JP7473207B2 - 末梢血流障害の治療剤 - Google Patents
末梢血流障害の治療剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7473207B2 JP7473207B2 JP2020557865A JP2020557865A JP7473207B2 JP 7473207 B2 JP7473207 B2 JP 7473207B2 JP 2020557865 A JP2020557865 A JP 2020557865A JP 2020557865 A JP2020557865 A JP 2020557865A JP 7473207 B2 JP7473207 B2 JP 7473207B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell preparation
- muse
- blood flow
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 title claims description 41
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims description 32
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 223
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 53
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 claims description 46
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 claims description 37
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 34
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims description 11
- 208000000575 Arteriosclerosis Obliterans Diseases 0.000 claims description 9
- 206010043540 Thromboangiitis obliterans Diseases 0.000 claims description 9
- 230000006355 external stress Effects 0.000 claims description 8
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010071642 Popliteal artery entrapment syndrome Diseases 0.000 claims description 6
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 95
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 23
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 18
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 17
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 16
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 10
- GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N prostaglandin E1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 9
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 8
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 7
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 7
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 208000033386 Buerger disease Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 4
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 description 3
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 3
- -1 antithrombotic drugs Substances 0.000 description 3
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 3
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 2
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003866 melanoblast Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004786 perivascular cell Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000016702 sympathetic nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 208000037997 venous disease Diseases 0.000 description 2
- GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N (8R,11R,12R,13E,15S)-11,15-Dihydroxy-9-oxo-13-prostenoic acid Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000012109 Alexa Fluor 568 Substances 0.000 description 1
- LYRPNNXUPAXZGU-OJQZDGIKSA-N Alprostadil alfadex Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O.OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO LYRPNNXUPAXZGU-OJQZDGIKSA-N 0.000 description 1
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000001387 Causalgia Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000027932 Collagen disease Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010069729 Collateral circulation Diseases 0.000 description 1
- 208000023890 Complex Regional Pain Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102100021811 E3 ubiquitin-protein ligase RNF5 Human genes 0.000 description 1
- 206010014513 Embolism arterial Diseases 0.000 description 1
- 238000012276 Endovascular treatment Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061225 Limb injury Diseases 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 101100154912 Mus musculus Tyrp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- BYPFEZZEUUWMEJ-UHFFFAOYSA-N Pentoxifylline Chemical compound O=C1N(CCCCC(=O)C)C(=O)N(C)C2=C1N(C)C=N2 BYPFEZZEUUWMEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004983 Phantom Limb Diseases 0.000 description 1
- 206010056238 Phantom pain Diseases 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000288754 Scandentia Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010041955 Stasis dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000001106 Takayasu Arteritis Diseases 0.000 description 1
- 102000035100 Threonine proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005501 Threonine proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229960000711 alprostadil Drugs 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940127217 antithrombotic drug Drugs 0.000 description 1
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 description 1
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 201000002816 chronic venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960004588 cilostazol Drugs 0.000 description 1
- RRGUKTPIGVIEKM-UHFFFAOYSA-N cilostazol Chemical compound C=1C=C2NC(=O)CCC2=CC=1OCCCCC1=NN=NN1C1CCCCC1 RRGUKTPIGVIEKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 208000014439 complex regional pain syndrome type 2 Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003999 epithelial cell of bile duct Anatomy 0.000 description 1
