍）はＳｈａｍ群（１．００±０．０３倍）と比較し、有意に径が大きい（ｐ＜０．０１）が、解離を起こした３つの群では、Ｍｕｓｅ群がＶｅｈｉｃｌｅ群（ｐ＜０．０１）や、ＭＳＣ－７５０Ｋ群（ｐ＜０．０５）よりも有意に径拡大抑制効果があることが示された。Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＭＳＣ－７５０Ｋ群の間に有意差は認められなかった（図５）。細胞投与後８週でも解離を起こした３群はＳｈａｍ群（１．０２±０．０３倍）と比較し、それぞれＶｅｈｉｃｌｅ群（１．３６±０．０７倍）、ＭＳＣ－７５０Ｋ群（１．２３±０．１１）、Ｍｕｓｅ群（１．０９±０．０２倍）で有意に径が大きい（ｐ＜０．０１）が、Ｍｕｓｅ群がＶｅｈｉｃｌｅ群（ｐ＜０．０１）と、ＭＳＣ－７５０Ｋ群（ｐ＜０．０１）と比較して、細胞投与４週よりもさらに有意に径拡大抑制効果があることが示された。また、Ｍｕｓｅ細胞よりも比較的程度は低い（lesser extent）が、ＭＳＣ－７５０Ｋ群はＶｅｈｉｃｌｅ群と比較し有意に径拡大抑制効果があることが示された（ｐ＜０．０５）（図５）。
実施例６：Ｍｕｓｅ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏでの大動脈分布、及び全身分布の評価
　Ｍｕｓｅ細胞とＭＳＣの標識にＡｋａｌｕｃ（Ｉｗａｎｏ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１８；３５９：９３５－９）を導入した。人工酵素であるＡｋａｌｕｃを緑色蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ）で標識した上でレンチウイルスを用いてヒト骨髄由来ＭＳＣに導入し（Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ作成）、ＶｅｎｕｓとＳＳＥＡ－３の二重の陽性細胞をＦＡＣＳにて分離した（Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞作成）。大動脈径評価の際と同様に、解離発症２４時間以内にＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞５．０×１０４を経静脈的に投与した群（Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群）、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ７．５×１０５を経静脈的に投与した群（Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群）を作成し、細胞投与後１週、４週、８週にＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ＣＴにてｉｎ　ｖｉｖｏでの全身局在を評価した。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣの局在は、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｒａｄｉａｎｃｅ（光源から放射された臓器表面の輝度の平均値（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ））で評価し、シグナルの強さはＴｏｔａｌ　Ｆｌｕｘ（光源の光度つまり光の強さ（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ））で評価した。数値化にはＬｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅ　ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群の各臓器のＴｏｔａｌ　Ｆｌｕｘの値はＶｅｈｉｃｌｅ群の各臓器のｔｏｔａｌ　ｆｌｕｘ　（自家蛍光）を引いた値である．モデルマウス数は各群ｎ＝３とした。
　結果を図６及び７に示す。ＩＶＩＳでの結果は、Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群では大動脈では解離の生じている遠位弓部大動脈から下行大動脈～腹部大動脈上部にシグナルが確認され、その最大強度と範囲が１週、４週、８週と経過しても減弱しなかった。肺では１週、４週、８週のどの時点でもシグナルは認められなかった。下肢骨（大腿骨、脛骨）では細胞投与１週で弱いシグナルが認められたが、４週、８週ではシグナルは認められなかった（図６Ａ、６Ｃ、６Ｅ）。Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群では、大動脈において解離の生じている遠位弓部大動脈から下行大動脈～腹部大動脈上部にシグナルが確認されたが、強度や範囲は１週、４週、８週の各時点でばらつきがあり、一定の傾向は認められなかった。肺では細胞投与１週でシグナルが認められたが、４週、８週ではシグナルは認められなかった。下肢骨（大腿骨、脛骨）では、細胞投与１週で弱いシグナルが認められたが、４週、８週ではシグナルは認められなかった（図６Ａ、６Ｃ、６Ｅ）。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群ともに脳、心臓、肝臓、膵臓、脾臓、胃、小腸、大腸などの他臓器にシグナルは認められなかった（図７）。