- SSQPWTVBQMWLSZ-AAQCHOMXSA-N ethyl (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosapentaenoate Chemical compound CCOC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CC SSQPWTVBQMWLSZ-AAQCHOMXSA-N 0.000 description 1
- 238000009207 exercise therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002600 icosapent ethyl Drugs 0.000 description 1
- 210000001621 ilium bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229960001476 pentoxifylline Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003137 popliteal artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 229950005789 sarpogrelate Drugs 0.000 description 1
- FFYNAVGJSYHHFO-UHFFFAOYSA-N sarpogrelate Chemical compound COC1=CC=CC(CCC=2C(=CC=CC=2)OCC(CN(C)C)OC(=O)CCC(O)=O)=C1 FFYNAVGJSYHHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150077014 sox10 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000015 thermotherapy Methods 0.000 description 1
- 206010048627 thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 1
- MTKNGOHFNXIVOS-UHFFFAOYSA-N ticlopidine hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].ClC1=CC=CC=C1CN1CC(C=CS2)=C2CC1 MTKNGOHFNXIVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002961 ticlopidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、末梢動脈疾患などの末梢血流障害の血管再生療法に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。
65歳以上の高齢者人口の割合は、予測を大きく上回るスピードで増加している。
その一方で、食生活の欧米化や車社会を中心とした生活様式の変化により、メタボリックシンドロームなどの新しい生活習慣病の概念が生まれ、社会の疾病構造が大きく変化している。特に動脈硬化性疾患が増え、虚血性心疾患の増加とともに末梢動脈疾患（PAD:peripheral arterial disease）が増加している。
その一方で、食生活の欧米化や車社会を中心とした生活様式の変化により、メタボリックシンドロームなどの新しい生活習慣病の概念が生まれ、社会の疾病構造が大きく変化している。特に動脈硬化性疾患が増え、虚血性心疾患の増加とともに末梢動脈疾患（PAD:peripheral arterial disease）が増加している。
PADは、主に四肢の慢性動脈閉塞症のことを意味し、閉塞性動脈硬化症（ASO:arteriosclerosis obliterans）、閉塞性血栓血管炎（TAO:thromboangiitis obliterans、いわゆるバージャー病）、膝窩動脈捕捉症候群などが含まれる。
PADは虚血肢という足の症状として現れる。しかし単なる足の病気ではなく、加齢や糖尿病を背景とした動脈硬化により末梢の血管の閉塞が起こり、虚血肢として現れたものである。このためPADは同じ動脈硬化性疾患である虚血性心疾患や脳疾患を伴うことが多い。予後は非常に悪く、死亡率は悪性腫瘍よりも高いといわれている。早期発見により適切な治療を行うことが重要である。
PADは虚血肢という足の症状として現れる。しかし単なる足の病気ではなく、加齢や糖尿病を背景とした動脈硬化により末梢の血管の閉塞が起こり、虚血肢として現れたものである。このためPADは同じ動脈硬化性疾患である虚血性心疾患や脳疾患を伴うことが多い。予後は非常に悪く、死亡率は悪性腫瘍よりも高いといわれている。早期発見により適切な治療を行うことが重要である。
現在のPADの治療方針は、下肢の循環障害への対応、全身の主要臓器（脳、心臓、腎臓）への対応、動脈硬化のリスクファクター（喫煙、糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満、運動不足、ストレスなど）への対応などであり、治療方法としては、大きく内科的治療と外科的治療に分類される。
PADの内科的治療としては、運動療法、温熱療法などの理学療法や、シロスタゾール、ペラプロストナトリウム、塩酸サルポグレラート、塩酸チクロピジン、イコサペント酸エチル、アルプロスタジル、アルプロスタジルアルファデクス、アルガトロバン、パトロキソビン、ペントキシフィリンなどの抗血小板薬、抗血栓薬および血管拡張薬などをはじめとする薬物療法が行なわれている。
また、PADの外科的治療としては、バルーン拡張術、ステント留置術、アテレクトミーなどの血管内治療や、血栓内膜摘除術、バイパス術、交感神経切除術などの外科的手術が行われている。
PADの内科的治療としては、運動療法、温熱療法などの理学療法や、シロスタゾール、ペラプロストナトリウム、塩酸サルポグレラート、塩酸チクロピジン、イコサペント酸エチル、アルプロスタジル、アルプロスタジルアルファデクス、アルガトロバン、パトロキソビン、ペントキシフィリンなどの抗血小板薬、抗血栓薬および血管拡張薬などをはじめとする薬物療法が行なわれている。
また、PADの外科的治療としては、バルーン拡張術、ステント留置術、アテレクトミーなどの血管内治療や、血栓内膜摘除術、バイパス術、交感神経切除術などの外科的手術が行われている。
しかし、下肢の壊死が重症な場合には、上記内科的治療や外科的治療を行っても効果が得られないことも多く、このような場合には救命を目的として肢趾切断となる患者が後を絶たない。
したがって、閉塞性動脈硬化症（ASO:arteriosclerosis obliterans）、閉塞性血栓血管炎（TAO:thromboangiitis obliterans、いわゆるバージャー病）、膝窩動脈捕捉症候群などを含むPADにおいて、血管の再生、それに基づく下肢虚血改善効果等を可能とする新たな治療方法が望まれている。
近年、当該PADの治療においても、再生医療による研究がなされている。
その一つとして、成人の骨髄及び末梢血単核球中に血管内皮細胞に分化しうる血管内皮前駆細胞が存在することが報告され、骨髄由来単核細胞移植は下肢虚血動物モデルにおいて、血管新生や側副血行路の発達により下肢血流量増加作用を発揮することが確認された。（非特許文献１）
しかしながら、骨髄単核球移植による治療は多量の骨髄液採取を必要とし、侵襲が大きく、また、新鮮分離細胞のため骨髄細胞中の幹細胞及び前駆細胞量に個人差があり臨床効果に大きな差が出ることが明らかとなっている。
その一つとして、成人の骨髄及び末梢血単核球中に血管内皮細胞に分化しうる血管内皮前駆細胞が存在することが報告され、骨髄由来単核細胞移植は下肢虚血動物モデルにおいて、血管新生や側副血行路の発達により下肢血流量増加作用を発揮することが確認された。（非特許文献１）
しかしながら、骨髄単核球移植による治療は多量の骨髄液採取を必要とし、侵襲が大きく、また、新鮮分離細胞のため骨髄細胞中の幹細胞及び前駆細胞量に個人差があり臨床効果に大きな差が出ることが明らかとなっている。
また、間葉系幹細胞を用いた当該再生医療研究として、ラット下肢虚血モデル、マウス下肢虚血モデル、ウサギ下肢虚血モデルを用い、間葉系細胞を移植することにより血管再生促進効果、下肢虚血の改善効果が報告されている。（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）
しかしながら、移植細胞の血管への長期生着や血管構成細胞への分化が見られないなど、再生医療の効果として十分なものとは言えない。
しかしながら、移植細胞の血管への長期生着や血管構成細胞への分化が見られないなど、再生医療の効果として十分なものとは言えない。
一方、本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、遺伝子導入やサイトカイン等による誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（例えば、特許文献１；非特許文献５～７）。しかしながら、末梢動脈疾患の治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
Hou X et al. Mol Biol Rep 37:1467-1475 (2010)
Liu J., Hao H., Xia L., et al. Hypoxia pretreatment of bone marrow mesenchymal stem cells facilitates angiogenesis by improving the function of endothelial cells in diabetic rats with lower ischemia. PLoS ONE. 2015;10(5)
Xie N., Li Z., Adesanya T. M., et al. Transplantation of placenta-derived mesenchymal stem cells enhances angiogenesis after ischemic limb injury in mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2016;20(1):29-37
Cunping Yin, Yuan Liang, Jian Zhang, Guangping Ruan, Zian Li, Rongqing Pang, and Xinghua Pan, Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells Relieve Hindlimb Ischemia through Enhancing Angiogenesis in Tree Shrews. Stem Cells International, Volume 2016 (2016), Article ID 9742034, 9 pages
Kuroda Y et al. Proc Natl Acad Sci USA，2010: 107: 8639-8643.