　各臓器の光度合計値（ｐ／ｓ）を比較すると大動脈では細胞投与１、４、８週全ての時点においてＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群ではＡｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群と比較し有意に光度が高く、１週では３．１９倍（１５６２±８６対４８９±１０８；Ｐ＜０．００１）（図６Ｂ）、４週では３．８５倍（１８５３±４４８対４８１±１４６；Ｐ＜０．０１）（図６Ｄ）、８週では３．６８倍（２０５８±６２５対５５９±１１２；Ｐ＜０．０５）（図６Ｆ）であった。肺では細胞投与１週の時点においてＡｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群ではＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群と比較し有意に光度が高かった（５４００±２２８７対シグナルなし、Ｐ＜０．０５）が、４週と８週ではシグナルは認められず、有意差は認められなかった。下肢骨では細胞投与１週の時点においてＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群とＡｋａｌｕｃ－ＭＳＣ－７５０Ｋ群の間で統計学的有意差は認められなかった（７９３±１２１対６２０±３８４、Ｐ＞０．０５）（図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ）。４週と８週ではシグナルは認められず、有意差は認められなかった。
実施例７：蛍光免疫染色による解離血管局所でのＭｕｓｅ細胞の分化の評価（抗ＧＦＰと抗αＳＭＡ）、（抗ＧＦＰと抗ＣＤ３１）
　解離発症２４時間以内に前述の方法でＧＦＰを導入したＭｕｓｅ細胞またはＭＳＣを投与する（Ｍｕｓｅ群またはＭＳＣ－７５０Ｋ群）。細胞投与後４週間、８週間に屠殺し、血管内をＰＢＳにてｗａｓｈ　ｏｕｔした後、４％パラホルムアルデヒドにて体幹部ごと２４時間浸漬固定した。その後上行～総腸骨動脈分岐部まで大動脈を摘出し、凍結組織包埋剤にて包埋した。大動脈短軸方向に６μｍの切片を作成し、Ｍｕｓｅ細胞の血管平滑筋への分化を評価するため蛍光免疫染色を行った。１次抗体としてウサギ抗ＧＦＰ抗体（１：５００）及び平滑筋マーカーであるマウス抗αＳＭＡ（Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ａｃｔｉｎ）抗体（１：２００）、２次抗体としてＡｌｅｘａ　５９４標識ロバ抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ　６８０標識ロバ抗マウス抗体（１：５００）を使用した。また、同様にＭｕｓｅ細胞の血管内皮細胞への分化を評価するための蛍光免疫染色を行った。１次抗体としてウサギ抗ＧＦＰ抗体（１：５００）及び内皮細胞マーカーであるヤギ抗ＣＤ３１　ＩｇＧ抗体（１：５０）、２次抗体としてＡｌｅｘａ　５９４標識ロバ抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ　６４７標識ロバ抗ヤギ抗体（１：５００）を使用した。解離大動脈中膜または内膜でのＧＦＰ陽性細胞のうちさらにαＳＭＡ陽性細胞数又はＣＤ３１陽性細胞数（２重陽性細胞数）の割合をカウントした。また、解離大動脈面積あたりのＧＦＰとαＳＭＡの２重陽性細胞数と、ＧＦＰとＣＤ３１の２重陽性細胞数をカウントした。モデルマウス数は細胞投与後４週、８週それぞれｎ＝３とした。細胞数は大動脈組織毎に５切片でカウントし、その平均を算出した。
　結果を図８に示す。Ｍｕｓｅ群では４週、８週での解離血管中膜にＧＦＰとαＳＭＡの２重陽性細胞が、解離血管新生内膜にＧＦＰとＣＤ３１の２重陽性細胞が認められた（図８Ａ、８Ｄ）。ＭＳＣ－７５０Ｋ群でも同様の傾向が認められたが、Ｍｕｓｅ群と比較してその数は少なかった。Ｍｕｓｅ群では、４週の時点で、解離血管中膜でのＧＦＰ陽性細胞のαＳＭＡ陽性率は４２．３±８．８％であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群の２２．８±４．０％と比較して統計学的に有意に多く、１．８６倍であった（Ｐ＜０．０５）。また、８週の時点では、Ｍｕｓｅ群は４６．３±８．５％であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群２２．２±３．７％に対し統計学的に有意に多く、２．０９倍（Ｐ＜０．０５）とその差は広がった（図８Ｂ）。また、Ｍｕｓｅ群では、４週の時点で解離血管新生内膜でのＧＦＰ陽性細胞のＣＤ３１陽性率は６．２±２．２％であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群５．９±３．２％との間に有意差は認められなかった（Ｐ＝０．８８）。しかし、８週の時点では、Ｍｕｓｅ群は９．０±０．３％であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群の４．０±１．８％に対し統計学的に有意に多く（Ｐ＜０．０５）、２．２５倍であった（図８Ｅ）。
　解離血管面積あたりのＧＦＰとαＳＭＡの２重陽性細胞数は、Ｍｕｓｅ群では４週の時点で１１５．９±１７．５個／ｍｍ２であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群の２０．２±７．８個／ｍｍ２と比較して統計学的に有意に多かった（Ｐ＜０．００１）（図８Ｃ）。また、８週の時点ではＭｕｓｅ群は１３０．１±１１．７個／ｍｍ２であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群の１４．８±４．８個／ｍｍ２と比較して統計学的に有意に多く（Ｐ＜０．０５）、その差は８．７９倍にまで拡大した（図８Ｃ）。また、解離血管面積あたりのＧＦＰとＣＤ３１の２重陽性細胞数は、Ｍｕｓｅ群では４週の時点で１９．５±６．９個／ｍｍ２であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群の３．９±０．６個／ｍｍ２と比較して統計学的に有意に多かった（Ｐ＜０．０５）（図８Ｆ）。また、８週の時点ではＭｕｓｅ群は１９．７±８．０個／ｍｍ２であり、ＭＳＣ－７５０Ｋ群の２．９±１．０個／ｍｍ２と比較して統計学的に有意に多く（Ｐ＜０．０５）、その差は６．７９倍にまで拡大した（図８Ｆ）。
　上記結果から、解離発症後４週の時点で、解離血管の中膜に抗ＳＭＡと抗ＧＦＰの二重陽性細胞が認められ、解離血管の新生内膜に抗ＣＤ３１と抗ＧＦＰの二重陽性細胞が認められることから、Ｍｕｓｅ細胞は中膜の血管平滑筋、内膜の内皮細胞等に分化したことが示唆された。
実施例８：血管弾性繊維面積（Ｅｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色）の評価
　解離発症８週間後に造影ＣＴにて血管径を評価した後、モデルマウスを屠殺し、血管内をＰＢＳにてｗａｓｈ　ｏｕｔした後、４％パラホルムアルデヒドにて体幹部ごと２４時間浸漬固定した。その後上行～総腸骨動脈分岐部まで大動脈を摘出し、パラフィンにて包埋した。大動脈短軸方向に３μｍの切片を作成し、弾性繊維の評価としてＥｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色を行った。従来技術（例えば、Jones JA et al. Am J Pathol. 2009; 175: 1746-56）を参考にして、解離血管の新生内膜と中膜の面積に対する弾性繊維の面積の割合（％）を算出し、１標本あたり５切片の平均値として定量し比較した。それぞれの面積測定にはＩｍａｇｅＪソフトウェア、ＧＩＭＰソフトウェアを使用した。モデルマウス数は各群ｎ＝６とした。
　結果を図９に示す。解離大動脈の新生内膜と中膜の弾性繊維を評価するため、各種細胞投与後８週の解離大動脈をＥｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色にて観察した（図９Ａ）。新生内膜と中膜面積に対する弾性繊維面積の割合（Ｅｌａｓｔｉｎ　ａｒｅａ）（％）は、Ｓｈａｍ群で４３．５±１．２％、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で２１．５±２．０％、ＭＳＣ－７５０Ｋ群で２７．８±１．７％、Ｍｕｓｅ群で３３．６±１．９％であり、どの群間での比較においても統計学的有意差を認めた（Ｐ＜０．０５）（図９Ｂ）。つまり解離大動脈での弾性繊維構成割合は、Ｍｕｓｅ群はＶｅｈｉｃｌｅ群、ＭＳＣ－７５０群よりも有意差を持って高く、ＭＳＣ－７５０群はＶｅｈｉｃｌｅ群よりも有意差を持って高かった。
実施例９：
エラスチンノックダウンＭｕｓｅ細胞による弾性繊維産生効果
　Ｍｕｓｅ群では有意に解離血管径の拡大抑制（図５）と高い割合の弾性繊維領域（図９Ｂ）がみられたこと、及び解離部位にホーミングしたＭｕｓｅ細胞は弾性繊維を産生する血管平滑筋へ分化していることが示唆された（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）ことから、Ｍｕｓｅ細胞が分化した血管平滑筋から産生された弾性繊維により解離血管壁の弾性が強化され、解離大動脈径拡大抑制効果が得られていることが想定された。そこで、エラスチンｓｈＲＮＡレンチウイルスをトランスフェクトし、エラスチンの産生を抑制したＭｕｓｅ細胞を経静脈的に投与した。その後、造影ＣＴにて解離大動脈径を測定し、Ｍｕｓｅ細胞における弾性繊維産生の貢献度を評価した。
　エラスチンｓｈＲＮＡレンチウイルス（ｓｃ－４３３６０－Ｖ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＭＳＣにトランスフェクトし、エラスチンｓｈＲＮＡが導入されたＭｕｓｅ細胞（エラスチンノックダウンＭｕｓｅ細胞）をＳＳＥＡ－３の陽性細胞としてＦＡＣＳにてソーティングを行った。モデルマウスへの細胞投与は解離発症２４時間以内にエラスチンノックダウンＭｕｓｅ細胞５×１０４個を経静脈投与した（エラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ群）。また、対照ｓｈＲＮＡレンチウイルス（ｓｃ－１０８０８０、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を同様の方法でＭＳＣにトランスフェクトし、対照ｓｈＲＮＡが導入されたＭｕｓｅ細胞（ｓｈＲＮＡ対照Ｍｕｓｅ細胞）をＦＡＣＳにてソーティングした。モデルマウスへの細胞投与は解離発症２４時間以内にｓｈＲＮＡ対照Ｍｕｓｅ細胞５×１０４個を経静脈投与した（ｓｈＲＮＡ対照Ｍｕｓｅ群）。