Wakao S et al. Proc Natl Acad Sci USA，2011: 108: 9875-9880.
Kuroda Y et al. Nat Protc, 2013: 8: 1391-1415.
Kondo K et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009; 29: 61-66.
本発明は、末梢動脈疾患を含む末梢血流障害の治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、マウス下肢虚血モデルにおいて、ヒトＭｕｓｅ細胞を血管等から投与、あるいは対象の末梢動脈部位及びその周辺に直接投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が傷害された末梢動脈部位に集積・生着して障害を生じている末梢動脈部位の血管を再生し、末梢動脈部位の血管障害の改善又は回復をもたらすことを見出し、それにより、Ｍｕｓｅ細胞が末梢動脈疾患を含む末梢血流障害の治療に好適に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、末梢血流障害を治療するための細胞製剤。
［２］末梢血流障害が末梢動脈疾患である、［１］に記載の細胞製剤。
［３］末梢動脈疾患が、四肢の慢性動脈閉塞症である、［２］に記載の細胞製剤。
［４］末梢動脈疾患が、閉塞性動脈硬化症である、［２］または［３］に記載の細胞製剤。
［５］末梢動脈疾患が、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）である、［２］または［３］に記載の細胞製剤。
［６］末梢動脈疾患が、膝窩動脈捕捉症候群である、［２］または［３］に記載の細胞製剤。
［７］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［８］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
［８］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞の、末梢血流障害を治療するための細胞製剤の製造のための使用。
［９］前記［１］～［７］のいずれかに記載の細胞製剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、末梢血流障害の治療方法。
［１０］前記細胞製剤は静脈内に投与される、［９］の末梢血流障害の治療方法。
［１１］前記細胞製剤は複数回投与される、［９］または［１０］の末梢血流障害の治療方法。
［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、末梢血流障害を治療するための細胞製剤。
［２］末梢血流障害が末梢動脈疾患である、［１］に記載の細胞製剤。
［３］末梢動脈疾患が、四肢の慢性動脈閉塞症である、［２］に記載の細胞製剤。
［４］末梢動脈疾患が、閉塞性動脈硬化症である、［２］または［３］に記載の細胞製剤。
［５］末梢動脈疾患が、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）である、［２］または［３］に記載の細胞製剤。
［６］末梢動脈疾患が、膝窩動脈捕捉症候群である、［２］または［３］に記載の細胞製剤。
［７］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［８］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
［８］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞の、末梢血流障害を治療するための細胞製剤の製造のための使用。
［９］前記［１］～［７］のいずれかに記載の細胞製剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、末梢血流障害の治療方法。
［１０］前記細胞製剤は静脈内に投与される、［９］の末梢血流障害の治療方法。
［１１］前記細胞製剤は複数回投与される、［９］または［１０］の末梢血流障害の治療方法。
本発明では、末梢動脈疾患などの末梢血流障害を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を血管等から投与あるいは対象の末梢血管部位及びその周辺に直接投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が障害を受けた末梢血管部位に集積・生着して障害を生じている末梢血管部位の血管を再生し、末梢血管部位の血流障害の改善又は回復させることができる。
Ｍｕｓｅ細胞は、障害を受けた末梢血管部位へ効率的に遊走して生着することができ、生着した部位で血管を構成し、移植に先立って治療対象細胞への分化誘導が不要である。また、非腫瘍形成性であり安全性にも優れる。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は免疫拒絶を受けないことから、ドナーから製造された他家製剤による治療も可能である。従って、上記に示す優れた性能を有するＭｕｓｅ細胞によって、末梢動脈疾患などの末梢血流障害を患う患者の治療に容易に実行可能な手段を提供することができる。
間葉系幹細胞や自家骨髄細胞では静脈投与で細胞が障害部位に到達することが難しい、あるいは到達するとしてもその効率が非常に低いため筋肉注射で投与されることが一般的であるが、筋肉注射は連続治療が困難であるという問題がある。これに対し、Ｍｕｓｅ細胞等は静脈投与だけで障害部位に選択的に到達・集積することが可能であり、また静脈投与であるために複数回投与も可能である。これらのことから複数回の治療を行うことで、間葉系幹細胞や自家骨髄細胞よりも優れた治療効果が得られる可能性が示唆される。
間葉系幹細胞や自家骨髄細胞では静脈投与で細胞が障害部位に到達することが難しい、あるいは到達するとしてもその効率が非常に低いため筋肉注射で投与されることが一般的であるが、筋肉注射は連続治療が困難であるという問題がある。これに対し、Ｍｕｓｅ細胞等は静脈投与だけで障害部位に選択的に到達・集積することが可能であり、また静脈投与であるために複数回投与も可能である。これらのことから複数回の治療を行うことで、間葉系幹細胞や自家骨髄細胞よりも優れた治療効果が得られる可能性が示唆される。
本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、末梢血流障害を治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
１．適用疾患
本発明のＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤は、末梢動脈疾患の治療に使用される。
本発明のＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤は、末梢動脈疾患の治療に使用される。
本発明において、「末梢血流障害」とは、末梢血管の障害や交感神経の障害などにより末梢の血流が低下することによって起こる障害を意味する。
末梢血管の障害としては、末梢動脈疾患（PAD:peripheral arterial disease）および末梢静脈疾患が挙げられる。
「末梢動脈疾患」には、器質的末梢動脈疾患および機能的末梢動脈疾患が含まれ、器質的末梢動脈疾患としては、閉塞性動脈硬化症（ASO:arteriosclerosis obliterans）、閉塞性血栓血管炎（TAO:thromboangiitis obliterans、いわゆるバージャー病）、急性動脈閉塞症（急性動脈塞栓症、急性動脈血栓症を含む）、大動脈炎症候群、ベーチェット病、膝窩動脈捕捉症候群、膝窩動脈外膜嚢腫、遺残坐骨動脈などが挙げられ、機能的末梢動脈疾患としてはレイノー病などが挙げられる。
「末梢動脈疾患」としては、四肢の慢性動脈閉塞症に該当する疾患が好ましく、上記の疾患のうち、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓血管炎および膝窩動脈捕捉症候群が好ましい。
レイノー病としては、一次性レイノー症候群および二次性レイノー症候群を含み、その原因は特に限定されず、膠原病によるもの、外傷によるもの、振動によるもの、胸郭出口症候群によるもの、慢性閉塞性動脈疾患によるもの、血液疾患によるもの、神経疾患によるもの、などが例示される。
「末梢動脈疾患」としては、四肢の慢性動脈閉塞症に該当する疾患が好ましく、上記の疾患のうち、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓血管炎および膝窩動脈捕捉症候群が好ましい。
レイノー病としては、一次性レイノー症候群および二次性レイノー症候群を含み、その原因は特に限定されず、膠原病によるもの、外傷によるもの、振動によるもの、胸郭出口症候群によるもの、慢性閉塞性動脈疾患によるもの、血液疾患によるもの、神経疾患によるもの、などが例示される。
「末梢静脈疾患」としては、静脈血栓症（深部静脈血栓症等）、慢性静脈不全、下肢静脈瘤、静脈瘤性湿疹、静脈瘤性潰瘍などが挙げられる。
交感神経の障害としては、交感神経の反射異常が挙げられ、反射性交感神経性委縮症、カウザルギー、幻肢痛、中枢性疼痛などの末梢血流障害を引き起こしうる交感神経の障害が含まれる。
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｊａｎ １７，２０１４））や皮膚の真皮結合組織等から得ることができるほか、広く組織や臓器の結合組織に存在することが知られている。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－３）」陽性細胞、好ましくはＳＳＥＡ－３陽性かつＣＤ１０５陽性の二重陽性細胞として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３単独又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５の発現を指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、特許文献２（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号）に開示されている。また、Ｍｕｓｅ細胞が様々な外的ストレスに対する耐性が高いことを利用して、蛋白質分解酵素処理や、低酸素条件、低リン酸条件、低血清濃度、低栄養条件、熱ショックへの暴露、有害物質存在下、活性酸素存在下、機械的刺激下、圧力処理下など各種外的ストレス条件下での培養によりＭｕｓｅ細胞を選択的に濃縮することができる。なお、本明細書においては、末梢動脈疾患を治療するための細胞製剤として、ＳＳＥＡ－３を指標として用いて、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から調製された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」以外の細胞を指すことがある。
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｊａｎ １７，２０１４））や皮膚の真皮結合組織等から得ることができるほか、広く組織や臓器の結合組織に存在することが知られている。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－３）」陽性細胞、好ましくはＳＳＥＡ－３陽性かつＣＤ１０５陽性の二重陽性細胞として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３単独又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５の発現を指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、特許文献２（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号）に開示されている。また、Ｍｕｓｅ細胞が様々な外的ストレスに対する耐性が高いことを利用して、蛋白質分解酵素処理や、低酸素条件、低リン酸条件、低血清濃度、低栄養条件、熱ショックへの暴露、有害物質存在下、活性酸素存在下、機械的刺激下、圧力処理下など各種外的ストレス条件下での培養によりＭｕｓｅ細胞を選択的に濃縮することができる。なお、本明細書においては、末梢動脈疾患を治療するための細胞製剤として、ＳＳＥＡ－３を指標として用いて、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から調製された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」以外の細胞を指すことがある。
Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ－３又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５を指標として生体組織（例えば、間葉系組織）から調製することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織、血液、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などから得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を調製し、利用することが好ましい。また、上記調製手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を調製してもよい。
また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与えることにより、該外的ストレスに耐性の細胞を選択的に増殖させてその存在比率を高めた細胞を回収することを含む方法によっても調製することができる。
前記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。
前記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５～３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。
前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。更に、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
前記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。