エラスチン遺伝子の発現量はデジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）にて定量した。各種Ｍｕｓｅ細胞からのＲＮＡの抽出精製にはＲＮＡ抽出キット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　ＸＳ、Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用した。一本鎖ｃＤＮＡの合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ）を使用した。ＰＣＲでは、プライマーとしてエラスチン（エラスチン、Ｈｓ００３５５７８３　ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ＤＮＡは、デジタル液滴ＰＣＲ　ＱＸ２００システム（ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して増幅され、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（Ｖｅｒ．１．７、ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して解析された。
　結果を図１０に示す。エラスチン遺伝子の発現量をｄｄＰＣＲにてエラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ細胞、ｓｈＲＮＡ対照Ｍｕｓｅ細胞、Ｍｕｓｅ細胞で検討したところ、エラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ細胞では、エラスチンの遺伝子発現量がｓｈＲＮＡ対照Ｍｕｓｅ細胞と比較し、５４．３％低かった（図１０Ａ）。解離血管径の測定は上述と同様に造影ＣＴにて行った（図１０Ｂ）。解離発症１日目の径を基準として、細胞投与４週、８週の径がどの程度拡大したかという解離血管径拡大率では、細胞投与後４週でエラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ群は１．１６±０．０５倍であり、Ｍｕｓｅ群の１．０５±０．０５倍と比較して有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）（図１０Ｃ）。細胞投与後８週では、エラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ群は１．２２±０．０４倍であり、Ｍｕｓｅ群の１．０９±０．０４倍と比較して有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）（図１０Ｃ）。また、４週、８週ともにエラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ群とＭＳＣ－７５０Ｋ群の間には統計学的に有意な差は認められなかった（Ｐ＝０．６１）。モデルマウス数は各群ｎ＝１０とした。
　また、解離発症８週間目の解離大動脈弾繊維をＥｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色にて評価したところ、解離血管の新生内膜と中膜面積に対する弾性繊維の面積の割合（％）は、細胞投与後８週でエラスチンＫＤ－Ｍｕｓｅ群は２９．４±１．８％であり、Ｍｕｓｅ群の３３．６±１．９％よりも統計学的有意差を持って低かった（Ｐ＜０．０５）（図１０Ｄ）。ＭＳＣ－７５０Ｋ群とは統計学的有意差は認められなかった（Ｐ＝０．２８）。
　また、以上の結果から、ＭＳＣ－７５０Ｋ群とＭｕｓｅ群に含まれるＭｕｓｅ細胞の数は同じであるのに、Ｍｕｓｅ群の方が、優れた解離血管径拡大抑制効果を示し（図５）、解離血管におけるαＳＭＡやＣＤ３１陽性細胞数が多く（図８Ｂ、８Ｃ、８Ｅ、８Ｆ）、弾性繊維が多く保たれていた（図９Ｂ）。これは、ＭＳＣ－７５０Ｋ群のＭｕｓｅ細胞がＭｕｓｅ群のＭｕｓｅ細胞よりも解離血管への遊走率が低いこと（図６）が影響している可能性がある。スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）は、障害組織より産生され、Ｍｕｓｅ細胞の障害組織への遊走を誘導する物質であり、Ｍｕｓｅ細胞の障害組織への選択的遊走にはＳ１Ｐ－Ｓ１Ｐ受容体２軸（Yamada Y, et al. Circ Res. 2018; 122: 1069-83）が関与している。ＭＳＣ－７５０Ｋ群でＭｕｓｅ細胞（３８，０００個）よりも大量に含まれている非Ｍｕｓｅ細胞（７１２，０００個）が、上記ＭＳＣ－７５０Ｋ群とＭｕｓｅ群の作用効果の相違に影響を与えている可能性が示唆される。
　本発明の細胞製剤は、動脈解離を発症した患者に投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が解離血管に集積し、弾性繊維の割合を高く保持し、経時的な偽腔の拡大による解離の伸展や破裂、偽腔が膨らんで瘤化（いわゆる、解離性動脈瘤）することを防止し、動脈解離の治療に応用することができる。
　本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (14)