前記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５～３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。
前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。更に、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３陽性又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から調製することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を調製することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に調製することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に調製することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に調製することができる。
また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。
ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ ＸＬ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞（肝芽細胞又は肝細胞マーカーを発現する細胞を含む）、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで傷害を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。
上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り一定の大きさになると１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に移行すると、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が約１．３日の増殖速度で広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
（２）細胞製剤の調製及び使用
本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞数が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の懸念が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ）など）において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞が得られる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、骨髄液から得られた骨髄間葉系幹細胞を外的ストレス条件下で培養して有効な治療量に達するまでＭｕｓｅ細胞を増殖、濃縮した後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞数が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の懸念が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ）など）において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞が得られる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、骨髄液から得られた骨髄間葉系幹細胞を外的ストレス条件下で培養して有効な治療量に達するまでＭｕｓｅ細胞を増殖、濃縮した後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、末梢血流障害の治療において所望の効果が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。なお、対象とする個体はヒトなどの哺乳動物を含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２～１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり一回につき１×１０３細胞～１×１０１０細胞で１～１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０３細胞～１×１０１１細胞、好ましくは１×１０４細胞～１×１０１０細胞、さらに好ましくは１×１０５細胞～１×１０９細胞などが挙げられる。
本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、傷害を受けた末梢血管部位へと遊走し、生着する性質を有する。したがって、細胞製剤の投与部位や投与形態は特に限定されず、末梢血流障害部位またはその近傍に注射などの方法により局所投与されてもよいし、血管内に注射などの方法によって投与してもよい。投与される血管の種類（静脈及び動脈）は特に限定されず、疾患に応じて適宜選択されるが、静脈内注射が好ましく、静脈内注射を複数回行うことにより、治療効果を長期間持続可能であるためより好ましい。
本発明の細胞製剤は、末梢血流障害を患う患者の障害が生じた末梢血管部位の血管を再生することができる。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：下肢虚血モデルマウスの作製
本実施例におけるマウスを用いた実験プロトコールは、「京都府立医大動物実験等に関する規定」を遵守し、実験動物は、京都府立医大動物実験センターの監督下において該規定に沿って作製された。より具体的には、以下の手順により作製した。
８－１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスをイソフルランの吸入により麻酔（誘導時：4%、維持時： 2%）した。下肢を切開し、実体顕微鏡（KONAN OPERATION MICROSCOPE KOM）下で、左総大腿動静脈、および左浅大腿動静脈末梢を5-0絹糸で結紮した。このようにして作製されたマウスを下肢虚血モデルマウスとして以下の実験に使用した。
本実施例におけるマウスを用いた実験プロトコールは、「京都府立医大動物実験等に関する規定」を遵守し、実験動物は、京都府立医大動物実験センターの監督下において該規定に沿って作製された。より具体的には、以下の手順により作製した。
８－１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスをイソフルランの吸入により麻酔（誘導時：4%、維持時： 2%）した。下肢を切開し、実体顕微鏡（KONAN OPERATION MICROSCOPE KOM）下で、左総大腿動静脈、および左浅大腿動静脈末梢を5-0絹糸で結紮した。このようにして作製されたマウスを下肢虚血モデルマウスとして以下の実験に使用した。
実施例２：ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
ヒトＭｕｓｅ細胞の分離及び同定に関する国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に準じて、Ｍｕｓｅ細胞を得た。Ｍｕｓｅ細胞のソースとしては市販の間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Lonza社）を用いた。移植に使用されるＭｕｓｅ細胞は、障害を受けた末梢動脈部位に生着したことを確認するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、細胞がこれにより標識されるように、予めレンチウイルス－ＧＦＰ遺伝子をＭｕｓｅ細胞に導入した。ＧＦＰで標識されたＭｕｓｅ細胞をＧＦＰとＳＳＥＡ－３の二重の陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。またＭＳＣからＭｕｓｅ細胞を分離した残りの細胞を非Ｍｕｓｅ細胞として使用した。また、ＧＦＰ陽性ＭＳＣもＦＡＣＳにて単離し、ＭＳＣ群として使用した。
ヒトＭｕｓｅ細胞の分離及び同定に関する国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に準じて、Ｍｕｓｅ細胞を得た。Ｍｕｓｅ細胞のソースとしては市販の間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Lonza社）を用いた。移植に使用されるＭｕｓｅ細胞は、障害を受けた末梢動脈部位に生着したことを確認するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、細胞がこれにより標識されるように、予めレンチウイルス－ＧＦＰ遺伝子をＭｕｓｅ細胞に導入した。ＧＦＰで標識されたＭｕｓｅ細胞をＧＦＰとＳＳＥＡ－３の二重の陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。またＭＳＣからＭｕｓｅ細胞を分離した残りの細胞を非Ｍｕｓｅ細胞として使用した。また、ＧＦＰ陽性ＭＳＣもＦＡＣＳにて単離し、ＭＳＣ群として使用した。
実施例３：下肢虚血モデルマウスに対する各細胞の投与
実施例１で作製した下肢虚血モデルマウスを４群に分け、モデル作製後、１日目に、各群のマウスにＭｕｓｅ細胞（３×１０４個、１００μＬ）（Muse）、非Ｍｕｓｅ細胞（３×１０４個、１００μＬ）（nMuse）、ＭＳＣ（２×１０５個、１００μＬ）（BM）あるいはＶｅｈｉｃｌｅ（リン酸緩衝液）（Ve）を左大腿部２箇所に分けて投与した。一群の動物数は ５匹とした。
実施例１で作製した下肢虚血モデルマウスを４群に分け、モデル作製後、１日目に、各群のマウスにＭｕｓｅ細胞（３×１０４個、１００μＬ）（Muse）、非Ｍｕｓｅ細胞（３×１０４個、１００μＬ）（nMuse）、ＭＳＣ（２×１０５個、１００μＬ）（BM）あるいはＶｅｈｉｃｌｅ（リン酸緩衝液）（Ve）を左大腿部２箇所に分けて投与した。一群の動物数は ５匹とした。
実施例４：レーザードップラーによる継時的下肢血流評価
下肢虚血モデルマウス作製後、０、３、７、１０及び１４日に、二次元レーザー血流画像装置［laser doppler perfusion image (LDPI) analyzer (OMEGAZONE OZ-1, OMEGAWAVE, Inc. Tokyo, Japan)を用いて血流を測定した。各個体の左右両方の下肢血流を測定し、左側（患側）／右側（健側）の比を算出し、これをLDPIインデックスとした。
図１に示す通り、Ｍｕｓｅ細胞群では１４日以降も血流改善が継続し、虚血した左下肢は健康な右下肢と同程度まで血流が改善した。一方、非Ｍｕｓｅ細胞群（nMuse）、ＭＳＣ群（BM）及びＶｅｈｉｃｌｅ群（Ve）では１０日までは一定の血流改善を示すが１４日以降は改善が見られなかった。
下肢虚血モデルマウス作製後、０、３、７、１０及び１４日に、二次元レーザー血流画像装置［laser doppler perfusion image (LDPI) analyzer (OMEGAZONE OZ-1, OMEGAWAVE, Inc. Tokyo, Japan)を用いて血流を測定した。各個体の左右両方の下肢血流を測定し、左側（患側）／右側（健側）の比を算出し、これをLDPIインデックスとした。
図１に示す通り、Ｍｕｓｅ細胞群では１４日以降も血流改善が継続し、虚血した左下肢は健康な右下肢と同程度まで血流が改善した。一方、非Ｍｕｓｅ細胞群（nMuse）、ＭＳＣ群（BM）及びＶｅｈｉｃｌｅ群（Ve）では１０日までは一定の血流改善を示すが１４日以降は改善が見られなかった。
実施例５：血管新生因子である血管新生関連遺伝子の発現量の測定
細胞投与後６日目の左側（患側）の下肢骨格筋のｍＲＮＡを抽出して、血管新生関連遺伝子として代表的なＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ（特に、FGF-2）の発現量をreal-time RT-PCRの絶対定量法で測定した。測定方法は非特許文献８に基づいて行った。その結果を図２に示す。Ｍｕｓｅ細胞群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較してこれら血管新生因子である血管新生関連遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量が有意に高かった。
細胞投与後６日目の左側（患側）の下肢骨格筋のｍＲＮＡを抽出して、血管新生関連遺伝子として代表的なＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ（特に、FGF-2）の発現量をreal-time RT-PCRの絶対定量法で測定した。測定方法は非特許文献８に基づいて行った。その結果を図２に示す。Ｍｕｓｅ細胞群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較してこれら血管新生因子である血管新生関連遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量が有意に高かった。
実施例６：虚血骨格筋内血管密度の測定
細胞投与後２８日の左側（患側）の下肢骨格筋の組織を４％パラホルムアルデヒド（Paraformaldehude:ＰＦＡ）によって固定し、パラフィン切片を作成した後、抗Isolectin GS-IB4抗体, Alexa Fluor 568 Conjugate（Thermo Fisher Scientific社整、３００倍希釈で使用）を用いて虚血下肢骨格筋における血管内皮細胞の免疫組織化学染色を行い、骨格筋線維あたりの血管内皮細胞の割合を血管密度として測定した。その結果を図３に示す。Ｍｕｓｅ細胞群（図３左）では、Ｖｅｈｉｃｌｅ群（図３右）と比較してこれら虚血骨格筋内の血管密度が高いことがわかる。
細胞投与後２８日の左側（患側）の下肢骨格筋の組織を４％パラホルムアルデヒド（Paraformaldehude:ＰＦＡ）によって固定し、パラフィン切片を作成した後、抗Isolectin GS-IB4抗体, Alexa Fluor 568 Conjugate（Thermo Fisher Scientific社整、３００倍希釈で使用）を用いて虚血下肢骨格筋における血管内皮細胞の免疫組織化学染色を行い、骨格筋線維あたりの血管内皮細胞の割合を血管密度として測定した。その結果を図３に示す。Ｍｕｓｅ細胞群（図３左）では、Ｖｅｈｉｃｌｅ群（図３右）と比較してこれら虚血骨格筋内の血管密度が高いことがわかる。
実施例７：野生型マウスを用いた下肢虚血モデルにおける評価