  1. 　生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、動脈解離を治療するための細胞製剤。
  2. 　動脈解離が大動脈解離である、請求項１に記載の細胞製剤。
  3. 　血管状態の拡張を低減又は抑制するためのものである、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
  4. 　血管状態の破裂を低減又は抑制するためのものである、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
  5. 　血管状態の狭窄又は閉塞を低減又は抑制するためのものである、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
  6. 　大動脈解離が、スタンフォード分類のＢ型に属するものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  7. 　大動脈解離が、急性大動脈解離スタンフォードＢ型に属するものである、請求項６に記載の細胞製剤。
  8. 　大動脈解離が、スタンフォード分類のＡ型に属するものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  9. 　動脈解離が、大動脈以外の動脈に生じる動脈解離である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  10. 　大動脈以外の動脈に生じる動脈解離が、脳動脈、頸動脈、椎骨動脈、冠動脈、その他の動脈に生じる動脈解離である、請求項９に記載の細胞製剤。
  11. 前記多能性幹細胞が、以下の性質のいずれか１つを有する多能性幹細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    （ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    （ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
    （ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    （ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  12. 前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    （ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    （ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
    （ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    （ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  13. 前記多能性幹細胞が、以下の性質のいずれか１つを有する多能性幹細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    　（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
    　（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
    　（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    　（ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
    　（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    　（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
  14. 前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    　（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
    　（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
    　（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    　（ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
    　（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    　（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
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WO2018021515A1 (ja) * 2016-07-29 2018-02-01 国立大学法人東北大学 血管障害の予防又は治療剤

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