野生型BALBcマウス（オス１２週齢）を用いて、実施例１と同様にして、下肢虚血モデルマウスを作製した。作製した下肢虚血モデルマウスを群に分け、モデル作製後１日目に、各群のマウスに、Ｍｕｓｅ細胞（３×１０４個、２００μＬ）（Muse）、非Ｍｕｓｅ細胞（３×１０４個、２００μＬ）（non Muse）、あるいは骨髄単核細胞（２×１０５個、２００μＬ）（BMMNC）を尾静脈内(i.v.)または筋肉内(i.m.)に注射した。対照として、ＰＢＳを尾静脈に注射した。一群の動物数は５匹とした。
野生型BALBcマウス（オス１２週齢）を用いて、実施例１と同様にして、下肢虚血モデルマウスを作製した。作製した下肢虚血モデルマウスを群に分け、モデル作製後１日目に、各群のマウスに、Ｍｕｓｅ細胞（３×１０４個、２００μＬ）（Muse）、非Ｍｕｓｅ細胞（３×１０４個、２００μＬ）（non Muse）、あるいは骨髄単核細胞（２×１０５個、２００μＬ）（BMMNC）を尾静脈内(i.v.)または筋肉内(i.m.)に注射した。対照として、ＰＢＳを尾静脈に注射した。一群の動物数は５匹とした。
術前、術直後、術後1日目、3日目、7日目、14日目に、それぞれの群において、血流を実施例４と同様にレーザードップラー血流分析器によって評価し、虚血後肢と非虚血後肢とで血流量を測定し、その比を算出した。結果を図４のＡに示す。また、７日目および１４日目の結果を図４のＢおよびＣに示す。
その結果、野生型マウスにおいても、ヒトMuse細胞は筋注、静注のいずれにおいても下肢の虚血を改善させることが分かった。ヒトMuse細胞静注は、Muse細胞筋注、およびマウス自家骨髄単核球筋注とほぼ同等の効果があるということは、Muse細胞は静脈から患部に到達して生着し、虚血改善効果を発揮するということを示している。
次に、対照群またはMuse細胞静注群のマウスの虚血性内転筋を術後14日目に採取し、組織解析を行った。採取された虚血性内転筋を4%PFA中で1時間固定し、30%ショ糖溶液中で一晩インキュベートした。次いで、組織を最適切断温度(OCT)化合物(Sakura Finetek)に包埋し、液体窒素中で急速凍結し、クリオスタット上で切断した。組織切片を1:5,000の希釈でウサギ抗CD31(ab182981;Abcam)と一晩インキュベートした。ヤギ抗ウサギAlexa594(Abcam)を二次抗体として用いた。DAPI(サーモフィッシャー・サイエンティフィック)を有するProlong GOLD Antifadeでマウントした後、BZ X800光学顕微鏡(Keyence)を用いて画像化を行った。結果を図５に示す。Muse投与群では内皮細胞マーカーであるCD31の発現が有意に亢進しており、Muse細胞は虚血後肢の血管新生を促進して虚血状態を改善することが示唆された。
本発明の細胞製剤は、末梢動脈疾患などの末梢血流障害を患う患者に投与することにより、障害を受けた末梢血管部位に集積・生着して、障害を生じている末梢血管部位の血管を再生し、末梢血管部位の血流障害の改善又は回復させることができる。
Claims (6)
- 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から、ＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離されたか、または、外的ストレス条件下で培養することにより濃縮された多能性幹細胞を含む、末梢血流障害を治療するための細胞製剤であって、
前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、細胞製剤：
（ｉ） ＳＳＥＡ－３陽性；
（ｉｉ） ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ） 三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ） 腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ） セルフリニューアル能を持つ。 - 末梢血流障害が、末梢動脈疾患である、請求項１に記載の細胞製剤。
- 末梢動脈疾患が、四肢の慢性動脈閉塞症である、請求項２に記載の細胞製剤。
- 末梢動脈疾患が、閉塞性動脈硬化症である、請求項２または３に記載の細胞製剤。
- 末梢動脈疾患が、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）である、請求項２または３に記載の細胞製剤。
- 末梢動脈疾患が、膝窩動脈捕捉症候群である、請求項２または３に記載の細胞製剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018225295 | 2018-11-30 | ||
| JP2018225295 | 2018-11-30 | ||
| PCT/JP2019/046847 WO2020111249A1 (ja) | 2018-11-30 | 2019-11-29 | 末梢血流障害の治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020111249A1 JPWO2020111249A1 (ja) | 2020-06-04 |
| JP7473207B2 true JP7473207B2 (ja) | 2024-04-23 |
Family
ID=70853028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020557865A Active JP7473207B2 (ja) | 2018-11-30 | 2019-11-29 | 末梢血流障害の治療剤 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220000936A1 (ja) |
| EP (1) | EP3888751B1 (ja) |
| JP (1) | JP7473207B2 (ja) |
| KR (1) | KR20210099014A (ja) |
| CN (1) | CN113195054A (ja) |
| AU (1) | AU2019388016A1 (ja) |
| CA (1) | CA3121444A1 (ja) |
| SG (1) | SG11202105686UA (ja) |
| WO (1) | WO2020111249A1 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011007900A1 (ja) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Dezawa Mari | 生体組織から単離できる多能性幹細胞 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012024296A1 (en) * | 2010-08-20 | 2012-02-23 | University Of Miami | Arterial repair with cultured bone marrow cells and whole bone marrow |
| CN102641297B (zh) * | 2011-02-21 | 2016-02-24 | 杨子江 | 治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法 |
| AU2017303905B2 (en) * | 2016-07-29 | 2022-11-10 | Life Science Institute, Inc. | Prophylactic or therapeutic agent for vascular disorder |
-
2019
- 2019-11-29 CN CN201980078419.XA patent/CN113195054A/zh active Pending
- 2019-11-29 US US17/298,367 patent/US20220000936A1/en active Pending
- 2019-11-29 EP EP19891644.7A patent/EP3888751B1/en active Active
- 2019-11-29 WO PCT/JP2019/046847 patent/WO2020111249A1/ja unknown
- 2019-11-29 CA CA3121444A patent/CA3121444A1/en active Pending
- 2019-11-29 SG SG11202105686UA patent/SG11202105686UA/en unknown
- 2019-11-29 AU AU2019388016A patent/AU2019388016A1/en active Pending
- 2019-11-29 KR KR1020217018397A patent/KR20210099014A/ko unknown
- 2019-11-29 JP JP2020557865A patent/JP7473207B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011007900A1 (ja) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Dezawa Mari | 生体組織から単離できる多能性幹細胞 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Trends Glycosci. Glycotechnol., (2009), 21, [120], p.197-206 |
| Trends Glycosci. Glycotechnol., (2009), 21, [120], p.207-218 |
| 的場聖明，末梢動脈閉塞症に対する血管再生医療，京都府立医科大学雑誌，2016年，Vol.125, No.11，pp.759-767 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3888751A1 (en) | 2021-10-06 |
| SG11202105686UA (en) | 2021-06-29 |
| KR20210099014A (ko) | 2021-08-11 |
| EP3888751C0 (en) | 2024-04-17 |
| CA3121444A1 (en) | 2020-06-04 |
| JPWO2020111249A1 (ja) | 2020-06-04 |
| CN113195054A (zh) | 2021-07-30 |
| WO2020111249A1 (ja) | 2020-06-04 |
| EP3888751A4 (en) | 2022-10-05 |
| EP3888751B1 (en) | 2024-04-17 |
| AU2019388016A1 (en) | 2021-07-08 |
| US20220000936A1 (en) | 2022-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101730052B1 (ko) | 심근경색의 수복 재생을 유도하는 다능성 간세포 | |
| JP5606008B2 (ja) | 骨髄間質細胞及び間葉系幹細胞の培養方法、中枢神経系疾患治療用の移植細胞の製造方法 | |
| US12053492B2 (en) | Perinatal tissue derived mesenchymal stem cells: method of preparation and uses thereof | |
| JP6452107B2 (ja) | 糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞 | |
| Zhao et al. | Endothelial progenitor cells from human fetal aorta cure diabetic foot in a rat model | |
| JP7029729B2 (ja) | 血管障害の予防又は治療剤 | |
| JP2014167017A (ja) | 肢虚血の治療 | |
| JP7473207B2 (ja) | 末梢血流障害の治療剤 | |
| WO2021045190A1 (ja) | 心筋炎の治療剤 | |
| WO2021029346A1 (ja) | 脳血管性認知症の治療または予防剤 | |
| KR20230137808A (ko) | 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 기질 혈관 분획을 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물 | |
| Fukuta et al. | Synergistic effect of ex-vivo quality and quantity cultured mononuclear cells and mesenchymal stem cell therapy in ischemic hind limb model mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AA64 | Notification of invalidation of claim of internal priority (with term) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764 Effective date: 20210907 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211101 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221114 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20230822 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20230822 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231003 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231204 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240305 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240404 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7473207 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |